CN110499290B - 一株人尤文肉瘤细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株人尤文肉瘤细胞系，命名为人耐药尤文肉瘤细胞SGH‑01，于2018年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2018222。所述的细胞系的供体为临床耐药尤文肉瘤患者，该细胞系具有阿霉素耐药性、裸鼠皮下成瘤能力、胫骨原位成瘤能力，裸鼠胫骨原位瘤具有肺转移能力。该细胞系可成为研究者深入开展尤文肉瘤耐药、转移机理及寻找/评价治疗方案的实验素材。

Description

一株人尤文肉瘤细胞系

技术领域

本发明涉及一种细胞系，具体涉及一株人尤文肉瘤细胞系。

背景技术

尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma，ES)是小圆形细胞的低分化的恶性肿瘤，它占所有原发性骨肿瘤的6％～8％，是儿童和青少年最常见的恶性原发性骨肿瘤。男女比例约为(2.0-2.5)：1，全身骨骼均可发病，但以四肢长骨多见，如：股骨、肱骨、胫骨，其次为扁平骨，如：肩胛骨。临床表现为年轻患者的患处出现巨大的软组织包块，多伴有疼痛和肿胀，还常出现发热、贫血和体重减轻等症状。肺是最常见的转移部位，其次是其他部位的骨，大多患者在就诊时就有可能已经存在微转移。

尤文肉瘤恶性程度高，病程短，转移快。化疗目前认为对尤文肉瘤有效的药物有环磷酰胺、阿霉素、更生霉素、长春新碱、卡氮芥等。

阿霉素英文名称为adriamycin，可抑制RNA和DNA的合成，抗瘤谱较广、作用强，是尤文肉瘤一线化疗中最常用的药物。

尤文肉瘤一旦一线化疗方案耐药，其他方案也很难有好的治疗效果，目前还没有耐药尤文肉瘤细胞系。因此由具有耐药性的临床患者的肿瘤组织分离培养得到的耐药细胞系，对研究尤文肉瘤耐药机制及寻找治疗方案具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种人尤文肉瘤细胞系，该细胞系具有阿霉素耐药性，并且裸鼠皮下及胫骨原位成瘤能力稳定，裸鼠胫骨原位瘤具有肺转移能力。

为了达到上述目的，本发明提供了一株人尤文肉瘤细胞系，命名为人耐药尤文肉瘤细胞SGH-01，保藏编号为CCTCC NO:C2018222，于2018年10月18日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

所述的细胞系的供体来源为临床耐药尤文肉瘤患者。

所述的细胞系具有阿霉素耐药性。

所述的细胞系具有裸鼠皮下成瘤能力。

所述的细胞系具有胫骨原位成瘤能力。

所述的细胞系形成的裸鼠胫骨原位瘤具有肺转移能力。

所述的细胞系具有在琼脂中克隆成球的能力。

所述的细胞系能够被慢病毒转染，能够进行基因修饰。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的细胞系供体为临床耐药尤文肉瘤患者，且该细胞系体外证实具有阿霉素耐药性。

(2)本发明提供的细胞系裸鼠皮下及胫骨原位成瘤能力稳定。

(3)本发明提供的细胞系裸鼠胫骨原位瘤具有肺转移能力。

附图说明

图1为SGH-01的传代培养细胞系在光镜下的细胞形态。

图2为SGH-01的传代培养细胞系经结晶紫染色后在光镜下的细胞形态。

图3为SGH-01稳定转染带GFP标签慢病毒后的显微照片。

图4为SGH-01在琼脂中成球生长的照片。

图5为阿霉素对尤文肉瘤细胞系TC71和SGH-01的抑制率曲线图。

图6为接种SGH-01细胞后皮下成瘤的裸鼠及瘤体照片，其中，图6的A为成瘤的裸鼠的照片，图6的B为自成瘤的裸鼠取下的瘤体照片。

图7为接种SGH-01细胞后的肿瘤生长曲线图。

图8为接种SGH-01并经裸鼠皮下移植后获得的肿瘤组织、临床患者肿瘤组织及PDX肿瘤组织的HE染色的切片的显微镜拍照结果图，其中，图(A)和(A’)为临床患者肿瘤组织的拍照结果，图(B)和(B’)为PDX肿瘤组织的拍照结果，图(C)和(C’)分别为接种SGH-01并经裸鼠皮下移植后获得的肿瘤组织的拍照结果。

