CN118256440A - 胃癌顺铂耐药细胞株及其建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了胃癌顺铂耐药细胞株及其建立方法。本发明基于不同细胞对顺铂的敏感性差异,针对不同细胞确定不同体系的培养参数,进行耐药细胞的筛选,在高效筛选的同时获得高度耐药的细胞;此外,还通过改进细胞耐药维护培养液的组成,大大提高了耐药细胞的增殖效率,可进一步提高筛选效率。利用本发明方法筛选得到的胃癌顺铂耐药细胞株HGC‑27/DDP16和AGS/DDP24具有高度耐药性。
Description
技术领域
本发明属于细胞系领域,具体涉及胃癌顺铂耐药细胞株及其建立方法。
背景技术
目前胃癌是全球第三大恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居前三,东亚地区是胃癌高发区域。由于胃癌发病的隐匿性,虽然现在强调了胃镜检查,提高了早期胃癌的检出率,但是很多胃癌患者首诊时已经发展成为进展期胃癌。由于新的有效手段的匮乏,目前化疗仍是胃癌治疗的基石。多数胃癌患者需要接受辅助化疗和术后化疗。顺铂是铂类化合物,是胃癌化疗的一线药物,以顺铂为基础的药物由于其有效性和低廉的价格,被广泛使用。研究人员发现,使用顺铂作为治疗手段的胃癌患者,一旦化疗失败或者转移复发,主要的因素是胃癌细胞发生顺铂耐药引起的。因此,如何有效地克服顺铂耐药是提升患者生存的关键环节。
基于顺铂耐药的研究愈来愈受到研究人员的重视,已知的顺铂耐药通常有以下几个主要因素:1)铂类化合物在细胞内的积聚减少;2)DNA损伤修复增加;3)凋亡失活;4)上皮-间充质转化(EMT)激活;5)DNA甲基化改变、miRNA图谱变化、癌症干细胞特征和应激反应伴侣蛋白的表达改变等。为了进一步探究顺铂耐药的发生机制,必须要获得胃癌顺铂耐药细胞株。
除了从临床上获得的顺铂耐药细胞以外,通过梯度提升顺铂浓度和高剂量间歇诱导获得耐药细胞的方法是普遍认识。分别利用药物浓度递增法和大剂量药物冲击法建立的两种耐药细胞株在细胞形态和生物学特性上都有很大的差别,是不同的细胞亚系。前一种方法筛选获得的耐药细胞耗时较长,与临床上用药方式和用药量存在明显差异,而后一种方法采用大剂量药物间歇冲击对培养细胞的影响较大,诱导效率低,细胞由于成活率过低导致前期培养细胞增殖过于缓慢,受环境影响大,最终耐药性能不够稳定。
例如,延冰等人在题为“高剂量法诱导胃癌铂类耐药细胞株的建立及其生物学特性”的文章(山东大学学报(医学版),Vol52,No.4,P49-57)中公开了利用大剂量冲击法(对数期细胞给予0.8μg/mL高剂量顺铂冲击,持续冲击4个月)诱导胃癌顺铂耐药细胞株BGC823/cDDP建立,利用CCK-8法检测到BGC823/cDDP细胞对顺铂的耐药指数为4.54。
例如,刘玉侠等人在题为“人胃癌耐药细胞的建立方法及意义”的文章(Chin JLab Diagn,June,2021,Vol 25,No.6,P 904-906)中公开了反复冲击法诱导胃癌顺铂耐药细胞株建立。具体为:体外培养人胃癌细胞SGC-7901,用50μmol/L顺铂反复冲击4次和6次,建立的胃癌顺铂耐药细胞株对顺铂的耐药指数分别为3.11和3.64。
例如,顾一帆在题为“耐顺铂胃癌细胞中miRNA-21介导的自噬抑制的相关体外机制研究”的学位论文(上海交通大学,2019)构建了耐受顺铂人胃癌细胞株SGC7901/DDP,以0.1μg/ml作为培养胃癌耐药细胞的初始浓度,用成倍递增的顺铂浓度处理胃癌细胞,经过为期6个月的药物处理,最后构建耐出顺铂人胃癌细胞株SGC7901/DDP,最终细胞耐受的顺铂浓度为10μg/ml,维持其耐药性的浓度为5μg/ml。SGC7901/DDP对顺铂的耐药指数为5.546。
Snow等人认为耐药指数小于5是低度耐药,耐药指数5~15是中度耐药,耐药指数大于15是高度耐药。目前的研究发现高度耐药的胃癌顺铂耐药细胞株的获得非常困难,这也导致胃癌顺铂耐药的发生发展机制的研究难以深入。
因此,迫切需要寻找一种新的方法建立高度耐药的胃癌顺铂耐药细胞株,这是决定胃癌顺铂耐药机制探索成败的关键。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了胃癌顺铂耐药细胞株及其建立方法。本发明基于不同细胞对顺铂的敏感性差异,针对不同细胞确定不同体系的培养参数,进行耐药细胞的筛选,在高效筛选的同时获得高度耐药的细胞;此外,还通过改进细胞耐药维护培养液的组成,大大提高了耐药细胞的增殖效率,可进一步提高筛选效率。
为了实现上述目的,本发明采取了以下技术方案:
本发明提供了一种顺铂耐药细胞株的建立方法,包括以下步骤:
(1)第一次筛选:将含Na-1个胃癌细胞的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含浓度为Ca-1的顺铂的细胞完全培养液进行培养;第3~5天换液时,换成含浓度为IC50(3)-1的顺铂的细胞完全培养液进行培养,并在此浓度下连续培养14~21天;然后,更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-1的顺铂的细胞完全培养液,待细胞增殖至超过1×106个细胞后,得到第一次筛选耐药细胞株;
(2)第二次筛选:将含Na-2个所述第一次筛选耐药细胞株的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含浓度为Ca-2的顺铂的细胞完全培养液进行培养;第3~5天换液时,换成含浓度为IC50(3)-2的顺铂的细胞完全培养液进行培养,并在此浓度下连续培养14~21天;然后,更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-2的顺铂的细胞完全培养液,待细胞增殖至超过1×106个细胞后,得到第二次筛选耐药细胞株;
……(以此类推)
(i)第i次筛选:将含Na-i个第i-1次筛选耐药细胞株的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含浓度为Ca-i的顺铂的细胞完全培养液进行培养;第3~5天换液时,换成含浓度为IC50(3)-i的顺铂的细胞完全培养液进行培养,并在此浓度下连续培养14~21天;然后,更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-i的顺铂的细胞完全培养液,待细胞增殖至超过1×106个细胞后,得到第i次筛选耐药细胞株;
其中,
Na-i为第i次耐药筛选中加入至培养瓶中的细胞实际数量,其为第i次耐药筛选中加入至培养瓶中的细胞数量理论值N-i的0.8~1.2倍;
Ca-i为第i次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂实际浓度,其为第i次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂浓度理论值C1-i的0.8~1.2倍;
Cb-i为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中顺铂实际浓度,其为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i的0.5~1.5倍;
每次耐药筛选中各理论值N、C1、C2通过以下方式预先获得:
①每次耐药筛选前,在三个不同时间点分别检测在含有不同浓度的顺铂的细胞完全培养液中细胞生长情况,并基于此计算得到在第一次、第二次和第三次的时间点检测得到的IC50和IC10,分别记为:IC50(1)、IC50(2)、IC50(3)、IC10(1)、IC10(2)和IC10(3);相邻两次检测的时间间隔不应低于24小时;
②通过以下公式(Ⅰ)~(Ⅲ)计算得到每次耐药筛选中各理论值N、C1、C2:
其中
e代表自然指数,即通常所说的而是e的幂;
Sa代表本次筛选所用的培养瓶的底面积;s代表步骤①中检测时单个培养孔的底面积;n代表步骤①中检测时初始铺板细胞数;R0为本次筛选所用的细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i与前一次筛选所用的细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-(i-1)的比值,即,R0-i=C2-i/C2-(i-1),由于第一次进行顺铂耐药筛选时细胞未耐受,因此,R0-1设定为1。
