CN116256515A

CN116256515A - Ppdpf在胆管癌诊断及药物制备中的用途

Info

Publication number: CN116256515A
Application number: CN202310068453.7A
Authority: CN
Inventors: 邓跃臻; 杜建奎; 范琦
Original assignee: Shanghai Chest Hospital
Current assignee: Shanghai Chest Hospital
Priority date: 2023-02-06
Filing date: 2023-02-06
Publication date: 2023-06-13

Abstract

本申请涉及医药技术领域，具体为PPDPF在胆管癌诊断及药物制备中的用途。本申请提供胰腺祖细胞分化和增殖因子的用途，选自以下任一项或多项：1)作为胆管癌治疗的靶标；2)作为对胆管癌诊断或预后的标志物；3)制备胆管癌诊断或预后的诊断产品；4)作为筛选抑制胆管癌的药物的靶标；5)制备亮氨酸分解代谢抑制剂。本发明确认胆管癌组织中胰腺祖细胞分化和增殖因子(PPDPF)表达显著升高且与病人不良预后相关，PPDPF促进胆管癌细胞的生长和增殖，而敲除PPDPF能够显著抑制胆管细胞的增殖和生长。抑制PPDPF的表达水平显著抑制胆管癌细胞系的裸鼠移植瘤成瘤能力，这提示PPDPF可作为胆管癌发生发展过程中的分子标志物，并可作为治疗胆管癌的靶点。

Description

PPDPF在胆管癌诊断及药物制备中的用途

技术领域

本申请涉及医药技术领域，具体为PPDPF在胆管癌诊断及药物制备中的用途。

背景技术

原发性肝癌分为肝细胞癌(hepatocellμLar carcinoma，HCC)和胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)。根据胆管癌解剖学位置不同又分为肝内胆管癌(intrahepatic CCA，ICCA)、肝周胆管癌(perihilar CCA，pCCA)或远端胆管癌(distalCCA，dCCA)。每种亚型都有不同的流行病学、生物学、预后特征和临床治疗策略。目前，CCA尤其是ICCA的发病率逐年上升，目前的治疗方法以手术治疗为主。肝外胆管癌易引起胆管阻塞、黄疸等临床症状，早期发现后可进行手术根治。30％～40％的病人采用根治性手术后5年生存率为20％-40％。对于中晚期病人，目前没有有效的靶向药物，顺铂联合吉西他滨是标准的治疗方案，但并不能让所有患者从中获益。

肝内胆管癌细胞可起源于肝内胆管上皮细胞或肝祖细胞。少数胆管癌来源于肝细胞，这些肿瘤呈现肝细胞癌和胆管细胞癌的双重特征。与肝癌形成的小梁状、假腺管性、高细胞密度的实体瘤不同，胆管癌是由导管状、乳头状的实质肿瘤结构嵌入肿瘤基质形成。常见的肝损伤因素如肥胖、嗜酒、脂质代谢紊乱、病毒性肝炎、代谢综合征等均能促进肝癌及胆管癌的发生。但目前导致胆管癌发生及发展的具体机制尚不明确。大规模基因组学和转录组学研究发现在胆管癌中存在大量抑癌基因失活突变及致癌信号通路的异常激活如TP53缺失，KRAS激活，IDH1/2突变，EGFR基因融合等。但到目前为止，分子靶向药物的胆管癌临床试验结果不佳，作为单药治疗的司鲁替尼或联合化疗方案的索拉菲尼联合吉西他滨，西妥昔单抗联合吉西他滨等对患者的生存期改善效果十分有限。

面对胆管癌治疗现状的窘态，发现新的分子或生物标志物，揭示其发生发展的潜在机制可能为胆管癌病人的治疗提供新的方案。

代谢重编程对肿瘤的发生和发展至关重要。肿瘤细胞重塑代谢物消耗的过程，以利用中间产物作为物质合成的原料。氨基酸分解代谢的产物是肿瘤细胞能量来源之一。很多氨基酸分解代谢的酶在肿瘤细胞中表达升高，不仅为细胞生存提供能量和物质，也能调节肿瘤细胞蛋白质翻译、生长、增殖、免疫逃逸等生物学过程。例如，肿瘤细胞能够上调双加氧酶和精氨酸酶的表达，加速分解肿瘤微环境中的精氨酸和色氨酸，促进细胞能量的储备同时抑制局部细胞毒性T细胞的增殖，造成免疫逃逸。作为必需氨基酸，支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，BCCA)是肿瘤细胞生长增殖所必须且首选的营养原料，能够用于肿瘤细胞内蛋白质合成或能量供给。除其代谢作用外，BCAA及其许多代谢产物还具有重要的变构调节和信号传导作用。目前研究最多的就是亮氨酸对mTOR信号通路的调节。mTORC1信号通路掌控细胞内多种代谢过程，包括蛋白质合成和细胞生长等过程。亮氨酸通过直接与mTORC1的负调因子Sestrin2结合，来解除对mTORC1的抑制促进其激活。活化后的mTORC1能够促进蛋白质合成，抑制细胞自噬，促进细胞增殖。

越来越多的证据表明支链氨基酸分解代谢过程的改变可影响肿瘤的生物学特性，但对于不同组织来源的肿瘤组织来说支链氨基酸的利用方式大相径庭。比如同样是KRAS和P53突变驱动的肿瘤，肺癌和胰腺癌对BCAA的利用方式就截然不同。对于非小细胞肺癌来说，BCAA的分解代谢过程加快主要为核酸的合成提供氮源。而对于胰腺导管腺癌来说，BCAA分解主要促进三羧酸循环，提高能量产生。胆管癌也是一种由KRAS和P53突变驱动的肿瘤，但在胆管癌中BCAA发挥的作用尚不明确。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供PPDPF在胆管癌诊断及药物制备中的用途。在本研究中，发明人前期实验意外通过SILAC找到了调控胆管癌细胞BCAA代谢的关键分子PPDPF(胰腺祖细胞分化和增殖因子)，发现PPDPF影响胆管癌BCAA分解代谢及促进mTORC1信号通路激活的具体机制，揭示了胆管癌细胞独特的代谢过程，为拓宽胆管癌治疗手段的提供新的思路。

