CN112402438B - 重楼皂苷ⅶ在制备msn蛋白抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重楼皂苷Ⅶ在制备MSN蛋白抑制剂中的应用，通过系列实验，证明了重楼皂苷Ⅶ具有抗多发性骨髓瘤的活性。且重楼皂苷Ⅶ通过直接抑制MSN蛋白水平而靶向多发性骨髓瘤干细胞样细胞侧群细胞而发挥了抗多发性骨髓瘤的活性。重楼皂苷Ⅶ可以作为MSN蛋白的抑制剂达到治疗因MSN蛋白质表达升高引起的疾病如多发性骨髓瘤等，有望被开发为新型的抗肿瘤药物。

Description

重楼皂苷Ⅶ在制备MSN蛋白抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及重楼皂苷Ⅶ的新用途，具体涉及重楼皂苷Ⅶ在制备MSN蛋白抑制剂中的应用。属于医药技术领域。

背景技术

MSN(moesin)是ezrin-radixin-moesin(ERM)蛋白家族的成员，是一种将肌动蛋白细胞骨架与跨膜受体连接的蛋白。ERM蛋白的生理作用与细胞皮层的结构有关，参与细胞分化和形态发生。MSN在多种人类癌症中上调，包括乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌以及肺和黑色素瘤等，MSN是淋巴细胞中占主导地位的ERM蛋白，与次级淋巴器官的T和B细胞流出有关。CD44可通过与ERM蛋白(Ezrin、radixin、moesin)结合而在质膜和肌动蛋白细胞骨架之间提供连接。MSN-CD44相互作用是胶质母细胞瘤的潜在治疗靶点， Wnt/β-catenin通路是MSN-CD44相互作用下游的特异性信号。在胰腺导管腺癌中，Ezrin 可调控肿瘤干细胞的特性，并可能成为治疗的新靶点。MSN和肿瘤干细胞、多药耐药密切相关。目前尚未有MSN的特异性抑制剂。

尽管最近MM治疗取得了进展，但仍然无法治愈，会有耐药和复发/难治性的患者。硼替佐米(BTZ)耐药是一种常见的耐药类型，是临床上急需解决的问题。多发性骨髓瘤干细胞样细胞(MMSC)定义为恶性组织内的一种具有自我更新和分化为骨髓瘤浆细胞的主要谱系的能力的细胞。MMSC被认为可能是导致耐药性产生的根源，抑制MMSC成为 MM的治疗新策略。目前，MMSC的典型特征包括侧群细胞(side population cell，SP细胞) 的增加、经典干细胞基因的表达和克隆发生潜能等。侧群细胞，是偏离主群细胞呈Hoechst 33342低染的一群细胞。其表型主要与ATP依赖性细胞表面蛋白成员ABC转运蛋白家族有关。ABC转运蛋白家族包括ABCG2、ABCB1、ABCC1等。与干性密切相关的基因有 Oct4、Nanog、Sox2、Lin28、Klf4等，其在干细胞中有较高表达，MMSC具有更强的集落形成能力和成瘤能力。

近年来，化合物库已成为新药发现过程中不可或缺的工具，帮助科学家寻找新药开发的先导化合物。癌症是世界范围内的主要健康问题，天然产物被认为是治疗不同类型人类癌症的一种新的、可靠的疗法。越来越多的研究表明，发现具有显著抗肿瘤活性的药物及其靶蛋白对促进临床治疗具有重要意义。重楼皂苷Ⅶ(PolyphyllinⅦ，PP7)是重楼的生物活性成分之一，现代医学研究其在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、止血等方面发挥着重要的作用。已有研究表明，PP7可抑制多种肿瘤的活性，包括肺癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、口腔癌、结肠癌等，其抗肿瘤作用机制包括：诱导凋亡、细胞周期抑制和自噬抑制。综上所述，PP7是一种广谱且具有重要临床开发潜力的抗肿瘤药物，但PP7在多发性骨髓瘤和肿瘤干细胞中的作用以及靶蛋白的作用尚不清楚。重楼皂苷Ⅶ广泛存在于重楼等植物中，而这类天然药物资源丰富，故重楼皂苷Ⅶ在抗MM等肿瘤的临床治疗中有着巨大的潜在价值。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供重楼皂苷Ⅶ在制备MSN蛋白抑制剂中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

1、重楼皂苷Ⅶ在制备MSN蛋白抑制剂中的应用。

2、重楼皂苷Ⅶ在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。

优选的，重楼皂苷Ⅶ在制备治疗复发/难治性多发性骨髓瘤药物中的用途。

3、重楼皂苷Ⅶ在制备肿瘤干细胞抑制剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明公开了重楼皂苷Ⅶ在制备MSN蛋白抑制剂中的新应用。本发明通过系列实验，证明了重楼皂苷Ⅶ具有抗多发性骨髓瘤的活性。且重楼皂苷Ⅶ通过直接抑制MSN蛋白水平而靶向多发性骨髓瘤干细胞样细胞侧群细胞而发挥了抗多发性骨髓瘤的活性。重楼皂苷Ⅶ可以作为MSN蛋白的抑制剂达到治疗因MSN蛋白质表达升高引起的疾病如多发性骨髓瘤等，有望被开发为新型的抗肿瘤药物。