优选的技术方案中,步骤(1)中所述胃癌细胞为HGC-27和所述细胞完全培养液为含10%FBS的RPMI 1640培养液,第7次筛选所得的胃癌顺铂耐药细胞株为人胃癌细胞HGC-27/DDP16。
优选的技术方案中,步骤(1)中所述胃癌细胞为AGS和所述细胞完全培养液为含10%FBS的F-12培养液,第7次筛选所得的胃癌顺铂耐药细胞株为人胃癌细胞AGS/DDP24。
优选的技术方案中,第1次检测的时间点至少为培养24小时,所有检测均在细胞培养2周内完成。
优选的技术方案中,所述细胞耐药维护培养液中还含有浓度为15.625~125nM的组胺,最优选为所述细胞耐药维护培养液中还含有浓度为62.5nM的组胺。
同时,本发明还提供了一种胃癌顺铂耐药细胞株,命名为人胃癌细胞HGC-27/DDP16,其于2023年02月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCCNO:C202326。
本发明所述胃癌顺铂耐药细胞株,较佳地,还包括如上所述的人胃癌细胞HGC-27/DDP16的子代细胞。
同时,本发明还提供了一种胃癌顺铂耐药细胞株,命名为人胃腺癌细胞AGS/DDP24,其于2023年02月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCCNO:C202325。
本发明所述胃癌顺铂耐药细胞株,较佳地,还包括如上所述的人胃腺癌细胞AGS/DDP24的子代细胞。
此外,本发明还提供了一种细胞耐药维护培养液,为含15.625~125nM的组胺和浓度为Cb-i的顺铂的细胞完全培养液,Cb-i为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中顺铂实际浓度,其为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i的0.5~1.5倍,C2-i通过以下方式预先获得:
①第i次耐药筛选前,在三个不同时间点分别检测在含有不同浓度的顺铂的细胞完全培养液中细胞生长情况,并基于此计算得到在第一次、第二次和第三次的时间点检测得到的IC50和IC10,分别记为:IC50(1)、IC50(2)、IC50(3)、IC10(1)、IC10(2)和IC10(3);相邻两次检测的时间间隔不应低于24小时;
②通过以下公式(Ⅲ)计算得到第i次耐药筛选中理论值C2-i:
优选的技术方案中,所述组胺的浓度为62.5nM。
本发明中,利用不同细胞对顺铂的敏感性差异,改进细胞株培养方式,针对不同细胞确定不同体系的培养参数,通过特定参数下细胞培养,加速胃癌耐药细胞的筛选效率并获得高度耐药的细胞株;进一步,通过改进细胞耐药维护培养液的组成,大大提高了胃癌耐药细胞的增殖效率。研究结果显示:本发明的培养方式,其对顺铂耐药细胞株的筛选效率远高于单纯以某一特定梯度方式的筛选效率,最少仅需要7次筛选,即可获得高度耐药的细胞株。
人耐药胃癌细胞株HGC-27/DDP16在第48小时的IC50、第72小时的IC50分别为65.6747μM和51.4369μM,耐药指数RI分别为54.149和75.088。而且,胃癌顺铂耐药细胞HGC-27/DDP16不仅对顺铂耐药,同时也针对紫杉醇、卡铂、奥沙利铂和5-FU具有不同程度的耐药特征。该人耐药胃癌细胞株HGC-27/DDP16的日常细胞耐药维护的顺铂浓度达到约16μM。
人耐药胃癌细胞株AGS/DDP24在第48小时的IC50、第72小时的IC50分别为85.340μM和64.226μM,耐药指数RI分别为19.150和24.227。而且,胃癌顺铂耐药细胞AGS/DDP24不仅对顺铂耐药,同时也针对卡铂、奥沙利铂和5-FU具有不同程度的耐药特征。该人耐药胃癌细胞株AGS/DDP24的日常细胞耐药维护的顺铂浓度达到约24μM。
相比于现有技术,本发明具有以下有益的技术效果:
(1)本发明建立的人胃癌细胞株性状稳定,可稳定多次传代,为胃癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。
(2)本发明建立的人胃癌细胞株具有高度耐药性和多药耐药性,是研究胃癌耐药机制的良好试验材料,具有很高的科研价值和开发意义。
(3)本发明的顺铂耐药细胞株建立方法具有高的筛选效率,同时能获得高度耐药细胞株。
(4)本发明建立的人胃癌顺铂耐药细胞株,可用于构建体内、外肿瘤耐药模型,为揭示胃癌耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物提供实验基础。
生物材料的保藏
本发明的胃癌顺铂耐药细胞株,命名为人胃癌细胞HGC-27/DDP16,其于2023年02月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:C202326。
本发明的胃癌顺铂耐药细胞株,命名为人胃腺癌细胞AGS/DDP24,其于2023年02月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:C202325。
附图说明
图1为通过CCK-8检测HGC-27在含不同浓度顺铂的完全培养液A中在48小时、72小时、144小时时的相对细胞活力(分别相对于无顺铂组)的结果。
图2为通过CCK-8检测HGC-27/DDP-1在含不同浓度顺铂的完全培养液A中在48小时、72小时、96小时时的相对细胞活力(分别相对于无顺铂组)的结果。
图3为通过CCK-8检测HGC-27和HGC-27/DDP16在含不同浓度顺铂的完全培养液A中在48小时、72小时的相对细胞活力(分别相对于无顺铂组)的结果比较。
图4为通过CCK-8检测AGS在含不同浓度顺铂的完全培养液A中在48小时、120小时、144小时时的相对细胞活力(分别相对于无顺铂组)的结果。
图5为通过CCK-8检测AGS/DDP-1在含不同浓度顺铂的完全培养液B中在48小时、72小时、96小时时的相对细胞活力(分别相对于无顺铂组)的结果。
图6为通过CCK-8检测AGS和AGS/DDP24在含不同浓度顺铂的完全培养液B中在48小时、72小时时的相对细胞活力(分别相对于无顺铂组)的结果比较。
图7为通过CCK-8检测对比例1~4和对照1~2在含不同浓度顺铂的完全培养液A中培养72小时的相对细胞活力(分别相对于无顺铂组)的结果。
图8A为AGS/DDP3在含有不同浓度组胺的细胞耐药维护培养液中的细胞生长曲线对照。图8B为HGC-27/DDP16在含有不同浓度组胺的细胞耐药维护培养液中的细胞生长曲线对照。图8C为AGS/DDP24在含有不同浓度组胺的细胞耐药维护培养液中的细胞生长曲线对照。图8D为HGC-27/DDP8在含有不同浓度组胺的细胞耐药维护培养液中的细胞生长曲线对照。
图9A和图9B分别为亲本细胞HGC-27和耐药细胞HGC-27/DDP16在显微镜下的观察图片(200×);图9C和图9D分别为亲本细胞AGS和耐药细胞AGS/DDP24在显微镜下的观察图片(200×)。
图10A为HGC-27和HGC-27/DDP16细胞在无顺铂药物干扰下的细胞生长曲线;图10B为AGS和AGS/DDP24细胞在无顺铂药物干扰下的细胞生长曲线。
图11A为亲本细胞和耐药细胞在含不同浓度PTX的细胞完全培养液中作用48小时时CCK-8测定的相对细胞活力结果(相对于无药物组)。
图11B为亲本细胞和耐药细胞在含不同浓度奥沙利铂的细胞完全培养液中作用48小时时,CCK-8测定的相对细胞活力结果(相对于无药物组)。
图11C为亲本细胞和耐药细胞在含不同浓度5-FU的细胞完全培养液中作用48小时时,CCK-8测定的相对细胞活力结果(相对于无药物组)。
图11D为亲本细胞和耐药细胞在含不同浓度卡铂的细胞完全培养液中作用48小时时,CCK-8测定的相对细胞活力结果(相对于无药物组)。
各图中,*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001,****表示p<0.0001,NS表示没有显著性差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,可采用本领域中的常规方法,例如参考《分子克隆实验指南》(第三版,纽约,冷泉港实验室出版社,New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)或按照供应商所建议的条件。