为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供胰腺祖细胞分化和增殖因子的用途，选自以下任一项或多项：

1)作为胆管癌治疗的靶标；

2)作为对胆管癌诊断或预后的标志物；

3)制备胆管癌诊断或预后的诊断产品；

4)作为筛选抑制胆管癌的药物的靶标；

5)制备亮氨酸分解代谢抑制剂。

本申请第二方面提供特异性识别或扩增胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质在制备胆管癌诊断产品或胆管癌预后诊断产品中的用途。

本申请第三方面提供胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂在制备产品中的用途，所述产品至少具备以下功效之一：

1)抑制胆管细胞的增殖和生长；

2)治疗胆管癌。

在本申请的任意实施例中，所述胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂包括：抑制胰腺祖细胞分化与增殖因子活性的物质，或抑制胰腺祖细胞分化与增殖因子的表达、稳定性，或减少其有效作用时间的物质。

在本申请的任意实施例中，所述抑制剂选自：敲除或沉默胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质、特异性与胰腺祖细胞分化与增殖因子结合的结合分子、针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的化学小分子拮抗剂或抑制剂、抑制由胰腺祖细胞分化与增殖因子介导的胆管癌细胞的非锚定依赖生长或成瘤的物质、或干扰胰腺祖细胞分化与增殖因子和效应分子相互作用的物质。

在本申请的任意实施例中，所述敲除或沉默胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质包括：针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的CRISPR基因编辑物质、特异性干扰胰腺祖细胞分化与增殖因子的编码基因表达的干扰分子、或针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的同源重组物质或定点突变物质，所述同源重组物质或定点突变物质将胰腺祖细胞分化与增殖因子进行功能丧失性突变。

在本申请的任意实施例中，所述干扰分子选自siRNA、shRNA或miRNA；优选地，所述干扰分子选自shRNA；更优选地，所述shRNA的靶标分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

在本申请的任意实施例中，所述CRISPR基因编辑物质为sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示。

本申请第四方面提供一种治疗胆管癌的方法，为向对象施用前述用途中的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂。

在本申请的任意实施例中，对象为哺乳动物。

本申请第五方面提供一种治疗胆管癌的药物，包括有效剂量的前述用途中的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：

1、本申请首次发现胆管癌组织中PPDPF表达显著升高且与病人不良预后相关，PPDPF促进胆管癌细胞的生长和增殖。

2、本申请首次披露敲除PPDPF能够显著抑制胆管细胞的增殖和生长，抑制PPDPF的表达水平显著抑制胆管癌细胞系的裸鼠移植瘤成瘤能力，这提示PPDPF可作为胆管癌发生发展过程中的分子标志物，并可作为治疗胆管癌的靶点。

3、本申请首次披露PPDPF通过抑制亮氨酸分解代谢促进胆管癌细胞的恶性表型。

附图说明

图1为胆管癌组织中PPDPF表达显著增加的表征图。其中，图1A为通过查阅GEPIA数据库，分析PPDPF在胆管癌组织和癌旁组织中表达水平，图1B为4例代表性胆管癌组织PPDPF免疫组化结果，图1C为使用inForm 2.4.0软件对80例胆管癌组织标本进行打分，癌组织中PPDPF表达水平高于癌旁正常组织，图1D为Western blot检测24对组织标本中PPDPF表达水平，β-actin或GAPDH作为内参。*表示P<0.05。

图2为PPDPF表达与胆管癌预后不良相关的表征图。其中图2A为通过检索UCSCXena数据库分析PPDPF表达水平与胆管癌病人总生存期之间的关系，图2B为80例胆管癌病人中PPDPF表达水平与病人总生存期之间的关系。

图3为PPDPF促进胆管癌内mTORC1信号通路激活的表征图。其中，图3A为使用PPDPF过表达的Hibe-pic细胞进行RNA测序后进行GSEA分析图。发现mTORC1信号通路激活，图3B为使用PPDPF过表达的Hibe-pic细胞进行RNA测序，对结果进行KEGG富集分析发现PI3K-Akt-mTORC1信号通路激活，图3C为流式细胞仪检测细胞粒径，PPDPF过表达后Hibe-pic细胞直径增大。

图4为PPDPF促进胆管癌细胞生长和增殖的表征图。其中，图4A为构建敲除PPDPF的RBE和9810细胞系，Western blot检测PPDPF的表达水平，GAPDH作为内参，图4B为建过表达PPDPF的RBE、9810和Hibe-pic细胞系,Western blot检测外源PPDPF的表达水平，GAPDH作为内参，图4C为CCK-8实验检测敲除PPDPF后RBE和9810细胞的增殖，使用Student t-text进行统计分析，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。图4D为CCK-8实验检测过表达PPDPF后Hibe-pic，RBE和9810细胞的增殖，使用Student t-text进行统计分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。图4E为软琼脂克隆形成实验检测敲低或敲除PPDPF后胆管癌细胞非锚定依赖生长的能力，使用Student t-text进行统计分析，*P<0.05，**P<0.01。图4F为软琼脂克隆形成实验检测敲低或敲除PPDPF后Hela细胞非锚定依赖生长的能力，使用Student t-text进行统计分析，*P<0.05，**P<0.01。图4G为软琼脂克隆形成实验检测过表达PPDPF后永生化胆管上皮细胞Hibe-pic非锚定依赖生长的能力，使用Student t-text进行统计分析，**P<0.01。图4H为成球实验检测表达PPDPF后，Hibe-pic细胞成球能力，使用Student t-text进行统计分析，*P<0.05，**P<0.01。

图5为抑制PPDPF的表达水平能够抑制胆管癌细胞系TFK1裸鼠移植瘤的成瘤能力的表征图。其中，图5A为裸鼠皮下移植瘤，图5B为肿瘤生长曲线，Student t-text进行统计分析，图5C为和肿瘤重量，Student t-text进行统计分析，图5D为Western blot实验检测异种移植瘤内PPDPF，p-S6，S6的表达，β-actin作为内参，图5E为免疫组化检测组织中PPDPF及p-S6的表达水平。