本发明通过对重楼皂苷Ⅶ进行体外活性实验，发现重楼皂苷Ⅶ具有显著的抗多发性骨髓活性，且重楼皂苷Ⅶ细胞毒性较小。重楼皂苷Ⅶ能直接抑制MM细胞中MSN蛋白水平，具有选择性抑制多种MM细胞增殖的作用，且细胞毒性较小，可以作为MSN蛋白的特异性抑制剂，通过下调MSN蛋白水平，靶向侧群细胞而发挥了抗多发性骨髓瘤的活性，达到治疗因MSN蛋白质表达异常引起的疾病如MM等，有望被开发为新型的抗肿瘤靶向药物。

附图说明

图1为重楼皂苷Ⅶ对MM细胞系、正常人PBMC细胞以及MM患者原代CD138⁺细胞存活率的影响；其中，A为CCK-8方法检测2μM重楼皂苷Ⅶ(PP7)、重楼皂苷Ⅵ(PP6)、重楼皂苷Ⅰ(PP1)对MM细胞系存活率的影响；B为CCK-8方法检测不同浓度重楼皂苷Ⅶ对永生化B淋巴细胞和MM细胞系细胞存活率的影响；C为CCK-8方法检测不同浓度重楼皂苷Ⅶ对正常人外周血单个核细胞(PBMC)以及MM患者原代CD138⁺细胞存活率的影响ARP1、KMS11、MM.1S、RPMI-8226、ANBL6和ANBL6-BR细胞为不同的MM 细胞系。PBMC细胞为正常人外周血单个核细胞，MMpatient为MM患者原代CD138⁺细胞。ns：p＞0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2为重楼皂苷Ⅶ抑制多发性骨髓瘤干细胞样细胞并靶向侧群细胞；其中，A为流式检测重楼皂苷Ⅶ对ARP1和RPMI-8226细胞侧群细胞比率的影响；B为qPCR检测重楼皂苷Ⅶ对ARP1和RPMI-8226细胞干性基因Oct4、Nanog、Sox2、Lin28、Klf4的影响；C 为流式分选ARP1细胞的侧群与主群细胞后，CCK-8法检测重楼皂苷Ⅶ对侧群细胞和主群细胞存活率的影响；D为流式分选ARP1细胞的侧群与主群细胞后，软琼脂克隆形成实验检测重楼皂苷Ⅶ对侧群细胞和主群细胞克隆形成能力的影响。NC为对照，PP7即重楼皂苷Ⅶ，V为维拉帕米(Verapamil)，维拉帕米组为阴性对照组。SP为侧群细胞，MP为主群细胞。ns：p＞0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；E流式检测重楼皂苷Ⅶ对MM 患者原代CD138⁺细胞侧群细胞的比率的影响。

图3为重楼皂苷Ⅶ抑制MSN蛋白；其中，A为DARTS(药物亲和反应的靶点稳定性法)寻找重楼皂苷Ⅶ的靶标蛋白。pronase为链霉蛋白酶，蛋白酶：总蛋白表示二者的蛋白质量比；B为DARTS法处理样品后，WB检测MSN蛋白的变化；C为CETSA(细胞热转变分析)法处理样品后，WB检测MSN蛋白的变化；D为WB检测正常人永生化B淋巴细胞和MM细胞系中MSN表达的差异，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参；E 为WB检测重楼皂苷Ⅶ处理ARP1、MM.1S、ANBL6和ANBL6-BR细胞后，MSN蛋白的变化。B cell为正常人永生化淋巴细胞，MM.1R、U266均为MM细胞系。β-actin为β肌动蛋白，作为内参。

图4为干扰MSN的表达抑制MM细胞的生长和侧群细胞的比率；其中，A为加入 MSN的shRNA干扰后，WB检测ARP1细胞中MSN在蛋白水平上的变化。GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参；B为加入MSN的shRNA干扰后，细胞计数检测ARP1细胞生长的变化；C为加入MSN的shRNA干扰后，流式检测ARP1细胞SP比率的变化。 Scramble:shRNA的对照序列，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5为过表达MSN后促进MM细胞的生长和提高侧群细胞的比率；其中，A为加入 MSN的过表达慢病毒载体后，WB检测ARP1细胞中MSN在蛋白水平上的变化。GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参；B为加入MSN的过表达慢病毒载体后，细胞计数检测ARP1细胞生长的变化；C为加入MSN的过表达慢病毒载体后，流式检测ARP1细胞侧群细胞比率的变化；D为加入MSN的过表达慢病毒载体后，WB检测MM患者原代 CD138⁺细胞中MSN在蛋白水平上的变化。GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参；E 为加入MSN的过表达慢病毒载体后，CCK-8检测MM患者原代CD138⁺细胞存活率的变化。EV为慢病毒空载体，OE-MSN为过表达MSN后的慢病毒载体，维拉帕米(Verapamil) 组为阴性对照组，**p<0.01。

图6为重楼皂苷Ⅶ抑制ANBL6-BR细胞成瘤；其中，A为取出小鼠皮下的肿瘤后，用照相机拍照；B为小鼠肿瘤体积生长曲线；C为小鼠体重变化曲线；D为小鼠肿瘤离体体积；E为小鼠肿瘤离体体重；F为免疫组化检测Ki67；G为免疫组化检测MSN ANBL6-BR 细胞为MM细胞株ANBL6的硼替佐米(BTZ)耐药细胞株。

