CN108642016A - Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents
Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108642016A CN108642016A CN201810294236.9A CN201810294236A CN108642016A CN 108642016 A CN108642016 A CN 108642016A CN 201810294236 A CN201810294236 A CN 201810294236A CN 108642016 A CN108642016 A CN 108642016A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gist
- cell
- imatinib
- kit
- drug
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株命名为GIST‑FR,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTC NO:C2017111。同时本发明还提供了这一细胞株的构建方法以及该细胞株作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路研究的细胞模型的用途,采用组织块培养法获取GIST原代细胞,并进行永生化,建立GIST‑F细胞系,随后对其进行Imatinib耐药诱导,建立Imatinib耐药的GIST细胞株GIST‑FR。GIST‑FR细胞已体外传代40余代,较GIST‑F细胞生长慢,对Imatinib的IC50显著增高,耐药指数为3.52(P<0.01);全外显子组测序结果显示GIST‑FR细胞KIT和PDGFRA均阴性。本发明从人GIST原代组织成功建立GIST细胞系,并进一步诱导获得其Imatinib耐药细胞,为GIST发病机制及耐药相关研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及耐药细胞株及其构建方法和应用,尤其涉及一种Imatinib耐药的 KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
GIST(胃肠道间质瘤)是胃肠道中最常见的间叶性肿瘤,约占胃肠道恶性肿瘤的1%~3%。研究发现,约85%的胃肠道间质瘤(GIST)存在KIT(65%) 或PDGFRA(20%)基因突变。KIT和PDGFRA都属于跨膜Ⅲ型酪氨酸受体家族。
目前,关于胃肠道间质瘤(GIST)的发病机制、病理诊断、临床治疗等方面的研究都取得了很大的进步,酪氨酸激酶抑制剂,主要是伊马替尼(Imatinib) 等分子靶向药物的应用,极大的提高了胃肠道间质瘤(GIST)的临床疗效。但伊马替尼(Imatinib)不能完全根除胃肠道间质瘤(GIST),部分患者在接受伊马替尼(Imatinib)治疗两年内出现继发耐药,耐药成为影响伊马替尼(Imatinib) 疗效的关键因素之一。
目前,国外已建立的较为经典的胃肠道间质瘤(GIST)细胞株很少,如 GIST-882、GIST-T1等,且均存在KIT突变。但是,未见针对国人建立胃肠道间质瘤(GIST)细胞株的报道,且没有KIT和PDGFRA野生型GIST细胞。为此,从人原代GIST肿瘤组织构建了一株永生化GIST细胞系,并进一步构建了其伊马替尼(Imatinib)耐药细胞株,经全外显子组测序为KIT和PDGFRA野生型,以期为研究胃肠道间质瘤(GIST)发病机制及耐药机制提供基础。
发明内容
针对上述存在的问题,本发明提供一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用,以克服目前国内未建立伊马替尼耐药的 KIT和PDGFRA野生型GIST耐药细胞株导致研究GIST发病机制及耐药机制较为困难的问题,从而为GIST耐药相关研究奠定基础,加大国家在国际医学上的影响力。
为了实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,命名为GIST-FR,保藏于中国典型培养物保藏中心,其细胞株的保藏编号CCTC NO:C2017111,保藏日期为2017年8月16日,保藏单位地址为湖北省武汉市武汉大学,分类命名为:Gastrointestinal CélulaTumore Cellulis。
上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,其中,所述 Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株经全外显子组测序,结果显示其KIT和PDGFRA均无突变,其细胞形态呈短梭形。。
上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,其中,所述 Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株耐药前IC50为15.91,耐药后IC50为55.95,耐药指数为3.52。
上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,其中,所述 Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株为KIT和PDGFRA野生型。
上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途。
上述的伊马替尼耐药的GIST耐药细胞株的构建方法,其中,包括以下步骤:
(1)原代GIST细胞的获得