下列实施例中未特别说明的各种仪器、原料和试剂均为本领域熟知的市售产品,可通过商业途径获得。在下列实施例中列出的所使用的具体材料及其来源,仅仅是示例性的,并不意图限制本发明,与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
RPMI 1640培养液购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司(货号CGM111.05)。F-12培养液购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司(货号CGM108.05)。磷酸盐缓冲液(PBS)购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司(货号101.05)。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(货号D119450)。胎牛血清购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司(货号SA201.02)。胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)购自北京索莱宝科技有限公司(货号T1300)。顺铂购自美国selleck公司(货号S1166)。CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所(货号CK04),按照说明书进行操作。HGC-27细胞从中国科学院细胞库购买,目录号TCHu22。AGS细胞从中国科学院细胞库购买,目录号TCHu232。细胞完全培养液A为含10%FBS(胎牛血清)的RPMI1640培养液。细胞完全培养液B为含10%FBS(胎牛血清)的F-12培养液。
含顺铂的细胞完全培养液的配制(现配现用):用DMF将顺铂稀释至浓度为20mM作为顺铂母液。用细胞完全培养液A将顺铂母液稀释至指定浓度得到含不同浓度顺铂的细胞完全培养液A。例如:指定浓度为80μM,40μM,20μM,10μM,5μM,2.5μM,1.25μM,0.625μM,0.3125μM时,得到一系列含梯度浓度顺铂的细胞完全培养液A。用完全培养液B将顺铂母液稀释至指定浓度得到含不同浓度顺铂的细胞完全培养液B,例如:指定浓度为80μM,40μM,20μM,10μM,5μM,2.5μM,1.25μM,0.625μM,0.3125μM时,得到一系列含梯度浓度顺铂的细胞完全培养液B。
mM是mmol/L的简写,μM是μmol/L的简写,nM是nmol/L的简写。
CCK-8检测方法以及IC50、IC10计算说明:
将细胞株置于细胞完全培养液进行培养,在其对数生长期时,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化并吹打为细胞悬液,计数后,调整悬液的细胞浓度为3×104/mL。按照每孔100μL细胞悬液(即,初始铺板细胞数为3000/孔)将细胞接种于96孔细胞培养板,培养24小时后,向96孔板的每个培养孔中加入100μL含顺铂的细胞完全培养液进行培养,各列培养孔中加入的细胞完全培养液中顺铂的浓度如下表1所示,每一浓度设6个复孔,在培养不同时间后分别测定CCK-8,并通过CompuSyn软件分别计算得到每次测定时的IC50和IC10。
表1:各列培养孔中加入的细胞完全培养液中顺铂浓度
注:为了避免周围孔蒸发过快,向最外围培养孔(包括第1、12列、第A、H行)中加入PBS。
其中,CCK-8的测定时间依据以下原则按需设置,通常,第一次测定CCK-8的时间至少应为培养24小时,相邻两次测定CCK-8的时间间隔不应低于24小时。可以多次测定CCK-8,但一般来说,CCK-8的测定均安排在细胞培养2周内完成。第i次测定CCK-8计算得到的IC50和IC10记为IC50(i)和IC10(i)。例如,分别在24小时(第1次)、48小时(第2次)、72小时(第3次)时测定CCK-8,相对应的IC50和IC10,分别记为IC50(1)、IC50(2)、IC50(3)和IC10(1)、IC10(2)、IC10(3)。其中,IC50代表用CCK-8测定细胞半数致死量时的顺铂浓度,IC10代表用CCK-8测定细胞10%致死量时的顺铂浓度。
不同于现有技术中常用的药物浓度梯度递增法和大剂量药物冲击法建立耐药细胞株,本发明通过CCK-8检测确定细胞对顺铂的敏感度,并基于不同细胞对顺铂的敏感性差异,针对不同细胞确定不同体系的多个培养参数,进行耐药细胞的筛选,在高效筛选的同时获得了高度耐药的细胞株。
在此,先对耐药细胞的每次筛选中各培养参数的确定方法进行说明。各培养参数包括Na、Ca、Cb:
每次耐药筛选中加入至培养瓶中的细胞实际数量Na,为每次耐药筛选中加入至培养瓶中的细胞数量理论值N的0.8~1.2倍,N通过以下公式(Ⅰ)计算得到;
每次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂实际浓度Ca,为每次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂浓度理论值C1的0.8~1.2倍,C1通过以下公式(Ⅱ)计算得到;
每次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中顺铂实际浓度Cb,为每次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2的0.5~1.5倍,C2通过以下公式(Ⅲ)计算得到;
其中,
e代表自然指数,即通常所说的而是e的幂;
Sa代表本次筛选所用的培养瓶的底面积,且需要保证细胞将此培养瓶铺满时细胞量不少于1×107个;s代表本次筛选前CCK-8检测时单个培养孔的底面积;n代表本次筛选前CCK-8检测时初始铺板细胞数;IC50(1)为本次筛选前第1次测定CCK-8计算得到的IC50,IC50(3)为本次筛选前第3次测定CCK-8计算得到的IC50;R0为本次筛选所用的细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i与前一次筛选所用的细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-(i-1)的比值,即,R0-i=C2-i/C2-(i-1),由于第一次进行顺铂耐药筛选时细胞未耐受,因此,R0-1设定为1。
实施例1HGC-27耐药细胞的筛选
1.1按照上述培养参数的确定方法来确定第一次顺铂耐药筛选的各项参数
即,首先在三个不同时间分别检测在含有不同浓度的顺铂的细胞完全培养液中细胞生长情况,然后再根据上述公式来计算和确定各项参数。
本步骤的细胞培养中,细胞为HGC-27细胞,细胞完全培养液为细胞完全培养液A,含顺铂的细胞完全培养液为含顺铂的细胞完全培养液A。在HGC-27细胞的培养时间为48小时(第1次)、72小时(第2次)、144小时(第3次)时,分别通过CCK-8检测在含不同浓度的顺铂的细胞完全培养液A中HGC-27的相对细胞活力,顺铂浓度梯度设置如下:0μM,0.3125μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM,40μM,80μM。
根据检测结果计算HGC-27细胞的48小时、72小时、144小时的IC50和IC10,分别记为IC50(1)-1、IC50(2)-1、IC50(3)-1、和IC10(1)-1、IC10(2)-1、IC10(3)-1。检测结果为3次取均值的结果。图1是检测结果的可视化结果,据此计算得到:IC50(1)-1=1.21286μM,IC50(2)-1=0.68502μM,IC50(3)-1=0.64309μM,IC10(3)-1=0.28029μM。
本步骤中,CCK-8检测时96孔板中单个培养孔的底面积s为0.32cm2,新接种细胞的培养瓶的底面积Sa为75cm2,CCK-8检测时初始铺板细胞数n=3000。