图7为重楼皂苷Ⅶ或敲低MSN抑制ARP1细胞成瘤；其中，A为每只小鼠腹腔注射入100mg/kg D-荧光素后，利用小动物成像仪进行拍照；B为取出小鼠皮下的肿瘤后，用照相机拍照；C为小鼠肿瘤体积生长曲线；D为小鼠体重变化曲线；E为小鼠肿瘤离体体重。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明涉及的重楼皂苷Ⅶ，纯度为98％(质量百分数)。

实施例1：重楼皂苷Ⅶ被鉴定为是治疗多发性骨髓瘤的理想天然化合物单体

重楼皂苷系列的重楼皂苷Ⅶ(PP7)、重楼皂苷Ⅵ(PP6)、重楼皂苷Ⅰ(PP1)(均购买自美国Selleck生物科技有限公司)具有抗肿瘤活性。我们首先将这3种单体以2μM的浓度处理MM细胞MM.1S(来自ATCC)、ARP1、ANBL6和ANBL6-BR细胞(均来自中南大学肿瘤研究所周文教授)，期望得到在四种细胞中具有最佳抗肿瘤活性的天然产物单体。证明重楼皂苷Ⅶ抗肿瘤效果最显著后，采用CCK-8法检测重楼皂苷Ⅶ对永生化B淋巴细胞(来自中南大学生命科学学院遗传学实验室)和MM细胞系、正常人PBMC细胞 (来自中南大学湘雅医院)以及MM患者原代CD138⁺细胞(来自湖南省肿瘤医院)存活率的影响，来评估不同细胞类型对重楼皂苷Ⅶ的敏感性。

1、CCK-8方法检测2μM的3种重楼皂苷对MM.1S、ARP1、ANBL6和ANBL6-BR 细胞存活率的影响

(1)MM.1S、ARP1、ANBL6和ANBL6-BR细胞长到对数期，将细胞重悬至15mL 离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。

(2)设置不加细胞只有完全培养基(RPMI-1640培基+10％BI胎牛血清+1％双抗)孔板组以及不加药物、只有细胞和完全培养基的对照组，每个浓度设置4个复孔。

(3)分别加入2μM的3种重楼皂苷，接种细胞(96孔板中每孔约8×10³个细胞)于 96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。

(4)在细胞培养液中直接加入1/10体积的Cell Counting Kit-8(CCK-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。

(5)继续培养3小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，计算细胞存活率。

细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药)：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药)：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力(％)：细胞增殖活力或细胞毒性活力

2、CCK-8方法检测不同浓度重楼皂苷Ⅶ对MM细胞系细胞存活率的影响

(1)正常人永生化淋巴细胞，ARP1、KMS11、MM.1S、RPMI-8226和ANBL6细胞长到对数期，将细胞重悬至15mL离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。

(2)设置不加细胞只有完全培养基(RPMI-1640培基+10％BI胎牛血清+1％双抗)孔板组以及不加药物、只有细胞和完全培养基的对照组，每个浓度设置4个复孔。

(3)分别加入0.5μM、1μM和2μM的重楼皂苷Ⅶ，接种细胞(96孔板中每孔约8× 10³个细胞)于96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。

(4)在细胞培养液中直接加入1/10体积的Cell Counting Kit-8(CCK-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。

(5)继续培养3小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，计算细胞存活率。

3、CCK-8方法检测不同浓度重楼皂苷Ⅶ对正常人PBMC细胞以及MM患者原代 CD138⁺细胞存活率的影响

(1)以淋巴细胞分离液分离出MM患者的骨髓单个核细胞。

(2)以CD138磁珠分选出单个核细胞中的CD138⁺细胞。

(3)将CD138⁺原代细胞重悬至15mL离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。

(4)设置不加细胞只有完全培养基(RPMI-1640培基+10％BI胎牛血清+1％双抗)孔板组以及不加药物、只有细胞和完全培养基的对照组，每个浓度设置4个复孔。

(5)分别加入0.5μM、1μM和2μM的重楼皂苷Ⅶ，接种细胞(96孔板中每孔约8 ×10³个细胞)于96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。

(6)在细胞培养液中直接加入1/10体积的Cell Counting Kit-8(CCK-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。

(7)继续培养12小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，计算细胞存活率。

实验结果如图1所示，其中，A为CCK-8方法检测2μM重楼皂苷Ⅶ(PP7)、重楼皂苷Ⅵ(PP6)、重楼皂苷Ⅰ(PP1)对MM细胞系存活率的影响；B为CCK-8方法检测不同浓度重楼皂苷Ⅶ对永生化B淋巴细胞和MM细胞系细胞存活率的影响；C为CCK-8方法检测不同浓度重楼皂苷Ⅶ对正常人外周血单个核细胞(PBMC)以及MM患者原代CD138⁺细胞存活率的影响ARP1、KMS11、MM.1S、RPMI-8226、ANBL6和ANBL6-BR细胞为不同的MM细胞系。PBMC细胞为正常人外周血单个核细胞，MM patient为MM患者原代CD138⁺细胞。ns：p＞0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。在四种MM细胞中重楼皂苷Ⅶ活性最强，在四种细胞中其IC50均小于2μ。重楼皂苷Ⅶ可以显著抑制MM细胞系ARP1、KMS11、MM.1S、RPMI-8226、ANBL6和ANBL6-BR细胞的增殖，但对正常人B淋巴细胞抑制率较低。重楼皂苷Ⅶ可显著抑制CD138⁺原代细胞的增殖，但对正常人 PBMC的抑制增殖作用较小，表明其在具有显著抗MM活性的同时，对正常细胞的副作用较小，具有较强的选择性。