图9a为裸鼠胫骨原位成瘤大体图片；图9b为肺转移灶在体图片；图9c为肺转移灶HE染色的显微镜拍照结果。

具体实施方式

以下对本发明提供的细胞株作进一步说明。

本发明提供的人耐药尤文肉瘤细胞SGH-01，以下简写为SGH-01。

一、细胞系的建立

样本来源于一例男性9岁骨盆尤文肉瘤患者，术前经13个周期VAC/IE化疗方案。手术切除新鲜标本接种至BALB/C裸鼠，建立病人来源异种移植瘤(Patient derivedxenograft,PDX)模型。PDX传至第二代时取出肿瘤组织，利用组织贴壁法培养原代细胞，待细胞长至80％左右融合度时胰酶消化法传代培养，待细胞传至15代以后进行后续鉴定及其他实验。

细胞系含少量鼠源基质细胞，培养基：RPMI-1640+10％FBS+1％PS，培养条件：5％CO₂、饱和湿度、37℃培养。

二、细胞系形态观察

1.传代培养细胞系在不同生长密度时显微镜观察细胞形态并拍照。细胞形态如图1所示。图1的(A)、(B)、(C)分别为细胞在不同密度下100×光镜的拍摄结果。(A)、(B)、(C)相应的细胞密度逐渐增加。图1的(A’)、(B’)、(C’)分别为细胞在不同密度下200×光镜的拍摄结果。图1为细胞传代培养至第15代，贴壁生长时不同生长密度下肿瘤细胞形态，肿瘤细胞呈不规则椭圆或多边形，细胞较小，密度较高的地方细胞呈现透亮样，未出现老化现象；而夹杂在其中的少量成纤维细胞呈细长的纺锤形或铺展很开的多边形。

2.传代培养细胞系经结晶紫染色后在显微镜观察细胞形态并拍照。细胞形态如图2所示。图2的(A)、(B)、(C)分别为细胞在不同密度下100×光镜的拍摄结果。(A)、(B)、(C)相应的细胞密度逐渐增加。图2的(A’)、(B’)、(C’)分别为细胞在不同密度下200×光镜的拍摄结果。图2为细胞传代培养至第15代，贴壁生长时不同生长密度下肿瘤细胞形态，细胞经结晶紫染色后，肿瘤细胞较小，呈紫色深染；而夹杂在其中的少量成纤维细胞铺展较开，核相对较少，呈淡紫色浅染。