取手术切除的新鲜人胃肠道间质瘤GIST组织,剔除周围坏死组织及粘膜后,分别用含5%双抗的PBS和1640培养液洗涤3次;剪成1mm3小组织块;取所述小组织块接种于胶原包被后的六孔板中,放置于37℃培养箱中培养,8 小时后各孔加200μL含20%FBS的1640培养液;第二天换液,将新的200μL 含20%FBS的1640培养液换至六孔板中,以后每两天换一次培养液,直至细胞爬出所述小组织块生长至局部密集;
(2)永生化GIST细胞GIST-F的构建
采用pLVX-IRES-Neo-SV40 large T和pLOX-TERT-iresTK慢病毒质粒分别进行慢病毒包装;待细胞爬出所述小组织块生长至局部密集时,去除所述小组织块,再用pLVX-IRES-Neo-SV40 large T和pLOX-TERT-iresTK两种病毒共同感染GIST细胞,命名为GIST-F;6小时后换液,将新的2mL含20%FBS的1640 培养液换至六孔板中;之后扩大培养并进行细胞鉴定;用定量RT-PCR方法检测 SV40 large T的基因表达,SV40 large T引物序列为F-5’AAGCATTGCCTGGAACGCA3’,R-5’TCAGCCACAGGTCTGTACCA3’;
(3)伊马替尼耐药细胞株GIST-FR的建立
采用逐步递增伊马替尼浓度的方法诱导GIST-F细胞耐药;待细胞进入对数生长期后,从IC50的1/20开始加药诱导,常规传代,等细胞耐受后,逐步提升药物浓度;直到细胞在3倍IC50以上的药物浓度中可稳定生长,将其命名为 GIST-FR。
上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法,其中,步骤(1)中所述胶原的浓度为200ug/mL。
上述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法,其中,步骤(1)中,当所述小组织块在所述六孔板中贴壁牢固后,所换的培养液为2mL含20%FBS的1640培养液。
本发明提供了一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,命名为GIST-FR,保藏于中国典型培养物保藏中心,其细胞株的保藏编号CCTC NO:C2017111。同时本发明还提供了这一细胞株的构建方法以及该细胞株作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途,采用组织块培养法获取GIST原代细胞,并进行永生化,建立GIST-F细胞系,随后对其进行Imatinib耐药诱导,建立Imatinib耐药的GIST细胞株GIST-FR. GIST-FR细胞已体外传代40余代,较GIST-F细胞生长慢,对Imatinib的IC50 显著增高,耐药前IC50为15.91,耐药后IC50为55.95,耐药指数为3.52(P< 0.01);全外显子组测序结果显示GIST-FR细胞KIT和PDGFRA均阴性。本发明从人GIST原代组织成功建立GIST细胞系,并进一步诱导获得其Imatinib耐药细胞,为GIST耐药相关研究奠定了基础。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制实施例所作的详细描述,本发明及其特征、外形和优点将会变得更加明显,在全部附图中相同的标记指示相同的部分,并未刻意按照比例绘制附图,重点在于示出本发明的主旨。
图1是显微镜下的原代细胞、永生化细胞和Imatinib耐药细胞GIST-FR的示意图;
图2是GIST-FR来源的肿瘤组织的CD117和DOG-1表达及耐药前永生化细胞的CD117表达的示意图;
图3是GIST-FR细胞Imatinib药物敏感试验及生长曲线的示意图;
图4是GIST-FR细胞的细胞周期的示意图;
图5是对GIST-FR进行了KIT和PDGFRA常见外显子突变的验证示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步的说明,但是不作为本发明的限定。
实施例1:
本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,命名为GIST-FR,保藏于中国典型培养物保藏中心,其细胞株的保藏编号 CCTC NO:C2017111,保藏日期为2017年8月16日,保藏单位地址为湖北省武汉市武汉大学,分类命名为:Gastrointestinal Célula Tumore Cellulis。
本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株中,伊马替尼耐药的GIST细胞株GIST-FR细胞已经体外传代40余代;细胞形态呈短梭形;KIT和PDGFRA均不存在突变;GIST-FR细胞较非耐药裸细胞生长慢,对Imatinib的IC50显著增高,耐药指数为3.52(P<0.01);耐药前后细胞周期分别为G0/Gl期(24.59±5.63%vs 44.76±2.11%),S期(69.60±4.53% vs 52.64±0.60%),G2/M期(5.82±1.10%vs 2.60±1.50%)(P<0.05)。
本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株可作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途。
本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法,包括以下步骤:
(1)原代胃肠道间质瘤(GIST)细胞的获得