实施例2：重楼皂苷Ⅶ抑制多发性骨髓瘤干细胞样细胞并靶向侧群细胞。

采用流式检测重楼皂苷Ⅶ对ARP1和RPMI-8226细胞侧群细胞比率的影响，qPCR检测重楼皂苷Ⅶ对ARP11和RPMI-8226细胞干性基因Oct4、Nanog、Sox2、Lin28、Klf4的影响，流式分选ARP1细胞的侧群与主群细胞后，CCK-8检测重楼皂苷Ⅶ对侧群细胞和主群细胞存活率的影响，软琼脂克隆形成实验检测重楼皂苷Ⅶ对侧群细胞和主群细胞克隆形成能力的影响。并通过流式检测重楼皂苷Ⅶ对MM患者原代CD138⁺细胞侧群细胞比率的影响。

实验步骤如下：

1、流式检测重楼皂苷Ⅶ对ARP1和RPMI-8226细胞侧群细胞比率的影响

(1)800rpm，5min离心收集细胞，每个样的细胞数＞5×10⁵

(2)用含体积百分数2％胎牛血清、10mM的HEPES缓冲液、体积百分数1％青链霉素双抗的RPMI-1640培养基将细胞重悬(细胞密度约10⁶个/mL)

(3)将细胞液与5μg/mL的Hoechst 33342在37℃水浴孵育90min(染色完成后，需处于4℃环境)

(4)1000rpm，10min，4℃离心

(5)用含体积百分数2％胎牛血清、10mM HEPES的磷酸缓冲液重悬细胞。

(6)流式检测前加终浓度为2ug/mL的PI，染色5min，流式细胞仪上检测。

2、qPCR检测重楼皂苷Ⅶ对ARP1和RPMI-8226细胞干性基因Oct4、Nanog、Sox2、Lin28、Klf4的影响

(1)ARP1和RPMI-8226细胞长到对数期，1μM重楼皂苷Ⅶ处理细胞。将细胞重悬至15mL离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。

(2)提RNA：1000rpm，5min离心，弃上清，细胞沉淀中加入1mL TRIzol，充分混匀后，在冰上放置10min，使细胞完全溶解于TRIzol中。

(3)向TRIzol中加入300μL氯仿，颠倒混匀后室温放置15min。将无色透明的上层水相吸到新的1.5mL离心管中。加入与上层水相等量体积的异丙醇，颠倒混匀后室温放置15min。12000rpm，4℃离心10min，弃上清。

(4)在细胞沉淀中加入1mL体积百分数75％的乙醇溶液，8000rpm，4℃离心5min，弃上清。

(5)滤干后加DEPC水溶解，测RNA浓度。

(6)逆转录：使用逆转录试剂盒对RNA进行逆转录，获得cDNA。

(7)qPCR:配制10μL的qPCR的反应体系，3μl cDNA、5μl 2×SYBR Green Mix、 1μlForward Primer和1μl Reverse Primer，在如下反应条件下进行qPCR实验：

3、流式分选ARP1细胞的侧群与主群细胞后，CCK-8检测重楼皂苷Ⅶ对侧群细胞和主群细胞存活率的影响

(1)当ARP1生长到对数期时，使用流式细胞分选仪分选出侧群和主群细胞

(2)将细胞重悬至15mL离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。

(3)设置不加细胞只有培基的孔板组以及不加药物适当浓度的DMSO对照组，每个浓度设置4个复孔。

(4)分别加入0.5μM、1μM和2μM的重楼皂苷Ⅶ，接种细胞(96孔板中每孔约8× 10³个细胞)于96孔板，每组4个复孔，使之生长24h。

(5)在细胞培养液中直接加入1/10体积的Cell Counting Kit-8(CCK-8)，充分混合，保证孔中颜色均一性，尽量避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。

(6)继续培养3小时至颜色变为橙色，用酶标仪读取450nm光吸收值，计算细胞存活率。

4、流式分选ARP1细胞的侧群与主群细胞后，软琼脂克隆形成实验检测重楼皂苷Ⅶ对侧群细胞和主群细胞克隆形成能力的影响。

(1)当ARP1生长到对数期时，使用流式细胞分选仪分选出侧群和主群细胞。

(2)分别配制质量浓度3.5％，1.66％琼脂糖高压灭菌，放置室温待用。

(3)用微波炉融化步骤1配制的琼脂糖，分别将3.5％和1.66％琼脂糖置于42度和37度水浴锅，同时将含体积百分数20％胎牛血清，体积百分数1％青链霉素的RPMI-1640 培养基置于42度水浴锅。

(4)配制下层胶：将3.5％琼脂糖和培养基按照1：5的比列混合，注意琼脂糖往培养基里面加，混匀时不要产生气泡。混匀后马上将混合液滴加到12孔板里(从孔的中间往下滴)，1毫升/孔，室温静置10分钟。

