CN113234679A - 一种克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞株及其制备和应用 - Google Patents
一种克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞株及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞株及其制备和应用。该人肺腺癌细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：C202169。该肺腺癌细胞可用于构建肺腺癌移植模型，并且该细胞株对克唑替尼具有耐药性，属于原发性耐药，可用于研究肺腺癌耐药机制，在逆转肺癌细胞耐药性、指导病人用药和筛选新的治疗药物方面都具有重要的应用前景。本发明的人肺腺癌细胞株性状稳定，可稳定多次传代。本发明的人肺腺癌细胞株具有临床上人肺腺癌的生物学性状，为肺腺癌的研究提供更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种克唑替尼(Crizotinib)耐药的人肺腺癌细胞细胞株及其制备和应用。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居世界首位。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占80-85％。肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)是最常见的非小细胞肺癌类型。肺腺癌是源于支气管粘膜腺上皮的一类恶性肿瘤，约占全部肺癌的45％左右，目前主要的治疗方法有手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等。现阶段，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂和间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂是临床常见的非小细胞肺癌靶向治疗药物。已有的临床研究证实了EGFR、ALK抑制剂的用药安全性及有效性，但是，部分初期治疗效果良好的患者于持续用药1年及以上时，机体会对靶向治疗药物产生耐药性，导致临床治疗进展陷入瓶颈。
克唑替尼(Crizotinib)是小分子ATP竞争性抑制剂，对间变性淋巴瘤激酶(ALK)和肝细胞生长因子受体(c-Met/HGFR)以及它们的致癌变异体有选择性抑制作用。作为非小细胞肺癌患者靶向治疗的常用药物，克唑替尼在临床应用中的疗效及安全性均较显著，但是作为靶向药物之一，许多患者因基因突变等多种因素而产生获得性耐药性，获得性耐药机制主要分为药物靶点变异(包括ALK拷贝数扩增或激酶区突变)、旁路激活及其他耐药机制，部分患者多种耐药机制共存。此外，目前仍有约30％的ALK抑制剂耐药患者的耐药机制并不明确。
因此，为了研发出更加科学、安全、有针对性的靶向药物，以提高靶向治疗效果，促使肿瘤患者获益，这就需要对药物的耐药机制进行进一步的分析和研究。本发明得到的克唑替尼耐药性细胞株，对于肺腺癌的获得性耐药机制的研究和开发后续疗法有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对当前获得性的ALK抑制剂耐药肺腺癌细胞的缺乏，提供了一株来源于中国人的克唑替尼耐药的肺腺癌细胞及其制备和应用。保藏编号为：CCTCC No：C202169。该细胞株为更好的研究肺腺癌耐药问题，以及为揭示肺腺癌的耐药机制及筛选能够逆转肺腺癌耐药的化疗药物提供了良好的工具。
一种对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞，保藏编号为CCTCC No：C202169。
本发明还提供了如上所述的人肺腺癌细胞的子代细胞。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，用于肺腺癌克唑替尼耐药机制研究提供实验材料。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，所述的实验材料包括：肺腺癌克唑替尼耐药细胞株和/或肺腺癌克唑替尼耐药动物模型。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，所述的动物模型是裸鼠。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，用于构建体内或体外药物筛选平台，筛选治疗克唑替尼耐药型人肺腺癌药物。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，包括以下步骤：