根据公式(Ⅰ)计算得到第一次顺铂耐药筛选中加入至培养瓶中的HGC-27细胞数量理论值N-1为180771(1.80771×105)个细胞/培养瓶。为了方便吸取细胞悬液体积,第一次顺铂耐药筛选中实际加入至培养瓶中的HGC-27细胞数量Na-1为1.8×105个细胞/培养瓶。即,每个75cm2培养瓶中转入1.8×105个细胞。根据Corning 75cm2培养瓶中HGC-27细胞汇合率达到100%时获得的细胞计数数量为1.05×107个细胞,因此,实际转入培养瓶中的HGC-27细胞数量为培养瓶中细胞铺满数量的1.72%。(注:若计算得到的细胞接种数量大于培养瓶铺板量的10%,需要将Na个细胞分至多个同等大小的培养瓶中培养,保证细胞铺板数量低于10%。)
根据公式(Ⅱ),计算得出第一次顺铂耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂浓度理论值C1-1为2.026755947μM。为了方便计算,第一次顺铂耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂实际浓度Ca-1为2.0μM。
根据公式(Ⅲ),计算得出第一次顺铂耐药筛选中细胞耐药维护培养液中的最佳顺铂浓度理论值C2-1为0.47278953μM。为了方便计算,第一次顺铂耐药筛选中细胞耐药维护培养液中的顺铂实际浓度Cb-1为0.5μM。
1.2HGC-27顺铂耐药细胞的第一次筛选
将含Na-1(1.8×105)个HGC-27细胞的细胞悬液转入有细胞完全培养液A的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含Ca-1浓度(2.0μM)顺铂的细胞完全培养液A进行培养。第3天换液时,换成含IC50(3)-1浓度(0.64μM)的顺铂的细胞完全培养液A进行培养。在此浓度下连续培养14天。更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,细胞耐药维护培养液为含Cb-1(0.5μM)顺铂的细胞完全培养液A,待细胞增殖至超过1×106个细胞浓度后(约为4个细胞倍增周期),得到第一次筛选耐药株HGC-27/DDP-1。
1.3参考1.1的方法确定第二次顺铂耐药筛选的各项参数
本步骤中,细胞为经过第一次顺铂耐药筛选得到的耐药细胞株HGC-27/DDP-1。在HGC-27/DDP-1细胞的培养时间为48小时(第1次)、72小时(第2次)、96小时或更长(第3次),分别通过CCK-8检测在含不同浓度的顺铂的细胞完全培养液A中HGC-27/DDP-1的相对细胞活力,顺铂浓度梯度设置如下:0μM,0.3125μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM。图2给出了检测结果,检测结果为3次取均值的结果。根据检测结果计算得到相应的IC50(1)-2、IC50(2)-2、IC50(3)-2和IC10(3)-2。IC50(1)-2=4.52555μM、IC50(2)-2=2.22583μM、IC50(3)-2=1.66101μM、IC10(3)-2=0.68417μM。
本步骤中,CCK-8检测时96孔板中单个培养孔的底面积s为0.32cm2,新接种细胞的培养瓶的底面积Sa为75cm2,CCK-8检测时初始铺板细胞数n=3000。根据公式(Ⅰ)~(Ⅲ),分别计算第二次耐药筛选中加入至培养瓶中的HGC-27/DDP-1细胞数量理论值N-2、第二次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液A中顺铂浓度理论值C1-2、第二次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中的最佳顺铂浓度理论值C2-2。N-2=1327185个细胞,C1-2=7.58920665μM,C2-2=1.497727701μM。
实际上,第二次顺铂耐药筛选中加入至培养瓶中总的HGC-27/DDP-1细胞的实际数量Na-2为1.5×106个细胞。根据Corning 75cm2培养瓶中HGC-27/DDP-1细胞汇合率达到100%时获得的细胞计数数量为1.05×107个细胞,按此计算,实际转入培养瓶中的HGC-27细胞数量为培养瓶中细胞铺满数量的14.2%。因此,需要将Na个细胞分至多个同等大小的培养瓶中培养,保证细胞铺板数量低于10%。这里采用了2个培养瓶,在每个75cm2培养瓶中转入0.75×106个细胞,即,实际转入每个培养瓶中的HGC-27细胞数量为培养瓶中细胞铺满数量的7.14%。第二次顺铂耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂实际浓度Ca-2为7.5μM,第二次顺铂耐药筛选中细胞耐药维护培养液中的顺铂实际浓度Cb-2为1.5μM。
1.4参考1.2的方法进行第二次顺铂耐药筛选
将含Na-2(1.5×106)个HGC-27/DDP-1细胞的细胞悬液转入2个有细胞完全培养液A的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含Ca-2浓度(7.5μM)的顺铂的细胞完全培养液A进行培养。第3~5天换液时(每次调整新的顺铂筛选浓度的时间周期需要在3天及以上,一般选择3~5天),换成含IC50(3)-2浓度(1.66μM)的顺铂的细胞完全培养液A进行培养。在此浓度下连续培养14天(最佳的时间范围是14~21天)。更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,细胞耐药维护培养液为含Cb-2浓度(1.5μM)的顺铂的细胞完全培养液A,待细胞增殖至超过1×106个细胞后(平均4个细胞倍增周期),得到第二次筛选耐药株HGC-27/DDP-2。
以此类推,进行7个培养循环(7次筛选)后,获得本发明的人耐药胃癌细胞株HGC-27/DDP16。该人耐药胃癌细胞株HGC-27/DDP16的日常细胞耐药维护培养液中顺铂浓度达到约16μM。
附:本实施例中,第3~7次筛选中所确定的筛选参数如下:
Na-3为3.5×105个,Ca-3为9.00μM,IC50(3)-3为2.55μM,Cb-3为2.00μM;
Na-4为2.0×105个,Ca-4为6.50μM,IC50(3)-4为2.38μM,Cb-4为1.00μM;
Na-5为5.5×105个,Ca-5为13.00μM,IC50(3)-5为4.11μM,Cb-5为2.00μM;
Na-6为1.4×106个,Ca-6为30.00μM,IC50(3)-6为9.52μM,Cb-6为8.00μM;
Na-7为6.4×105个,Ca-7为40.00μM,IC50(3)-7为15.23μM,Cb-7为16.00μM。
1.5HGC-27/DDP16的耐药性能测试
分别在培养48小时、72小时时,通过CCK-8检测在含不同浓度的顺铂的完全培养液A中HGC-27和HGC-27/DDP16的相对细胞活力,顺铂浓度梯度设置如下:0μM,0.3125μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM,40μM,80μM。检测结果为3次取均值的结果。检测结果如图3所示。根据CCK-8检测结果,用CompuSyn软件计算得到HGC-27和HGC-27/DDP16在48小时、72小时的IC50值,基于IC50值可以计算相应的耐药指数RI(RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50),如表2所示。
表2
根据计算结果,可以发现:该人耐药胃癌细胞株HGC-27/DDP16的耐药水平达到第48小时的IC50(1)、第72小时的IC50(2)分别为65.6747μM和51.4369μM,实现对应耐药倍数(耐药指数,RI)为54.149和75.088。当前,耐药胃癌细胞株HGC-27/DDP16已稳定传代50代以上,2~3天传代一次。并且,该耐药胃癌细胞株HGC-27/DDP16对顺铂耐受稳定,其所获得的细胞冻存复苏时,可以直接选用细胞耐药维护培养液进行培养,无需等待细胞贴壁后再更换成含顺铂的细胞完全培养液。
实施例2AGS耐药细胞的筛选
2.1按照上述培养参数的确定方法来确定第一次顺铂耐药筛选的各项参数
即,首先在三个不同时间分别检测在含有不同浓度的顺铂的细胞完全培养液中细胞生长情况,然后再根据各个公式来计算和确定各项参数。