(5)配制上层胶：将细胞和重楼皂苷Ⅶ按一定密度稀释在培养基里，然后将1.66％琼脂糖和含细胞的培养基按照1：5的比列混合，注意琼脂糖往培养基里面加，混合均匀后将0.5mL混合液滴加到下层胶上，注意不要产生气泡，室温静置5分钟，然后将12孔板转移到细胞培养箱培养。12孔板：3000细胞/孔。

(6)每隔2-3天往孔里滴加一滴新鲜培养基，2-3个星期后拍照，计算克隆形成率。

5、流式检测重楼皂苷Ⅶ对MM患者原代CD138⁺细胞侧群细胞比率的影响

(1)以淋巴细胞分离液分离出MM患者的骨髓单个核细胞。

(2)以CD138磁珠分选出单个核细胞中的CD138⁺细胞。

(3)将CD138⁺原代细胞重悬至15mL离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml 的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。

(4)1500rpm，5min离心收集细胞，每个样的细胞数为5×10⁵

(5)用含体积百分数2％胎牛血清、10mM的HEPES缓冲液、体积百分数1％青链霉素双抗的RPMI-1640培养基将细胞重悬(细胞密度约10⁶个/mL)

(6)将细胞液与5μg/mL的Hoechst 33342在37℃水浴孵育90min(染色完成后，需处于4℃环境)

(7)1500rpm，10min，4℃离心

(8)用含体积百分数2％胎牛血清、10mM HEPES的磷酸缓冲液重悬细胞。

(9)流式检测前加终浓度为2ug/mL的PI，染色5min，流式细胞仪上检测。

实验结果如图2所示，其中，A为流式检测重楼皂苷Ⅶ对ARP1和RPMI-8226细胞侧群细胞比率的影响；B为qPCR检测重楼皂苷Ⅶ对ARP1和RPMI-8226细胞干性基因Oct4、 Nanog、Sox2、Lin28、Klf4的影响；C为流式分选ARP1细胞的侧群与主群细胞后，CCK-8 法检测重楼皂苷Ⅶ对侧群细胞和主群细胞存活率的影响；D为流式分选ARP1细胞的侧群与主群细胞后，软琼脂克隆形成实验检测重楼皂苷Ⅶ对侧群细胞和主群细胞克隆形成能力的影响。NC为对照，PP7即重楼皂苷Ⅶ，V为维拉帕米(Verapamil)，维拉帕米组为阴性对照组。SP为侧群细胞，MP为主群细胞。ns：p＞0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001； E流式检测重楼皂苷Ⅶ对MM患者原代CD138⁺细胞侧群细胞的比率的影响。在ARP1、 RPMI-8226细胞中，重楼皂苷Ⅶ可显著抑制侧群细胞的比率，显著降低干性基因Oct4、 Sox2、Nanog、Lin28和Klf4的表达。且在分选出ARP1细胞的的侧群与主群细胞后，重楼皂苷Ⅶ仍可显著抑制侧群细胞的比率，但在相同浓度下对主群细胞的抑制率远小于侧群细胞，且重楼皂苷Ⅶ在原代细胞种也显著抑制侧群细胞比率，表明重楼皂苷Ⅶ可通过侧群细胞发挥抑制增殖的作用。

实施例3：重楼皂苷Ⅶ抑制MSN蛋白

采用DARTS(药物亲和反应的靶点稳定性法)寻找重楼皂苷Ⅶ的靶标蛋白。并用DARTS法和CETSA(细胞热转变分析)法处理样品后，WB验证MSN蛋白是否为重楼皂苷Ⅶ的靶标蛋白，而后WB检测正常人永生化B淋巴细胞和MM细胞系中MSN表达的差异，WB直接检测重楼皂苷Ⅶ处理ARP1和MM.1S细胞后，MSN蛋白的变化。研究发现小分子药物与蛋白结合后会稳定蛋白构象形态，使其对蛋白酶的水解作用产生抵抗， DARTS法基于此原理而发明。而药物配体也会诱导靶蛋白热稳定，CETSA法基于此原理而发明。

1、DARTS法寻找重楼皂苷Ⅶ的靶标蛋白

(1)收集2×10⁷个处于生长对数期的MM.1S细胞。用补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的适当体积的M-PER裂解细胞，室温5min裂解。

(2)4℃，13800rpm，离心15分钟。将上清液转移至含有10×TNC缓冲液(500mMTris-HCl(pH8.0)，500mM NaCl，100mM CaCl ₂)的新管中。BCA法测蛋白浓度。

(3)将溶解物在数个EP管中等分。加入适宜浓度的药物或等体积的溶剂。25℃，水浴孵育60min。

(4)孵育的样品用不同浓度的pronase(链霉蛋白酶)进行蛋白水解，25℃，水浴孵育 30min。

(5)加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，加入等量2×loading buffer，95℃、10min煮蛋白后，上样。

(6)SDS-PAGE电泳，剩余样品-80℃保存。

(7)考马斯亮蓝R250染色或银染，用脱色液进行脱色，脱色完成后拍照。

2、DARTS法处理样品后，WB检测MSN蛋白的变化

(1)DARTS法处理样品，同上述方法

(2)提细胞总蛋白：收集细胞，800rpm，4℃离心5min。加入一定量含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的RIRA裂解液，充分混匀细胞和细胞裂解液，冰浴30min。超声20次。4℃，13800rpm，离心15min，收集上清液。