取手术切除的新鲜人GIST组织,剔除周围坏死组织及粘膜后,分别用含 5%双抗的PBS和1640培养液洗涤3次;剪成1mm3小组织块;取小组织块接种于浓度为200ug/mL胶原包被后的六孔板中,放置于37℃培养箱中培养,8小时后各孔加200μL含20%FBS的1640培养液;第二天换液,将新的200μL 含20%FBS的1640培养液换至六孔板中,以后每两天换一次培养液,直至细胞爬出小组织块生长至局部密集,其中,当小组织块在所述六孔板中贴壁牢固后,所换的培养液为2mL含20%FBS的1640培养液;200μL或者2mL是根据所选用的培养皿的规格确定的,本申请的权利要求书以及实施例中均采用的是六孔板,但是也可以根据需要选用12孔板或者24孔板等,此时所加入的培养液量就根据培养皿来确定;
(2)永生化GIST细胞GIST-F的构建
采用pLVX-IRES-Neo-SV40 large T和pLOX-TERT-iresTK慢病毒质粒分别进行慢病毒包装;待细胞爬出所述小组织块生长至局部密集时,去除所述小组织块,再用pLVX-IRES-Neo-SV40 large T和pLOX-TERT-iresTK两种病毒共同感染GIST细胞,命名为GIST-F;6小时后换液,将新的2mL含20%FBS的1640 培养液换至六孔板中;之后扩大培养并进行细胞鉴定;用定量RT-PCR方法检测 SV40 large T的基因表达,SV40 large T引物序列为F-5’AAGCATTGCCTGGAACGCA3’,R-5’TCAGCCACAGGTCTGTACCA3’;
(3)伊马替尼耐药细胞株GIST-FR建立
采用逐步递增伊马替尼浓度的方法诱导GIST-F细胞耐药;待细胞进入对数生长期后,从IC50的1/20开始加药诱导,常规传代,等细胞耐受后,逐步提升药物浓度;直到细胞在3倍IC50以上的药物浓度中可稳定生长,将其命名为 GIST-FR。
同时,本发明实施例1中还对耐药诱导前GIST细胞的鉴定、耐药细胞 GIST-FR的形态学观察、生物学特性鉴定及基因突变检测,包括:
①药物诱导前GIST细胞的鉴定
GIST-F细胞来源于临床肿瘤组织,IHC检测结果显示该肿瘤组织呈CD117 阳性和DOG-1阳性(参见图2-A);取制作好的GIST细胞爬片,Triton-X100 通透20分钟;PBS洗3次,5分钟/次;5%BSA封闭1小时,加CD117抗体 (1:100),4℃孵育过夜。第二天二抗孵育2小时;DAB显色5-10分钟,清水清洗,苏木素染色并清洗后封片。对照组为结直肠癌细胞HCT-116(参见图 2-B);从GIST细胞中提取蛋白,定量后,用Westernblot方法检测CD117蛋白表达。对照组为HCT-116细胞(参见图2-C)。
②耐药细胞GIST-FR的形态学观察
采用组织块培养法获取GIST原代细胞,十余天后细胞逐渐爬出组织块贴壁延伸生长,细胞呈长梭形(参见图1-A);经永生化处理,传5代后部分细胞开始凋亡,存活细胞形态逐步转变为短梭形,此后凋亡开始减少(参见图1-B);经过8个月的Imatinib药物诱导培养,细胞形态变短,变圆,表面不光滑,并呈克隆状生长(参见图1-C)。
③Imatinib耐药细胞株GIST-FR药物敏感性分析及细胞增殖实验
取对数生长期细胞,以3000个/孔接种于96孔板,设3个复孔,24小时后加入4、8、16、32、64ug/mL的Imatinib,并设无药对照组。48小时后用CCK-8 法测定OD450值。细胞活力(%)=(加药组OD值/对照组OD值)×100%。绘制细胞浓度效应曲线。GIST-FR对Imatinib敏感性较GIST-F细胞显著降低,两者IC50分别为55.95μg/mL和15.91μg/mL,耐药指数为3.52(P<0.01) (参见图3-A),表明Imatinib耐药细胞GIST-FR构建成功。随后对两株细胞的增殖情况进行了比较;以2000个/孔接种于96孔板,设置3个复孔,利用CCK-8 方法绘制细胞增殖曲线,发现GIST-FR较GIST-F细胞增殖速度显著减慢(P< 0.01,参见图3-B);
④流式细胞仪检测Imatinib耐药细胞株GIST-FR的细胞周期
由于GIST-FR的生长速度较亲本细胞GIST-F明显减慢,随后对两株细胞的细胞周期进行检测。收集对数生长期细胞,预冷的PBS洗2次,用95%的-20℃预冷乙醇固定细胞过夜,离心弃上清,预冷的PBS洗2次,重悬细胞,加入碘化丙啶(PI),37℃避光孵育30分钟后用BDFACS CancoⅡ流式细胞仪检测细胞周期。其耐药前后细胞周期分别为:G0/Gl期(24.59±5.63%vs 44.76±2.11%), S期(69.60±4.53%vs 52.64±0.60%),G2/M期(5.82±1.10%vs 2.60±1.50%)。耐药细胞GIST-FR的G0/Gl期细胞比例上调,S期和G2/M期细胞比例下调(图 4),差异有统计学意义(P<0.05),表明耐药细胞株进入静止期的细胞增多,从而促进细胞耐药。
⑤Imatinib耐药细胞株GIST-FR和耐药诱导前GIST细胞GIST-F的全外显子组测序。
对GIST-FR和GIST-F进行了全外显子组测序,提取细胞DNA送上海伯豪生物技术有限公司进行检测,结果显示两种细胞株的KIT和PDGFRA均无突变。随后采用Sanger测序方法对GIST关键驱动基因(KIT和PDGFRA)的常见外显子突变进行了进一步验证,包括KIT外显子9、11、13、17和PDGFRA外显子18,用康为柱式全基因组提取试剂盒提取GIST-F细胞DNA,用primer premier 6软件设计KIT外显子9、11、13、17和PDGFRA外显子18的PCR引物(参见表2)。PCR扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司测序分析。结果显示两株细胞以上外显子均无突变(参见图5,为GIST-FR细胞sanger测序验证结果)。。
表2.KIT和PDGFRA各外显子引物信息