本步骤的细胞培养中,细胞为AGS细胞,细胞完全培养液为细胞完全培养液B,含顺铂的细胞完全培养液为含顺铂的细胞完全培养液B。在AGS细胞的培养时间为48小时(第1次)、120小时(第2次)、144小时(第3次),分别通过CCK-8检测在含不同浓度的顺铂的细胞完全培养液B中AGS的相对细胞活力,顺铂浓度梯度设置如下:0μM,0.3125μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM,40μM,80μM,160μM。
根据CCK-8检测结果计算AGS细胞的48小时、120小时、144小时的IC50和IC90,分别记为IC50(1)-1、IC50(2)-1、IC50(3)-1、和IC10(1)-1、IC10(2)-1、IC10(3)-1。检测结果为3次取均值的结果。图4给出了检测结果,据此计算得到:IC50(1)-1=3.66064μM,IC50(2)-1=1.62148μM,IC50(3)-1=1.26467μM,IC10(3)-1=0.25282μM。
本步骤中,CCK-8检测时96孔板中单个培养孔的底面积s为0.32cm2,新接种细胞的培养瓶的底面积Sa为75cm2,CCK-8检测时初始铺板细胞数n=3000。
根据公式(Ⅰ)计算得到第一次顺铂耐药筛选中加入至培养瓶中的AGS细胞数量理论值N-1为385401(3.85401×105)个细胞/培养瓶。为了方便吸取细胞悬液体积,第一次顺铂耐药筛选中实际加入至培养瓶中的AGS细胞数量Na-1为4.0×105个细胞/培养瓶。即,每个75cm2培养瓶中转入4.0×105个细胞。可计算出Corning 75cm2培养瓶中AGS细胞汇合率达到100%时获得的细胞计数数量为1.25×107个细胞,因此,实际转入培养瓶中的AGS细胞数量为培养瓶中细胞铺满数量的3.08%。
根据公式(Ⅱ),计算得到第一次顺铂耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂浓度理论值C1-1为6.020829727μM。为了方便计算,第一次顺铂耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂实际浓度Ca-1为6.0μM。
根据公式(Ⅲ),计算得出第一次顺铂耐药筛选中细胞耐药维护培养液中的最佳顺铂浓度理论值C2-1为2.298203619μM。为了方便计算,第一次顺铂耐药筛选中细胞耐药维护培养液中的顺铂实际浓度Cb-1为2.0μM。
2.2AGS顺铂耐药细胞的第一次筛选
将含Na-1(4.0×105)个AGS细胞的细胞悬液转入有细胞完全培养液B的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含Ca-1浓度(6.0μM)顺铂的细胞完全培养液B进行培养。第3天换液时,换成含IC50(3)-1浓度(1.26μM)顺铂的细胞完全培养液B进行培养。在此浓度下连续培养14天。更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,细胞耐药维护培养液为含Cb-1(2.0μM)顺铂的细胞完全培养液B,待细胞增殖至超过1×106个细胞后浓度(平均4个细胞倍增周期),得到第一次筛选耐药株AGS/DDP-1。
2.3参考2.1的方法确定第二次顺铂耐药筛选的各项参数
本步骤中,细胞为经过第一次顺铂耐药筛选得到的耐药细胞株AGS/DDP-1。在AGS/DDP-1细胞的培养时间为48小时(第1次)、72小时(第2次)、96小时或更长(第3次),分别通过CCK-8检测在含不同浓度的顺铂的细胞完全培养液B中AGS/DDP-1的相对细胞活力,顺铂浓度梯度设置如下:0μM,0.3125μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM。图5给出了检测结果,检测结果为3次取均值的结果。根据检测结果计算得到AGS/DDP-1的IC50(1)-2、IC50(2)-2、IC50(3)-2和IC10(3)-2,具体如下:IC50(1)-2=4.84625μM、IC50(2)-2=2.58913μM、IC50(3)-2=2.09412μM和IC10(3)-2=0.46565μM。
本步骤中,CCK-8检测时96孔板中单个培养孔的底面积s为0.32cm2,新接种细胞的培养瓶的底面积Sa为75cm2,CCK-8检测时初始铺板细胞数n=3000。根据公式(Ⅰ)~(Ⅲ),分别计算第二次耐药筛选中加入至培养瓶中的AGS/DDP-1细胞数量理论值N-2、第二次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂浓度理论值C1-2、第二次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中的最佳顺铂浓度理论值C2-2。N-2=957440个细胞,C1-2=8.301910676μM,C2-2=2.94654984μM。
实际上,第二次顺铂耐药筛选中加入至培养瓶中的AGS/DDP-1细胞的实际数量Na-2为1.0×106细胞/培养瓶。根据Corning 75cm2培养瓶中AGS/DDP-1细胞汇合率达到100%时获得的细胞计数数量为1.25×107个细胞,计算得到实际转入培养瓶中的AGS/DDP-1细胞数量为培养瓶中细胞铺满数量的8.0%。第二次顺铂耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂实际浓度Ca-2为8.0μM,第二次顺铂耐药筛选中细胞耐药维护培养液中的顺铂实际浓度Cb-2为3.0μM。
2.4参考1.2的方法进行第二次顺铂耐药筛选
将含Na-2(1.0×106)个AGS/DDP-1细胞的细胞悬液转入有细胞完全培养液B的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含Ca-2浓度(8.0μM)顺铂的细胞完全培养液B进行培养。第3~5天换液时(每次调整新的顺铂筛选浓度的时间周期需要在3天及以上,一般选择3~5天),换成含IC50(3)-2浓度(2.09μM)的顺铂的细胞完全培养液B进行培养。在此浓度下连续培养14天(最佳的时间范围是14天~21天)。更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,细胞耐药维护培养液为含Cb-2浓度(3.0μM)的顺铂的完全培养液B,待细胞增殖至超过1×106个细胞后(平均4个细胞倍增周期),得到第二次筛选耐药株AGS/DDP-2(也可记为耐药细胞株AGS/DDP3)。
依此类推,进行7个培养循环(7次筛选)后,获得本发明的人耐药胃癌细胞株AGS/DDP24。该人耐药胃癌细胞株AGS/DDP24的日常细胞耐药维护培养液中顺铂浓度达到约24μM。
附:本实施例中,第3~7次筛选中所确定的筛选参数如下:
Na-3为4.0×105个,Ca-3为14μM,IC50(3)-3为4.48μM,Cb-3为4.00μM;
Na-4为5.0×105个,Ca-4为25μM,IC50(3)-4为9.11μM,Cb-4为8.00μM;
Na-5为3.6×105个,Ca-5为35μM,IC50(3)-5为14.74μM,Cb-5为12.000μM;
Na-6为3.6×106个,Ca-6为60μM,IC50(3)-6为12.62μM,Cb-6为10.00μM;
Na-7为3.6×105个,Ca-7为60μM,IC50(3)-7为46.98μM,Cb-7为24.00μM。
2.5AGS/DDP24的耐药性能测试
分别在培养48小时、72小时通过CCK-8检测在含不同浓度的顺铂的细胞完全培养液B中AGS和AGS/DDP24细胞的相对细胞活力,顺铂浓度梯度设置如下:0μM,0.3125μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM,40μM,80μM,160μM。检测结果为3次取均值的结果。检测结果如图6所示。根据CCK-8检测结果,利用CompuSyn软件可以计算得到AGS和AGS/DDP24的48小时、72小时的IC50值,基于IC50值可以计算相应的耐药指数RI(RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50),如表3所示。
表3
由表3可见:该人耐药胃癌细胞株AGS/DDP24的耐药水平达到第48小时的IC50(1)、第72小时的IC50(2)分别为85.340μM和64.226μM,实现对应耐药倍数为19.150和24.227。目前,耐药胃癌细胞株AGS/DDP24已稳定传代50代以上,3~4天传代一次。
对比例1顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D1的制备
(1)将胃癌细胞HGC-27的细胞悬液转入含有细胞完全培养液A的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待细胞增殖至约60~70%汇合率时,吸弃原培养液,加入含0.2μM顺铂的细胞完全培养液A,培养1小时后弃去含药培养液,加入1.5ml的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液,接着以1×105/ml细胞浓度5ml接种于新培养瓶中,加入无药的细胞完全培养液A,在37℃、5%CO2条件下培养,待细胞长至约60~70%贴壁率时再次加入含0.2μM顺铂的细胞完全培养液A处理,24小时后换无药的细胞完全培养液A。以此方式,维持顺铂的作用浓度不变培养4周后,认为获得在该顺铂浓度下稳定生长、传代的细胞株;
(2)对于步骤(1)得到的胃癌耐药细胞株,按照与步骤(1)相同的方法,用含0.6μM顺铂的细胞完全培养液A进行培养,4周后获得在该顺铂浓度下稳定生长、传代的细胞株;
(3)对于步骤(2)得到的胃癌耐药细胞株,按照与步骤(1)相同的方法,用含1.8μM顺铂的细胞完全培养液A进行培养,4周后获得在该顺铂浓度下稳定生长、传代的细胞株。记作:顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D1。
对比例2顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D2的制备
将胃癌细胞HGC-27悬液转入含有细胞完全培养液A的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待细胞增殖至约60~70%汇合率时,吸弃原培养液,加入含1.8μM顺铂的细胞完全培养液A,培养1小时后弃去含药培养液,加入1.5ml的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液,接着以1×105/ml细胞浓度5ml接种于新培养瓶中,加入无药的细胞完全培养液A,在37℃、5%CO2条件下培养,待细胞长至约60~70%贴壁率时再次加入含1.8μM顺铂的细胞完全培养液A处理,24小时后换新鲜的无药的细胞完全培养液A。以此方式,维持顺铂的作用浓度不变,培养12周,得到新的顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D2。
对比例3顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D3的制备
(1)将胃癌细胞HGC-27悬液转入含有细胞完全培养液A的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待细胞增殖至约50%汇合率时,吸弃原培养液,加入1.5ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液,使得贴壁细胞完全悬浮,弃去50%细胞,即为25%细胞密度,加入细胞完全培养液A,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24小时后加入含0.2μM顺铂的细胞完全培养液A,培养1小时后弃去含药培养液,加入无药的细胞完全培养液A,在37℃、5%CO2条件下培养。待细胞长至约50%贴壁率时,加入1.5ml含EDTA胰酶消化液,使得贴壁细胞完全悬浮,弃去50%细胞,转入新培养瓶中,加入新鲜的细胞完全培养液A,24小时后再次加入含0.2μM顺铂的细胞完全培养液A处理,24小时后换无药的细胞完全培养液A。以此方式,维持顺铂的作用浓度不变,培养4周后,认为获得在该顺铂浓度下稳定生长、传代的细胞株;
(2)对于步骤(1)得到的胃癌耐药细胞株,按照与步骤(1)相同的方法,用含0.6μM顺铂的细胞完全培养液A进行培养,4周后获得在该顺铂浓度下稳定生长、传代的细胞株;
(3)对于步骤(2)得到的胃癌耐药细胞株,按照与步骤(1)相同的方法,用含1.8μM顺铂的细胞完全培养液A进行培养,4周后获得在该顺铂浓度下稳定生长、传代的细胞株。记作:顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D3。
对比例4顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D4的制备
将胃癌细胞HGC-27悬液转入含有细胞完全培养液A的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待细胞增殖至约50%汇合率时,吸弃原培养液,加入1.5ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液,使得贴壁细胞完全悬浮,弃去50%细胞,即为25%细胞密度,加入细胞完全培养液A,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待次日细胞贴壁后,
吸弃原培养液,加入含1.8μM顺铂的细胞完全培养液A,培养1小时后弃去含药培养液,加入1.5ml含EDTA胰酶消化液,接着以1×105/ml细胞浓度5ml接种于新培养瓶中,加入新鲜的细胞完全培养液A,在37℃、5%CO2条件下培养,待细胞长至约25%贴壁率时再次加入含1.8μM顺铂的细胞完全培养液A处理,24小时后换新鲜的细胞完全培养液。以此方式,维持顺铂的作用浓度不变,一共培养12周,得到新的顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D4。
采用前述CCK-8检测方法分别测定上述对比例1~4所得到的各顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP-D1、HGC-27/DDP-D2、HGC-27/DDP-D3、HGC-27/DDP-D4在含不同浓度顺铂的细胞完全培养液A中培养72小时的细胞活力,如图7所示。同时,将实施例1中总的培养时间为12周时得到的耐药胃癌细胞株(记作HGC-27/DDP-3)以及细胞母株HGC-27分别作为对照1和对照2,采用前述CCK-8检测方法,测定两种细胞株在含不同浓度顺铂的细胞完全培养液A中培养72小时的细胞活力,如图7所示。顺铂浓度梯度设置如下:0μM,0.3125μM,0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM。检测结果为3次取均值的结果。根据CCK-8检测结果,利用CompuSyn软件计算得到对比例1~4和对照1~2的细胞在72小时时耐受顺铂的IC50值,结果如下表4所示。
表4
由图7和表4可见,实施例1中总的培养时间为12周时所得耐药胃癌细胞株HGC-27/DDP-3(即对照1)的顺铂耐药程度最高(p<0.0001),对比例1~4所得耐药细胞株与细胞母株HGC-27(对照2)的顺铂耐药程度没有明显差异(p>0.05)。表4中,***代表p<0.0001。说明按照对比例1~4的方法并未获得顺铂耐药胃癌细胞株。
实施例3~6耐药细胞的耐药维护
实施例3:将耐药细胞AGS/DDP3(实施例2中第二次筛选耐药株)置于不同组成的细胞耐药维护培养液中进行细胞增殖实验并测定细胞生长曲线。不同组成的细胞耐药维护培养液为含有不同浓度组胺和3.0μM顺铂的细胞完全培养液B。
实施例4:将耐药细胞HGC-27/DDP16置于不同组成的细胞耐药维护培养液中进行细胞增殖实验并测定细胞生长曲线。不同组成的细胞耐药维护培养液为含有不同浓度的组胺和16μM顺铂的细胞完全培养液A。
实施例5:将耐药细胞AGS/DDP24置于不同组成的细胞耐药维护培养液中进行细胞增殖实验并测定细胞生长曲线。不同组成的细胞耐药维护培养液为含有不同浓度的组胺和24μM顺铂的细胞完全培养液B。
实施例6:将耐药细胞HGC-27/DDP8(实施例1中第六次筛选耐药株)置于不同组成的细胞耐药维护培养液中进行细胞增殖实验并测定细胞生长曲线。不同组成的细胞耐药维护培养液为含有不同浓度的组胺和8μM顺铂的细胞完全培养液A。
各个实施例中,不同组成的细胞耐药维护培养液中组胺的浓度依次为:0nM、3.90625nM、7.8125nM、15.625nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM。组胺浓度为0nM作为无组胺对照。
实施例3的检测结果如图8A所示:从培养至18小时开始,耐药细胞AGS/DDP3的增殖速率开始有所改变;培养至108小时时,相对于无组胺组,给予组胺的各组中细胞增殖速率有32~39%的提升,尤其是当组胺浓度在15.625~62.5nM时,其细胞增殖效率最高,且显著高于无组胺组对照的耐药细胞增殖效率。
实施例4的检测结果如图8B所示:培养至120小时时,相对于无组胺组,给予组胺各组中细胞增殖速率有20~187%的提升,尤其是当组胺浓度15.625~125nM时,增殖速率提高71~187%。当组胺浓度为62.5nM时,增殖效率最高为187%。
实施例5的检测结果如图8C所示:培养至120小时时,相对于无组胺组,给予组胺的各组中细胞增殖速率有8~208%的提升,尤其是当组胺浓度15.625~125nM时,增殖速率提高24~208%。当组胺浓度为62.5nM时,增殖效率最高为208%。
实施例6的检测结果如图8D所示:培养至120小时时,相对于无组胺组,给予组胺的各组中细胞增殖速率有1~23%的提升,尤其是当组胺浓度在31.25~125nM时,增殖速率提高5~23%。当组胺浓度为31.25nM时,增殖效率最高为23%。
第二部分:细胞系的生物学特性
(一)形态学观察:
取人胃癌细胞亲本和人胃癌顺铂耐药细胞接种到10cm2培养皿当中,待生长至对数期,分别置于倒置显微镜(日本奥林巴斯CKX53倒置显微镜)下观察活细胞形态并拍照,如图9A和图9B、图9C和图9D所示,放大倍数均为200倍。图9A和图9B分别对应亲本细胞HGC-27和耐药细胞HGC-27/DDP16,两者形貌上无明显差异,仅仅是耐药细胞的伪足更短。图9C和图9D分别对应亲本细胞AGS和耐药细胞AGS/DDP24,两者形貌上无明显差异。
(二)耐药细胞系的遗传物质STR分析
短串联重复序列(short tandem repeat,STR)又称为微卫星DNA,是指染色体上由数个(2~6个)碱基对作为核心单位,串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10~60多次,基因片段在400碱基对以下);每个核心单位重复的次数会出现个体差异,从而形成片段长度不同的等位基因。因此,一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的,是个体的基因身份特征,也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。委托上海翼和应用生物技术有限公司进行细胞遗传质量鉴定检测。细胞库为DSMZ。对耐药细胞的STR鉴定结果显示HGC-27/DDP16与HGC-27的相似度为92%,AGS/DDP24与AGS的相似度为100%,说明这两个耐药细胞株没有其他细胞污染。
(三)细胞生长曲线
分别取对数生长期的亲本胃癌细胞和胃癌顺铂耐药细胞,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞,以2000个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中,采用细胞完全培养液A(适用于HGC-27和HGC-27/DDP16)或细胞完全培养液B(适用于AGS和AGS/DDP24),在培养温度37℃、气体环境为5%CO2/95%空气(v/v)、湿度为饱和湿度的孵育箱中培养。利用艾森多功能实时无标记细胞分析仪(xCELLigence RTCA S16)测定细胞的生长曲线,待细胞生长到平台期结束实验,以培养时间为横坐标,细胞生长指数为纵坐标,绘制生长曲线,分别对应于图10A和图10B。
图10A显示的是HGC-27和HGC-27/DDP16细胞在无顺铂药物干扰下的细胞生长曲线。由图10A可见,与亲本细胞相比,HGC-27/DDP16细胞周期变长,增殖缓慢,符合耐药细胞的增殖周期长、生长缓慢的特点,可以认为成功获得耐药细胞。
图10B显示的是AGS和AGS/DDP24细胞在无顺铂药物干扰下的的细胞生长曲线。从图10B可以看出,与亲本细胞相比,AGS/DDP24细胞周期变长,增殖缓慢,符合耐药细胞的增殖周期长、生长缓慢的特点,可以认为成功获得耐药细胞。
(四)多药耐药实验
含卡铂(Carboplatin,购自MCE公司,HY-17393)的细胞完全培养液的配制(现配现用):用60℃灭菌纯水溶解卡铂粉末,并超声保证溶解充分,配制成10mM卡铂母液。用细胞完全培养液A或者细胞完全培养液B将卡铂母液稀释至指定浓度(为200μM,100μM,50μM,25μM,12.5μM,6.25μM,3.125μM,0μM),得到一系列含梯度浓度卡铂的细胞完全培养液C/细胞完全培养液D。
含奥沙利铂(Oxalipatin,购自MCE公司,HY-17371)的细胞完全培养液的配制(现配现用):用60℃灭菌纯水溶解奥沙利铂粉末,并超声保证溶解充分,配制成5mM奥沙利铂母液。用细胞完全培养液A或者细胞完全培养液B将奥沙利铂母液稀释至指定浓度(200μM,100μM,50μM,25μM,12.5μM,6.25μM,3.125μM,0μM),得到含一系列含梯度浓度奥沙利铂的细胞完全培养液E/细胞完全培养液F。
含5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU,购自MCE公司,HY-90006)的细胞完全培养液的配制(现配现用):用DMSO溶解5-FU粉末,配制成350mM 5-FU母液。用细胞完全培养液A或者细胞完全培养液B将5-FU母液稀释至指定浓度(2800μM,1400μM,700μM,350μM,175μM,87.5μM,43.75μM,21.875μM,10.9375μM,5.46875μM,2.734375μM,0μM),得到一系列含梯度浓度5-FU的细胞完全培养液G/细胞完全培养液H。
含紫杉醇(Paclitaxel,PTX,购自Selleck公司,S1150)的细胞完全培养液的配制(现配现用):用DMSO溶解PTX粉末,配制成20mM PTX母液。用细胞完全培养液A或者细胞完全培养液B将PTX母液稀释至指定浓度(200nM,100nM,50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.125nM,0μM),得到一系列含梯度浓度PTX的细胞完全培养液J/细胞完全培养液K。
分别取对数生长期的亲本胃癌细胞HGC-27、AGS和胃癌顺铂耐药细胞HGC-27/DDP16、AGS/DDP24,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化并吹打为细胞悬液,计数后,调整悬液的细胞浓度为3×104/mL。按照每孔100μL细胞悬液(即,以3000个细胞/孔的铺板密度)接种于96孔培养板中,采用细胞完全培养液A(适用于HGC-27和HGC-27/DDP16)或细胞完全培养液B(适用于AGS和AGS/DDP24),在培养温度37℃、气体环境为5%CO2/95%空气(v/v)、湿度为饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。铺板24小时后,向每孔中加入100μL含不同浓度药物的细胞完全培养液(HGC-27和HGC-27/DDP16采用细胞完全培养液C/E/G/J,AGS和AGS/DDP24采用细胞完全培养液D/F/H/K),将细胞板放回原培养环境中,奥沙利铂、5-FU和PTX组各继续培养48小时,卡铂组培养120小时,再进行细胞活力测定。根据细胞活力测定结果,用CompuSyn软件计算出相应作用时间下亲本细胞和耐药细胞的IC50,进而计算RI值。同时,设置上述亲本细胞和耐药细胞的无药物组(药物浓度为0)培养作为对照。
各细胞完全培养液中加入的药物浓度如下表5所示。由于每孔中细胞悬液与含药物的细胞完全培养液的体积比为1:1,因此药物的实际作用浓度为药物配制浓度的1/2。
表5
亲本细胞和耐药细胞在含不同浓度PTX的细胞完全培养液中作用48小时时,CCK-8测定的细胞活力结果(相对于无药物组)如图11A所示。检测数据为三次取均值的结果。
亲本细胞和耐药细胞在含不同浓度奥沙利铂的细胞完全培养液中作用48小时时,CCK-8测定的细胞活力结果(相对于无药物组)如图11B所示。检测数据为三次取均值的结果。
亲本细胞和耐药细胞在含不同浓度5-FU的细胞完全培养液中作用48小时时,CCK-8测定的细胞活力结果(相对于无药物组)如图11C所示。检测数据为三次取均值的结果。
亲本细胞和耐药细胞在含不同浓度卡铂的细胞完全培养液中作用48小时时,CCK-8测定的细胞活力结果(相对于无药物组)如图11D所示。检测数据为三次取均值的结果。
根据上述检测结果,计算亲本细胞与耐药细胞对卡铂、奥沙利铂、5-FU、PTX药物的IC50和对应耐药指数(RI),如表6所示。
表6
注:RI为耐药指数
由此可见,顺铂耐药细胞HGC-27/DDP16和AGS/DDP24不仅对顺铂耐药,同时也针对紫杉醇、卡铂、奥沙利铂和5-FU具有不同程度的耐药特征(除了AGS/DDP24对紫杉醇没有耐药改变之外)。
可见,本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明,在不背离所述原理的情况下,实施方式可作任意修改。所以,本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
Claims (10)
1.一种胃癌顺铂耐药细胞株的建立方法,包括以下步骤:
(1)第一次筛选:将含Na-1个胃癌细胞的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含浓度为Ca-1的顺铂的细胞完全培养液进行培养;第3~5天换液时,换成含浓度为IC50(3)-1的顺铂的细胞完全培养液进行培养,并在此浓度下连续培养14~21天;然后,更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-1的顺铂的细胞完全培养液,待细胞增殖至超过1×106个细胞后,得到第一次筛选耐药细胞株;
(2)第二次筛选:将含Na-2个所述第一次筛选耐药细胞株的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含浓度为Ca-2的顺铂的细胞完全培养液进行培养;第3~5天换液时,换成含浓度为IC50(3)-2的顺铂的细胞完全培养液进行培养,并在此浓度下连续培养14~21天;然后,更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-2的顺铂的细胞完全培养液,待细胞增殖至超过1×106个细胞后,得到第二次筛选耐药细胞株;
……
(i)第i次筛选:将含Na-i个第i-1次筛选耐药细胞株的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;待次日细胞贴壁后,吸弃原培养液,加入含浓度为Ca-i的顺铂的细胞完全培养液进行培养;第3~5天换液时,换成含浓度为IC50(3)-i的顺铂的细胞完全培养液进行培养,并在此浓度下连续培养14~21天;然后,更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养,所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-i的顺铂的细胞完全培养液,待细胞增殖至超过1×106个细胞后,得到第i次筛选耐药细胞株;
其中,
Na-i为第i次耐药筛选中加入至培养瓶中的细胞实际数量,其为第i次耐药筛选中加入至培养瓶中的细胞数量理论值N-i的0.8~1.2倍;
Ca-i为第i次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂实际浓度,其为第i次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂浓度理论值C1-i的0.8~1.2倍;
Cb-i为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中顺铂实际浓度,其为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i的0.5~1.5倍;
每次耐药筛选中各理论值N、C1、C2通过以下方式预先获得:
①每次耐药筛选前,在三个不同时间点分别检测在含有不同浓度的顺铂的细胞完全培养液中细胞生长情况,并基于此计算得到在第一次、第二次和第三次的时间点检测得到的IC50和IC10,分别记为:IC50(1)、IC50(2)、IC50(3)、IC10(1)、IC10(2)和IC10(3);相邻两次检测的时间间隔不应低于24小时;
②通过以下公式(Ⅰ)~(Ⅲ)计算得到每次耐药筛选中各理论值N、C1、C2:
其中,
Sa代表本次筛选所用的培养瓶的底面积;s代表步骤①中检测时单个培养孔的底面积;n代表步骤①中检测时初始铺板细胞数;R0为本次筛选所用的细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i与前一次筛选所用的细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-(i-1)的比值,即,R0-i=C2-i/C2-(i-1),且R0-1设定为1。
2.如权利要求1所述的细胞株的建立方法,其特征在于,步骤(1)中所述胃癌细胞为HGC-27和所述细胞完全培养液为含10%FBS的RPMI 1640培养液,第7次筛选所得的胃癌顺铂耐药细胞株为人胃癌细胞HGC-27/DDP16。
3.如权利要求1所述的细胞株的建立方法,其特征在于,步骤(1)中所述胃癌细胞为AGS和所述细胞完全培养液为含10%FBS的F-12培养液,第7次筛选所得的胃癌顺铂耐药细胞株为人胃癌细胞AGS/DDP24。
4.如权利要求1所述的细胞株的建立方法,其特征在于,第1次检测的时间点至少为培养24小时,所有检测均在细胞培养2周内完成。
5.如权利要求1所述的细胞株的建立方法,其特征在于,所述细胞耐药维护培养液中还含有浓度为15.625~125nM的组胺。
6.一种胃癌顺铂耐药细胞株,其特征在于,命名为人胃癌细胞HGC-27/DDP16,其于2023年02月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:C202326。
7.如权利要求6所述胃癌顺铂耐药细胞株的子代细胞。
8.一种胃癌顺铂耐药细胞株,其特征在于,命名为人胃腺癌细胞AGS/DDP24,其于2023年02月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:C202325。
9.如权利要求8所述胃癌顺铂耐药细胞株的子代细胞。
10.一种细胞耐药维护培养液,为含15.625~125nM的组胺和浓度为Cb-i的顺铂的细胞完全培养液,Cb-i为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中顺铂实际浓度,其为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i的0.5~1.5倍,C2-i通过以下方式预先获得:
①第i次耐药筛选前,在三个不同时间点分别检测在含有不同浓度的顺铂的细胞完全培养液中细胞生长情况,并基于此计算得到在第一次、第二次和第三次的时间点检测得到的IC50和IC10,分别记为:IC50(1)、IC50(2)、IC50(3)、IC10(1)、IC10(2)和IC10(3);相邻两次检测的时间间隔不应低于24小时;
②通过以下公式(Ⅲ)计算得到第i次耐药筛选中理论值C2-i:
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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CN118256440A true CN118256440A (zh) | 2024-06-28 |
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