(3)BCA法测定蛋白质浓度

(4)Western Blot分离蛋白质：将蛋白样品煮沸变性5分钟，用质量浓度 10％SDS-PAGE分离后用NC膜转膜，再用封闭液(PBST溶液配制的体积百分数5％的脱脂牛奶)室温封闭2小时。加入一抗孵育10-12小时，PBST洗3次，用封闭液稀释的二抗室温孵育2小时，PBST洗3次；

(5)用ECL显影，凝胶成像系统检测蛋白质MSN的表达变化。

3、CETSA(细胞热转变分析)法处理样品后，WB检测MSN蛋白的变化

(1)在4个培养皿中均匀铺ARP1细胞，用1、2、4μM PolyphyllinⅦ或等量灭菌水培养，分别在37℃下保持2h。

(2)PBS洗涤后，细胞重新悬浮在500μl PBS中，PBS中含有新添加的蛋白酶抑制剂，并平均分为10管。每管中的细胞在指定温度(41、44、47、50、53、56、59、62、 65、68℃)下加热3分钟，并在室温(25℃)下保持3分钟。

(3)在液氮中冷冻(1分钟)和在室温下在水中解冻(1分钟)，使加热的细胞溶解。

(4)细胞溶解物在20000g在4℃条件下离心20分钟，分离出可溶性部分用于免疫印迹分析。

(5)Western Blot分离蛋白质，用ECL显影，同上述方法。

4、WB检测正常人永生化B淋巴细胞和MM细胞系中MSN表达的差异

(1)收集2×10⁶个处于生长对数期的MM.1S、MM.1R(来自中南大学肿瘤研究所周文教授)、KMS11、ARP1、RPMI-8226、ANBL6、U266(来自中南大学肿瘤研究所周文教授)和人永生化B淋巴细胞。

(2)用RIRA提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，Western Blot分离蛋白质，用ECL显影，同上述方法。

5、WB检测重楼皂苷Ⅶ处理ARP1和MM.1S细胞后，MSN蛋白的变化

(1)处于生长对数期的ARP1和MM.1S细胞，用0.5、1μM重楼皂苷Ⅶ或灭菌水处理，分别在培养箱中培养24h。

(2)收集2×10⁶个ARP1和MM.1S细胞，用RIRA提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，Western Blot分离蛋白质，用ECL显影，同上述方法

实验结果如图3所示，其中，A为DARTS(药物亲和反应的靶点稳定性法)寻找重楼皂苷Ⅶ的靶标蛋白。pronase为链霉蛋白酶，蛋白酶：总蛋白表示二者的蛋白质量比；B为DARTS法处理样品后，WB检测MSN蛋白的变化；C为CETSA(细胞热转变分析)法处理样品后，WB检测MSN蛋白的变化；D为WB检测正常人永生化B淋巴细胞和MM细胞系中MSN表达的差异，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参；E为WB检测重楼皂苷Ⅶ处理ARP1和MM.1S细胞后，MSN蛋白的变化。MM.1R、U266均为MM细胞系。β-actin为β肌动蛋白，作为内参。

用DARTS法处理样品后进行了考马斯亮蓝染色，成功找到了重楼皂苷Ⅶ的特异差异条带，将此条带进行质谱分析，发现了MSN蛋白。通过DARTS法处理样品后进行WB 验证，发现有重楼皂苷Ⅶ存在的情况下，MSN蛋白被链霉蛋白酶降解的更少，说明MSN 蛋白受到重楼皂苷Ⅶ的保护。同样地，通过CETSA法处理样品后进行WB验证，同样发现在温度升高的情况下，有重楼皂苷Ⅶ存在的情况下，MSN蛋白的降解速率明显小于对照组。以上两个实验说明MSN的确是重楼皂苷Ⅶ直接结合的蛋白。WB检测正常人永生化B 淋巴细胞和MM细胞系中MSN表达的差异后，发现在MM细胞系中MSN为高表达，而重楼皂苷Ⅶ处理后，ARP1和MM.1S细胞MSN蛋白水平上的表达显著受到抑制。综上， MSN蛋白为重楼皂苷Ⅶ的靶标蛋白，重楼皂苷Ⅶ直接抑制MSN蛋白。

实施例4：沉默MSN的表达抑制MM细胞的生长和侧群细胞的比率

采用shRNA降低MSN的表达后，WB检测ARP1细胞中MSN在蛋白水平上的变化，细胞计数检测ARP1细胞生长的变化，流式检测ARP1细胞侧群比率的变化。

实验步骤如下：

1、加入MSN的shRNA干扰后，WB检测ARP1细胞中MSN在蛋白水平上的变化。

(1)干扰MSN表达:将培养皿中处于对数期的细胞吹打混匀，分别取0.5ml的细胞悬液至六孔板的四个孔中，分别标记为Scramble组(对照组)和sh1、sh2组(敲低组)，在敲低组加入shRNA，并设置副孔一个。在六孔板中的加了细胞的孔分别加入1640培养基1.5ml，培养24h。

