CN113528454A - 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法 - Google Patents
一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113528454A CN113528454A CN202110785413.5A CN202110785413A CN113528454A CN 113528454 A CN113528454 A CN 113528454A CN 202110785413 A CN202110785413 A CN 202110785413A CN 113528454 A CN113528454 A CN 113528454A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- sv40lt
- rat
- cells
- htert
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 101
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims abstract description 15
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 38
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 claims description 7
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 claims description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 13
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 17
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 3
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 2
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 108700021154 Metallothionein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100028708 Metallothionein-3 Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 230000008414 cartilage metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 210000005065 subchondral bone plate Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008791 toxic response Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，属于生物技术领域。本发明的方法构建hTERT和SV40LT慢病毒穿梭载体；通过体外感染大鼠原代软骨细胞，获得体外永生化的大鼠软骨细胞，为骨性关节炎的体外药效研究提供基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法。
背景技术
骨性关节炎（OA）是一种以软骨退变为核心，软骨下骨囊变为病理特征的常见关节疾病，多发于中老年人。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，在软骨形成、代谢以及修复中起着举足轻重的作用，特别是在细胞外基质的合成、分解及功能维持有着重要作用。因此，体外实验中常以软骨细胞为研究对象。
但是，原代软骨细胞在体外传代次数有限，通过正常培养的手段获得可以稳定传代的软骨细胞具有很大的难度，严重制约了外源基因在细胞水平表达的研究。人端粒酶逆转录酶( hTERT) 在激活端粒酶的过程中发挥着关键作用，在体外培养的细胞中，可以有效激活端粒酶，活化的端粒酶再以其自身为模板不断合成端粒DNA 来补充和延长端粒的长度，有效维持端粒缩短和延长的动态平衡，恢复染色体的稳定性，获得无限分裂和增殖的能力，进而延长细胞体外培养时间或者永生化。猿猴病毒大T抗原基因（SV40 LT）虽然是一种病毒蛋白，但其在端粒酶的活化、生长抑制因子的失活等多方面亦发挥着积极的作用。因此，本发明构建hTERT和SV40LT重组慢病毒载体，通过体外感染大鼠原代软骨细胞，以期获得体外永生化的大鼠软骨细胞，为骨性关节炎的体外药效研究提供基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，包括以下具体步骤：
（1）用含有0.2wt%的II型胶原酶消化大鼠关节软骨，提取并培养大鼠软骨细胞；
（2）将P3代大鼠软骨细胞培养至对数期生长期，接种到6孔板，37℃培养过夜，接种细胞数量应保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%以上；
（3）病毒转染：取MOI值=10病毒浓缩液和8 μg/ml Polybrene，加入已含有1ml完全培养液的EP管中，混匀，得病毒稀释液；吸去培养板中的原培养基，沿壁加入病毒稀释液，勿吹起细胞；在水平方向轻轻拍打培养板，使每个孔中的溶液都混合均匀，然后把培养板放回37℃培养箱孵育；
（4）感染6 h后，补充1 ml完全培养基，37℃过夜培养；
（5）感染24 h后，吸去含病毒培养基，加入2 ml新鲜培养基，继续培养；
（6）感染48-72 h后， Q-PCR检测SV40LT基因和hTERT基因的表达情况。
上述步骤（3）中病毒浓缩液的制备方法为：