三、GFP慢病毒转染

传代培养细胞系转染带GFP标签的慢病毒，检测细胞病毒易感性。实验步骤如下：

1.慢病毒包装及收集

(1)6孔板培养293T细胞至60％融合度，换无血清无双抗培养基；

(2)用

2000预孵育构建好的病毒质粒及pGMLV-SC1病毒辅助质粒约5分钟，加入无血清无双抗培养的293T细胞中，6小时后更换新鲜无血清无双抗培养基；

(3)12小时后更换新鲜含血清无双抗培养基促进病毒扩增，在荧光显微镜下可见293T细胞发出绿色荧光；

(4)48小时和72小时各搜集一次培养上清，用22μm过滤器滤除细胞碎片，搜集的滤液即为病毒液，直接使用或保存于4℃短期内使用或-80℃长期保存。

2.GFP慢病毒转染细胞

(1)GFP慢病毒转染细胞：

a.6孔板培养本发明的SGH-01细胞；

b.待细胞生长旺盛，长至50％融合度时，更换无血清无双抗培养基处理6小时；

c.去除培养基，加入搜集过滤好的病毒液原液，或用培养基1:1稀释；

d.24小时后更换新鲜含血清和双抗的培养基继续培养；

e.48小时后在荧光显微镜下可见细胞内明显绿色荧光，说明病毒转染成功；

(2)稳定转染细胞株的筛选：

a.将上述成功转染的骨肉瘤细胞株传代至多个6孔板中，加入浓度梯度的嘌呤霉素(Puromycin)筛选，

b.48小时后挑选荧光显微镜下全部细胞均有较强荧光的孔进行传代培养拍照。

图3为SGH-01细胞感染病毒后，在显微镜下的拍摄结果。图3的(A)为光镜下相差模式拍摄，图3的(B)为显微镜FITC通道下拍摄，可见明亮荧光。将图3的(A)和图3的(B)融合，得到图3的(C)。结果证明病毒成功转染SGH-01细胞，说明本发明提供的人耐药尤文肉瘤细胞SGH-01易于被慢病毒转染，具有较好的基因修饰潜力及用途。

四、3D琼脂成球实验

传代培养SGH-01细胞系接种至软琼脂中培养，观察其成球能力。实验步骤如下：

(1)用干粉配制2×的RPMI1640培养基，含20％FBS(胎牛血清)，2％PS(青霉素、链霉素)；

(2)用低熔点琼脂和蒸馏水配制1.4％与0.6％琼脂溶液，高温蒸汽灭菌使其溶解；

(3)在6孔板中铺入0.7％琼脂下层胶：40℃时将1.4％溶解琼脂溶液1:1加入2×RPMI1640培养基，充分混匀后铺入6孔板，室温下水平静置使其凝固，注意保持无菌；

(4)体外培养SGH-01，待细胞长至对数生长期，消化细胞成单细胞，2×RPMI1640培养基重悬，计数后以2000cells每孔与0.6％琼脂混合，均匀铺于6孔板中，细胞终浓度为1000cells每孔，凝固后即为上层胶，细胞均匀悬浮于上层胶中；

(5)将铺好细胞和上、下层琼脂凝胶的6孔板放于细胞培养箱中培养，注意保持环境湿度，14天后观察单细胞克隆成球，于显微镜下拍照。

3D琼脂成球实验结果如图4所示。图4的(A)、(B)、(C)分别为100×、200×、400×的拍摄结果。由图4可知，SGH-01细胞具有在琼脂中克隆成球的能力，说明SGH-01细胞具有肿瘤恶性生长特性。

五、体外耐药性检测

阿霉素为尤文肉瘤最常用的一线化疗药，我们采用CCK-8对比阿霉素对尤文肉瘤细胞系TC71与SGH-01的抑制率。

实验步骤如下：

(1)体外培养人尤文肉瘤细胞系TC71和SGH-01，待细胞长至对数生长期，消化细胞成单细胞悬液，计数后用完全培养基配制成5×10⁴cells/ml细胞悬液；

(2)96孔板以每孔100μl细胞悬液铺板，培养过夜后加入预定浓度的待测药物，待测药物为阿霉素，继续培养72小时后加入CCK-8试剂孵育2小时；

(3)检测OD450，并根据吸光值应用Graph Pad7.0软件计算IC50及95％可信区间。

实验结果如图5和表1所示。阿霉素对尤文肉瘤细胞系TC71的IC50为151.1nM，而对SGH-01的IC50为1241.2nM，较TC71高约8.2倍，显示出明显的耐药性。