(2)换液，每孔加入2mL完全培养基培养。

(3)提细胞总蛋白，与上述方法相同

(4)BCA法测定蛋白质浓度，与上述方法相同

(5)Western Blot分离蛋白质，与上述方法相同

(6)用ECL显影，与上述方法相同。

2、加入shRNA降低MSN的表达后，细胞计数检测ARP1细胞生长的变化

(1)干扰MSN表达，与上述方法相同

(2)将细胞重悬至15mL离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。

(3)在96孔板中加入3000个细胞，分别培养1、3、5、7天，每隔两天计数一次，绘制生长曲线。

3、加入shRNA降低MSN的表达后，流式检测侧群细胞比率的变化

(1)干扰MSN表达，与上述方法相同

(2)流式检测SP，与上述方法相同。

实验结果如图4所示，其中，A为加入MSN的shRNA干扰后，WB检测ARP1细胞中MSN在蛋白水平上的变化。GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参；B为加入MSN 的shRNA干扰后，细胞计数检测ARP1细胞生长的变化；C为加入MSN的shRNA干扰后，流式检测ARP1细胞SP比率的变化。Scramble:shRNA的对照序列，*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001。干扰MSN的表达后，MSN在蛋白水平上的表达显著下降，MM细胞的生长受到明显抑制，侧群细胞比率明显下降。敲低MSN后，抑制MM细胞的生长和干细胞样细胞的比率。

实施例5：过表达MSN后促进MM细胞的生长和提高侧群细胞比率

加入MSN的过表达慢病毒载体，使MSN表达升高，而后WB检测ARP1细胞中MSN 在蛋白水平上的变化，细胞计数检测ARP1细胞生长的变化，流式检测ARP1细胞侧群细胞比率的变化。

实验步骤如下：

1、加入MSN的过表达慢病毒载体后，WB检测ARP1细胞中MSN在蛋白水平上的变化。

(1)过表达MSN：将培养皿中处于对数期的细胞吹打混匀，分别取0.5ml的细胞悬液至六孔板的四个孔中，分别标记为EV组(空载对照组)和OE MSN组(过表达组)，在空载对照组加入空载慢病毒载体，在过表达组加入过表达慢病毒载体，并设置副孔一个。在六孔板中的加了细胞的孔分别加入1640培养基0.5ml，培养12h。

(2)收集细胞，800rpm，4℃离心5min。弃上清，加入3mL培养基重悬细胞，加入六孔板中继续培养48h。

(3)提细胞总蛋白，与上述方法相同

(4)BCA法测定蛋白质浓度，与上述方法相同

(5)Western Blot分离蛋白质，与上述方法相同

(6)用ECL显影，与上述方法相同。

2、加入MSN的过表达慢病毒载体后，细胞计数检测ARP1细胞生长的变化

(1)过表达MSN，与上述方法相同

(2)将细胞重悬至15mL离心管之中，并吹散混匀。细胞稀释10倍于1.5ml的离心管中，通过使用细胞计数板算出细胞密度。

(3)在96孔板中加入3000个细胞，分别培养1、3、5、7天，每隔两天计数一次，绘制生长曲线。

3、加入MSN的过表达慢病毒载体后，流式检测ARP1细胞侧群细胞比率的变化。

(1)过表达MSN，同上述方法

(2)流式检测SP，同上述方法。

4、加入MSN的过表达慢病毒载体后，WB检测MM患者原代CD138⁺细胞中MSN 在蛋白水平上的变化。同上述方法。

5、加入MSN的过表达慢病毒载体后，细胞计数检测MM患者原代CD138⁺细胞生长的变化。同上述方法。

实验结果如图5所示，其中，A为加入MSN的过表达慢病毒载体后，WB检测ARP1 细胞中MSN在蛋白水平上的变化。GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参；B为加入 MSN的过表达慢病毒载体后，细胞计数检测ARP1细胞生长的变化；C为加入MSN的过表达慢病毒载体后，流式检测ARP1细胞侧群细胞比率的变化；D为加入MSN的过表达慢病毒载体后，WB检测MM患者原代CD138⁺细胞中MSN在蛋白水平上的变化。GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参；E为加入MSN的过表达慢病毒载体后，CCK-8检测 MM患者原代CD138⁺细胞存活率的变化。EV为慢病毒空载体，OE-MSN为过表达MSN 后的慢病毒载体，维拉帕米(Verapamil)组为阴性对照组，**p<0.01。ARP1细胞和MM 患者原代CD138⁺细胞中过表达MSN后，MSN在蛋白水平上的表达显著上升，MM细胞的生长能力明显增强，SP比率明显上升。过表达MSN后促进MM细胞的生长和提高侧群细胞的比率。

实施例6：重楼皂苷Ⅶ抑制ANBL6-BR细胞成瘤

(1)用1640培基收集ANBL6-BR细胞，调整为200μl含3×10⁶个ANBL6-BR细胞的细胞液。

(2)选择5-8周龄的8只NCG小鼠，体重在18-22g之间。在1.5mL离心管中将细胞混匀，用1mL注射器吸入100μl细胞液，将其接种于NCG小鼠的右侧腋窝中后部的皮下部位。

(3)当可测量肿瘤时(即第14天)，将8只NCG小鼠随机分为两组。

(4)第14天时，治疗包括腹腔注射媒介物(对照组)或重楼皂苷Ⅶ(10mg/kg/2天)。每2天记录1次每只小鼠的肿瘤体积和体重。

(5)连续治疗16天(共8次)，到第28天对照组小鼠的肿瘤非常显著时，对小鼠实施安乐死。绘制小鼠肿瘤体积和体重变化曲线，对离体肿瘤进行拍照，记录肿瘤离体体积和离体体重。