将SV40LT和hTERT基因CDS区片段接入PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体中，构建慢病毒穿梭载体PCDH-CMV-SV40LT-EF1-Puro和PCDH-CMV-hTERT-EF1-Puro；后利用Lipo3000转染试剂，将慢病毒穿梭载体与pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G共转至293FT细胞中，在转染48h和72 h收集细胞上清液并用0.45 μm 滤器过滤，滤液经离心去除细胞碎片，上清液继续经超滤管浓缩和纯化至SV40LT过表达慢病毒滴度为：2.0×108TU/ml，hTERT过表达慢病毒滴度为：2.5×108TU/ml，获得病毒浓缩液。
上述步骤（6）中 Q-PCR检测SV40LT基因和hTERT基因的引物序列如下：
SV40LT-F:5’-GGCTACACTGTTTGTTGCCC-3’；
SV40LT-R:5’-AAGTTCAGCCTGTCCAAGGG-3’；
Htert-F:5’-AGGTGTCCCTGAGTATGGCT-3’；
Htert-R:5’-GAGTAGTCGCTCTGCACCTC-3’；
GAPDH-F:5’-GTGCCAGCCTCGTCTCATAG-3’；
GAPDH-R:5’-CTTTGTCACAAGAGAAGGCAG-3’。
本发明的优点在于：
本发明构建hTERT和SV40LT重组慢病毒穿梭载体，通过体外感染大鼠原代软骨细胞，获得体外永生化的大鼠软骨细胞，为骨性关节炎的体外药效研究提供基础。
附图说明：
图1慢病穿梭载体PCDH-CMV-SV40LT-EF1-Puro的质粒图谱。
图2慢病穿梭载体PCDH-CMV-hTERT-EF1-Puro的质粒图谱。
图3 SV40LT/hTERT双标大鼠软骨永生化细胞镜下观察（P30代）。
图4 II型胶原法和阿利新蓝法染色法鉴定大鼠软骨细胞及永生化细胞。
图5 Q-PCR检测大鼠软骨细胞中SV40LT和hTERT的过表达水平。
图6 β-半乳糖苷酶染色法检测大鼠软骨衰老细胞。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1 软骨细胞的分离培养
4周龄SD大鼠4只，无菌条件下切取关节软骨，剪成1 mm3的大小，PBS洗涤3次，吸干PBS残液，加入含有0.2wt%的II型胶原酶消化液的培养皿，放入37℃的培养箱中，每隔2 h吸取上清液，1000 r/min的离心5min，弃消化液，收集细胞沉淀，更换消化液，重复4次。用5 mlDMEM培养液（10 vol%小牛血清、链霉素100 mg/L和青霉素100 U/ml）重悬细胞，全部接种于50 ml培养瓶中（原代），待细胞铺满培养瓶底部80%后，加入0.5-1 ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中，瓶口旋紧，放在倒置显微镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未飘起时将胰酶弃去，加入10 ml DMEM培养液终止消化。用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，旋紧瓶口，置于37℃下继续培养（F1代）。第二天观察贴壁生长情况。3天细胞可铺满培养瓶底部80%，细胞传至P3代。
实施例2 软骨细胞鉴定
（1）II型胶原鉴定
取对数期生长的F3代软骨细胞，按1×105个/ml接种于含有盖玻片的六孔板中，加入10vol%FBS （胎牛血清）DMEM培养基进行培养，待细胞爬满盖玻片后，按下述方法进行处理：
（1）PBS洗细胞爬片1遍，2 min；
（2）4%多聚甲醛处理30 min（多聚甲醛室温，否则细胞会皱缩）；
（3）PBS洗2遍，每遍2 min；
（4）0.15% Txiton X-100 室温处理10 min；
（5）PBS洗2遍，每遍2 min；
（6）加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；
（7）PBS洗2遍，每遍2 min；
（8）用1%牛血清白蛋白（BSA）配制一抗：II型胶原蛋白（Collagen II）（1:200），37℃孵育2 h 或4℃过夜孵育；
（9）PBS洗2遍，每遍2 min；
（10）滴加反应增强液，室温处理20 min；
（11）PBS洗2遍，每遍2 min；
（12）滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温处理20 min；
（13）PBS洗2遍，每遍2 min；
（14）DAB显色液室温处理5-8 min。
（2）阿利新蓝法染色
取对数期生长的F3代软骨细胞，按1×105个/ml接种于含有盖玻片的六孔板中，加入10%FBS DMEM培养基进行培养，待细胞爬满盖玻片后，按下述方法进行处理：
1、 4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤。
2、 加入阿利新蓝（Alcian）酸化液浸泡3 min。
3、 加入Alcian染色液染色30 min。
4、 PBS洗涤5 min。
实施例3 大鼠软骨永生化细胞构建
（1）实验材料
实验试剂：
仪器与设备：
载体系统：
第三代慢病毒包装系统：包括pMDLg/pRRE（#ZVE1894，载基生物），pRSV-Rev（#ZVE1049，载基生物），pMD2.G（#ZVE1890，载基生物）三种辅助质粒。
包装细胞株：
293FT细胞（#ZCL1032，载基生物），为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM（含10 % FBS+1%双抗（青链霉素混合液（100×），其中青霉素10000 U/ml，链霉素10mg/ml））。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
（2）慢病毒包装实验步骤：
重组质粒载体构建：
由生物公司直接化学合成SV40LT和hTERT基因CDS区片段；SV40LT基因片段（2133bp）和hTERT基因片段（3405 bp）；后利用如下引物进行PCR扩增获得目的基因，然后重组到目的载体PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro I酶切载体）中构建重组质粒，重组质粒经测序和双酶切鉴定（EcoRI-BamHI，XbaI-EcoRI），最终获得目的基因慢病毒穿梭载体PCDH-CMV-SV40LT-EF1-Puro和PCDH-CMV-hTERT-EF1-Puro，慢病毒穿梭载体图谱见图1和图2。
质粒载体抽提：
构建好的慢病毒穿梭载体PCDH-CMV-SV40LT-EF1-Puro、PCDH-CMV-hTERT-EF1-Puro及辅助质粒（pMDLg/pRRE，pRSV-Rev，pMD2.G）利用无内毒素质粒大提试剂盒进行大量抽提，浓度要求大于1 μg/μl，A260/A280在1.8～2.0之间。
细胞株的培养要点
细胞状态对于慢病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
293FT细胞会随着传代次数的增加，出现生长状态下降现象。因此，293FT细胞需经常更换新的细胞，更换频率约4~8周。
细胞消化要充分，成团生长的细胞会影响转染效率。
慢病毒包装流程
第一天：细胞铺板
293FT 细胞种于10cm-dish中，中板密度为第二天转染前细胞密度达到80%，置于37°C，5 % CO2的培养箱中。
第二天：质粒转染
1、转染试剂：Lipo3000
2、质粒共转体系：
3、转染用培养基：转染前1 h，更换不含双抗，含10%FBS的DMEM培养基。
4、转染后6 h，更换含10 % FBS的新鲜培养基。
第四天：病毒上清收集
1、转染后48 h，收集细胞上清液，并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基，72 h再次收集一次病毒上清。
2、将收集的病毒上清液用0.45 μm 滤器过滤, 4℃储存备用；
第五天：病毒浓缩和纯化
1、超速离心法沉淀病毒：将收集的病毒上清，4°C ，3000 rpm ，离心20 min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于Beckman超速离心管中，4°C，25000 rpm沉淀2 h，去上清，加入4 ml PBS溶解；
2、超滤管浓缩和纯化：将上述溶解液加入预先消毒处理的超滤浓缩管中进一步浓缩和纯化，4000× g，离心10-15 min，获得小于1 ml的病毒浓缩液。用PBS补足至4 mL，再次离心1次，最后浓缩液加入适量病毒保存液稀释至1.2 ml，获得慢病毒浓缩液；
3、病毒保存：按照200 μl/管分装病毒，贴上标签，-80°C冰箱保存，备用。
、慢病毒滴度检测
4.1 检测流程
1、细胞准备：将生长状态良好的293FT细胞消化后，按3.0×105/孔, 加入6孔板中，设2复孔，置于37°C，5 % CO2 培养箱中培养；
2、慢病毒感染：贴壁培养16 h，按4 μl 病毒液/孔加入慢病毒浓缩液，感染72h；
3、采用全式金EasyPure® Genomic DNA Kit试剂盒进行细胞基因组提取；
4、标准品制备和稀释：以含病毒特征序列和宿主细胞单拷贝基因序列的质粒标准品，10倍梯度稀释质粒标准品（104~109）；
5、Q-PCR上机检测：取上述待测样品（基因组）稀释至5-50 ng/μl，分别取2 μl待测样品及梯度稀释的标准品进行上机检测，引物同表1。
Q-PCR反应
6、计算慢病毒滴度
4.2 滴度检测结果
实施例4 稳转株构建实验步骤
1. 最佳MOI值
MOI值（感染复数）是指每个细胞感染的病毒颗粒数。一般选定的MOI值需要使宿主细胞达到80%以上感染，并且细胞没有出现明显毒性反应。由于慢病毒对不同细胞的亲嗜性不同，导致对不同细胞的感染效率不同。即使是同一种细胞，由于不同实验室的细胞来源、代数和细胞状态的影响，最佳MOI值也不一致。因此，实验前应确定最佳MOI值范围，可以通过查询文献或预实验确定，大多数细胞的最佳MOI值在10~40范围。
本实验MOI值：10
2. Polybrene（聚凝胺）浓度摸索
常用的感染增强剂，是一种多聚阳离子聚合物，能与细胞表面的阴离子结合，显著提高慢病毒感染效率（2-10倍），使用过程中可以用PBS或培养基进行稀释。
Polybrene对细胞具有一定毒性。不同细胞的敏感度不同，使用前应对Polybrene浓度进行摸索，摸索范围1~10 μg/ml；常用的使用浓度是5~10 μg/ml。
本实验Polybrene浓度：8 μg/ml
3. 病毒感染贴壁细胞
1）病毒准备：提前从-80℃冰箱中取出病毒原液，放冰上融化，使用前离心；
2）将P3代大鼠软骨细胞培养至对数期生长，接种到6孔板，37℃培养过夜，接种细胞数量因细胞的状态不同而略有区别，应保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%；
3）稀释病毒：取MOI值=10的病毒浓缩液和8 μg/ml 聚凝胺，加入已含有1 ml完全培养液的EP管中，混匀；
4）感染前，吸去培养板中的原培养基，沿壁加入上述稀释后的病毒稀释液，勿吹起细胞；
5）在水平方向轻轻拍打培养板，使每个孔中的溶液都混合均匀，然后把培养板放回37℃培养箱孵育；
6）感染6 h后，补充1 ml完全培养基，37℃过夜培养；
7）感染24 h后，吸去含病毒培养基，加入2 ml新鲜培养基，继续培养；
8）感染48-72 h后，在荧光显微镜下观察荧光表达情况。对于生长缓慢的细胞，可以适当延长观察时间，2天换一次液；
9）Puromycin（嘌呤霉素）抗性筛选：对于携带Puromycin抗性的病毒，一般在感染48-72 h后，需要加入Puromycin进行筛选。筛选浓度在1~10 μg/ml，不同的细胞所需的Puromycin浓度不同，实验前需要对Puromycin筛选浓度进行摸索，一般为在3天左右使正常细胞全部死亡的最低浓度；
本实验Puromycin筛选浓度：10 μg/ml
4. 大鼠软骨永生化细胞镜下观察和鉴定
方法同实施例2。结果如图3、图4所示，结果表明， SV40LT/hTERT双标大鼠软骨永生化细胞（P30代）在100倍和200倍镜下观察，细胞生长状态良好，单层生长，彼此不相接触，三角形、长梭形或多角形，胞体丰满，胞浆均匀，白色“类软骨样”物质。进而对永生化细胞进行II型胶原法和阿利新蓝法染色法鉴定，结果可见永生化软骨细胞胞浆被染成棕黄色，胞核不着色，胞外基质中也有棕黄色颗粒出现，与P3代的正常软骨细胞染色结果一致；阿利新蓝法染色法鉴定结果显示，永生化软骨细胞（P30代）胞浆和胞膜呈深蓝色，说明培养的软骨细胞分泌和合成蛋白聚糖，细胞核呈淡蓝色，细胞形态完好，与P3代的正常软骨细胞染色结果一致。
检测结果
待构建的大鼠软骨稳转细胞和空载转染的大鼠软骨细胞生长至80%时，分别收集
细胞，提取细胞总RNA并合成cDNA,使用SV40LT和hTERT特定引物进行定量PCR扩增，GAPDH作
为内参基因（表1）。根据 2-ΔΔCt 法对数据进行相对定量分析，计算公式如下（x表示任意一
个样本）：
。结果如图5所示，结果表
明相比于空载转染的大鼠软骨细胞，大鼠软骨稳转细胞中SV40LT和hTERT表达水平均上调。
表1 Real-Time PCR引物
6、大鼠软骨衰老细胞检测
β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色：
（1）对于 6 孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用 PBS 或 HBSS 洗涤 1 次，加入 1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液， 室温固定 15min。对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。
（2） 吸除细胞固定液，用 PBS 或 HBSS 洗涤细胞 3 次，每次 3 min。
（3）吸除 PBS 或 HBSS，每孔加入 1 ml 染色工作液。使用聚丙烯(polypropylene)容器，不能使用聚苯乙烯(polystyrene) 容器配制染色工作液。 染色工作液配方如下：
（4） 37℃孵育过夜，可以用 parafilm 或保鲜膜封住 6 孔板防止蒸发。 注意：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。
（5） 普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入 2ml PBS，4℃可以保存数天；或者加上封片液封片后，4℃可以保存较长时间。结果如图6所示，结果显示正常软骨细胞（P3代）和永生化软骨细胞（P30代）均不表达SA-β-Gal，表明永生化细胞P30未出现衰老现象。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州载基生物科技有限公司
<120> 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法
<130> 10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> SV40LT-1F
<400> 1
ctccatagaa gattctagag ctagcgaatt catggataaa gttttaaaca gagaggaatc 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> SV40LT-1R
<400> 2
gcgatcgcag atccttcgcg gccgcggatc cttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> hTERT-1F
<400> 3
acgctgtttg acctccatag aagattctag aatgccgcgc gctccccgct gccgagccgt 60
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> hTERT-1R
<400> 4
cgcggccgcg gatccgattt aaattcgaat tctcagtcca ggatggtctt gaagtctga 59
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> SV40LT Forward Primer
<400> 5
ggctacactg tttgttgccc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> SV40LT Reverse Primer
<400> 6
aagttcagcc tgtccaaggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> hTERT Forward Primer
<400> 7
aggtgtccct gagtatggct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> hTERT Reverse Primer
<400> 8
gagtagtcgc tctgcacctc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> GAPDH Forward Primer
<400> 9
gtgccagcct cgtctcatag 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> GAPDH Reverse Primer
<400> 10
ctttgtcaca agagaaggca g 21
Claims (3)
1.一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
（1）用含有0.2wt%的II型胶原酶消化大鼠关节软骨，提取并培养大鼠软骨细胞；
（2）将P3代大鼠软骨细胞培养至对数期生长期，接种到6孔板，37℃培养过夜，接种细胞数量应保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%以上；
（3）病毒转染：取MOI值=10的病毒浓缩液和8 μg/ml 聚凝胺，加入已含有1 ml完全培养液的EP管中，混匀，得病毒稀释液；吸去步骤（2）培养板中的原培养基，沿壁加入病毒稀释液，勿吹起细胞；在水平方向轻轻拍打培养板，使每个孔中的溶液都混合均匀，然后把培养板放回37℃培养箱孵育；
（4）感染6 h后，补充1 ml完全培养基，37℃过夜培养；
（5）感染24 h后，吸去含病毒培养基，加入2 ml新鲜培养基，继续培养；
（6）感染48-72 h后， Q-PCR检测SV40LT基因和hTERT基因的表达情况。
2.根据权利要求1所述的一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（3）中病毒浓缩液的制备方法为：将SV40LT和hTERT基因CDS区全片段接入PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体中，构建慢病毒穿梭载体PCDH-CMV-SV40LT-EF1-Puro和PCDH-CMV-hTERT-EF1-Puro；后利用Lipo3000转染试剂，将慢病毒穿梭载体与pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G共转至293FT细胞中，在转染48 h和72h收集细胞上清液并用0.45 μm 滤器过滤，滤液经离心去除细胞碎片，上清液继续经超滤管浓缩和纯化至SV40LT过表达慢病毒滴度为：2.0×108TU/ml，hTERT过表达慢病毒滴度为：2.5×108TU/ml，获得病毒浓缩液。
3.根据权利要求1所述的一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（6）中 Q-PCR检测SV40LT基因和hTERT基因的引物序列如下：
SV40LT-F:5’-GGCTACACTGTTTGTTGCCC-3’；
SV40LT-R:5’-AAGTTCAGCCTGTCCAAGGG-3’；
hTERT-F:5’-AGGTGTCCCTGAGTATGGCT-3’；
hTERT-R:5’-GAGTAGTCGCTCTGCACCTC-3’；
GAPDH-F:5’-GTGCCAGCCTCGTCTCATAG-3’；
GAPDH-R:5’-CTTTGTCACAAGAGAAGGCAG-3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110785413.5A CN113528454A (zh) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110785413.5A CN113528454A (zh) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113528454A true CN113528454A (zh) | 2021-10-22 |
Family
ID=78098620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110785413.5A Pending CN113528454A (zh) | 2021-07-12 | 2021-07-12 | 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113528454A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1539963A (zh) * | 2003-10-27 | 2004-10-27 | 健 刘 | 一种BALB/c小鼠膝关节软骨细胞的培养方法 |
| US20130171731A1 (en) * | 2009-05-06 | 2013-07-04 | Sanofi | Reversibly immortalized cells as well as methods relating hereto |
| CN104911145A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-09-16 | 上海中医药大学附属曙光医院 | 一种高活力原代软骨细胞的制备方法 |
| CN108642016A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-10-12 | 江南大学附属医院 | Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 |
| CN109295103A (zh) * | 2018-10-30 | 2019-02-01 | 湖南丰晖生物科技有限公司 | 一种慢病毒载体及其在构建永生化细胞中的应用 |
| CN112574947A (zh) * | 2020-09-02 | 2021-03-30 | 北京昱龙盛世生物科技有限公司 | 一种软骨细胞的体外培养方法 |
-
2021
- 2021-07-12 CN CN202110785413.5A patent/CN113528454A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1539963A (zh) * | 2003-10-27 | 2004-10-27 | 健 刘 | 一种BALB/c小鼠膝关节软骨细胞的培养方法 |
| US20130171731A1 (en) * | 2009-05-06 | 2013-07-04 | Sanofi | Reversibly immortalized cells as well as methods relating hereto |
| CN104911145A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-09-16 | 上海中医药大学附属曙光医院 | 一种高活力原代软骨细胞的制备方法 |
| CN108642016A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-10-12 | 江南大学附属医院 | Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 |
| CN109295103A (zh) * | 2018-10-30 | 2019-02-01 | 湖南丰晖生物科技有限公司 | 一种慢病毒载体及其在构建永生化细胞中的应用 |
