CN111849884B - 一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法，包括一种人胎盘羊膜间充质干细胞分离培养的技术，以及将所述细胞采用慢病毒介导法定向诱导分化为肝细胞。

Description

一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体为涉及一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法。
背景技术
肝脏是机体新陈代谢的中心站,具有维持机体健康运转所必需的多种生理、生化功能。肝细胞则是肝脏执行这些功能的最基本单位,因而,其研究价值不言而喻。肝炎病毒、药物、酒精等因素引起的肝功能衰竭(简称肝衰竭)是临床治疗中的一大顽疾。迄今,肝脏移植是唯一证实有效的治疗手段,但其受到肝脏来源缺乏、手术费用昂贵等因素的限制。生物人工肝、肝细胞移植、肝组织工程的研究为终末期肝病的治疗带来新的希望,但缺乏有效的肝细胞来源是这三者临床应用的最大瓶颈。因原代肝细胞在体外培养中很难在维持其形态和功能的前提下进行可观的增殖,肝细胞的来源常常依赖于供体捐献,这一直是基础研究、药物研发及肝病治疗等相关领域的主要制约因素。如何在体外获取可增殖的功能型肝细胞,是迫切需要解决的问题。正常情况下干细胞可以自我更新并保持其未分化状态,在一些特定的诱导环境下,干细胞可以分化成多种其他类型并且具有功能的成体细胞。因此,以易于获取或培养的干细胞为起源细胞,诱导其形成成熟的肝细胞或肝样细胞被认为是最切实可行的办法,目前这方面的研究也取得了许多进展。但是由于许多不可避免的局限性,不同的起始细胞和诱导分化方法各有优劣。
在肝脏的发育中，FoxA家族、GATA家族、HNF家族、C/EBPα、Prox1和Hhex等肝内转录因子间复杂的网络调控不仅对肝脏发育有着重要影响，而且对肝细胞表型以及其正常功能的发挥也起着举足轻重的作用。然而，对于这些核心转录因子在调控网络中是如何相互合作、相互依赖的促进肝细胞的分化或增殖仍知之甚少。现有技术中，王巧燕等构建了FoxA3和Hnf4α基因的慢病毒载体,共转染体外培养的原代大鼠肝细胞，结果表明,FoxA3和Hnf4α能促使体外培养的原代大鼠肝细胞进行增殖,并维持肝细胞的基本生物学特性。代克强等尝试在iPSCs和BMSCs中过表达FOXA3和HNF4α两个肝富集转录因子联合诱导这两种干细胞向肝样细胞定向分化,发现iPSCs来源的肝样细胞体现出不完全的肝细胞功能,在本研究检测的三个指标中,只有较强的糖原合成和储存功能,而不具备脂肪合成和储存功能,药物代谢功能非常微弱,而BMSCs来源的肝样细胞则表现出非常全面的肝细胞功能,糖代谢和脂代谢功能非常明显,药物代谢功能稍弱。金晔等发现大鼠骨髓间充质肝细胞在生长因子HGF,EGF,bFGF,地塞米松和胰岛素的诱导培养下可以分化为具有成熟肝细胞功能和形态的肝细胞样细胞,肝细胞分化过程中转录因子HNF4α、C/EBPα和C/EBPβ呈特征性时序表达,表明大鼠骨髓间充质干细胞在向肝细胞分化时,肝细胞相关转录因子的表达与细胞分化的启动和维持密切相关。然而，现有技术中尚未有利用人胎盘羊膜间充质干细胞分化诱导为肝细胞的研究报道。
发明内容
为了填补现有技术中的空白，本发明提供了一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法，包括一种人胎盘羊膜间充质干细胞分离培养的技术，以及将所述细胞采用慢病毒介导法定向诱导分化为肝细胞。另外，申请人还在研究过程中惊喜地发现，采用慢病毒介导法在人胎盘羊膜间充质干细胞中过表达Foxa3、Gata4、Hnf4a能够协同地诱导人胎盘羊膜间充质干细胞分化为干细胞。
更为具体的，所述方法包括如下技术步骤：
1.人胎盘羊膜间充质干细胞的分离培养：⑴取新鲜采集的足月剖腹产胎儿的胎盘组织，放置于胎盘盒中，首先采用75％的酒精进行擦拭消毒，然后采用PBS缓冲液进行反复冲洗，直至洗掉表面的血污；