图6为PPDPF促进胆管癌细胞内BCAA累积的数据分析图。其中，图6A为检测对照细胞和敲低PPDPF的细胞中BCAA含量，Student t-text进行统计分析，**P<0.01，***P<0.001。图6B为检测对照细胞和敲除PPDPF的细胞中BCAA含量，Student t-text进行统计分析，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。图6C为检测对照细胞和过表达PPDPF的Hibe-pic细胞中BCAA含量，Student t-text进行统计分析，***P<0.001。

图7为PPDPF抑制胆管癌内亮氨酸分解代谢的数据分析图。其中，图7A为敲除胆管癌细胞系RBE中PPDPF表达后，靶向代谢组学检测代谢产物，KEGG通路富集展示差异代谢物富集的信号通路。图7B为火山图展示差异代谢物富集的信号通路。图7C-D为靶向代谢组学检测对照细胞和敲除PPDPF后的RBE细胞中亮氨酸、异戊酰肉碱乙酰辅酶A及柠檬酸含量，Student t-text进行统计分析，*P<0.05。图7E为亮氨酸代谢过程示意图。

图8为回补亮氨酸能够回补抑制PPDPF引起的胆管癌细胞表型。其中，图8A为将5×10³个对照细胞和敲除PPDPF的细胞分别种于96孔板中，次日将其中一组细胞中的培基换为额外补充了1×亮氨酸的培基，培养12小时后，通过Edu实验检测细胞增殖情况，Student t-text进行统计分析，*P<0.05，**P<0.01。图8B为软琼脂克隆形成实验检测对照和敲除PPDPF后Hucc-T1，TFK1及Hela细胞在正常营养环境或补充1×亮氨酸的情况下非锚定依赖生长的能力，Student t-text进行统计分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

具体实施方式

为了使本申请的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本申请，并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。

本申请的发明人经过大量探索研究，发现了PPDPF在胆管癌诊断及药物制备中的用途。

胰腺祖细胞分化和增殖因子(Pancreatic progenitor cell differentiationand proliferation factor，PPDPF)的编码基因PPDPF位于人类20号染色体上，其编码的蛋白质约为12KD。人源PPDPF的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:1所示或如Gene ID:79144所示，具体地，为：MAAIPSSGSLVATHDYYRRRLGSTSSNSSCSSTECPGEAIPHPPASFSGSPPSRSWPRCWSPQSTRNLPRPPAA(SEQ ID NO:1)

本发明所述PPDPF可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的PPDPF也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组PPDPF，以应用于实验或临床。在应用时，可采用重组的PPDPF。所述的PPDPF包括全长的PPDPF或其生物活性片段。优选的，所述的PPDPF的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。根据PPDPF的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的PPDPF的氨基酸序列也包括在本发明中。PPDPF或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种PPDPF的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，PPDPF的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的PPDPF的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长PPDPF的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长PPDPF的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明人深入研究临床数据后，确定了以PPDPF作为胆管癌的研究靶点。围绕这一靶点，本发明人进行了深入的实验论证，所述实验论证包括细胞水平上以及动物水平上的论证，具体包括:

(1)胆管癌组织中PPDPF的表达明显升高；

(2)PPDPF的表达与胆管癌患者的总生存期呈负相关；

(3)在胆管癌细胞中过表达PPDPF促进胆管癌胞的非锚定依赖生长能力；

(4)敲除内源PPDPF的表达显著抑制胆管癌细胞的非锚定依赖生长能力；

(5)PPDPF促进体内胆管癌细胞的成瘤能力；

(6)在小鼠模型中，PPDPF敲除抑制胆管癌的发生发展；

(7)PPDPF促进胆管癌细胞mTORC1信号通路激活；

(8)PPDPF促进胆管癌细胞内BCAA累积；

(9)PPDPF抑制胆管癌内亮氨酸分解代谢。

基于本研究的发现，本申请一方面提供了胰腺祖细胞分化和增殖因子的用途，选自以下功效之一：

1)作为胆管癌治疗的靶标；

2)作为对胆管癌诊断或预后的标志物；

3)制备胆管癌诊断或预后的诊断产品；

4)作为筛选抑制胆管癌的药物的靶标；

5)制备亮氨酸分解代谢抑制剂。

可以通过判断待评估样本中PPDPF的表达情况或活性情况，来预测提供该待评估样本的受试者的胆管癌的预后情况，选择合适的药物实施治疗。通常，可以规定一个PPDPF的阈值，当PPDPF的表达情况高于所规定的阈值时，考虑采用抑制PPDPF的方案进行治疗。所述的阈值对于本领域技术人员而言是易于确定的，例如可以通过将正常人细胞或组织中的PPDPF的表达情况与患者细胞或组织中的PPDPF的表达情况进行比较后，获得PPDPF表达异常的阈值。根据测定参数、测定仪器等的不同，所述的阈值的具体数值可以是不同的。

可采用各种本领域已知的技术来检测PPDPF基因的存在与否及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。

本发明还提供了特异性识别或扩增胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质在制备胆管癌诊断产品或胆管癌预后诊断产品中的用途。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增PPDPF的引物；或特异性识别PPDPF的探针来确定PPDPF基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合PPDPF编码的蛋白的抗体或配体来确定PPDPF的表达情况。

针对PPDPF基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与PPDPF基因上特定位点发生特异性结合，而不与PPDPF基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。利用特异性结合PPDPF的抗体来检测分析物中PPDPF表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。

本发明还提供了用于在分析物中检测PPDPF基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增PPDPF基因的引物，特异性识别PPDPF基因的探针，或特异性结合PPDPF基因编码的蛋白的抗体或配体。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于:抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。

本申请另一方面提供胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂在制备产品中的用途，所述产品至少具备以下功效之一：

1)抑制胆管细胞的增殖和生长；

2)治疗胆管癌。

PPDPF或其编码基因的抑制剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，这些术语可互换使用。PPDPF或其编码基因的抑制剂是指任何可降低PPDPF的活性、降低PPDPF或其编码基因的稳定性、抑制PPDPF的表达、减少PPDPF有效作用时间、或抑制PPDPF基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调PPDPF有用的物质，从而可用于抑制胆管癌。