(6)取小鼠肿瘤进行不断研磨，通过细胞滤网后收集细胞，提取蛋白，进行WesternBlot，方法如前所述。

(7)取小鼠肿瘤新鲜组织，进行免疫组化

1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-二甲苯III15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-体积百分数85％酒精5min-体积百分数75％酒精5min-蒸馏水洗。

2)抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火10min至沸，停火5min保温，中低火5min，停火2min保温再转中低火5min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS (PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3)阻断内源性过氧化物酶：切片放入体积百分数3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4)血清封闭:在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)

5)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

6)加二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。

7)DAB显色：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8)复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。

9)脱水封片：将切片依次放入体积百分数75％酒精5min-体积百分数85％酒精5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

10)显微镜镜检，图像采集分析。

实验结果如图6所示，其中，A为取出小鼠皮下的肿瘤后，用照相机拍照；B为小鼠肿瘤体积生长曲线；C为小鼠体重变化曲线；D为小鼠肿瘤离体体积；E为小鼠肿瘤离体体重；F为免疫组化检测Ki67；G为免疫组化检测MSN ANBL6-BR细胞为MM细胞株 ANBL6的硼替佐米(BTZ)耐药细胞株。重楼皂苷Ⅶ治疗后的小鼠，其肿瘤体积显著小于对照组，且重楼皂苷Ⅶ治疗后的小鼠的肿瘤体积增长速率明显低于对照组，另外，重楼皂苷Ⅶ治疗后的小鼠肿瘤瘤体体积、瘤体体重以及Ki67的染色程度皆显著小于对照组，表明重楼皂苷Ⅶ可以显著抑制ANBL6-BR细胞的成瘤。此外，重楼皂苷Ⅶ治疗后的小鼠，其体重在治疗过程中没有明显变化，表明重楼皂苷Ⅶ对小鼠没有明显的副作用。并且免疫组化结果显示重楼皂苷Ⅶ治疗后的小鼠肿瘤组织MSN的染色程度显著低于对照组，表明 MSN蛋白在重楼皂苷Ⅶ治疗后显著下降。以上结果表明重楼皂苷Ⅶ在体内和体外都能克服 MM的BTZ耐药，且可显著抑制MSN蛋白的表达。

实施例7：重楼皂苷Ⅶ或敲低MSN抑制ARP1细胞成瘤

(1)用1640培基收集带荧光素酶的ARP1细胞和带荧光素酶的敲低MSN后的ARP1 细胞，调整为200μl含1×10⁶个ARP1细胞的细胞液。

(2)选择5-8周龄的20只NCG小鼠，体重在18-22g之间。在1.5mL离心管中将细胞混匀，用1mL注射器吸入100μl细胞液，将其接种于NCG小鼠的右侧腋窝中后部的皮下部位。

(3)当可测量肿瘤时(即第21天)，将20只NCG小鼠随机分为4组。

(4)第21天时，治疗包括腹腔注射媒介物(对照组)或重楼皂苷Ⅶ(5mg/kg/天)。每天记录1次每只小鼠的肿瘤体积和体重。

(5)连续治疗8天(共8次)，到第30天对照组小鼠的肿瘤非常显著时，每只小鼠腹腔注射入100mg/kg的D-荧光素，5min后利用小动物成像仪对小鼠进行拍照，5min-20min 的时间段内，每分钟拍照一张。

(6)对小鼠实施安乐死。绘制小鼠肿瘤体积和体重变化曲线，对离体肿瘤进行拍照，记录肿瘤离体重量。

实验结果如图7所示，其中，A为每只小鼠腹腔注射入100mg/kg D-荧光素后，利用小动物成像仪进行拍照；B为取出小鼠皮下的肿瘤后，用照相机拍照；C为小鼠肿瘤体积生长曲线；D为小鼠体重变化曲线；E为小鼠肿瘤离体体重。重楼皂苷Ⅶ治疗或敲低MSN 后的小鼠，其肿瘤体积和荧光成像的程度显著小于对照组，且重楼皂苷Ⅶ治疗或敲低MSN 后的小鼠的肿瘤体积增长速率明显低于对照组，另外，重楼皂苷Ⅶ治疗或敲低MSN后的小鼠肿瘤重量皆显著小于对照组，表明重楼皂苷Ⅶ或敲低MSN可以显著抑制ARP1细胞的成瘤。此外，重楼皂苷Ⅶ治疗或敲低MSN后的小鼠，其体重在治疗过程中没有明显变化，表明重楼皂苷Ⅶ或敲低MSN对小鼠没有明显的副作用。以上结果表明重楼皂苷Ⅶ或敲低MSN在体内和体外都能显著抑制MM的发展。并且与敲低MSN组的小鼠相比，敲低MSN后再加入重楼皂苷Ⅶ组的小鼠，其肿瘤体积、荧光成像的程度、肿瘤体积增长速率以及小鼠肿瘤重量都没有显著性差别，这表明在敲低MSN的情况下，重楼皂苷Ⅶ几乎没有发挥药效，这证明在体内实验中重楼皂苷Ⅶ也是通过靶向MSN而发挥作用的。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (2)

1.重楼皂苷Ⅶ在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，其中，重楼皂苷Ⅶ为PolyphyllinⅦ。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，重楼皂苷Ⅶ在制备治疗复发/难治性多发性骨髓瘤药物中的用途。

Images