⑵用手术镊将胎盘外层的羊膜慢慢撕下，放置于无菌培养皿中，采用上述PBS缓冲液反复清洗表面血污，洗净后转移至新的培养皿中，加入D-Hanks溶液，更换一把新的手术镊，配合手术剪，将羊膜剪成直径为1cm3的组织小块，并在溶液中清洗干净；
⑶剪碎后的小组织块移入新的培养皿中，加入消化酶组合物(0.25v/v％胰酶+0.1v/v％胶原酶IV型)，37℃消化，后1500r离心8～12min，制备出单细胞悬液，再用红细胞裂解液处理3～8min，去除红细胞，最后用D-Hanks溶液清洗1遍，1500r离心8～12min，收集底部组织块；
⑷在底部组织块中加入含10％FBS的DMEM培养基，于37℃，5％CO2中进行培养，细胞长到瓶底90％后采用0.25％胰酶进行消化，1:2的比例进行传代培养，将细胞培养传代至第5～7代；
2.诱导分化：
⑴慢病毒制备
将HEK293T细胞进行传代培养，以3～5×106个/mL的细胞密度接种1mL细胞悬液于75cm2的细胞培养瓶，当细胞汇合度为50～60％时，采用0.25M的磷酸钙溶液进行转染，再加入包装质粒pCMVΔ8.91以及包膜质粒pVSV-G，最后分别加入慢病毒质粒Foxa3、Gata4、Hnf4a，培养48～72h，离心收集浓缩病毒液，Foxa3、Gata4、Hnf4a三种重组慢病毒各包装一瓶。
⑵肝样细胞的诱导
将传代5～7次的hp-MSCs传代至细胞培养皿中，细胞密度约为3～6×104个/皿，加入Foxa3、Gata4、Hnf4a这三种浓缩病毒液进行侵染诱导，当细胞长80％融合时，可进行传代，待细胞发生明显形态变化形成肝样细胞克隆时，挑取诱导细胞至铺有胶原蛋白的培养皿中，并更换iHep培养基(KnockoutTMDMEM+1％非必须氨基酸+1％GlutaMAXTM+1％ITS+50μMβ-巯基乙醇+0.1μM地塞米松+1％青链霉素)进行扩大培养，待诱导细胞生长至约80％汇合时，进行消化，离心，冻存。
在一些实施方案中，所述三种慢病毒质粒Foxa3、Gata4、Hnf4a的浓度分别为50-100ng/μL，添加量为每种20μg，所述Foxa3、Gata4、Hnf4a三种浓缩病毒液的添加量为每种100μL。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测原代分离的hp-MSC细胞的步骤，所述检测包括报告基因及形态学的检测。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测分化获得的肝样细胞的步骤，所述检测包括细胞功能的检测，具体为ICG的摄入与排泌。
基于上述技术方案，本发明实现了如下的技术效果：
1、本发明通过对肝内细胞核转录因子的组合进行反复尝试，确定了最优的用于将hp-MSCs诱导为肝细胞的转录因子组合；
2、通过构建三种重组慢病毒质粒Foxa3、Gata4、Hnf4a，并将其转染到获得的hp-MSCs中，成功将其诱导为肝样细胞，并具有成熟肝细胞的功能；
3、本发明中采用的磷酸钙溶液转染技术可高效转染hp-MSCs，从而快速获得肝细胞。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1原代hp-MSCs的细胞形态(标尺为40μm)A.分离培养大约一周时的形态；B.持续培养大约两周时的形态。
图2Foxa3、Gata4、Hnf4a三种重组慢病毒制备结果(A：Foxa3；B：Gata4；C：Hnf4a)。
图3 hp-MSCs向肝细胞定向分化的诱导结果
图4 ICG摄入检测结果
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1hp-MSCs的原代分离培养
1、取新鲜采集的足月剖腹产胎儿的胎盘组织，放置于胎盘盒中，首先采用75％的酒精进行擦拭消毒，消毒时间控制在2分钟以内，然后采用PBS缓冲液进行反复冲洗(3～5次)，直至洗掉表面的血污；
2、用手术镊将胎盘外层的羊膜慢慢撕下，放置于无菌培养皿中，采用上述PBS缓冲液反复清洗表面血污，洗净后转移至新的培养皿中，加入20～30mL的D-Hanks溶液，更换一把新的手术镊，配合手术剪，将羊膜剪成直径为1cm3的组织小块，并在溶液中清洗干净；
3、剪碎后的小组织块移入新的培养皿中，加入消化酶组合物(0.25％胰酶+0.1％胶原酶IV型)，37℃消化(10～20min)，后1500r离心8～12min，制备出单细胞悬液，再用红细胞裂解液处理3～8min，去除红细胞，最后用D-Hanks溶液清洗1遍，1500r离心8～12min，收集底部组织块；
4、在底部组织块中加入含10％FBS的DMEM培养基，于37℃，5％CO2中进行培养，细胞长到瓶底90％后采用0.25％胰酶进行消化，1:2的比例进行传代培养，将细胞培养传代至第5～7代。
培养结果鉴定：
采用酶消化法从人胎盘羊膜中分离间充质干细胞，培养至7d左右，观察到局部细胞呈集落生长，此时，更换新鲜培养基，继续培养一周左右，细胞达到80％～90％汇合，即可进行传代。在显微镜下可以清晰的看到细胞较大，轮廓清楚，内部有清晰的应力纤维，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显，呈现典型的成纤维细胞样形态(图1-A)；持续培养大约两周时，细胞基本达到完全汇合，形态发生一定的变化，胞质变得狭窄，内部的应力纤维也不明显，呈平行排列或漩涡生长(图1-B)。结果显示成功获得原代hp-MSC。
实施例2hp-MSCs诱导分化为肝细胞
1、慢病毒制备
将HEK293T细胞进行传代培养，以3～5×106个/mL的细胞密度接种1mL细胞悬液于75cm2的细胞培养瓶，当细胞汇合度为50～60％时，采用0.25M的磷酸钙溶液进行转染，再加入包装质粒pCMVΔ8.91以及包膜质粒pVSV-G，最后分别加入慢病毒质粒Foxa3、Gata4、Hnf4a(根据NCBI网站获取三种基因序列信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列优化并合成，然后采用试剂盒进行提取)，培养48～72h，离心收集浓缩病毒液，Foxa3、Gata4、Hnf4a三种重组慢病毒各包装一瓶。
实验结果：
在转染HEK293T细胞16h后，检测报告基因GFP的表达情况，可见本实验中采用的磷酸钙溶液转染技术可使三种质粒均达到较高的转染效率(图2：A：Foxa3；B：Gata4；C：Hnf4a)。
2、肝样细胞的诱导
将传代5～7次的hp-MSCs传代至细胞培养皿中，细胞密度约为3～6×104个/皿，分别加入Foxa3、Gata4、Hnf4a这三种浓缩病毒液中的两种或三种进行侵染诱导，其中每一种质粒的浓度和添加量均为：50～100ng/μL、20μg。实验分组如下：
分组 转染基因
组1 Foxa3+Gata4
组2 Foxa3+Hnf4a
组3 Gata4+Hnf4a
组4 Foxa3+Gata4+Hnf4a
当每组细胞长至约80％融合时，可进行传代，待细胞发生明显形态变化形成肝样细胞克隆时，挑取诱导细胞至铺有胶原蛋白的培养皿中，并更换iHep培养基(KnockoutTMDMEM+1％非必须氨基酸+1％GlutaMAXTM+1％ITS+50μMβ-巯基乙醇+0.1μM地塞米松+1％青链霉素)进行扩大培养，待诱导细胞生长至约80％汇合时，进行消化，离心，冻存。
实验结果：
Figure BDA0002610981060000071
Figure BDA0002610981060000081
实施例3肝细胞的功能鉴定——ICG摄取与排泌
肝细胞对吲哚菁绿(Indocyaninegreen,ICG)具有摄入和排出的功能，故临床上通常利用ICG检测肝功能是否正常。本实验中用含有1mg/mLICG的培养基孵育诱导第4组细胞分化获得的肝样细胞、HepG2及hp-MSCs，具体为：将含1mg/mLICG的培养基加入分化获得的肝细胞中，37℃孵育30min；然后用PBS洗3次，加入新鲜培养基；倒置显微镜下观察细胞染色情况，绿色细胞为阳性。同时检测诱导细胞，HepG2及hp-MSCs。
实验结果：绿色细胞为摄入ICG的阳性细胞，结果显示诱导的细胞及HepG2中有部分细胞呈绿色，hp-MSCs中未观察到摄入ICG的细胞(图4)。表明诱导的部分细胞具有成熟肝细胞摄入与排泌ICG的功能。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）取新鲜采集的足月剖腹产胎儿的胎盘组织，放置于胎盘盒中，首先采用75%的酒精进行擦拭消毒，然后采用PBS缓冲液进行反复冲洗，直至洗掉表面的血污；
（2）用手术镊将胎盘外层的羊膜慢慢撕下，放置于无菌培养皿中，采用上述PBS缓冲液反复清洗表面血污，洗净后转移至新的培养皿中，加入D-Hanks溶液，更换一把新的手术镊，配合手术剪，将羊膜剪成直径为1cm3的组织小块，并在溶液中清洗干净；
（3）剪碎后的小组织块移入新的培养皿中，加入消化酶组合物，37℃消化后，1500 r离心8~12 min，制备出单细胞悬液，再用红细胞裂解液处理3~8min，去除红细胞，最后用D-Hanks溶液清洗1遍，1500 r离心8~12 min，收集底部组织块；
（4）在底部组织块中加入含10% FBS的DMEM培养基，于37℃ ，5% CO2中进行培养，细胞长到瓶底90%后采用0.25%胰酶进行消化，1:2的比例进行传代培养，将hp-MSC细胞培养传代至第5~7代；
（5）将HEK293T细胞进行传代培养，以3~5×106个/mL的细胞密度接种于1 mL 细胞悬液并置于75 cm2的细胞培养瓶中培养，当细胞汇合度为50~60% 时，采用0.25 M的磷酸钙溶液进行转染，再加入包装质粒pCMVΔ8.91以及包膜质粒pVSV-G，最后分别加入慢病毒质粒Foxa3、Gata4、Hnf4a，所述三种慢病毒质粒的浓度均为50-100ng/μL，每种添加量为20μg,培养48~72h，离心收集浓缩病毒液，获得Foxa3、Gata4、Hnf4a三种重组慢病毒浓缩液；
（6）将传代5~7次的hp-MSCs传代至细胞培养皿中，细胞密度约为3~6×104个/皿，加入步骤（5）获得的Foxa3、Gata4、Hnf4a三种浓缩病毒液各100μL进行侵染诱导，当细胞生长至约80%融合时，可进行传代，待细胞发生明显形态变化形成肝样细胞克隆时，挑取诱导细胞至铺有胶原蛋白的培养皿中，并更换iHep培养基进行扩大培养，待诱导细胞生长至约80%汇合时，进行消化，离心，冻存；所述iHep培养基由如下组分配制获得：Knockout™ DMEM、1%非必须氨基酸、1%GlutaMAX™、1% ITS、50µM β-巯基乙醇、0.1µM 地塞米松和 1% 青链霉素。
2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，步骤（3）中所述消化酶组合物为0.25v/v%胰酶以及0.1v/v%IV型胶原酶的组合物。
3.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述方法进一步包括检测原代分离的hp-MSC细胞的步骤。
4.如权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述检测步骤包括细胞内报告基因的检测及细胞形态学的检测。
5.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述方法进一步包括检测分化获得的肝样细胞的功能的步骤。
6.如权利要求5所述的诱导方法，其特征在于，所述检测步骤具体为肝样细胞对ICG的摄入与排泌。
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