表1阿霉素对尤文肉瘤细胞系TC71和SGH-01的半数抑制率

六、裸鼠皮下移植瘤模型的建立及组织形态学鉴定

1.裸鼠皮下移植瘤模型的建立的实验步骤如下：

(1)体外培养细胞SGH-01，待细胞长至对数生长期，消化细胞成单细胞悬液，预冷PBS洗涤3次，计数后用无菌生理盐水配制成1×10⁷cells/ml细胞悬液；

(2)用1ml注射器接种100μl于裸鼠皮下，定期记录小鼠体重，约8天后肿瘤包块长大，定期用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积，计算公式如下：

V＝1/2ab²

其中V为肿瘤体积(mm³)；a为肿瘤长径，b为肿瘤短径(mm)；

(3)待有肿瘤长径接近20mm时，终止实验，安乐死实验小鼠，取出皮下肿瘤用福尔马林固定；

(4)根据计算肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。

裸鼠及瘤体的图片请参阅图6，图6的A为成瘤的裸鼠的照片，图6的B为自成瘤的裸鼠取下的瘤体照片。图7为肿瘤生长曲线。1×10⁶个SGH-01细胞接种至裸鼠皮下，6个接种点均长出实质性肿瘤，且30天后肿瘤体积均超过1000mm³，证明SGH-01在裸鼠体内有很好的成瘤能力。另一方面，实验终点时，除一个肿瘤体积在1321mm³，其余5个肿瘤体积均在2400mm³～3400mm³之间，其体积差异较小，说明其在小鼠体内肿瘤生长稳定。因此，SGH-01具有很好的裸鼠体内成瘤能力，且其生长较为稳定，可应用于小鼠体内研究。

2.将体外培养SGH-01并经裸鼠皮下移植后获得的肿瘤组织切片进行HE染色，与临床患者肿瘤组织及PDX肿瘤组织的HE染色进行组织形态学对比。PDX肿瘤组织是病人来源异种移植瘤(Patient derived xenograft,PDX)，即将病人的肿瘤组织以组织的形式移植至小鼠后获得，很好的保持了肿瘤的异质性。免疫组织化学染色步骤如下：

2.1免疫组织化学染色

2.1.1组织固定脱水包埋及切片

a.将肿瘤组织在10％福尔马林溶液中常温固定过夜，或-4℃保存；

b.采用梯度脱水法脱水至蜡：75％乙醇1h，85％乙醇1h，95％乙醇1h，100％乙醇1h×2次，二甲苯1h×2次，浸蜡>2h；

c.于预加热的包埋仪上按实验所需切面包埋组织于蜡块中，置于冰上冷却。

d.-8℃预冷蜡块，用莱卡组织切片仪切成4μm厚切片，43℃热水中展片至完全平整，防脱切片捞片后于60℃烘箱拷片>2h。

2.1.2切片脱蜡及抗体修复

a.60℃预热切片按梯度脱蜡至水：二甲苯10min×2次，100％乙醇5min×2次，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，PBS 5min×3次；

b.将脱水好切片浸于0.01M枸橼酸缓冲液，微波高火加热至沸腾，关闭微波，冷却5min，如此反复3次进行抗原修复，最后连同枸橼酸缓冲液一起自然冷却至室温，PBS洗涤5min×3次。

2.1.3抗体孵育及DAB显色

a.向切片组织部分滴加5％BSA，室温封闭30min；

b.用5％BSA配制一抗，甩去封闭液后一抗4℃孵育过夜；

c.PBS洗涤5min×3次；

d.孵育代HRP标记的相应二抗，37℃2小时；

e.PBS洗涤5min×3次；

f.滴加配制好的DAB显色液，镜下观察显色反应，流水冲洗停止显色；

g.甩去残留液体，滴加苏木精复染，盐酸酒精分化，用流水浸泡30min反蓝；

h.按梯度脱水至二甲苯：75％乙醇5min，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇5min×2次，二甲苯10min×2次；