(1)将所述的对克唑替尼耐药的肺腺癌细胞的子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得耐药型人肺腺癌动物模型；
(2)将测试药物施用于耐药型动物模型，施用后导致肺腺癌症状改善或治愈的测试药物即为治疗肺腺癌的候选药物。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，所述的哺乳动物为裸小鼠；所述的裸小鼠为BALB/c裸小鼠；优选采用细胞悬液注射来建立动物模型。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的建立方法，包括以下步骤：
(1)将新鲜的对克唑替尼耐药的肺腺癌肿瘤组织接种移植到免疫缺陷小鼠前肢或后肢背侧皮下，对于荷瘤小鼠，每周至少观察一次，将达到一定体积的肿瘤及时传代并冻存；
(2)传代之后，选择肿瘤体积达到一定体积的小鼠，剥取瘤块进行单细胞分离，去除结缔组织和坏死组织，然后将肿瘤样本剪切成小块；
(3)将剪碎的组织转移到消化液中，孵育、过滤、离心；
(4)用培养基重悬细胞、培养；
(5)当细胞密度达到一定程度时，吸弃培养基，消化细胞并接种于新的培养瓶中，进行细胞传代。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的建立方法，
上述步骤(1)将肿瘤组织使用肿瘤接种针移植到免疫缺陷小鼠前肢或后肢背侧皮下，每块组织约30-50mm3；
上述步骤(2)传代4次-5次之后，选择肿瘤体积达到500-800mm3的小鼠，剥取瘤块进行单细胞分离，将肿瘤样本剪切成1-2mm3小块；
上述步骤(3)将剪碎的组织转移到消化液中，在37℃水浴中孵育，将孵育好的混合物用滤膜过滤，将滤液收集离心，去掉上清；
上述步骤(4)当细胞密度达到80-90％时，吸弃培养基，消化细胞并接种于新的培养瓶中，进行细胞传代，传代至50代以上。
所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的建立方法，具体包括以下步骤：
1)将新鲜的对克唑替尼耐药的肺腺癌肿瘤组织，在无菌条件下放入无菌，4℃预冷的组织保护液中，转移到预灭菌的生物安全柜中，从离心管中取出组织，快速转移至10cm的培养皿中，并用含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素双抗的PBS清洗2遍，剔除坏死组织以及周围非肿瘤组织；
2)将肿瘤组织使用肿瘤接种针移植到免疫缺陷小鼠前肢或后肢背侧皮下，每块组织约30-50mm3，每只小鼠接种1～4个点；对于荷瘤小鼠，每周至少观察一次，将达到一定体积的肿瘤及时传代并冻存；
3)传代4次-5次之后，选择肿瘤体积达到500-800mm3的小鼠，安乐死并剥取瘤块进行单细胞分离，用含双抗的PBS清洗肿瘤组织，去除结缔组织和坏死组织，然后将组织转移至含有10mL不含胎牛血清的RPMI 1640培养基中，用无菌手术剪将肿瘤样本剪切成1-2mm3小块；
4)将剪碎的组织转移到15mL accumax消化液中，在37℃水浴中孵育1小时，将孵育好的混合物用70μm的滤膜过滤，将滤液收集在50mL离心管中，用30mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基冲洗滤膜，合并滤液，将滤液用1300rpm离心5分钟，去掉上清；
5)用5mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，并转移到25mm3的培养皿中，分离出的肿瘤细胞在37℃培养箱中，5％CO2条件下培养；
6)当细胞密度达到80-90％时，吸弃培养基，0.5％胰酶消化细胞并接种于新的培养瓶中，进行细胞传代，传代至50代以上，细胞生长良好，形态较为均一。
本发明的有益效果体现在：本发明建立的耐克唑替尼的人肺腺癌细胞株性状稳定，可稳定多次传代，为肺腺癌耐药机制的研究提供了更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料；本发明的细胞株可以用来构建体内和体外药物筛选平台，对于筛选新的抗人肺腺癌肿瘤药物，研发包括中药或者天然药物类在内的人肺腺癌肿瘤耐药逆转药物提供了耐药细胞株与动物模型，应用范围较广。
生物材料的保藏
本发明的耐克唑替尼的人肺腺癌细胞，于2021年4月28日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，中国)，培养物名称为耐克唑替尼的人肺腺癌细胞LUAD2018，保藏编号为：CCTCC No：C202169。
附图说明
图1是本发明保藏的耐克唑替尼的人肺腺癌细胞LUAD2018的形态学观察(10X)。
图2是体外测试耐克唑替尼的人肺腺癌细胞LUAD2018对ALK抑制剂的反应性。
图3是耐克唑替尼的人肺腺癌细胞LUAD2018倍增曲线。
图4是体内测试耐克唑替尼的人肺腺癌细胞LUAD2018对克唑替尼和顺铂的反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：人肺腺癌细胞LUAD2018的制备
NOD SCID小鼠，雌性，体重18-22g，鼠龄6-8周，饲养于SPF环境。小鼠由北京维通利华实验动物有限公司提供。
(1)从湖南肿瘤医院获得新鲜的临床肺腺癌手术切除样本(男，67岁，原发肺腺癌肿瘤(符合伦理学，以及经过患者同意)，临床分期IV期，ALK+患者，经克唑替尼治疗出现耐药)，立即在无菌条件下将肿瘤组织放入无菌、4℃预冷的组织保护液中，转移到预灭菌的生物安全柜中，从离心管中取出组织，快速转移至10cm的培养皿中，并用含双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的PBS清洗2遍，剔除坏死组织以及周围非肿瘤组织，尽可能确保坏死部分不被用于接种；(2)将肿瘤组织使用肿瘤接种针移植到免疫缺陷小鼠前肢或后肢背侧皮下，每块组织约30-50mm3，根据病人肿瘤组织的总体大小决定接种数量，每只小鼠接种1～4个点；
(3)对于荷瘤小鼠，每周至少观察一次，将达到一定体积的肿瘤(400-1000mm3)及时传代并冻存；
(4)传代4次-5次之后，选择肿瘤体积达到500-800mm3的小鼠，安乐死并剥取瘤块进行单细胞分离，用含双抗的PBS清洗肿瘤组织，去除结缔组织和坏死组织，然后将组织转移至含有10mL不含胎牛血清的RPMI 1640培养基中，用无菌手术剪将肿瘤样本剪切成小块(1-2mm3大小)；
(5)将剪碎的组织转移到15mL accumax消化液中，在37℃水浴中孵育1小时，将孵育好的混合物用70μm的滤膜过滤，将滤液收集在50mL离心管中，用30mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基冲洗滤膜，将滤液用1300rpm离心5分钟，去掉上清。
(6)用5mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，并转移到25mm3的培养皿中，分离出的肿瘤细胞在37℃培养箱中，5％CO2条件下培养；
(7)当细胞密度达到80-90％时，吸弃培养基，0.5％胰酶消化细胞并接种于新的培养瓶中，进行细胞传代，传代至50代以上，细胞生长良好，形态较为均一。
在本发明中，来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养呈上皮样，细胞形态较为均一，该细胞株命名为LUAD2018，保藏编号为CCTCC No：C202169。
实施例2：细胞的生物学特性
本发明采用RPMI 1640培养基培养LUAD2018细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至30代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察和验证，体外生长的LUAD2018细胞具有典型的上皮样形态，失去接触生长抑制，呈恶性生长，该细胞株可以为研究体外和体内抗癌药物敏感性及耐药性，为肺腺癌的发生、发展和转移提供新的试验材料。
形态学观察
将培养的LUAD2018细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照，结果见图1(10X)，可见LUAD2018细胞失去了接触抑制，呈恶性生长，具有上皮样细胞特点。
体外测试细胞对ALK抑制剂的反应性
体外测定该肺腺癌细胞LUAD2018对ALK抑制剂的敏感性，取对数生长期的细胞用于铺板，调整细胞浓度，在培养板中每孔加入90μL细胞悬液，在空白对照孔中加入不含细胞的培养液；将培养板在37℃,5％CO2,及100％相对湿度的培养箱中培养过夜；取10μL的不同浓度的ALK抑制剂工作液加入到上述的细胞培养板中，使克唑替尼的终浓度依次为100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128和0.000256μM，阿来替尼(Alectinib)的终浓度依次为10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032、0.00064、0.000128和0.000026μM，每组三个复孔，在溶媒对照(含有细胞和细胞培养液，不添加ALK抑制剂)和空白对照(含有细胞培养液，不含细胞，不添加ALK抑制剂)中加入10μL DMSO-细胞培养液混合液，DMSO终浓度为0.25％，将96孔细胞板放回培养箱中培养72h。然后每孔加入50μL(等于每孔中细胞培养液一半体积)PromegaCellTiter-Glo发光法细胞活性检测试剂盒(Promega-G7573)的CellTiter-Glo工作液，用铝箔纸包裹细胞板以避光；将培养板在轨道摇床上振摇2分钟以诱导细胞裂解，培养板在室温放置10分钟以稳定发光信号，在2104EnVision读板器上检测发光信号；计算检测化合物的抑制率(Inhibition rate，IR)：IR(％)＝(1–(RLU化合物–RLU空白对照)/(RLU溶媒对照–RLU空白对照)*100％。在Excel中计算不同浓度化合物的抑制率，然后用GraphPad Prism软件作抑制曲线图和计算相关参数IC50，结果如表1和图2所示；克唑替尼在体外对肺腺癌细胞LUAD2018的IC50值为4.38μM，阿来替尼在体外对LUAD2018的IC50值为2.86μM。根据文献报道，克唑替尼在体外对肺腺癌细胞H2228的IC50为300nM，因此LUAD2018细胞对克唑替尼的IC50是普通肺腺癌细胞的10倍以上，表明LUAD2018对克唑替尼耐药。
表1.ALK抑制剂对细胞的半数抑制浓度
| 化合物名称 | 克唑替尼 | 阿来替尼 |
| 绝对IC50值(μM) | 4.38 | 2.86 |
细胞动力学：
将LUAD2018细胞以3000/孔和6000/孔的密度接种在96孔板中，进行培养，分别在6小时，24小时，48小时，72小时，96小时，120小时，144小时和168小时使用CellTiter Glo试剂盒测定每孔中的活细胞数(见图3)。
STR鉴定：
短串联重复序列(Shorttandemrepeat，STR)又称为微卫星DNA，一般由一个长2～6bp的核心序列经多次串联重复排列而成，重复次数大多在10～60次之间，个体间核心序列的重复次数呈高度变异性，因而一组STR序列的重复次数在不同的个体中几乎是唯一的，是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。收集新鲜培养的人肺腺癌细胞LUAD2018，提取细胞的基因组的DNA，用5’端标记的STR引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序。其中STR位点的拷贝数如下表所示，和ATCC、DSMZ等细胞库的数据库进行比对，未发现相同STR检测结果，由此可证明其是唯一的，且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染。
表2.STR位点拷贝数
实施例3体内测试克唑替尼和顺铂对肺腺癌细胞LUAD2018的反应
体外培养LUAD2018细胞，取对数生长期内的细胞，计数并制备悬液，在BALB/cNude小鼠右侧颈背部皮下接种LUAD2018细胞，接种体积为0.2mL，接种细胞量为10x106，细胞悬液为PBS加基质胶(体积比为1:1),建立LUAD2018皮下异种移植模型；
常规饲养LUAD2018移植模型小鼠，观察并测量肿瘤大小长至74-285mm3时，随机化分组并给予克唑替尼(前6天给予3mg/kg克唑替尼处理，之后22天给予25mg/kg克唑替尼)和顺铂(3mg/kg)处理28天，观察并测量肿瘤体积，发现克唑替尼和顺铂均不能显著抑制肿瘤的生长。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞，其特征在于，保藏编号为CCTCC No：C202169。
2.权利要求1所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，其特征在于，用于肺腺癌克唑替尼耐药机制研究提供实验材料。
3.根据权利要求2所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，其特征在于，所述的实验材料包括：肺腺癌克唑替尼耐药细胞株和/或肺腺癌克唑替尼耐药动物模型。
4.根据权利要求3所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，其特征在于，所述的动物模型是裸鼠。
5.权利要求1所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，其特征在于，用于构建体内或体外药物筛选平台，筛选治疗克唑替尼耐药型人肺腺癌药物。
6.根据权利要求5所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述的对克唑替尼耐药的肺腺癌细胞的子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得耐药型人肺腺癌动物模型；
(2)将测试药物施用于耐药型动物模型，施用后导致肺腺癌症状改善或治愈的测试药物即为治疗肺腺癌的候选药物。
7.根据权利要求6所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的应用，其特征在于，所述的哺乳动物为裸小鼠；所述的裸小鼠为BALB/c裸小鼠；优选采用细胞悬液注射来建立动物模型。
8.权利要求1所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将新鲜的对克唑替尼耐药的肺腺癌肿瘤组织接种移植到免疫缺陷小鼠前肢或后肢背侧皮下，对于荷瘤小鼠，每周至少观察一次，将达到一定体积的肿瘤及时传代并冻存；
(2)传代之后，选择肿瘤体积达到一定体积的小鼠，剥取瘤块进行单细胞分离，去除结缔组织和坏死组织，然后将肿瘤样本剪切成小块；
(3)将剪碎的组织转移到消化液中，孵育、过滤、离心；
(4)用培养基重悬细胞、培养；
(5)当细胞密度达到一定程度时，吸弃培养基，消化细胞并接种于新的培养瓶中，进行细胞传代。
9.根据权利要求8所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的建立方法，其特征在于，
步骤(1)将肿瘤组织使用肿瘤接种针移植到免疫缺陷小鼠前肢或后肢背侧皮下，每块组织约30-50mm3；
步骤(2)传代4次-5次之后，选择肿瘤体积达到500-800mm3的小鼠，剥取瘤块进行单细胞分离，将肿瘤样本剪切成1-2mm3小块；
步骤(3)将剪碎的组织转移到消化液中，在37℃水浴中孵育，将孵育好的混合物用滤膜过滤，将滤液收集，离心，去掉上清；
步骤(4)当细胞密度达到80-90％时，吸弃培养基，消化细胞并接种于新的培养瓶中，进行细胞传代，传代至50代以上。
10.根据权利要求9所述的对克唑替尼耐药的人肺腺癌细胞的建立方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)将新鲜的对克唑替尼耐药的肺腺癌肿瘤组织，在无菌条件下放入无菌，4℃预冷的组织保护液中，转移到预灭菌的生物安全柜中，从离心管中取出组织，快速转移至10cm的培养皿中，并用含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素双抗的PBS清洗2遍，剔除坏死组织以及周围非肿瘤组织；
2)将肿瘤组织使用肿瘤接种针移植到免疫缺陷小鼠前肢或后肢背侧皮下，每块组织约30-50mm3，每只小鼠接种1～4个点；对于荷瘤小鼠，每周至少观察一次，将达到一定体积的肿瘤及时传代并冻存；
3)传代4次-5次之后，选择肿瘤体积达到500-800mm3的小鼠，安乐死并剥取瘤块进行单细胞分离，用含双抗的PBS清洗肿瘤组织，去除结缔组织和坏死组织，然后将组织转移至含有10mL不含胎牛血清的RPMI 1640培养基中，用无菌手术剪将肿瘤样本剪切成1-2mm3小块；
4)将剪碎的组织转移到15mL accumax消化液中，在37℃水浴中孵育1小时，将孵育好的混合物用70μm的滤膜过滤，将滤液收集在50mL离心管中，用30mL含10％胎牛血清的RPMI1640培养基冲洗滤膜，合并滤液，将滤液用1300rpm离心5分钟，去掉上清；
5)用5mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，并转移到25mm3的培养皿中，分离出的肿瘤细胞在37℃培养箱中培养；
6)当细胞密度达到80-90％时，吸弃培养基，消化细胞并接种于新的培养瓶中，进行细胞传代，传代至50代以上。
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| CN113234679B (zh) | 2022-11-29 |
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