在一些实施方式中，抑制剂选自：敲除或沉默胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质、特异性与胰腺祖细胞分化与增殖因子结合的结合分子、针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的化学小分子拮抗剂或抑制剂、抑制由胰腺祖细胞分化与增殖因子介导的胆管癌细胞的非锚定依赖生长或成瘤的物质、或干扰胰腺祖细胞分化与增殖因子和效应分子相互作用的物质。

在一些实施方式中，敲除或沉默胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质包括：针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的CRISPR基因编辑物质、特异性干扰胰腺祖细胞分化与增殖因子的编码基因表达的干扰分子、或针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的同源重组物质或定点突变物质，同源重组物质或定点物质将胰腺祖细胞分化与增殖因子进行功能丧失性突变。

在一些实施方式中，抑制剂可以是PPDPF特异性的干扰RNA分子，如siRNA、shRNA、miRNA等，本发明人可以理解到，根据本发明中提供的PPDPF序列信息，可以制备获得此类干扰RNA分子。对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于:化学合成法，体外转录法等。干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。作为本发明的特别优选的方式，干扰分子选自shRNA。具体地，shRNA靶标分子的核苷酸序列为：gaagtccaccctcccgttcat(SEQ ID NO:10)。

在一些实施方式中，可采用CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而在靶向疾病的区域敲除PPDPF基因。常见的敲除PPDPF基因的方法包括：将sgRNA或能形成sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成Cas9mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。能形成sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或能形成所述Cas9mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9 mRNA。作为本发明的特别优选的方式，CRISPR基因编辑物质为sgRNA，sgRNA的序列如SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示。

本申请另一方面提供一种治疗胆管癌的方法，其特征在于，为向对象施用前述用途中的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂。

本申请所提供的治疗胆管癌的方法中，对象为哺乳动物。哺乳动物例如为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。灵长目动物例如为猴、猿或智人。

本申请另一方面提供一种治疗胆管癌的药物，包括有效剂量的前述用途中的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂。有效剂量是指指药物可以出现药效的剂量。因为药物要有一定的剂量被机体吸收后，才能达到一定的药物浓度，只有达到一定的药物浓度才能出现药物作用。如果剂量过小，在体内不能获得有效浓度，药物就不能发挥其有效作用。但是如果剂量过大，超过一定限度，药物的作用可出现质的变化，对机体可能产生不同程度的毒性。因此要发挥药物的有效作用，同时又要避免其不良反应，就必须严格掌握用药的剂量范围。

本申请所提供的的药物中，还包括辅料药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与溶酶体调节因子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂、抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

给药方式可以是常规方法，例如可以是静脉注射、静脉滴注、动脉灌注、胃肠道给药、胃肠外给药等方式。

本申请所提供的治疗胆管癌的药物中，所述药物通过抑制PPDPF能够显著抑制胆管细胞的增殖和生长，敲除PPDPF能够显著抑制胆管细胞的增殖和生长。抑制PPDPF的表达水平显著抑制胆管癌细胞系的裸鼠移植瘤成瘤能力，这提示PPDPF可作为胆管癌发生发展过程中的分子标志物，并可作为治疗胆管癌的靶点。

下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领

域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。

下述所用材料信息为：

永生化胆管上皮细胞Hibe-pic及胆管癌上皮细胞系Hucc-T1，TFK1，RBE，9810购自中国科学院细胞库。以上细胞均使用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。

胆管癌病人血液、组织及正常人血液组织来自于上海东方肝胆医院。组织样本均已获得患者知情同意书。本研究中的相关实验得到上海东方肝胆医院伦理委员会和中南大学动物伦理委员会的批准。

抗体信息如下：

抗体名称	公司	货号
			p-S6	CST	5364
S6	CST	2317
			PPDPF	Proteintech	19912-1-AP
GAPDH	Proteintech	10494-1-AP
			Tubulin	Proteintech	11224-1-AP
β-actin	Proteintech	81115-1-RR

实施例1

胆管癌临床样本中PPDPF表达

(1)组织脱水

a.10％中性福尔马林固定胆管癌组织和癌旁组织过夜后，将组织转入75％酒精中，4℃过夜；

b.80％乙醇1h；

c.95％乙醇45min，两遍；

d.100％乙醇25min，两遍；

e.正丁醇1h，两遍；

f.65℃浸蜡，2h；

g.包埋组织并切片。

(2)脱蜡：

a.将待染色玻片放入65℃烘箱1h，将玻片上的蜡熔化，之后进行脱蜡处理；

b.松节油I：5min

c.松节油II：5min

d.100％乙醇I：3min

e.100％乙醇II：3min

f.95％乙醇：3min

g.90％乙醇：3min

h.75％乙醇：3min

i.自来水冲洗：10min

j.双蒸水冲洗一遍

(3)抗原修复：

在EDTA溶液中进行抗原修复，高温高压煮5min，待液体自然冷却至室温，用PBS洗3遍，每遍3min；

(4)用免疫组化笔圈出组织区域，然后滴入内源性过氧化氢酶阻断剂，室温孵育10min后用PBS洗3次，每次3min；

(5)封闭：10％羊血清封闭1h后，用PBS洗3次，每次3min；

(6)使用适量一抗(PPDPF，proteintech，19912-1-AP)覆盖组织，将组织放入湿盒中4℃孵育过夜；

(7)隔日，恢复室温1h后，用PBS洗3次，每次3min；

(8)加入免疫组化增强剂，37℃孵育1h，TBST洗3遍，每次3min；

(9)加入二抗(HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，proteintech，SA00001-2)后，室温孵育1h，TBST洗3遍，每次3min；

(10)显色：配制DAB染色液，将其滴在组织表面，记录显色时间，待显色程度最佳时，终止染色，用清水洗掉表面残留DAB；

(11)染核：将切片浸泡入苏木素中3min，将切片浸泡于清水中洗掉浮色；

(12)分化：将切片放入盐酸酒精分化液(含有1％盐酸的无水乙醇)中，上下提拉3下；

(13)返蓝：用清水冲洗20min，待细胞核染色呈现浅蓝色；

(14)脱水：将切片顺次放入85％乙醇，95％乙醇I，95％乙醇II，无水乙醇I，无水乙醇II中各1min，放入二甲苯I，二甲苯II中各5min，，置于通风橱自然晾干；

(15)封片：在组织表面滴加封片剂(中性树胶：松节油＝7：3)，盖上盖玻片，静置直到树胶凝固；

(16)拍照以及使用inform2.0系统进行打分。

结果如图1所示。

实施例2

胆管癌临床样本组织蛋白提取并检测PPDPF蛋白表达

准备干净的研钵和杵置于冰上预冷。用液氮将胆管癌组织和癌旁组织速冻，然后将其研磨至粉末状。研磨充分后向研钵中加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，充分混匀，待RIPA混合液溶化后，将组织蛋白裂解液转移至1.5mL离心管中，使用4℃离心机离心蛋白裂解液，14000rpm离心15min后将上清液转移至新的1.5mL离心管，弃去沉淀及不溶解的物质，得到待检测样品。对待检测样品进行BCA蛋白定量，按照BCA蛋白定量试剂盒(美国ThermoFisher Scientific公司)的说明书进行，并根据蛋白定量结果进行蛋白印迹杂交实验，过程如下：

(1)配胶方案：

(2)按20μL/lane上样；

(3)电泳：80V/30min—120V/60min；

(4)转膜：运用天能转膜系统将蛋白从胶转移至PVDF膜，转膜条件100V/90min；

(5)抗体(PPDPF，proteintech，19912-1-AP；HRP-conjugated Affinipure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)，proteintech，SA00001-2)孵育；

(6)显影；

(7)应用同一样本扩增的PPDPF与内参基因通过循环数值进行半定量分析PPDPF表达结果如图1B-D所示。

实施例3

构建稳定敲低PPDPF的胆管癌细胞系

(1)PPDPF shRNA质粒构建

本研究选用pLKO.1载体构建PPDPF shRNA质粒，真核筛选标记均为嘌呤霉素。我们将采用连接法，将酶切位点AGE I和Ecor I设计到PPDPF的shRNA序列中，具体操作步骤如下。

a.设计引物：在Sigma-Aldrich官网查找PPDPF的shRNA序列及其反向互补序列，再根据pLKO.1载体要求，将酶切位点加在引物两侧：

表1 PPDPF shRNA序列

b.引物退火：按照以下体系配置体系进行退火。

表2 shRNA oligo退火体系

c.退火程序

表3 shRNA oligo退火的PCR程序

所得PCR产物用灭菌的双蒸水稀释200倍，暂存于4℃冰箱(长期保存应置于-20℃)，用于后续的连接反应。

d.酶切载体：用单酶切方法，先用Ecor I 37℃酶切4小时，反应体系如下：

表4单酶切体系

e.使用Omega纯化试剂盒回收线性载体，并测浓度；

f.使用Age I 37℃酶切4小时，反应体系为：

表5单酶切体系

g.胶回收：配置1％琼脂糖凝胶，将切好的载体与loading buffer混合后跑胶回收目的片段；

h.连接：使用200倍后的退火产物稀释，与载体进行连接，连接体系如下：

表6连接体系

i.转化：将DH5α大肠杆菌从-80℃冰箱取出放置于冰上至感受态融化，将10μL连接产物加入感受态中，冰上静置30min；

j.热激：将感受态细胞放入42℃水浴锅中，热激1min后迅速放回冰上，静止2min；

k.加入1ml无抗生素LB培养液，将其放入摇床中，37℃，220rpm摇1h；

l.室温下1000g离心5min，弃去上清后只留下100μL左右液体重悬菌块，均匀涂布在含有氨苄抗生素(Amp)的LB培养板上。倒置培养板于37℃恒温培养箱，过夜；

m.摇菌扩增：隔日从菌板上挑选单克隆菌落，将其加入适量含有氨苄的LB培养液中，220rpm摇菌12-16h，使菌体扩增，可观察到LB培养液由澄清变浑浊；

n.质粒小抽：离心方式富集菌液，根据天根小抽试剂盒说明书进行质粒提取

o.将质粒送铂尚测序公司进行测序，测序引物为U6，序列为：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGAC(SEQ ID NO:6)，使用Bio Edit软件将测序结果与插入的sh片段进行比对，完全一致则说明质粒构建成功。

(2)包装shPPDPF质粒慢病毒

a.包装体系：使用psPAX和pMD2.G进行慢病毒质粒的包装，对于10cm 293T细胞来说按照如下质粒用量，psPAX：3μg，pMD2.G：1μg，目的质粒(PPDPF shRNA质粒)4μg。

b.转染293T细胞：将750μL无血清DMEM加入EP管中，将上述质粒依次加入管中，按照1：2比例加入16μL Lipo8000，轻柔吹打混匀2次，室温静置20min后加入待感染的293T细胞中；

c.转染6小时后换全新的完全培养基，之后连续培养3天，收集每天的病毒上清液，置于4℃冰箱暂存；

d.使用蔗糖浓缩法浓缩病毒：500g室温离心病毒上清液10min，取0.22μM滤器进行过滤，然后按照病毒上清：蔗糖＝4：1的比例将蔗糖加到管底，勿扰动上清；

e.将d)中液体置于4℃离心机中，8000g离心3h，离心管下侧壁可见白色沉淀，移液管去除上清液，1mL用无血清培基溶解沉淀，4℃溶解过夜；

f.隔日使用无核酶EP管进行分装，每管100μL将病毒放在-80℃保存。

(3)感染目的细胞

取对数生长期的待感染目的细胞(胆管癌RBE和9810细胞系)，将其种入6孔板中，使其隔日密度达到70-80％，多种一个不感染病毒的空白孔作为对照细胞。取步骤(2)f中分装好的病毒，置于冰上融化后将其加入目的细胞中，并加入4μL浓度为10μg/mL的聚凝胺(Polybrene)增加感染效率，轻柔摇动培养皿使液体混合均匀。

(4)建立稳定敲低细胞系

病毒感染48h后将6孔板中细胞消化下来传到中皿中，待其贴壁后，按照培基：puromycin＝500：1的比例配置含有puromycin的培基，将其加入细胞中，连续培养3-4天，待未加病毒的空白孔细胞被全部杀死后，即说明未被感染的细胞已被淘汰，将剩下的细胞进行扩增传代即为敲低细胞系。

提取细胞总蛋白进行定量分析后通过Western blot验证PPDPF敲低效果。

结果如图4所示。

实施例4

构建稳定过表达PPDPF的胆管癌细胞系

(1)质粒构建

本研究选用pQCXIP-Flag载体构建野生型PPDPF-Flag质粒。该载体为逆病毒载体，需要使用293-GP2细胞进行病毒包装。我们将采用连接法进行构建，选择pQCXIP-Flag的酶切位点为BamH I和Not I。具体操作步骤如下：

a.设计引物：PPDPF具有两个异构体，我们选择了最长的异构体对它的全长序列进行克隆，全长序列为：

ATGGCGGCCATCCCCTCCAGCGGCTCGCTCGTGGCCACCCACGACTACTACCGGCGCCGCCTGGGTTCCACTTCCAGCAACAGCTCCTGCAGCAGTACCGAGTGCCCCGGGGAAGCCATTCCCCACCCCCCAGGTCTCCCCAAGGCTGACCCGGGTCATTGGTGGGCCAGCTTCTTTTTCGGGAAGTCCACCCTCCCGTTCATGGCCACGGTGTTGGAGTCCGCAGAGCACTCGGAACCTCCCCAGGCCTCCAGCAGCATGACCGCCTGTGGCCTGGCTCGGGACGCCCCGAGGAAGCAGCCCGGCGGTCAGTCCAGCACAGCCAGCGCTGGGCCCCCGTCCTGA(SEQ ID NO:7，野生型PPDPF序列)，根据酶切位点设计如下引物：

PPDPF forward(5’-3’)：CGCGGATCCATGGCGGCCATCCCCTCCAG(SEQ ID NO:8)；

PPDPF reverse(5’-3’):AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAGGACGGGGGCCCAGCGC(SE Q IDNO:9)。

b.配置扩增目的序列所需溶液：以细胞系RNA逆转的cDNA为模板，按照如下扩增体系配制混合液：

表7 PPDPF CDS序列扩增体系

c.按照如下程序进行目的片段的扩增：

表8 PPDPF CDS序列扩增的PCR程序

d.跑胶验证：配置2％的琼脂糖凝胶，取少量PCR产物与loading buffer混匀后进行电泳分析。跑胶20分钟后采用凝胶成像仪进行显像，对应Marker指示的位置，判断扩增出的PCR产物长度与PPDPF的CDS全长是否匹配。若条带位置大小和PPDPF的CDS序列全长一致，表明克隆成功，可进行后续的酶切。

e.双酶切PCR产物：由于此时得到的PCR产物酶切位点前含有保护碱基且为平末端，所以要对PCR产物进行酶切，使其成为粘性末端才能够与载体进行连接。按照如下体系配置体系，37℃进行双酶切4小时：

表9双酶切体系

f.胶回收：配置2％的琼脂糖凝胶，取酶切后的PCR产物与loading buffer混匀后进行电泳分析。跑胶20分钟后进行显像，判断酶切PCR产物长度与PPDPF的CDS全长是否匹配。若条带没有出现弥散、断裂等情况说明酶切成功。将PCR产物所在的位置进行切胶回收。将凝胶与binding buffer混匀后，56℃将胶煮化，然后按照Omega胶回收试剂盒(GelExtraction kit)进行胶回收，得到目的基因片段，测浓度后备用；

g.双酶切载体：按照酶切PCR产物同样的体系和方法进行pQCXIP-Flag载体的酶切和胶回收，得到有粘性末端的线性载体；

h.连接：将酶切好的目的片段和载体进行连接，按照如下公式进行计算：一般载体取50ng，PCR产物时载体量的10倍即为500ng，PCR产物用量＝500ng/(载体碱基数/PCR产物碱基数)，这里PPDPF的量为27.78ng。然后按照如下体系配好连接体系：

表10连接体系

i.转化：取10μl连接产物转入感受态细胞中；

j.隔日挑菌并摇菌扩增；

k.菌液浑浊后进行菌液PCR检测，按照如下体系进行配置：

表11菌液PCR体系

l.PCR扩增程序如上述c；

m.配置2％琼脂糖凝胶，将菌液PCR产物进行跑胶，采用凝胶成像仪进行显像，判断菌液PCR产物长度与PPDPF的CDS全长是否匹配，若匹配则可以送样进行测序；

n.使用Bio Edit将测序结果与PPDPF进行比对，若完全一致则质粒构建成功；

o.获得正确质粒后转染GP2细胞包病毒：包装质粒VSVG和目的质粒(PPDPF-Flag)用量比＝1：7，按照实施例3中(2)b的方法进行转染；

p.转染6小时后换液，然后收集三天病毒上清液，使用蔗糖浓缩的方法进行病毒浓缩，并分装及感染目的细胞(Hibe-pic、RBE、9810细胞系)。

结果如图3所示。

实施例5

构建敲除PPDPF的胆管癌细胞系

(1)质粒构建

使用LentiCRISPRv2载体构建PPDPF-CRISPR质粒，该载体具有嘌呤霉素抗性，可用于后续筛选。

(2)设计PPDPFsgRNA序列，如下：

序列如表12：

表12 sgPPDPF引物序列

引物进行退火反应后备用。

(3)对载体进行酶切，体系如表13：

表13 Lenti-CRISPR-v2酶切体系

(4)将退火后的引物与线性载体进行连接，转化后，挑选阳性克隆。

(5)包装慢病毒

a.包装体系：使用psPAX和pMD2.G进行慢病毒质粒的包装，对于10cm 293T细胞来说按照如下质粒用量，psPAX：3μg，pMD2.G：1μg，CRISPR质粒4μg。

b.转染293T细胞：将750μL无血清DMEM加入EP管中，将上述质粒依次加入管中，按照1：2比例加入16μL Lipo 8000，轻柔吹打混匀2次，室温静置20min后加入待感染的293T细胞中；

d.使用蔗糖浓缩法浓缩病毒，即可用与感染目的细胞，使用嘌呤霉素筛选阳性细胞。

结果如图4A所示。

实施例6

CCK-8实验

每组设置4个复孔，将1×10³个细胞(实施例3～5构建的细胞)接种于96孔板中，培养基为RPMI-1640。隔日弃去旧培养基，加入含10％CCK8试剂的培养基，同时设置不含细胞的空白孔，置于37℃培养箱中孵育1h，用酶标仪检测450nm下的吸光度，每天同一时间进行检测。细胞吸光度值＝测得值-空白孔。

结果如图4C-D所示。

实施例7

流式细胞仪检测细胞直径

将TFK1对照细胞和实施例4中过表达PPDPF的Hibe-pic细胞种在中皿中，隔日消化细胞，计数其密度为4×10⁶个/mL，取10μL细胞用JIMbio-Fil仪器检测细胞粒径。

结果如图3C所示。

实施例8

软琼脂克隆形成实验

使用低熔点琼脂粉配置1.25％Agar和1％Agar，并进行高温高压灭菌，置于4℃冰箱保存。做实验时提前将恒温水浴锅的温度调至42℃，并将1.25％Agar和1％Agar在微波炉中熔化，将其置于42℃水浴锅中备用，保证实验过程中胶为液体状态。

a.首先用PBS润洗24孔板；

b.制备下层胶:配置下层胶：将20％FBS，40％2×MEM，40％1.25％Agar混匀，每组细胞设置4个复孔，每孔加400μL下层胶；

c.消化细胞并进行细胞计数，每孔加入1000个细胞(实施例3～5构建的细胞)；

d.配置上层胶：将25％FBS，37.5％的2×MEM，2mM谷氨酰胺混匀，以4：1比例与细胞混匀后迅速加入下层胶的上层；

e.视细胞生长速度培养一周或两周时间，克隆生长为大小在50-150μm左右的球形时在显微镜下拍照记录并统计。

结果如图4E-G和图8B所示。

实施例9

干细胞成球实验

a.配置成球所需细胞培养基：配置适量含有20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、2％B27和2mM谷氨酰胺的DMEM/F12培养基；

b.使用处于对数生长期的细胞(实施例4构建的细胞)，对其胰酶消化、离心、弃去上清、PBS洗涤后用a)中培基重悬细胞，使用细胞计数仪进行计数，使细胞浓度为2×10³个/mL；

c.轻柔吹打细胞悬液使其内部细胞形成单个细胞，取500μL细胞悬液种于低粘附24孔板中，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养5天，直至出现由单个细胞形成的细胞团即为成功，在显微镜下拍照，记录细胞成球数量及大小。

结果如图4H所示。

实施例10

裸鼠皮下成瘤实验

购买6周龄的雄性裸鼠共18只，为排除个体差异，每组设置6只老鼠，每只老鼠种5×10⁶个TFK1细胞(人胆管癌细胞)。将细胞(TFK1对照细胞系和实施例3构建的PPDPF敲低细胞系)用50μL无血清培基重悬后与50μL基质胶混匀，种于裸鼠腹股沟处皮下。约一周后观察形成的肿瘤，每天记录肿瘤体积及老鼠体重，移植瘤体积计算公式＝(长×宽²)/2。当老鼠出现体重下降等消耗性状况时处死老鼠，将皮下肿瘤取下并进行拍照、称重及后续实验处理。该实验通过中南大学动物伦理委员会批准。

结果如图5所示。

实施例11

EdU细胞增殖实验

细胞接种于96孔板中，每孔5×10³个细胞，实验组(实施例5构建的敲除PPDPF的细胞)和对照组(PPDPF正常表达的细胞)均设置3个复孔，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。次日，对处理组更换补充了1×亮氨酸的培基进行培养12h，之后弃去培基，换成混有Edu试剂的培基，按照Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit说明书(锐博生物，C10310-1)进行检测。实验完成后，用荧光显微镜进行拍照，使用photoshop软件进行计数。EdU染色阳性细胞与Dapi染色阳性细胞的比值即为处于增殖期的细胞百分比。

结果如图8A所示。

实施例12

支链氨基酸检测

a.准备2×10⁶个细胞(实施例3～5构建的细胞)，使用100μL Assaybuffer进行裂解。15000g离心10分钟去除细胞碎片和其他不溶性物质；

b.配置反应试剂混合液：每个样品设置3个复孔，计算样品数量并将反应试剂配置成混合液，每个样品需含有Assay buffer 23μL，Enzyme Mix 1μL，WST substrate Mix 1μL；

c.配置背景对照试剂：计算样品数量并将反应试剂配置成混合液，Assay buffer24μL，WST substrate Mix 2μL；

d.取25μL样品加入96孔板中，分别加入反应试剂或背景试剂，混合均匀后避光室温孵育30min；

e.使用酶标仪读取450nm波长的吸光度数值；

f.计算：样品测得吸光度值减去背景对照吸光度值即为所求支链氨基酸含量吸光度值，并根据标准曲线进行计算。

结果如图6所示。

实施例13

结果分析

如图1所示，为了探究PPDPF在临床样本中的表达情况，通过检索TCGA数据库发现PPDPF在胆管癌组织中的表达较癌旁组织升高(图1A)。对80例胆管癌病人配对的癌及癌旁组织进行免疫组化染色，发现PPDPF在肿瘤组织中的表达显著升高(图1B-C)。进一步提取了24对胆管癌组织的蛋白，Western Blot实验表明，PPDPF在胆管癌组织中表达升高(图1D)。

如图2所示，分析UCSC Xena数据库发现PPDPF的高表达提示患者预后不良(图2A)，对收集的98例胆管癌病例进行生存分析发现，PPDPF高表达的患者生存时间更短(图2B)。通过分析病人组织中PPDPF的表达水平与临床病理参数之间的相关性，发现PPDPF高表达与肿瘤标志物CEA的含量呈正相关，与病人更短的生存期相关(表14)。上述结果表明PPDPF与胆管癌预后不良相关。

表14 PPDPF蛋白水平与胆管癌癌患者临床特征的相关性

如图3所示，对过表达PPDPF的Hibe-pic细胞进行RNA转录组测序分析，GSEA及KEGG功能注释表明PPDPF过表达促进PI3K-Akt-mTOR信号通路显著富集(图3A-B)。文献报道氨基酸含量变化能够直接影响mTORC1信号通路的激活，结合文献与RNA测序结果，推测PPDPF可能促进该信号通路激活。mTORC1信号通路激活的特征之一是使细胞粒径增大，因此检测了过表达PPDPF后Hibe-pic细胞的直径。流式细胞仪结果显示，过表达PPDPF后Hibe-pic细胞直径增大，表明细胞内mTORC1信号通路激活(图3C)。

如图4所示，PPDPF敲低抑制胆管癌细胞生长和增殖。采用CRISPR-Cas9系统构建了PPDPF敲除细胞系(图4A)。CCK-8实验结果显示敲除PPDPF后能够显著抑制RBE和9810细胞的增殖，过表达PPDPF则显著促进Hibe-pic，RBE及9810细胞的增殖(图4B)。敲除PPDPF后能够显著抑制RBE和9810细胞的增殖，过表达PPDPF则显著促进Hibe-pic，RBE及9810细胞的增殖(图4C-D)。用软琼脂克隆形成实验检测PPDPF对胆管癌细胞非锚定依赖性生长能力的影响。结果表明使用shRNA敲低PPDPF或使用Crispr质粒敲除PPDPF后细胞形成的克隆数量及大小均小于对照组(图4E-F)，过表达PPDPF则得到相反的结果(图4G)。细胞成球实验也表明过表达PPDPF能够促进永生化胆管上皮细胞成球，说明PPDPF能够促进永生化胆管上皮细胞的干性(图4H)。以上体外实验结果表明PPDPF能够促进胆管癌细胞的恶性表型。

如图5所示，使用TFK1对照细胞系和PPDPF敲低细胞系进行裸鼠异种移植瘤实验。结果显示，敲低PPDPF后，裸鼠皮下形成的肿瘤生长更慢(图5A-B)，肿瘤重量更轻(图5C)，表明抑制PPDPF表达能够显著抑制胆管癌细胞的体内生长能力。使用肿瘤组织进行Westernblot和免疫组化实验检测移植瘤中PPDPF对mTORC1信号通路的激活情况，结果均显示敲低PPDPF后能够显著抑制mTORC1信号通路下游p-S6的表达(图5C-D)，说明敲低PPDPF能够抑制mTORC1信号通路的激活。

如图6所示，在氨基酸饥饿，氨基酸刺激或正常培养三种模式下，敲低或敲除PPDPF后，胆管癌细胞内氨基酸含量显著下降(图6A-B)。反之，过表达PPDPF能够增加胞内支链氨基酸含量(图6C)，说明PPDPF能够促进胆管癌细胞中支链氨基酸的积累。

如图7所示，为了进一步证明PPDPF能够引起胆管癌内BCAA积累，使用对照细胞和敲除PPDPF的胆管癌细胞进行靶向代谢组学检测，通过对多种代谢途径中的所有产物进行绝对含量的检测，发现亮氨酸代谢途径发生了明显变化(图7A-B)。分析三种支链氨基酸分解代谢途径上代谢物的变化，结果发现敲除PPDPF后，亮氨酸，异戊酰肉碱表达量下降，亮氨酸代谢产物终乙酰辅酶A及柠檬酸含量升高(图7C-D)，说明干扰PPDPF的表达可能促进异戊酰肉碱下游代谢酶即酰基辅酶A脱氢酶(IVD)及3-甲基丁烯酸-辅酶A羧化酶A/B(MCCA/MCCB)介导的亮氨酸分解代谢(图7E)。

如图8所示，在敲除PPDPF的胆管癌细胞中进行亮氨酸的代谢回补，EdU(图8A)、软琼脂克隆形成实验(图8B)结果均显示在敲除PPDPF的细胞中回补亮氨酸能够逆转敲除PPDPF对胆管癌细胞增殖和非锚定性依赖生长的抑制作用。以上结果证实PPDPF通过抑制亮氨酸分解代谢促进胆管癌细胞的恶性表型。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。

Claims

1.胰腺祖细胞分化和增殖因子的用途，选自以下任一项或多项：

1)作为胆管癌治疗的靶标；

2)作为对胆管癌诊断或预后的标志物；

3)制备胆管癌诊断或预后的诊断产品；

4)作为筛选抑制胆管癌的药物的靶标；

5)制备亮氨酸分解代谢抑制剂。

2.特异性识别或扩增胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质在制备胆管癌诊断产品或胆管癌预后诊断产品中的用途。

3.胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂在制备产品中的用途，所述产品至少具备以下功效之一：

1)抑制胆管细胞的增殖和生长；

2)治疗胆管癌。

4.如权利要求3所述的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂在制备产品中的用途，其特征在于，所述胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂包括：抑制胰腺祖细胞分化与增殖因子活性的物质，或抑制胰腺祖细胞分化与增殖因子的表达、稳定性，或减少其有效作用时间的物质。

5.如权利要求4所述的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂在制备产品中的用途，其特征在于，所述抑制剂选自：

敲除或沉默胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质、特异性与胰腺祖细胞分化与增殖因子结合的结合分子、针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的化学小分子拮抗剂或抑制剂、抑制由胰腺祖细胞分化与增殖因子介导的胆管癌细胞的非锚定依赖生长或成瘤的物质、或干扰胰腺祖细胞分化与增殖因子和效应分子相互作用的物质。

6.如权利要求5所述的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂在制备产品中的用途，其特征在于，所述敲除或沉默胰腺祖细胞分化与增殖因子的物质包括：针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的CRISPR基因编辑物质、特异性干扰胰腺祖细胞分化与增殖因子的编码基因表达的干扰分子、或针对胰腺祖细胞分化与增殖因子的同源重组物质或定点突变物质，所述同源重组物质或定点突变物质将胰腺祖细胞分化与增殖因子进行功能丧失性突变。

7.如权利要求6所述的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂在制备产品中的用途，其特征在于，所述干扰分子选自siRNA、shRNA或miRNA；优选地，所述干扰分子选自shRNA；

更优选地，所述shRNA的靶标分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

和/或，所述CRISPR基因编辑物质为sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:11和/或SEQID NO:12所示。

8.一种治疗胆管癌的方法，其特征在于，为向对象施用如权利要求3～7任一所述用途中的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂。

9.如权利要求8所述的治疗胆管癌的方法，其特征在于，对象为哺乳动物。

10.一种治疗胆管癌的药物，包括有效剂量的权利要求3～7任一所述用途中的胰腺祖细胞分化和增殖因子抑制剂。