i.中性树脂封片保存。

2.1.4切片拍照及分析

a.用莱卡倒置拍照显微镜观察切片，100×、400×拍取肿瘤组织。

图8为免疫组织化学染色结果，其中图(A)和(A’)分别为临床患者肿瘤组织在100×及400×条件下显微镜拍照结果，图(B)和(B’)分别为PDX肿瘤组织在100×及400×条件下显微镜拍照结果，图(C)和(C’)分别为体外培养细胞SGH-01并经裸鼠皮下移植后获得的肿瘤组织在100×及400×条件下显微镜拍照结果。由图8可见三组切片肿瘤细胞均呈小圆形，核质比大，核分裂象明显，且肿瘤组织与间质成分之间无明显分界线，说明该肿瘤侵袭性可能较强。

七、骨原位肺转移模型的建立

实验步骤如下：

(1)体外培养细胞SGH-01，待细胞长至对数生长期，消化细胞成单细胞悬液，预冷PBS洗涤3次，计数后用无菌生理盐水配制成1×10⁸cells/ml细胞悬液；

(2)用微量注射器接种10μl于小鼠胫骨髓腔内，定期记录小鼠体重；

(3)待有肿瘤最长径接近20mm或小鼠出现死亡时，终止实验，安乐死实验小鼠，取出小鼠荷瘤大腿，称重；取出小鼠肺器官，计数表面肺转移结节，用福尔马林固定上述组织。

结果如图9a至图9c所示。图9a为裸鼠胫骨原位成瘤大体图片，可见裸鼠右腿有明显肿块。图9b为肺转移灶在体图片，如箭头所示，肺表面可见转移小结节。图9c为肺转移灶HE染色，可见肺组织中一团块样小结节，细胞核深染且高度聚集，为肿瘤肺转移灶。结果可以说明SGH-1细胞可在裸鼠胫骨原位成瘤，且会发生肺转移。

八、STR(短串联重复序列)基因型检测

委托上海翼和应用生物技术有限公司进行检测。检测方法：用Axygen的基因组抽提试剂盒提取DNA，采用21-STR扩增方案扩增，在ABI 3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。

STR基因型检测SGH-01细胞与临床患者供体白细胞的同源性，结果显示匹配度99％，为同一来源。

九、FISH检测

荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization)，简称FISH。利用SGH-01裸鼠皮下肿瘤组织与临床患者组织切片，FISH检测EWSR1基因断裂情况。

EWSR1基因全名为尤文肉瘤断裂区域1基因(Ewing sarcoma breakpointregion1gene)。最早在尤文肉瘤中发现，位于22q12，由17个外显子组成，编码含656个氨基酸的核蛋白。约95％的尤文肉瘤存在此基因的断裂融合，形成的融合基因表达嵌合蛋白可调控其他致癌基因的表达，成为肿瘤发生、发展的基础。

本检测由上海阿克曼医学检验所进行，送检患者肿瘤组织石蜡切片和细胞系建立裸鼠肿瘤组织的石蜡切片。

实验步骤如下：

1.脱蜡

(1)二甲苯脱蜡3×5min；

(2)无水乙醇2×3min；

(3)移除酒精，斜置切片，空气干燥。

2.蛋白酶处理

(1)加入蛋白酶K消化液37℃孵育20min；

(2)×SSC在室温下漂洗3×1min；

(3)立即置入-20℃预冷梯度酒精脱水晾干。

3.探针溶解变性及预杂交

(1)探针加入5μl预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0)，短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA；

(2)再加入预热至37℃的Master Mix 5μl，短时离心后在37℃振荡15～30min；

(3)短时离心后于80℃水浴中变性探针10min，冰浴5分钟；短时离心；

(4)于37℃水浴中预杂交30～60min；

4.探针杂交

(1)将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，封片后置于湿盒中，37℃杂交过夜；

(2)小心揭去封片胶和盖玻片，将玻片置于预热至46℃的50％甲酰胺/2×SSC中，5min×3缸；将玻片移入室温下4×SSC/0.1％Tween-20中振荡洗涤5min×2缸；

(3)每张玻片滴加30μl阻断液，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育30min；再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1％Tween-20中振荡洗涤5min×2缸；

(4)滴加一抗，将4μl Anti-DIG monoclonal antibody和0.5μl Texas

Avidin稀释于100μl抗体稀释液中，混匀；每张玻片滴加25μl于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育1小时；室温下4×SSC/0.1％Tween-20中振荡洗涤5min×2缸；

(5)滴加二抗，将4μl Anti-mouse-Ig-DIG和1μl Biotinylated goatanti-Avidin稀释于100μl抗体稀释液中，混匀；每张玻片滴加25μl于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育40min；室温下4×SSC/0.1％Tween-20中振荡洗涤5min×2缸；

(6)滴加三抗，将4μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5μl Texas-red-Avidin稀释于100μl抗体稀释液1中，混匀；每张玻片滴加25μl于杂交区域，盖上22mm×22mm盖玻片，于37℃湿盒中孵育30min；室温下4×SSC/0.1％Tween-20中振荡洗涤5min×2缸；

5.核复染和抗荧光淬灭剂封片

(1)将1.25μl 5mg/ml的DAPI加入50ml 2×SSC中(终浓度为125ng/ml，避光保存于4℃)，混匀；将玻片置于其中，避光复染2min；

(2)2×SSC中洗涤5min；梯度乙醇脱水晾干；

(3)每张玻片滴加10μl抗荧光淬灭剂封片，盖上22mm×22mm盖玻片，-20℃避光保存；

6.荧光显微镜检测FISH杂交信号、拍照

以荧光显微镜观察，在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察细胞的荧光杂交信号，计数细胞和采集图像。

7.结果判读

(1)计数100个细胞，典型异常细胞数/总计数细胞数≥20％为阳性结果(2)正常细胞：两个融合信号(黄色)。

(3)典型异常细胞：一个融合信号(黄色)和一个红色信号、一个绿色信号。

结果：FISH检测SGH-01裸鼠皮下肿瘤组织与临床患者EWSR1基因断裂，供体患者肿瘤组织EWSR1基因断裂分离信号百分比65％，结果为阳性；SGH-01裸鼠皮下肿瘤组织EWSR1基因断裂分离信号百分比43％，结果为阳性。

综上所述，本发明提供的人耐药尤文肉瘤细胞SGH-01供体为临床耐药尤文肉瘤患者，且该细胞系体外证实具有阿霉素耐药性，裸鼠皮下及胫骨原位成瘤稳定，裸鼠胫骨原位瘤具有肺转移能力，可成为研究者深入开展尤文肉瘤耐药、转移机理及寻找/评价治疗方案的实验素材。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (8)

1.一株人尤文肉瘤细胞系，其特征在于，命名为人耐药尤文肉瘤细胞SGH-01，保藏编号为CCTCC NO:C2018222。

2.根据权利要求1所述的人尤文肉瘤细胞系，其特征在于，所述的细胞系的供体来源为临床耐药尤文肉瘤患者。

3.根据权利要求1所述的人尤文肉瘤细胞系，其特征在于，所述的细胞系具有阿霉素耐药性。

4.根据权利要求1所述的人尤文肉瘤细胞系，其特征在于，所述的细胞系具有裸鼠皮下成瘤能力。

5.根据权利要求1所述的人尤文肉瘤细胞系，其特征在于，所述的细胞系具有胫骨原位成瘤能力。

6.根据权利要求5所述的人尤文肉瘤细胞系，其特征在于，所述的细胞系形成的裸鼠胫骨原位瘤具有肺转移能力。

7.根据权利要求1所述的人尤文肉瘤细胞系，其特征在于，所述的细胞系具有在琼脂中克隆成球的能力。

8.根据权利要求1所述的人尤文肉瘤细胞系，其特征在于，所述的细胞系能够被慢病毒转染。

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