| CN112574947A (zh) * | 2020-09-02 | 2021-03-30 | 北京昱龙盛世生物科技有限公司 | 一种软骨细胞的体外培养方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| PΊṄEΊRO-RAMΊL, M， ET AL.: "GENERATION OF AN IMMORTALIZED CHONDROCYTE CELL LINE FROM OSTEOARTHRITIS ARTICULAR CARTILAGE", 《OSTEOARTHRITIS AND CARTILAGE》 * |
| SRIDEVI YADAVILLI, ET AL.: "The emerging role of NG2 in pediatric diffuse intrinsic pontine Glioma", 《ONCOTARGET》 * |
| ZHIDAN CHEN, ET AL.: "Knockdown of LRP6 activates Drp1 to inhibit survival of cardiomyocytes during glucose deprivation", 《BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY》 * |
| 王吉兴等: "SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性", 《第一军医大学学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108103013B (zh) | 一种食管胃结合部平滑肌细胞的酶消化法原代培养及鉴定方法 | |
| CN107142242B (zh) | 一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法 | |
| US20190345441A1 (en) | Preparation and application of immortalized alpha-1,3-galactosyltransferase gene knockout pig hepatocyte cell line | |
| CN111019898B (zh) | 人恶性叶状肿瘤细胞系hjp-0320及其应用 | |
| US20220154139A1 (en) | YAP1 Gene-Modified Mesenchymal Stem Cell and Preparation Method Thereof | |
| KR20200136463A (ko) | Gmp-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법 | |
| CN109706181B (zh) | 一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用 | |
| US8835177B2 (en) | Method for transfer of gene into fat cell or progenitor fat cell | |
| CN113528454A (zh) | 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法 | |
| CN111019897B (zh) | 人良性叶状肿瘤细胞系glk-1010及其应用 | |
| CN112852751A (zh) | 一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法 | |
| RU2039816C1 (ru) | Препарат для открепления контактзависимых клеток от субстрата и дезагрегации их в культуре | |
| CN102933702A (zh) | 诱导组织再生的方法 | |
| Crawford et al. | Identification of murine endogenous xenotropic retrovirus in cultured multicellular tumour spheroids from nude‐mouse‐passaged nasopharyngeal carcinoma | |
| Yu et al. | Long-term effects on HEK-293 cell line after co-culture with porcine endogenous retrovirus | |
| JP2007105033A (ja) | レトロウィルス産生用無血清培地 | |
| CN109666650A (zh) | 一种细胞重编程方法 | |
| CN114807011B (zh) | 一种暗纹东方鲀精巢细胞系及其构建方法和应用 | |
| CN109852637B (zh) | 一种提高腺相关病毒转染效率的方法 | |
| Zhang et al. | Mitochondrial disease-specific induced Pluripotent stem cell models: generation and characterization | |
| CN111849884B (zh) | 一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 | |
| US8852915B2 (en) | Method of retrovirus storage | |
| CN112662621B (zh) | 一种逆转间充质干细胞衰老的方法及应用 | |
| CN109880828B (zh) | 干扰Mroh7基因表达的siRNA及其应用、干扰方法与药物 | |
| CN112870343A (zh) | 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211022 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |