CN111518769A - 一种克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系的建立方法，属于肿瘤细胞模型领域。本发明的方法以80‑120nM初始浓度，进行克唑替尼浓度梯度(80‑120nM)递增驯化，直至克唑替尼浓度增加至2400‑3200nM。本发明方法能成功建立得到对克唑替尼IC50高达7000nM以上的细胞系，将其应用于抑制克唑替尼耐药癌细胞的药物的筛选，具有极好的应用价值。

Description

一种克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系的建立方法
技术领域
本发明属于肿瘤细胞模型领域。
背景技术
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，根据组织学形态可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌为主要类型，约占所有肺癌的80％。现有研究发现大部分非小细胞肺癌都具有肿瘤驱动基因，临床针对驱动基因运用小分子靶向药物治疗在临床中取得了巨大进展，显著改善了患者预后。但遗憾的是相关小分子靶向药物使用后普遍产生耐药，因耐药机制并不完全清楚，大部分患者在小分子抑制剂耐药后缺乏有效解决办法，这使得肺癌患者长期获益仍然受限。获得性耐药的产生使得肺癌小分子靶向药物治疗面临巨大挑战，对其分子机制的深入阐释是当前肺癌研究亟需解决的重大科学问题。
ROS1(c-ros oncogene 1)融合基因是非小细胞肺癌中一种重要的肿瘤驱动基因，ROS1融合在非小细胞肺癌中的发生率约1-2％，常见于肺腺癌。克唑替尼是靶向MET原癌基因受体酪氨酸激酶、间变淋巴瘤激酶和ROS1的酪氨酸激酶抑制剂。克唑替尼用于ROS1融合型肺腺癌的临床治疗可以显著延缓患者病情的进展。然而，与针对其他驱动基因的靶向治疗一样，使用克唑替尼治疗ROS1融合型肺腺癌的过程中也不可避免地会产生耐药，且机制尚不完全清楚。有研究表明ROS1的G2032R和D2033N突变可导致ROS1融合型患者对克唑替尼耐药。
为了研究克唑替尼耐药机制，筛选有效抑制克唑替尼耐药肿瘤的药物，人们报道了若干耐受克唑替尼的细胞株。Siming Liu等在其新药研究中报道了一株耐受克唑替尼的细胞株，该细胞株携带ROS1 G2032R突变，来自于ROS1阳性的非小细胞肺癌患者，克唑替尼对该细胞株的半致死量(IC50)为643.5nM(Design，synthesis and biologicalevaluations of 2-amino-4-(1-piperidine)pyridine derivatives as novel anticrizotinib-resistant ALK/ROS1 dual inhibitors.Eur J Med Chem.2019 Oct 1；179：358-375.)。Katayama等报道了一系列ROS1突变的耐受克唑替尼的Ba/F3细胞，在克唑替尼处理下，L1951R、L2026M、G2032R和D2033N突变型细胞的IC50分别约为80、55、500和600nM(The new-generation selective ROS1/NTRK inhibitor DS-6051b overcomescrizotinib resistant ROS1-G2032R mutation in preclinical models.NatCommun.2019 Aug 9；10(1)：3604.)。
现有的克唑替尼耐药性细胞对克唑替尼的耐药性不够高，对治疗克唑替尼耐药性肿瘤的药物的筛选能力不够。
发明内容
本发明要解决的问题是，提供一种耐受克唑替尼的细胞系的建立方法。
本发明的技术方案如下：
一种克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系的建立方法，包括如下步骤：
1)将ROS1基因融合型的非小细胞肺癌细胞系置于含有80-120nM药物的培养基进行培养，传代；
2)观察细胞状态，若细胞状态良好，维持相同药物浓度传代3～4次，增加培养基药物浓度80-120nM，继续培养、传代；若细胞状态不好，则在当前药物浓度基础上降低80-120nM，待其能正常存活、增殖和传代后，增加培养基药物浓度80-120nM；
3)重复步骤2)，直至药物浓度增加至2400-3200nM，维持药物浓度继续培养，直至细胞能稳定增殖和传代；
所述药物为克唑替尼；
培养期间更换培养基，以维持细胞生活所需营养；
所述“细胞状态良好”指：倍增时间不低于在无药物的培养基内的50％；
所述“细胞状态不好”指：倍增时间低于在无药物的培养基内的50％。
如前述的方法，所述ROS1基因突变肺腺癌细胞系为HCC78。
如前述的方法，所述培养基为含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基。
如前述的方法，步骤1)所述药物的浓度为100nM。
如前述的方法，步骤2)中的增加和/或降低的药物浓度为100nM。
如前述的方法，步骤3)为：重复步骤2)，直至药物浓度增加至3000nM，维持药物浓度继续培养，直至细胞能稳定增殖和传代。
前述方法制备得到的克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系。
进一步的，所述细胞系对克唑替尼的IC50为7710.00±274.04nM。
前述细胞系在药物评价中的用途，所述药物为治疗克唑替尼耐药肿瘤的药物。
如前述的用途，所述肿瘤为肺腺癌。
本发明方法通过特定初始药物浓度和合适的药物浓度递增策略(包括药物浓度递增梯度、每个梯度持续培养时间、增加药物浓度的时机)，建立了能在克唑替尼浓度高达3000nM的环境稳定传代的细胞株，其IC50值可高达7000nM以上，远高于目前的耐受克唑替尼的细胞系，更有利于筛选或评价有效抑制克唑替尼耐药癌细胞的药物。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1.显微镜下观察克唑替尼敏感(HCC78)和耐药的肺癌细胞株(HCC78CR)的形态。
图2.短串联重复序列(STR)鉴定HCC78和HCC78CR为同源细胞。
图3.细胞增殖实验验证HCC78和HCC78CR细胞增殖能力相当。
图4.平板成克隆实验验证HCC78和HCC78CR细胞成克隆能力相当。
图5.细胞凋亡实验验证HCC78和HCC78CR细胞凋亡情况相当。
图6.CCK-8实验验证HCC78CR细胞对克唑替尼的耐药性显著高于HCC78细胞。
图7.显微镜下观察HCC78CR细胞和HCC78CR1细胞的形态。
图8.细胞增殖实验验证HCC78CR细胞和HCC78CR1细胞增殖能力相当。
图9.CCK-8实验验证HCC78CR细胞与HCC78CR1细胞对克唑替尼的耐药性相当。
具体实施方式
实施例1一种克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系的建立方法
该方法包括如下步骤：
(1)人ROS1基因融合型非小细胞肺癌细胞系HCC78(以下简称HCC78细胞)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。该细胞采用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(以下简称完全培养基)，于37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，采用0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(0.25％Trypsin-EDTA)进行消化传代。
(2)取对数生长期的HCC78细胞进行消化铺板，铺板密度50％-60％，待细胞贴壁后更换为含有100nM克唑替尼的完全培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，每48-72小时更换一次含有相同浓度克唑替尼的完全培养基，待细胞增殖至80％-90％密度时进行消化传代，观察细胞状态。若细胞生长状态良好(倍增时间不低于在无药物的培养基内的50％)，则在该药物浓度下稳定传代3～4次后继续增加药物浓度；若细胞状态不好(倍增时间低于在无药物的培养基内的50％)，则在当前药物浓度基础上降低100nM培养，待细胞恢复状态后再加入原浓度药物，直至细胞在该浓度下正常存活、增殖和传代，以此为一个培养周期。
(3)在原药浓度的基础上，以100nM的浓度差增加药物浓度，循环执行步骤(2)的培养周期，直至克唑替尼浓度增加至3000nM，随后在3000nM克唑替尼的培养基中维持，直至HCC78细胞能在含有3000nM克唑替尼的完全培养基中稳定增殖和传代后，即获得所述的耐克唑替尼人非小细胞肺癌细胞系HCC78CR细胞。按此方法实施，能完全重复建立该耐药细胞系。
实施例2一种克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系的建立方法
该方法包括如下步骤：
(1)人ROS1基因融合型非小细胞肺癌细胞系HCC78(以下简称HCC78细胞)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。该细胞采用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(以下简称完全培养基)，于37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，采用0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(0.25％Trypsin-EDTA)进行消化传代。
(2)取对数生长期的HCC78细胞进行消化铺板，铺板密度50％-60％，待细胞贴壁后更换为含有80nM克唑替尼的完全培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，每48小时更换一次含有相同浓度克唑替尼的完全培养基，待细胞增殖至80％-90％密度时进行消化传代，观察细胞状态。若细胞生长状态良好(倍增时间不低于在无药物的培养基内的50％)，则在该药物浓度下稳定传代两次后继续增加药物浓度；若细胞状态不好(倍增时间低于在无药物的培养基内的50％)，则在当前药物浓度基础上降低80nM培养待细胞恢复状态后再加入原浓度药物，直至细胞在该浓度下正常存活、增殖和传代，以此为一个培养周期。
(3)在原药浓度的基础上，以80nM的浓度差增加药物浓度，循环执行步骤(2)的培养周期，直至克唑替尼浓度增加至2400nM，随后在2400nM克唑替尼的培养基中维持，直至HCC78细胞能在含有2400nM克唑替尼的完全培养基中稳定增殖和传代后，即获得所述的耐克唑替尼人非小细胞肺癌细胞系HCC78CR细胞。按此方法实施，能完全重复建立该耐药细胞系。
实施例3一种克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系的建立方法
该方法包括如下步骤：
(1)人ROS1基因融合型非小细胞肺癌细胞系HCC78(以下简称HCC78细胞)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。该细胞采用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(以下简称完全培养基)，于37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，采用0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(0.25％Trypsin-EDTA)进行消化传代。
(2)取对数生长期的HCC78细胞进行消化铺板，铺板密度50％-60％，待细胞贴壁后更换为含有120nM克唑替尼的完全培养基，置于37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，每48-72小时更换一次含有相同浓度克唑替尼的完全培养基，待细胞增殖至80％-90％密度时进行消化传代，观察细胞状态。若细胞生长状态良好(倍增时间不低于在无药物的培养基内的50％)，则在该药物浓度下稳定传代两次后继续增加药物浓度；若细胞状态不好(倍增时间低于在无药物的培养基内的50％)，则在当前药物浓度基础上降低120nM培养待细胞恢复状态后再加入原浓度药物，直至细胞在该浓度下正常存活、增殖和传代，以此为一个培养周期。
(3)在原药浓度的基础上，以120nM的浓度差增加药物浓度，循环执行步骤(2)的培养周期，直至克唑替尼浓度增加至2400nM，随后在2400nM克唑替尼的培养基中维持，直至HCC78细胞能在含有2400nM克唑替尼的完全培养基中稳定增殖和传代后，即获得所述的耐克唑替尼人非小细胞肺癌细胞系HCC78CR细胞。按此方法实施，能完全重复建立该耐药细胞系。
以下用实验例的方式进一步说明本发明的有益效果。
实验例1几种不同的克唑替尼耐药细胞的构建方法的比较
(1)药物初始浓度对耐药细胞构建的影响
取对数生长期的HCC78细胞，胰酶消化、接种至6孔板中，接种密度50％-60％，待细胞贴壁后，加入药物浓度依次为0nM、1nM、10nM、100nM、1000nM，每个浓度设置3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h后，更换一次含有相同浓度克唑替尼的完全培养基，待细胞增殖至80％-90％密度时进行消化传代，观察细胞状态。培养2周后，结果显示在1nM和10nM浓度下，HCC78细胞生长速度及生长状态与在0nM浓度下无明显差异。在1000nM浓度下，HCC78细胞逐渐凋亡，最终未能有存活细胞。在100nM浓度下，HCC78细胞生长稍被抑制，细胞倍增速度约为在0nM浓度下的70％。因此，最终选择起始浓度为100nM的细胞组继续培养筛选耐药细胞系。
(2)药物递增浓度幅度对耐药细胞构建的影响
取对数生长期的能在100nM浓度下稳定传代的HCC78细胞，胰酶消化、接种至6孔板中，接种密度50％-60％，待细胞贴壁后，加入药物浓度依次为100nM、200nM、400nM、800nM、1000nM，每个浓度设置3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h后，更换一次含有相同浓度克唑替尼的完全培养基，待细胞增殖至80％-90％密度时进行消化传代，观察细胞状态。培养2周后，结果显示在400nM、800nM、1000nM浓度下，HCC78细胞呈现逐渐凋亡的趋势，细胞倍增速度为在100nM浓度下的50％以下。而在200nM浓度下，细胞倍增速度约为在100nM浓度下的80％。因此，最终选择药物浓度每次递增100nM继续培养筛选耐药细胞系。
(3)每个药物浓度梯度维持时间对耐药细胞构建的影响
取对数生长期的能在100nM浓度下稳定传代的HCC78细胞，胰酶消化、接种至6孔板中，接种密度50％-60％，待细胞贴壁后，加入药物浓度为200nM，共设置5组，每组设置3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h后进行消化传代。第1组在每次传代后均使用200nM浓度克唑替尼维持培养；第2组在每次传代后递增100nM浓度克唑替尼进行培养；第3组在每两次传代后递增100nM浓度克唑替尼进行培养；第4组在每三次传代后递增100nM浓度克唑替尼进行培养；第5组在每四次传代后递增100nM浓度克唑替尼进行培养。传代时间及传代细胞比例以第1组为参照。在第5组细胞培养2周期后，结果显示在第1组中，HCC78细胞倍增速度逐渐趋近于100nM浓度下的速度。在第2组和第3组中，HCC78细胞呈现逐渐凋亡的趋势，细胞倍增速度均为在100nM浓度下HCC78细胞的50％以下。而第4组和第5组，细胞倍增速度分别约为在100nM浓度下的70％和80％。因此，最终选择在每个药物浓度梯度维持传代3～4代次后再增加药物浓度的方法培养筛选耐药细胞系。
实验例2实施例1制得的耐药细胞系的功能学实验
(1)细胞形态学观察
取对数生长期的HCC78和HCC78CR细胞，常规消化、接种至6孔板，接种密度50％-60％，待细胞贴壁后，弃培养基，PBS清洗2次，充分去除死亡的细胞，倒置相差显微镜下观察两组细胞的形态并拍照保存。如图1所示。
图1结果显示，与HCC78细胞相比，HCC78CR细胞发生了细胞核变淡、细胞体积变小、细胞轮廓变锐利等形态学改变。
(2)短串联重复序列实验(STR)鉴定细胞系
将HCC78细胞和HCC78CR细胞用胰酶消化，加入完全培养基中和胰酶后，移至1.5ml离心管中，2000rpm，常温离心3min，去上清，保留细胞沉淀。使用PBS洗涤沉淀，2000rpm，常温离心3min，重复两次。向沉淀中加入200ul DNA裂解缓冲液及10ul蛋白酶K(20mg/ml)，充分混匀，55℃裂解2-3小时。95℃10min失活蛋白酶K，2000rpm离心3min，取上清加入两倍体积异丙醇(400ul)，1/10体积(20ul)的3M乙酸钠，颠倒混匀，-80℃冰箱静置30min，同时预冷低温离心机，13000rpm，4℃低温离心10min，弃上清，保留沉淀。沉淀中加入600ul 75％乙醇洗涤，充分接触后，7500rpm离心5min，弃液体，室温下使沉淀自然干燥。加入50ul超纯水，室温溶解沉淀。
提取样品基因组DNA后，按照STR荧光扩增试剂盒推荐的方案进行PCR扩增，9947A和去离子水分别用作阳性和阴性PCR对照。使用基因分析仪分离和检测PCR产物，并通过GeneMapper IDX Software v1.5软件(Applied Biosystems，Waltham，MA，USA)分析电泳原始数据。将PCR产物片段与STR荧光扩增试剂盒中提供的等位基因图谱进行比较后确定等位基因分配。通过Microsoft Office Excel软件对样品基因组DNA的19个X-STR基因座进行重组频率和突变分析。如图2所示。
图2结果显示，HCC78CR细胞和HCC78细胞STR结果鉴定一致，说明HCC78CR细胞未发生细胞种类变化。
(3)细胞增殖检测
取对数生长期的HCC78和HCC78CR细胞，胰酶消化后接种96孔板：每孔接种200ul细胞悬液，含3×103个细胞。设置24h、48h、72h、96h、120h 5个检测时间点，每组细胞设置3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。于各检测时点取出96孔板，吸尽培养基，每孔加入含10％CCK-8试剂的无血清培养基100ul，另设置1个无细胞的孔加入相同检测试剂作为调零孔。96孔板放回培养箱孵育3h，酶标仪检测各组细胞在450nM的吸光度(OD值)并以调零孔为参照得到Blank 450值。以各检测时点的Blank 450值绘制两种细胞的生长曲线图。如图3所示。
取对数期生长的HCC78和HCC78CR细胞，常规消化，制备单细胞悬液，计数后按500个细胞/孔接种到6孔板，补足培养基至2ml，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。每3天更换培养基，连续培养15天，定期显微镜观察克隆形成情况。完成培养后取出6孔板，弃培养基，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定15min，0.5％结晶紫染色30min，PBS清洗2次。倒置相差显微镜下观察克隆集落形态，并拍照保存。如图4所示。
图3结果显示，HCC78和HCC78CR细胞在各检测时间点的相对生长速率无明显差异。图4结果显示，HCC78和HCC78CR细胞的克隆形成无明显变化。说明HCC78和HCC78CR细胞增殖能力相当。
(4)细胞凋亡检测
取对数生长期的HCC78和HCC78CR细胞，消化、离心、重悬制备单细胞悬液，细胞计数后按每孔2×105个细胞接种6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。培养结束后，使用不含EDTA的2.5％胰酶消化细胞，1000rpm离心3min，弃培养基，使用提前预冷的PBS清洗2次，1000rpm离心3min，弃上清，加入500ml Annexin V banding buffer轻柔混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V和PI，室温下避光反应15min。流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况，激发波长为488nm，接收波长为530nm，Annexin V荧光通过FITC通道检测，PI荧光通过PE通道检测。如图5所示。
图5结果显示，HCC78和HCC78CR细胞凋亡无显著变化。
(5)细胞耐药性检测
取对数生长的HCC78和HCC78CR细胞，常规消化、离心、重悬制备单细胞悬液，计数后按每孔5×103个细胞接种96孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。两组细胞培养24h后，更换培养基，实验组HCC78和HCC78CR细胞按0nM、1000nM、2000nM、3000nM、4000nM、5000nM、6000nM、7000nM、8000nM、9000nM、10000nM、11000nM、12000nM浓度加入克唑替尼，各浓度设置3个复孔。克唑替尼培养48h后，取出96孔板，更换培养基，每孔加入含10％CCK-8试剂的无血清培养基，放入培养箱中反应3h后使用酶标仪检测细胞在各浓度克唑替尼处理下的450nM吸光度(OD值)，根据Blank 450绘制剂量-效应曲线，计算两组细胞的IC50。如图6所示。
图6结果显示，HCC78CR细胞对克唑替尼的IC50显著高于HCC78细胞(7710.00±274.04nM vs.2435.66±135.75nM，P＜0.001)，说明HCC78CR细胞对克唑替尼的耐药性较HCC78细胞显著升高，耐药细胞株建立成功。
实验例3重复性实验
取对数生长期的HCC78细胞进行消化铺板，铺板密度50％-60％，待细胞贴壁后更换为含有100nM克唑替尼的完全培养基，置于37℃、5％C02的培养箱内进行培养，每48-72小时更换一次含有相同浓度克唑替尼的完全培养基，待细胞增殖至80％-90％密度时进行消化传代。在原药浓度的基础上，以100nM的浓度差增加药物浓度，在每个药物浓度梯度维持传代3～4次后再增加药物浓度，直至克唑替尼浓度增加至3000nM，随后在3000nM克唑替尼的培养基中维持，直至HCC78细胞能在含有3000nM克唑替尼的完全培养基中稳定增殖和传代后，可完全重复出实施例1建立的耐克唑替尼人非小细胞肺癌细胞系HCC78CR细胞，将其命名为HCC78CR1细胞。HCC78CR细胞与HCC78CR1细胞的细胞形态、细胞增殖以及耐药性检测分别见图7、8和9。
图7显示HCC78CR细胞和HCC78CR1细胞的形态相似。图8显示HCC78CR细胞和HCC78CR1细胞增殖能力相当。图9显示HCC78CR细胞与HCC78CR1细胞对克唑替尼的耐药性相当。
结论：按实施例1的方法完全能重复出耐克唑替尼的非小细胞肺癌细胞系。
综上，本发明的方法可成功构建克唑替尼耐药性高的肺腺癌细胞，其耐药性远远高于已报道任何的克唑替尼耐药细胞。将该细胞用于克唑替尼耐药机制和相关抗肿瘤药物的药物评价/筛选，具有良好的前景。

Claims (10)

1.一种克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将ROS1基因融合型的非小细胞肺癌细胞系置于含有80-120nM克唑替尼的培养基进行培养，传代；
2)观察细胞的倍增时间，若细胞倍增时间不低于在无克唑替尼的培养基内的50％，维持相同药物浓度传代3～4次，提高培养基中克唑替尼的浓度，提高幅度为80-120nM，继续培养、传代；若细胞倍增时间不低于在无克唑替尼的培养基内的50％，则在当前药物浓度基础上降低80-120nM，待其能正常存活、增殖和传代后，增加培养基药物浓度80-120nM；
3)重复步骤2)，直至药物浓度增加至2400-3200nM，维持药物浓度继续培养，直至细胞能稳定增殖和传代；
培养期间更换培养基，以维持细胞生活所需营养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述ROS1基因突变肺腺癌细胞系为HCC78。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述培养基为含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于：
步骤1)所述药物的浓度为100nM。
5.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于：
步骤2)中的增加和/或降低的药物浓度为100nM。
6.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于：
步骤3)为：重复步骤2)，直至药物浓度增加至3000nM，维持药物浓度继续培养，直至细胞能稳定增殖和传代。
7.权利要求1～6任一所述方法制备得到的克唑替尼获得性耐药肺腺癌细胞系。
8.如权利要求7所述细胞系，其特征在于：所述细胞系对克唑替尼的IC50为7710.00±274.04nM。
9.权利要求7或8所述细胞系在药物评价中的用途，所述药物为治疗克唑替尼耐药肿瘤的药物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肺腺癌。
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