在本发明实施例1中,采用组织块培养法获取GIST原代细胞,十余天后细胞逐渐爬出组织块贴壁延伸生长,细胞呈长梭形(参见图1-A、B)。利用SV40 largeT和TERT慢病毒对原代GIST细胞两次感染,进行永生化处理。传5代后部分细胞开始凋亡,存活细胞形态逐步转变为短梭形,此后凋亡开始减少。检测GIST-F细胞中SV40 largeT的表达,结果显示GIST-F细胞中SV40 largeT高表达,而未永生化对照细胞无表达,表明SV40 largeT已经稳定整合到GIST细胞基因组上并能持续表达。现永生化GIST-F细胞已经体外传代40余代,状态良好,表明GIST-F细胞构建成功。
对GIST-F细胞进行的细胞鉴定:GIST主要根据形态学特征结合免疫表型 (CD117、DOG-1等)进行诊断,必要时进行基因突变检测。GIST-F细胞来源于临床肿瘤组织,IHC检测结果显示该肿瘤组织呈CD117阳性和DOG-1阳性(参见图2-A);与此一致,永生化的GIST-F细胞CD117染色也呈阳性,阴性对照组(NC)不表达CD117(参见图2-B)。Westernbolt检测进一步证实永生化的 GIST-F细胞表达CD117(参见图2-C)。随后采用浓度梯度递增的方法对GIST-F 细胞进行了Imatinib耐药诱导。经过8个月的药物诱导培养,细胞形态变短,变圆,表面不光滑,并呈克隆状生长,命名为GIST-FR。发现GIST-FR细胞株有以下特点:细胞形态变短,变圆,表面不光滑,并呈克隆状生长(参见图1-C);药物敏感性分析显示,GIST-FR对Imatinib敏感性较GIST-F细胞显著降低,两者IC50分别为55.95μg/mL和15.91μg/mL,耐药指数为3.52(P<0.01)(参见图3-A);随后对两株细胞的增殖情况进行了比较,发现GIST-FR较GIST-F 细胞增殖速度显著减慢(P<0.01,参见图3-B);由于GIST-FR的生长速度较亲本细胞GIST-F明显减慢,随后对两株细胞的细胞周期进行检测,其耐药前后细胞周期分别为:G0/Gl期(24.59±5.63%vs 44.76±2.11%),S期(69.60±4.53% vs 52.64±0.60%),G2/M期(5.82±1.10%vs 2.60±1.50%)。耐药细胞GIST-FR 的G0/Gl期细胞比例上调,S期和G2/M期细胞比例下调(参见图4),差异有统计学意义(P<0.05),表明耐药细胞株进入静止期的细胞增多,从而促进细胞耐药。随后对GIST-F和GIST-FR细胞进行了全外显子组测序,并采用Sanger 测序方法对两株细胞GIST关键驱动基因(KIT和PDGFRA)的常见外显子突变进行了进一步验证,包括KIT外显子9、11、13、17和PDGFRA外显子18,结果显示以上外显子均无突变(参见图5,为GIST-FR细胞sanger测序验证结果)。
所以,本发明实施例1提供的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST 细胞株,命名为GIST-FR,保藏于中国典型培养物保藏中心,其细胞株的保藏编号保藏编号CCTC NO:C2017111。同时本发明还提供了这一细胞株的构建方法以及该细胞株作为人胃肠道间质瘤耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途,采用组织块培养法获取GIST原代细胞,并进行永生化,建立GIST-F细胞系,随后对其进行Imatinib耐药诱导,建立Imatinib耐药的GIST 细胞株GIST-FR.。GIST-FR细胞已体外传代40余代,较GIST-F细胞生长慢,对Imatinib的IC50显著增高,耐药前IC50为15.91,耐药后IC50为55.95,耐药指数为3.52(P<0.01);全外显子组测序结果显示GIST-F和GIST-FR细胞 KIT和PDGFRA均阴性。本发明从人GIST原代组织成功建立GIST细胞系,并进一步诱导获得其Imatinib耐药细胞,为GIST耐药相关研究奠定了基础。
本领域技术人员应该理解,本领域技术人员结合现有技术以及上述实施例可以实现所述变化例,在此不予赘述。这样的变化例并不影响本发明的实质内容,在此不予赘述。
以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特点实施方式,其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施;任何熟悉本领域的技术人员,在不脱离本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰,或修改为等同变化的等效实施例,这并不影响本发明的实质内容,因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰,均属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (8)
1.一种Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,命名为GIST-FR,保藏于中国典型培养物保藏中心,其细胞株的保藏编号CCTC NO:C2017111。
2.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,其特征在于,所述Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的细胞形态呈短梭形。
3.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,其特征在于,所述Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株耐药前IC50为15.91,耐药后IC50为55.95,耐药指数为3.52。
4.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株,其特征在于,所述Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株为KIT和PDGFRA野生型。
5.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株作为人胃肠道间质瘤发病和耐药机制的探讨及其相关信号通路的研究的细胞模型的用途。
6.如权利要求1所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)GIST细胞的获得
取手术切除的新鲜GIST组织,剔除周围坏死组织及粘膜后,分别用含5%双抗的PBS和1640培养液洗涤3次;剪成1mm3小组织块;取所述小组织块接种于胶原包被后的六孔板中,放置于37℃培养箱中培养,8小时后各孔加200μL含20%FBS的1640培养液;第二天换液,将新的200μL含20%FBS的1640培养液换至六孔板中,以后每两天换一次培养液,直至细胞爬出所述小组织块生长至局部密集;
(2)永生化GIST细胞GIST-F的构建
采用pLVX-IRES-Neo-SV40 large T和pLOX-TERT-iresTK慢病毒质粒分别进行慢病毒包装;待细胞爬出所述小组织块生长至局部密集时,去除所述小组织块,再用pLVX-IRES-Neo-SV40 large T和pLOX-TERT-iresTK两种病毒共同感染GIST细胞,命名为GIST-F;6小时后换液,将新的2mL含20%FBS的1640培养液换至六孔板中;之后扩大培养并进行细胞鉴定;用定量RT-PCR方法检测SV40 large T的基因表达,SV40 large T引物序列为F-5’AAGCATTGCCTGGAACGCA3’,R-5’TCAGCCACAGGTCTGTACCA3’;
(3)伊马替尼耐药细胞株GIST-FR建立
采用逐步递增伊马替尼浓度的方法诱导GIST-F细胞耐药;待细胞进入对数生长期后,从IC50的1/20开始加药诱导,常规传代,待细胞耐受后,逐步提升药物浓度;直到细胞在3倍IC50以上的药物浓度中可稳定生长,将其命名为GIST-FR。
7.如权利要求6所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法,其特征在于,步骤(1)中所述胶原的浓度为200ug/mL。
8.如权利要求6所述的Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,当所述小组织块在所述六孔板中贴壁牢固后,所换的培养液为2mL含20%FBS的1640培养液。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810294236.9A CN108642016B (zh) | 2018-03-30 | 2018-03-30 | Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810294236.9A CN108642016B (zh) | 2018-03-30 | 2018-03-30 | Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108642016A true CN108642016A (zh) | 2018-10-12 |
CN108642016B CN108642016B (zh) | 2022-02-01 |
Family
ID=63745220
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810294236.9A Active CN108642016B (zh) | 2018-03-30 | 2018-03-30 | Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108642016B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111991421A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-27 | 杭州市第一人民医院 | 三氧化二砷联合沙利度胺在治疗胃肠道间质瘤中的应用 |
CN113528454A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-10-22 | 福州载基生物科技有限公司 | 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103333858A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-10-02 | 杭州市第一人民医院 | Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系及其方法及裸鼠移植瘤模型 |
CN105062975A (zh) * | 2015-09-04 | 2015-11-18 | 杭州市第一人民医院 | Imatinib耐药的胃肠道间质瘤细胞系及裸鼠移植瘤模型构建方法 |
-
2018
- 2018-03-30 CN CN201810294236.9A patent/CN108642016B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103333858A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-10-02 | 杭州市第一人民医院 | Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系及其方法及裸鼠移植瘤模型 |
CN105062975A (zh) * | 2015-09-04 | 2015-11-18 | 杭州市第一人民医院 | Imatinib耐药的胃肠道间质瘤细胞系及裸鼠移植瘤模型构建方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CRISTINA R. ANTONESCU等: "Acquired Resistance to Imatinib in Gastrointestinal StromalTumor Occurs Through Secondary Gene Mutation", 《CANCER THERAPY: PRECLINICAL》 * |
SONG ZHENG等: "Establishment and characterization of imatinib-resistant xenograft models of human gastrointestinal stromal tumor in mice", 《JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY》 * |
顾彬彬等: "胃肠道间质瘤伊马替尼耐药细胞株的建立及细胞凋亡的实验研究", 《医学研究杂志》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111991421A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-27 | 杭州市第一人民医院 | 三氧化二砷联合沙利度胺在治疗胃肠道间质瘤中的应用 |
CN113528454A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-10-22 | 福州载基生物科技有限公司 | 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108642016B (zh) | 2022-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105524924B (zh) | 环状RNA circ‑ZKSCAN1的用途 | |
CN106191067B (zh) | 环状RNA circ-NFATC3及其用途 | |
CN103667176A (zh) | 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用 | |
CN103627673A (zh) | 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 | |
CN105177005B (zh) | 一种长非编码rna及其应用 | |
CN105296430B (zh) | 一种人类结肠癌细胞系dxh-1及其应用 | |
CN104560878B (zh) | 一种人肝内胆管癌细胞系及其用途 | |
CN109609460A (zh) | 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 | |
CN103333858B (zh) | Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系及其方法及裸鼠移植瘤模型 | |
CN108642016A (zh) | Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 | |
CN107828888A (zh) | 环状RNA circ‑PTPRA的用途 | |
CN108913796A (zh) | 用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法 | |
CN103898057B (zh) | 一种顺铂耐药骨肉瘤u2os细胞系及其制备方法 | |
CN107858449A (zh) | 一种犬干扰素α生物学活性检测方法 | |
CN107858450A (zh) | 一种鸡干扰素α生物学活性检测方法 | |
CN108070567A (zh) | 一种永生化的尿液来源细胞株及其构建方法 | |
CN104174012B (zh) | Otud3蛋白在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用 | |
CN109536452B (zh) | 一株可视化鼻咽癌细胞及其应用 | |
CN113604436A (zh) | 一种肿瘤内分泌药物诱导的休眠或复发细胞株的构建方法 | |
CN108384757A (zh) | 一种制备人胆囊癌奥沙利铂耐药细胞系的方法 | |
CN103525900A (zh) | 抑制大脑eIF6基因表达的核酸抑制分子、其筛选方法和用途 | |
CN105861442A (zh) | 高转移肝癌细胞株及其构建方法和应用 | |
CN108315303A (zh) | 一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法 | |
CN104403996A (zh) | 一种具有5-氟尿嘧啶耐药性的人胃癌细胞系及其建立方法和应用 | |
Sagiv et al. | A color discriminating broad range cell staining technology for early detection of cell transformation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |