KR20180073631A - 세포의 조제 방법 - Google Patents

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KR20180073631A
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겐타 야마모토
츠나오 기시다
요시히로 소와
도시로 야마모토
오삼 마즈다
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교토후고리츠다이가쿠호진
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Abstract

포유 동물의 분화한 체세포를, 상기 분화한 체세포 이외의 다른 체세포를 분화 유도하기 위한 배지 중에서, TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양하여, 상기 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법을 제공한다.

Description

세포의 조제 방법
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은, 2015년 10월 21일에 출원된, 일본 특허 출원 제2015-207529호 명세서 (그 개시 전체가 참조에 의해 본 명세서 중에 원용된다) 에 기초하는 우선권을 주장한다.
본 발명은, 주로 세포의 조제 방법에 관한 것이다. 상세하게는 다이렉트·리프로그래밍에 의한 세포의 조제 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키기 위한 유도제에 관한 것이기도 하다.
최근, 세포를 환자에게 이식함으로써, 기능이나 형태의 이상을 보완하고, 병을 치료하는 재생 의료 기술이 주목되고 있다.
예를 들어 골아세포에 대해서는, 골 종양, 외상이나 골수염 등에 수반하는 골 결손, 또한 골 종양 등의 소파 후의 골 결손의 수복 목적으로, 병변부에 골아세포를 이식하면, 골 형성을 촉진시키고, 기능적 형태적인 예후가 향상되는 것으로 기대할 수 있다. 실제로, 예를 들어 환자의 해면골로부터 채취한 골수 세포를 자가 이식하는 치료가 실시되고 있고, 그 유효성이 알려져 있다. 이 경우 자가 골수 세포에 포함되는 간엽계 줄기 세포로부터 골아세포가 분화 유도되고, 골 형성과 리모델링에 기여하고 있는 것으로 생각된다. 한편, 고령화에 수반하여 골다공증의 이환율이 증가하고 있고, 고령자가 골절하면 장기 와상으로 연결되는 경우도 있다. 골아세포의 이식은, 골다공증이나 외상 등에 수반하는 골절, 난치성 골절이나 위골절의 치유를 촉진시킬 수 있는 것으로 생각된다. 골아세포의 이식은 또한, 관절 류머티즘, 돌발성 대퇴골두 괴사, 변형성 관절증, 요추 변형성 척추증, 척주관 협착증, 추간판 헤르니아, 척추 분리증, 척추 분리 미끄럼증, 척추 측만증, 경추증성 척수증, 후종 인대 골화증, 척수 손상, 변형성 고관절증, 변형성 슬관절증, 대퇴골두 미끄럼증, 골연화증, 수술 후의 뼈의 수복 (심장 수술 후의 흉골의 수복 등), 인공 족관절 수술에 수반하는 결손부의 수복, 골수염, 골 괴사 등에도 유용한 가능성이 있다.
한편, 치주병은 제 4 생활 습관병이라고도 불리며, 이환율이 매우 높고, 또한 다양한 전신 질환의 원인이 되고 있다. 치주병의 진행에 수반하여, 치조골의 골 흡수가 일어나기 때문에, 골아세포를 효율적으로 국소의 골 흡수부에 공급할 수 있으면, 치조골의 재생 치료로 연결되는 것으로 생각된다.
또한, 골아세포의 이식을, 골 이식, 인공 골 이식, 인공 관절이나 임플란트와 병용하면, 치료 효과를 높일 수 있을 가능성이 있다.
재생 의료 기술에 있어서, 사용하는 세포의 공급 수단이 과제의 하나이다.
예를 들어 이식 목적으로 하는 골아세포로서, 지금까지 골수 간엽계 줄기 세포나 골수 간엽계 줄기 세포를 포함하는 골수 세포 등이 이용되어 왔다. 그러나 골수의 채취는 환자에 대한 침습이 크고, 또한 충분한 수의 골수 세포를 공급할 수 없는 경우가 있는 등의 문제점이 있다. 한편, 인간 배성 줄기 세포 (ES 세포) 를 이용하면, 환자로부터 골수를 채취할 필요는 없고, 또한 충분한 수의 골아세포를 공급할 수 있을 가능성이 있지만, 윤리적 문제에 더하여 이식 후에 잔존 ES 세포가 종양화할 위험성이 있다. 또한 iPS 세포를 사용해도, 환자로부터 골수를 채취할 필요는 없고, 또한 충분한 수의 골아세포를 공급할 수 있을 가능성이 있지만, 이식 후에 잔존 iPS 세포가 종양화할 위험성이 있다.
다른 세포에 대해서도, 동일한 문제가 있다.
비특허문헌 1 은, 인간 ES 세포로의 Osterix 의 렌티바이러스 (Lentivirus) 벡터 도입 ＋ Osteogenic 배지에서의 골아세포로의 분화 유도를 실시하고 있다. 비특허문헌 2, 3 은, 마우스 iPS 세포로부터 MSC 를 거쳐 Osteogenic 배지로 분화 유도하여 골아세포를 얻고 있다.
비특허문헌 4 는, 마우스 iPS 세포에 Runx2 의 아데노바이러스 (Adenovirus) 벡터를 도입하고, Osteogenic 배지로 분화 유도하여 골아세포를 얻고 있다. 비특허문헌 1 ∼ 4 에 나타내는 바와 같이, 골아세포는 ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도하여 제작되고 있기 때문에, 장기간의 배양을 필요로 하고, 또한 암화의 위험성이 있었다.
체세포에, 조직 특이적인 전사 인자의 유전자군을 도입하여, iPS 세포를 거치지 않고 직접 그 조직 세포로 분화 유도할 수 있는 것 (다이렉트·컨버전 (다이렉트·리프로그래밍)) 에 대하여, 예를 들어, 이하의 보고가 있다 :
마우스 선유아세포 → 연골 세포 (SOX9 ＋ Klf4 ＋ c-Myc 유전자를 도입)
마우스 선유아세포 → 심근 세포 (GATA4 ＋ Mef2c ＋ Tbx5 유전자를 도입)
마우스 선유아세포 → 간 세포 (Hnf4α ＋ (Foxa1 또는 Foxa2 또는 Foxa3) 유전자를 도입)
마우스 선유아세포 → 신경 줄기 세포 (Sox2 ＋ FoxG1 유전자를 도입 등),
마우스, 인간 세포 → 조혈 줄기 세포 등.
특허문헌 1 에는, 체세포에 소정의 유전자군을 도입하여, 기능성을 갖는 골아세포를 효율적으로 조제 (다이렉트·컨버전) 하기 위한 방법이 개시되어 있다. 그러나, 유전자를 도입하는 방법에서는, 도입한 유전자나 벡터의 영향으로, 세포가 종양화할 가능성이 있다. 또한 안전성의 검증을 위해서 비용과 시간을 필요로 하는 등의 문제도 있다. 그래서, 유전자를 도입하지 않고 이식용의 세포를 유도하는 기술이 요구되고 있다.
국제 공개 공보 WO2015/012377
Karner E et al. J Cell Physiol. 2009. Li F et al. J Cell Biochem. 2010. Biloussova G et al. Stem cells. 2011. Tashiro K et al. Stem cells. 2009.
본 발명은, 주로, 세포의 조제 방법, 특히 분화한 체세포를 유전자 도입을 실시하지 않고 다른 체세포로 변환하는 기술 (다이렉트·컨버전 (다이렉트·리프로그래밍)) 의 기술) 을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는, 포유 동물의 분화한 체세포를 배지 중, TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서, 다양한 조성의 배지 중에 배양하여, 원재료의 체세포를, 당해 원재료의 체세포 이외의 다른 체세포로 변환할 수 있는 것을 알아냈다.
TGF-β 패스웨이 저해제를 사용한, 다이렉트·컨버전 (다이렉트·리프로그래밍) 의 보고는 없다.
본 발명은, 이하의 골아세포의 조제 방법, 골아세포 유도제 및 키트를 포함한다.
항 1, 포유 동물의 분화한 체세포를, 상기 분화한 체세포 이외의 다른 체세포를 분화 유도하기 위한 배지 중에서, TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양하여, 상기 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
항 2, TGF-β 패스웨이 저해제가, TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제인, 항 1 에 기재된 방법.
항 3, TGF-β 패스웨이 저해제가, D4476, SB431542, LY2157299, SD208, 또는 ALK5 저해제 II 인, 항 1 또는 2 에 기재된 방법.
항 4, TGF-β 패스웨이 저해제가, ALK5 저해제 II 인, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 5, 선유아세포를 간엽계의 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 6, 선유아세포 또는 케라티노사이트를 골아세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 7, 선유아세포 또는 말초혈 단핵 세포를 백색 지방 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 8, 선유아세포 또는 케라티노사이트를 갈색 지방 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 9, 체세포를 분화 유도하기 위한 배지가, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ (PPAR-γ) 아고니스트를 포함하는, 항 7 또는 8 에 기재된 방법.
항 10, 선유아세포를 연골 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 11, 선유아세포를 근아세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 12, 선유아세포를 슈반 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 13, 케라티노사이트를 요로 상피 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 14, 선유아세포를 간엽계 줄기 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 항 1 ∼ 4 의 어느 1 항에 기재된 방법.
항 15, TGF-β 패스웨이 저해제를 포함하는, 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키기 위한 유도제.
항 16, 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키기 위한 키트로서, TGF-β 패스웨이 저해제 및 상기 다른 체세포를 분화 유도하기 위한 배지를 포함하는 키트.
본 발명에서는, 저분자 화합물의 작용에 의해 분화한 체세포로부터 단기간에 다른 체세포를 제공할 수 있다. 얻어진 체세포 (예를 들어, 간엽계 줄기 세포나 골아세포) 는, 이식하는 본인의 체세포로부터 용이하게 유도할 수 있기 때문에, 얻어진 체세포 자체 또는 그것으로부터 제작한 조직을 이식한 경우에도 면역학적인 거절 응답 등의 문제는 발생하지 않는다. 또한, iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 체세포를 유도할 수 있기 때문에, 암화 등의 다능성 줄기 세포에서 기인하는 문제를 회피할 수 있다. 한편으로, 미리 제작하여 뱅크화해 두고, 그곳으로부터 환자로의 동종 이식이나 이종 이식에 사용하는 것도 가능하다.
도 1 은 알리자린 레드 S 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 2 는 알리자린 레드 S 염색의 결과 (흡광도 측정) 를 나타낸다.
도 3 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 4 는 오스테오칼신 (Osteocalsin) 의 면역 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 5 는 알리자린 레드 S 염색의 결과 (염색도 및 흡광도 측정) 를 나타낸다.
도 6 은 Runx2 의 면역 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 7 은 보디피 (Bodipy) 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 8 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 9 는 알시안 블루 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 10 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 11 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 12 는 오일레드 O (Oil Red O) 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 13 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 14 는 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 15A 는 Bodipy 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 15B 는 Bodipy 염색의 결과 (형광 강도 측정) 를 나타낸다.
도 16 은 TGF-β/SMAD 패스웨이를 모식적으로 나타낸다.
도 17 은 TGF-β/SMAD 패스웨이와 TGF-β/ERK 패스웨이를 모식적으로 나타낸다.
도 18 은 TGF-β/SMAD 패스웨이, TGF-β/JNK 패스웨이와 TGF-β/p38 패스웨이를 모식적으로 나타낸다.
도 19 는 TGF-β/SMAD 패스웨이와 TGF-β/RhoA 패스웨이를 모식적으로 나타낸다.
도 20 은 알리자린 레드 S 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 21 은 ALP 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 22 는 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 23 은 Oil Red O 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 24 는 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 25 는 알시안 블루 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 26 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 27 은 알리자린 레드 S 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 28 은 ALP 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 29 는 μCT 의 단층 이미지 (μCT analysis) 를 나타낸다. 화살표 머리는 골 결손 (Bone defect), 화살표는 재생한 골 조직 (화골) (Regenerated bone tissue (Callus)) 을 각각 나타낸다.
도 30 은 μCT 의 3D 재구축 이미지를 나타낸다. 이식 후 21 일 (21 days after transplantation) 의 이미지이다. 화살표는 골 결손 (Bone defect) 또는 재생한 골 조직 (화골) (Regenerated bone tissue (Callus)) 을 나타낸다. 상단은 단면도 (Cross section), 하단은 종단면 (Longitudinal) 이다.
도 31 은 헤마톡실린·에오신 염색 (HE 염색) 및 알리자린 레드 S 염색 (Alizarin Red S staining) 에 의한 조직학적 해석 (Histological analysis) 의 결과를 나타낸다.
도 32 는 DNA 마이크로 어레이 (DNA microarray) 해석에 의한, MSC 마커 유전자 (MSC marker genes) 의 발현량을 나타낸 히트 맵을 나타낸다.
도 33 은 알리자린 레드 S 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 34 는 알리자린 레드 S 염색의 결과 (흡광도 측정) 를 나타낸다.
도 35 는 알리자린 레드 S 염색 및 ALP 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 36 은 알리자린 레드 S 염색의 결과 (흡광도 측정) 를 나타낸다.
도 37 은 ALP 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 38 은 알리자린 레드 S 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 39 는 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 40 은 Osteocalsin (OC) 의 면역 염색의 결과 (염색도와 DAPI 양성 세포 중의 OC 양성 세포의 퍼센티지) 를 나타낸다.
도 41 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 42 는 UCP1 의 면역 염색의 결과 (염색 이미지) 를 나타낸다.
도 43 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 44 는 UCP1 의 면역 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 45 는 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 46 은 UCP1 의 면역 염색의 결과 (염색 이미지 (A) 와 DAPI 양성 세포 중의 UCP1 양성 세포의 퍼센티지 (B)) 를 나타낸다.
도 47 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 48 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 49 는 Bodipy 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 50 은 Bodipy 염색의 결과 (Bodipy 양성 세포의 비율) 를 나타낸다.
도 51 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 52 는 Bodipy 염색의 결과 (염색도) 를 나타낸다.
도 53 은 Bodipy 염색의 결과 (정량) 를 나타낸다.
도 54 는 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 55 는 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 56 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 57 은 리얼타임 RT-PCR 법에 의한 유전자 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
또한, 도 4, 도 6 및 도 7 은, 색반전 화상을 함께 나타내고 있다.
본 발명은, 포유 동물의 분화한 체세포를 원재료로 하여, 다른 체세포를 조제하는 방법에 관한 것이다. 다시 말하면, 본 발명은 포유 동물의 분화한 체세포를, 다른 체세포로 컨버트하는 방법에 관한 것이다. 「컨버트」 란, 체세포를 목적으로 하는 체세포로 변환하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법의 바람직한 양태의 하나는, 「다이렉트 컨버전」, 「다이렉트 리프로그래밍」 이라고도 불리는, iPS 세포의 제작으로 대표되는 세포의 초기화의 공정을 거치지 않고, 체세포를 다른 체세포로 컨버트하는 방법이다. 체세포를 다른 체세포로 직접 컨버트하는 방법이라고 환언할 수도 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 양태에 있어서는, 체세포는 유전자의 도입 없이, 다른 체세포로 컨버트된다. 「유전자의 도입 없이」 란, 체세포의 당초의 게놈 서열 (주로, DNA 의 염기 서열을 의미한다) 이 변화하지 않고, 다른 체세포로 컨버트되는 것을 의미한다. 혹은, 「유전자의 도입 없이」 란, 체세포의 당초의 내재 유전자의 기능에 기초하여, 다른 체세포로 컨버트되는 것을 의미한다.
분화한 체세포 (원재료)
본 발명의 방법에 있어서 원재료로서 사용하는 포유 동물의 분화한 체세포로는, 포유 동물 유래이면, 특별히 한정되지 않는다. 체세포란, 세포 중 생식 세포 이외의 세포를 의미한다.
체세포의 종류로는, 예를 들어, 선유아세포, 상피 세포 (피부 표피 세포, 구강 점막 상피 세포, 기도 점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포 등), 표피 세포, 잇몸 세포 (잇몸 선유아세포, 잇몸 상피 세포), 치수 세포, 백색 지방 세포, 피하 지방, 내장 지방, 근육, 혈액 세포 (예를 들어, 말초혈 단핵 세포) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 선유아세포, 잇몸 세포, 구강 점막 상피 세포, 치수 세포, 지방 세포, 표피 각화 세포 (케라티노사이트), 혈액 세포 등을 들 수 있다.
또한, 간엽계 줄기 세포 (Mesenchymal stem cell : MSC), 신경 줄기 세포 (Neural stem cell), 간 줄기 세포 (hepatic stem cell), 장 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 모낭 줄기 세포, 색소 세포 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 제작한 체세포도 들 수 있다. 또한, 다양한 체세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 다른 체세포로 유도한 세포도 들 수 있다. 또한, 생식 계열의 세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 유도한 체세포도 들 수 있다.
또한, 배양 세포도 들 수 있고, 배양 세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 유도한 체세포도 들 수 있다.
포유 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 인간, 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 소, 말, 돼지 등을 들 수 있다. 체세포는, 인간 유래인 것이 특히 바람직하다. 체세포가 유래하는 개체의 연령은 한정되지 않고, 성인이어도 되고 소아여도 되고 태아여도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 태아 유래의 세포, 그리고, 태반, 양막, 탯줄 등 유래의 세포도 「체세포」 에 포함된다.
조제한 체세포를 생체에 이식하는 경우에는, 이식되는 피험체 유래의 체세포 (자가 세포) 를 사용하는 것이, 감염이나 거절 응답 등의 위험을 저감시키기 때문에 바람직하다. 그러나, 자가 세포가 아니고, 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 만든 체세포를 이식에 사용할 수 있다. 또는 미리 준비해 둔 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 다른 체세포를 만들어, 이식에 사용할 수 있다. 또는 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 미리 만들어 둔 체세포를, 이식에 사용할 수 있다. 즉, 체세포 뱅크, 또는 체세포 전구 세포의 뱅크를 만들어 두고 이식 목적으로 제공할 수 있다. 이와 같은 경우, 거절 응답 등의 위험을 저감시키기 위해서, 미리 혈액형과 MHC 를 타이핑해 둘 수 있다. 또한, 미리 이식용의 체세포의 캐릭터나 조종양성 등을 확인해 둘 수 있다.
조제되는 다른 체세포
본 발명의 방법에 의해 조제되는 다른 체세포는, 원재료로서 사용하는 체세포 이외의 체세포이다. 또한, 원재료로서 사용하는 체세포로부터, 생리적인 조건하 (특히, 생체 내) 에서 분화하는 체세포는, 「다른 체세포」 에는 포함되지 않는다. 예를 들어, 생체 내에서 간엽계 줄기 세포로부터 골아세포로 분화하기 때문에, 간엽계 줄기 세포를 원재료로서 사용하는 경우에는, 골아세포는 「다른 체세포」 에는 해당하지 않는다.
조제되는 체세포의 종류로는, 예를 들어, 간엽계 줄기 세포 (MSC), 골아세포, 지방 세포 (갈색 지방 세포 또는 백색 지방 세포), 연골 세포, 근아세포, 요로 상피 세포, 골수 간질 세포, 건세포, 간세포, 담관 상피 세포, 슈반 세포 등의 글리아 세포, 신경 세포, 심근 세포, 평활근 세포, 혈관 내피 세포, 림프관 내피 세포 등을 들 수 있다.
또한, 표피 세포, 색소 세포, 모낭 세포, 조모 세포, 결합직세포, 폐와 기도의 세포 (기도 상피 세포, 폐포 상피 세포 등), 소화관 상피 세포, 선세포, 조혈 줄기 세포, 림프구, 과립구, 단구, 매크로파지, 마스트 세포, 거핵구, 혈소판, 적아구, 적혈구, 림프망내계 세포, 항원 제시 세포, 유선 상피 세포, 신장의 세포 (사구체 세포, 요세관 상피 세포, 요로 상피 세포 등의 요로계 세포 등), 생식기계 세포, 각막 세포, 결막 세포, 망막 세포, 활막 세포, 내분비 세포, 췌도의 세포 (인슐린 산생 세포 (β 세포) 등), 외분비 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 장관 줄기 세포, 타액선 줄기 세포 등을 들 수 있다.
원재료로서 사용하는 체세포와, 조제되는 체세포의 조합은 특별히 한정되지 않는다.
체세포가 조제되는 효율이 높다는 관점에서, 원재료로서 사용하는 체세포와 조제되는 다른 체세포는, 모두 간엽계 줄기 세포로부터 분화하는, 간엽계에 속하는 체세포인 것이 바람직하다.
간엽계에 속하는 세포로는, 간엽계 줄기 세포 (MSC), 선유아세포, 골아세포, 지방 세포, 연골 세포, 근아세포, 골수 간질 세포, 건세포 등이 예시된다. 또한, 간 세포, 담관 상피 세포, 글리아 세포, 신경 세포, 심근 세포, 평활근 세포, 혈관 내피 세포, 림프관 내피 세포 등의 간엽계 줄기 세포로부터 분화할 수 있는 가능성이 알려져 있는 세포도 「간엽계에 속하는 세포」 에 포함된다.
골아세포에는, 전골아세포, 미숙 골아세포, 성숙 골아세포, 골세포 등을 포함하는 것으로 한다. 또한 지방 세포에는, 백색 지방 세포와 갈색 지방 세포를 포함하고, 백색 지방 세포에는, 지방 줄기 세포, 전구 지방 세포, 성숙 지방 세포, 비대화 지방 세포 등을 포함하는 것으로 한다. 갈색 지방 세포에는, 베이지 세포, Brite 세포 등을 포함하는 것으로 한다. 연골 세포에는, 미숙 연골 세포, 성숙 연골 세포, 비대 연골 세포 등을 포함하는 것으로 한다. 근아세포에는, 근위성 세포, 미숙한 근아세포, 성숙한 근아세포, 근세포, 근관 세포, 근섬유 등을 포함하는 것으로 한다. 동일하게, 본 명세서에서 기재하는 세포는, 모두 그 명칭으로 대표되는 세포 계열의, 분화의 정도가 상이한 세포를 포함한다.
본 발명의 양태의 구체예로는, 선유아세포를 간엽계 줄기 세포 (MSC) 로 컨버트시키는 방법, 선유아세포를 골아세포로 컨버트시키는 방법, 선유아세포를 지방 세포로 컨버트시키는 방법 (예를 들어, 선유아세포를 백색 지방 세포로 컨버트시키는 방법, 선유아세포를 갈색 지방 세포로 컨버트시키는 방법 등), 선유아세포를 연골 세포로 컨버트시키는 방법, 선유아세포를 연골 세포로 컨버트시키는 방법, 선유아세포를 근아세포로 컨버트시키는 방법, 케라티노사이트를 요로 상피 세포로 컨버트시키는 방법, 혈액 세포 (예를 들어, 말초혈 단핵 세포) 를 백색 지방 세포로 컨버트시키는 방법 등이 예시된다.
또한, 잇몸 세포, 구강 점막 상피 세포, 치수 세포, 지방 세포, 혈액 세포 등을 원재료로 하고, 간엽계 줄기 세포 (MSC), 골아세포, 지방 세포, 연골 세포, 근아세포로 컨버트시키는 방법 등이 예시된다.
본 발명에서는, 원재료로부터 일단, 도중 경과의 세포 (예를 들어, MSC, MSC 모양의 세포, 그 밖의 체성 줄기 세포 등) 로 컨버트한 후에, 그 도중 경과의 세포로부터 최종 목적으로 하는 세포 (골아세포, 지방 세포, 연골 세포나 근아세포 등) 로 분화하는 것도 포함된다. 도중 경과의 세포 등도 체세포의 하나이기 때문에, 이것을 경유해도 본 명세서에서는 다이렉트·컨버전이라고 부른다.
배지
본 발명의 방법에 있어서, 분화한 체세포를, 분화한 체세포 이외의 다른 체세포를 유도하기 위한 배지 (분화 유도 배지) 중에서 배양한다. 분화 유도 배지로는, 목적으로 하는 조제되는 체세포에 따라, 공지된 분화 유도 배지를 사용할 수 있다.
「분화한 체세포 이외의 다른 체세포를 유도하기 위한 배지」, 「분화 유도 배지」 란, 주로 다능성 줄기 세포 (ES 세포, iPS 세포 등) 를 당해 체세포로 분화시킬 수 있는 성분을 포함하는 배지를 가리킨다.
예를 들어, 골아세포를 유도하기 위한 배지로는, 아스코르브산 (예를 들어, 농도 0.1 ∼ 1000 ㎍/㎖ 정도, 바람직하게는, 1 ∼ 100 ㎍/㎖ 정도) ; β-글리세로포스페이트 (β-Glycerophosphate) (예를 들어, 농도 0.1 ∼ 1000 mM 정도, 바람직하게는 1 ∼ 100 mM 정도) ; 덱사메타손 (1 nM ∼ 10 mM 정도, 바람직하게는 10 ∼ 1000 mM 정도) 및 히드로코르티손 등의 당질 코르티코이드로 이루어지는 군에서 선택되는 성분 (1 종 또는 2 종 이상) 을 통상적인 액체 배지에 첨가한 것이 예시된다. 구체적 예로서, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손 (모두 최종 농도) 을, 10 ％ FBS 혹은 5 ％ HS 첨가의 DMEM 등의 통상 배지에 첨가한 것을 들 수 있다. 그러나 이들에 한정되지 않는다.
백색 지방 세포를 유도하기 위한 배지로는, 인슐린 (Insulin) (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 ㎍/㎖ 정도, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎍/㎖ 정도) ; 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (3-isobutyl-1-methylxanthine ; IBMX) (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 mM 정도, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 mM 정도) ; 덱사메타손 (dexametazone) (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 μM 정도, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM 정도) 등의 성분 (1 종 또는 2 종 이상) 을 통상 배지에 첨가한 것이 예시된다. 구체예로서, 10 ％ FBS 첨가 DMEM ＋ MDI 배지 (0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 및 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한, 10 ％ FBS 첨가 DMEM) 를 들 수 있다. 그러나 이들에 한정되지 않는다.
백색 지방 세포로 컨버트시키는 효율이 높다는 관점에서, 추가로 Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ (PPAR-γ) 아고니스트 (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 μM 정도, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM 정도) 를 첨가하는 것이 바람직하다.
PPAR-γ 아고니스트로는, 로시글리타존, 시글리타존, GW1929, nTZDpa, 피오글리타존 하이드로클로라이드, 트로글리타존 등의 티아졸리딘디온 화합물이 예시된다.
갈색 지방 세포를 유도하기 위한 배지로는, 인슐린 (Insulin) (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 ㎍/㎖ 정도, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 ㎍/㎖ 정도) ; 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (3-isobutyl-1-methylxanthine ; IBMX) (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 mM 정도, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 mM 정도) ; 덱사메타손 (Dexametazone) (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 μM 정도, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM 정도) 를 통상 배지에 첨가한 것이 예시된다. 또한, 인도메타신 (Indometacin) (예를 들어 농도 0.001 ∼ 10 mM 정도, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 1 mM 정도) 를 첨가해도 된다.
갈색 지방 세포로 컨버트시키는 효율이 높다는 관점에서, 추가로 갑상선 호르몬 (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 nM 정도, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 nM 정도) 및/또는 Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ (PPAR-γ) 아고니스트 (예를 들어 농도 0.01 ∼ 100 μM 정도, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM 정도) 를 첨가하는 것이 바람직하고, 양자를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.
갑상선 호르몬으로는, 트리요오드티로닌 (Triiodothyronine, T3), 티록신 (Thyroxine, T4) 등이 예시된다.
PPAR-γ 아고니스트로는, 로시글리타존, 시글리타존, GW1929, nTZDpa, 피오글리타존 하이드로클로라이드, 트로글리타존 등의 티아졸리딘디온 화합물이 예시된다.
갈색 지방 세포를 유도하기 위한 배지의 구체예로는, [1] FBS 10 ％, 0.5 mM IBMX, 125 nM 인도메타신, 1 microM 덱사메타손, 850 nM 인슐린, 1 nM 트리요오드티로닌 (Triiodothyronine, T3), 1 μM 로시글리타존을 첨가한 DMEM 배지, [2] 10 ％ FBS, 850 nM 인슐린, 1 nM T3, 1 μM 로시글리타존을 첨가한 DMEM 배지가 예시된다. 제 1 ∼ 2 일에 [1] 을, 제 3 일 이후에 [2] 를 사용할 수 있다.
또한, 선유아세포로부터 갈색 지방 세포를 유도하기 위한 배지로서, 1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 및 10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM 을 사용할 수 있다. 케라티노사이트로부터 갈색 지방 세포를 유도하기 위한 배지로서, 1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한 HuMedia-KG2 를 사용할 수 있다.
그러나 이들에 한정되지 않는다.
PPAR-γ 아고니스트로는, 로시글리타존, 시글리타존, GW1929, nTZDpa, 피오글리타존 하이드로클로라이드, 트로글리타존 등이 예시된다.
간엽계 줄기 세포를 유도하기 위한 배지로는, 예를 들어 하기의 문헌 (1-1) ∼ (1-4) 에 기재된 배지를 사용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
(1-1) M. D. Hoffman and D. S. W. Benoit, J Tissue Eng Regen Med. 2013 Apr 1. doi : 10.1002/term.1736
(1-2) C-Y Li, et al., Stem Cell Res Ther. 2015 Apr 13 ; 6 : 55. doi : 10.1186/s13287-015-0066-5.
(1-3) B. Gharibi and F. J. Hughes, Stem Cells Transl Med. 2012 Nov ; 1(11) : 771-82. doi : 10.5966/sctm. 2010-0031. Epub 2012 Oct 23
(1-4) S.K. Both et al. Tissue Eng. 2007 Jan ; 13(1) : 3-9.
(1-5) F. Ng et al., Blood. 2008 Jul 15 ; 112(2) : 295-307. doi : 10.1182/blood-2007-07-103697. Epub 2008 Mar 10.
(1-6) Hynes K. et al., J Dent Res. 2013 Sep ; 92(9) : 833-9.
연골 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 하기의 문헌 (2-1) ∼ (2-4) 에 기재된 배지를 사용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
(2-1) H. Outani, et al., PLOS One, 8(10) : e77365. doi : 10.1371/journal.pone.0077365
(2-2) G.-I. Im, et al. Tissue Engineering. March 2006, 12(3) : 527-536. doi : 10.1089/ten.2006.12.527.
(2-3) H-J. Kim and G.-I. Im, Journal of Orthopaedic Research, Volume 27, Issue 5, pages 612-619, May 2009
(2-4) A.M. Ibrahim et al., Microscopy Research and Technique, Volume 78, Issue 8, pages 667-675, August 2015.
근아세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 5 ％ FBS, 50 microG/㎖ 소 페투인 (Bovine Fetuin), 10 nG/㎖ hEGF, 1 nG/㎖ bFGF, 10 microG/㎖ 인슐린, 0.4 microG 덱사메타손을 첨가한 Ham's/F10 배지 ; 10 ％ FBS, 10 microM 5-아자시티딘 (5-azacytidine), 10 ng/㎖ VEGF, 10 ng/㎖ IGF-1, 10 ng/㎖ bFGF 를 첨가한 DMEM 배지 ; 5 ％ 말혈청 (Horse serum), 10 ng/㎖ 를 첨가한 αMEM 배지 등을 사용할 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 : Int J Mol Med. 2014 Jan ; 33(1) : 160-70. doi : 10.3892/ijmm. 2013. 1555. Epub 2013 Nov 13. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
신경 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, [1] 1 microM Retinoic acid (RA), 5 microM FSK 첨가 DMEM 배지, [2] 1 microM RA, 5 microM FSK, 10 ng/㎖ bFGF 첨가 DMEM 배지, [3] 1 microM RA, 1 microM FSK, 10 ng/㎖ bFGF, 100 ng/㎖ SHH 첨가 DMEM 배지를 이용하여, 제 1 ∼ 3 일째에 [1], 제 4 ∼ 5 일째에 [2], 제 6 일째 이후에 [3] 을 사용할 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 : Yan Y. et al., Stem Cells Transl Med. 2013 Nov ; 2(11) : 862-70. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
글리아 세포와 신경 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 : L. Hook et al., Neurochemistry International. Volume 59, Issue 3, September 2011, Pages 432-444 나 Selvaraj V. et al., Front Biosci (Landmark Ed). 2012 Jan 1 ; 17 : 65-89. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나 이들에 한정되는 것은 아니다.
글리아 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 : Duan L. et al., Stem Cells Transl Med. 2015 May ; 4(5) : 437-47. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나 이들에 한정되는 것은 아니다.
슈반 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 10 ％ FBS (fetal bovine serum) 를 첨가한 DMEM 배지 (둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modied Eagle's Medium)) 등의 통상 배지에, 1 ∼ 20 μM 정도 (특히, 5 μM 정도) 의 포스콜린 (forskolin) ; 2 ∼ 50 ng/㎖ 정도 (특히, 10 ng/㎖ 정도) 의 bFGF (염기성 선유아세포 증식 인자, basic fibroblast growth factor) ; 2 ∼ 50 ng/㎖ 정도 (특히, 10 ng/㎖ 정도) 의 PDGF (platelet-Derived Growth Factor) ; 50 ∼ 1000 ng/㎖ 정도 (특히, 200 ng/㎖ 정도) 의 human neuregulin-β1 (별명, heregulin, GGF (Glial growth factor)) 등의 성분의 1 종 또는 2 종 이상 (바람직하게는, 모두) 을 포함하는 배지 (슈반 세포 유도 배지) 를 사용할 수 있다 (이상의 농도는, 모두 종농도이다). 일례로서, 하기 문헌 (3-1) ∼ (3-2) 에 기재된 배지 (미분화 지방 줄기 세포로부터 슈반 세포를 유도할 수 있는 배지) 를 사용할 수 있다.
(3-1) Kingham PJ, DF Kalbermatten, D Mahay, et al : Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype andpromote neurite outgrowth in vitro. ExpNeurol, 2007 ; 207 : 267-274.
(3-2) Liu Y, Zhang Z, Qin Y, Wu H, Lv Q, Chen X, Deng W : A new method for Schwann-like cell differentiation of adipose derived stem cells. Neurosci Lett. 2013 Sep 13 ; 551 : 79-83.
심근 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 : Y. J. Nam et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Apr 2 ; 110(14) : 5588-93. doi : 10. 1073/pnas. 1301019110. Epub 2013 Mar 4. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나 이들에 한정되지 않는다.
혈관 내피 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 10 ％ FBS, 100 ng/㎖ VEGF 를 첨가한 DMEM 을 사용할 수 있다. 또한, Chatterjee I. et al., Methods Mol Biol. 2015 Feb 17. PMID : 25687301 에 기재된 방법으로 실시할 수 있다. 그러나 이들에 한정되지 않는다.
평활근 세포 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Wang Y. et al., Biomaterials. 2014 Oct ; 35(32) : 8960-9. 에 기재된 방법으로 실시할 수 있다. 그러나 이들에 한정되지 않는다.
마스트 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, [1] 15 ％ FBS, 20 ng/㎖ VEGF 를 첨가한 DMEM 배지, [2] 10 ％ FBS, 10 ng/㎖ IL-3, 100 ng/㎖ IL-6, 10 ng/㎖ Flt3L, 10 ng/㎖ TPO, 10 ng/㎖ VEGF 를 첨가한 IDMD 배지, [3] 10 ％ Stem span, 100 ng/㎖ SCF, 100 ng/㎖ IL-6, 10 ng/㎖ Flt3L, 10 ng/㎖ TPO, 10 ng/㎖ VEGF 를 첨가한 IDMD 를 이용하여, 제 1 ∼ 8 일에 [1], 제 9 ∼ 18 일에 [2], 제 19 일 이후에 [3] 을 사용할 수 있다. 그러나 이들에 한정되지 않는다.
β 세포 (인슐린 산생 세포) 를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 15 ％ FBS, 100 ng/㎖ 액티빈 A (Activin A), 10 nM GLP-1, 10 mM 니코틴아미드 (Nicotinamide), 20 ng/㎖ EGF, 10 ng/㎖ bFGF, ITS 첨가 DMEM 을 사용할 수 있다. 또한, Shahjalal HM et al., J Mol Cell Biol. 2014 Oct ; 6(5) : 394-408. 이나 Noguchi H. et a., Curr Diabetes Rev. 2010 May ; 6(3) : 184-90. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
간 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Y. Yu et al., Stem Cell Res. 2012 Nov ; 9(3) : 196-207 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소화관의 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Spence JR. et al. Nature. 2011 Feb 3 ; 470(7332) : 105-9. 나 wells JM and Spence JR. Development. 2014 Feb ; 141(4) : 752-60. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
폐와 기도의 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Ghaedi M. et al., J Clin Invest. 2013 Nov ; 123(11) : 4950-62. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
요로 상피 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Osborn S.L. et al., Stem Cells Transl Med. 2014 ; 3(5) : 610-619. 나 Kang M. et al., Int. J. Mol. Sci. 2014, 15(5), 7139-7157 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
신장의 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Lam AQ, et al. Semin Nephrol. 2014 Jul ; 34(4) : 445-61. 이나 Lam AQ, and Bonventre JV. Curr Opin Organ Transplant. 2015 Apr ; 20(2) : 187-92. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
조혈 줄기 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Wang Y, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005 ; 102 : 19081-6. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
혈액 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Nakayama N. et al., Blood. 1998 Apr 1 ; 91(7) : 2283-95. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
림프구를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Carpenter L. et al., Blood. 2011 Apr 14 ; 117(15) : 4008-11. 이나 Vodyanik MA, et al., Blood. 2005 ; 105 : 617-26. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
적아구를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Lu SJ, et al., Blood. 2008 ; 112 : 4475-84. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
거핵구를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Takayama N. and Eto K. Methods Mol Biol. 2012 ; 788 : 205-17. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
수상 세포나 매크로파지를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Senju S. et al., Gene Ther. 2011 Sep ; 18(9) : 874-83. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
과립구를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Morishima T. et al., J Cell Physiol. 2011 May ; 226(5) : 1283-91. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
망막 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Maeda T. et al., J Biol Chem. 2013 Nov 29 ; 288(48) : 34484-93 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
각막 세포를 유도하기 위한 배지로는, 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, Yu D.et al., Cell Biol Int. 2013 Jan ; 37(1) : 87-94. 에 기재된 배지를 사용할 수 있다. 그러나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
통상 배지로는, 예를 들어, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, EMEM (Eagle's minimal essential medium) 등의 통상적인 액체 배지를 사용할 수 있다. 필요에 따라, 혈청 성분 (Fetal Bovine Serum (FBS), Human Serum (Serum)), 스트렙토마이신, 페니실린 등의 항균약, 비필수 아미노산 (Non-Essential Amino Acid) 등의 성분을 첨가할 수 있다.
TGF-β 패스웨이 저해제
본 발명의 방법에 있어서, 다른 체세포를 유도하기 위한 배지 중에서, TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양한다.
「TGF-β 패스웨이 저해제」 란, TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제, TGF-β/Erk 패스웨이 저해제, TGF-β/JNK 패스웨이 저해제, TGF-β/p38 패스웨이 저해제 및 TGF-β/RhoA 패스웨이 저해제를 포함한다. 즉, TGF-β 리셉터 패밀리의 분자, 그 리간드가 되는 TGF-β 슈퍼 패밀리의 사이토카인, TGF-β 리셉터 패밀리의 분자의 하류에서 TGF-β/SMAD 패스웨이, TGF-β/Erk 패스웨이, TGF-β/JNK 패스웨이, TGF-β/p38 패스웨이, TGF-β/RhoA 패스웨이를 구성하는 분자 중, 어느 1 개 이상을 억제하는 저해제가, 본 발명의 TGF-β 저해제이다.
「TGF-β 패스웨이 저해제」 는 협의의 저해제인 저분자 화합물에 그치지 않고, 사이토카인의 중화 항체, 수용체의 안타고니스트, 가용성 수용체, 패스웨이의 단백질에 결합하여 그 작용을 저해하는 활성을 갖는 항체, 압타머, 펩티드, 도미넌트 네거티브로서 작용하는 변이체 단백질이나 펩티드나 그 유사체, 패스웨이의 단백질의 발현을 억제하는 siRNA, shRNA, 마이크로 RNA 등을 포함한다.
TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제
TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제는, TGF-β/SMAD 패스웨이에 속하는 단백질의 활성을 저해할 수 있는 화합물을 의미한다. TGF-β/SMAD 패스웨이는 도 16 (Chen G et al, Int J Biol Sci, 2012 에서 인용) 에 모식적으로 나타내는, 당업자에게 공지된 시그널 경로이다.
TGF-β/SMAD 패스웨이는, TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 단백질로 구성되는 리간드 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC, 액티빈-βE, nodal, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, BMP10, BMP15, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF15, AMH (MIS) 등), 헤테로 2 량체형의 수용체를 구성하는 TGF-β 유형 I 수용체 패밀리에 속하는 단백질 및 TGF-β 유형 II 수용체 패밀리에 속하는 단백질, 그리고, 세포 내의 시그널 전달 분자 (이펙터) 인 SMAD 패밀리에 속하는 단백질 (특히 SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD1, SMAD5, 또는 SMAD8) 이 주로 구성한다.
TGF-β/SMAD 패스웨이에 있어서는, 리간드가 2 량체형의 수용체에 결합하면, 키나아제형 수용체인 TGF-β 유형 I 수용체 단백질이, SMAD 단백질을 인산화하여, 하류에 시그널을 전달한다. 따라서 본 명세서에서는, TGF-β 슈퍼 패밀리의 사이토카인, TGF-β 유형 I 수용체 패밀리, TGF-β 유형 II 수용체 패밀리, SMAD 패밀리 단백 (특히 SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD1, SMAD5, 또는 SMAD8) 의 어느 것을 억제하는 분자를, TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제라고 부른다.
TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제의 양태의 하나로서, TGF-β 유형 I 수용체 패밀리 (Activin receptor like kinase (ALK) 패밀리라고도 한다) 에 속하는 ALK 단백질 (ACVRL1 (ALK1), ACVR1 (ALK2), BMPR1A (ALK3), ACVR1B (ALK4), TGFBR1 (ALK5), BMPR1B (ALK6), ACVR1C (ALK7)) 의 저해제 (ALK 저해제) 가 예시된다. 또한, TGF-β 유형 II 수용체 패밀리에 속하는 단백질 (ACVR2A (ACTRII), ACVR2B (ACTRIIB), TGFBRII (AAT3), BMPR2 (PPH1)) 의 저해제가 예시된다.
구체적으로는, ALK5 의 저해제인 D4476 (4-[4-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐) 1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드), ALK5 저해제 II (2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘 ; 별명 RepSox), GW788388, SD-208 (2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-4-[(4-피리딜) 아미노]프테리딘) ; ALK5 와 TGFBRII (AAT3) 의 저해제인 LY2109761, LY2157299 (갈루니서팁, 4-[5,6-디하이드로-2-(6-메틸-2-피리디닐)-4H-피롤로[1,2-b]피라졸-3-일]-6-퀴놀린카르복사미드, LY364947 (4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린) ; ALK4 및 ALK5 의 저해제인 SM16 (4-(5-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-4-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-이미다졸-2-일) 비시클로[2.2.2]옥탄-1-카르복사미드), EW-7197, SB525334 ((6-[2-tert-부틸-5-(6-메틸-피리딘-2-일)-1H-이미다졸-4-일]-퀴녹살린) ; ALK4, ALK5 및 ALK7 저해제인 SB431542 (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(피리딘-2-일)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드), SB505124、A83-01；ALK2 및 ALK3 의 저해제인 LDN-193189、PKC-412, 아피게닌 (Apigenin), DMH1, ML347 ; ALK1 및 ALK2 의 저해제인 LDN-214117 ; ALK1, ALK2 및 ALK3 의 저해제인 LDN-212854 ; ALK1, ALK2, ALK3 및 ALK6 의 저해제인 K02288 이 예시된다.
TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제로서, Gellibert, F et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 4494-4506 에 기재된 하기 식 (1) 또는 (2) 로 나타내는 화합물 혹은 그 염을 사용할 수도 있다.
[화학식 1]
Figure pct00001
[식 중, X 는 CH 또는 N 이다.
R1 은 H, 메틸기 또는 할로겐 (예를 들어, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드) 이다.
R2 는 H 또는 메틸기이다.]
ALK 저해제로는, 효과가 높다는 관점에서, 적어도 ALK5 에 대한 저해 활성을 갖는 것 (ALK5 저해제) 이 바람직하다. 효과가 특히 높다는 관점에서, ALK4 및 ALK5, 또는 ALK5 에 대한 특이적인 저해 활성을 갖는 것 (ALK 단백질 중, 당해 단백질에 대한 저해 활성이 현저하게 높은 것) 이 바람직하다.
바람직한 ALK 저해제의 구체예로서, D4476, SB431542, SD208, LY2157299 및 ALK5 저해제 II 가 예시되고, ALK5 저해제 II 가 특히 바람직하다. D4476, SB431542, SD208, 및 ALK5 저해제 II 는, 선유아세포를 골아세포로 컨버트하는 효율이 높다. LY2157299 및 ALK5 저해제 II 는, 선유아세포를 갈색 지방 세포로 컨버트하는 효율이 높다.
TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제의 다른 양태로서, SMAD 단백질의 저해제가 예시된다. 그 중에서도, ALK5 의 하류에 위치하는 SMAD2 및 SMAD3, 나아가 SMAD4 의 저해제가 바람직하다.
TGF-β/ERK 패스웨이 저해제
TGF-β/ERK 패스웨이 저해제는, TGF-β/ERK 패스웨이에 속하는 단백질의 활성을 저해할 수 있는 화합물을 의미한다. TGF-β/ERK 패스웨이는 도 17 (Y. E. Zhang, "Non-smad pathways in TGF-β signaling" Cell Research 19 : 128, 2009 에서 인용) 에 모식적으로 나타내는, 당업자에게 공지된 시그널 경로이다.
TGF-β/Erk 패스웨이는, TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 단백질로 구성되는 리간드 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC, 액티빈-βE, nodal, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, BMP10, BMP15, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF15, AMH 등), 헤테로 2 량체형의 수용체를 구성하는 TGF-β 유형 I 수용체 패밀리에 속하는 단백질 및 TGF-β 유형 II 수용체 패밀리에 속하는 단백질, 그리고, 세포 내의 시그널 전달 분자인 Raf, MEK1/2, Erk1/2 단백질이 주로 구성한다.
TGF-β/Erk 패스웨이에 있어서는, 리간드가 2 량체형의 수용체에 결합하면, Raf, MEK1/2, Erk1/2 로 하류에 시그널이 전달한다. 따라서 본 명세서에서는, TGF-β 슈퍼 패밀리의 사이토카인, TGF-β 유형 I 수용체 패밀리, TGF-β 유형 II 수용체 패밀리, Raf, MEK1/2, Erk1/2 의 어느 것을 억제하는 분자를, TGF-β/Erk 패스웨이 저해제라고 부른다.
TGF-β/Erk 패스웨이 저해제의 양태의 하나로서, 전술한 ALK 단백질의 저해제가 예시된다.
TGF-β/Erk 패스웨이 저해제의 다른 양태로서, Raf 의 저해제, MEK1 의 저해제, MEK2 의 저해제, Erk1 의 저해제 및 Erk2 의 저해제의 저해제가 예시된다. 그 중에서도, Erk1 의 저해제, Erk2 의 저해제가 바람직하다.
TGF-β/JNK 패스웨이 저해제
TGF-β/JNK 패스웨이 저해제는, TGF-β/JNK 패스웨이에 속하는 단백질의 활성을 저해할 수 있는 화합물을 의미한다. TGF-β/JNK 패스웨이는 도 18 (Y. E. Zhang, "Non-smad pathways in TGF-β signaling" Cell Research 19 : 128, 2009 에서 인용) 에 모식적으로 나타내는, 당업자에게 공지된 시그널 경로이다.
TGF-β/JNK 패스웨이는, TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 단백질로 구성되는 리간드 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC, 액티빈-βE, nodal, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, BMP10, BMP15, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF15, AMH 등), 헤테로 2 량체형의 수용체를 구성하는 TGF-β 유형 I 수용체 패밀리에 속하는 단백질 및 TGF-β 유형 II 수용체 패밀리에 속하는 단백질, 그리고, 세포 내의 시그널 전달 분자인 TAB1/2, TAK1, TRAF6, MKK4, JNK 단백질이 주로 구성한다.
TGF-β/JNK 패스웨이에 있어서는, 리간드가 2 량체형의 수용체에 결합하면, TAB1/2, TAK1, TRAF6, MKK4, JNK 로 하류에 시그널이 전달한다. 따라서 본 명세서에서는, TGF-β 슈퍼 패밀리의 사이토카인, TGF-β 유형 I 수용체 패밀리, TGF-β 유형 II 수용체 패밀리, TAB1/2, TAK1, TRAF6, MKK4, JNK 의 어느 것을 억제하는 분자를, TGF-β/JNK 패스웨이 저해제라고 부른다.
TGF-β/JNK 패스웨이 저해제의 양태의 하나로서, 전술한 ALK 단백질의 저해제가 예시된다.
TGF-β/JNK 패스웨이 저해제의 다른 양태로서, TAK1 의 저해제, MKK4 의 저해제 및 JNK 의 저해제의 저해제가 예시된다. 그 중에서도, JNK 의 저해제가 바람직하다.
TGF-β/p38 패스웨이 저해제
본 발명의 방법에 있어서, 다른 체세포를 유도하기 위한 배지 중에서, TGF-β/p38 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양한다.
TGF-β/p38 패스웨이 저해제는, TGF-β/p38 패스웨이에 속하는 단백질의 활성을 저해할 수 있는 화합물을 의미한다. TGF-β/p38 패스웨이는 도 18 (Y. E. Zhang, "Non-smad pathways in TGF-β signaling" Cell Research 19 : 128, 2009 에서 인용) 에 모식적으로 나타내는, 당업자에게 공지된 시그널 경로이다.
TGF-β/p38 패스웨이는, TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 단백질로 구성되는 리간드 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC, 액티빈-βE, nodal, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, BMP10, BMP15, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF15, AMH 등), 헤테로 2 량체형의 수용체를 구성하는 TGF-β 유형 I 수용체 패밀리에 속하는 단백질 및 TGF-β 유형 II 수용체 패밀리에 속하는 단백질, 그리고, 세포 내의 시그널 전달 분자인 TAB1/2, TAK1, TRAF6, MKK3, MKK6, p38 패밀리에 속하는 단백질이 주로 구성한다.
TGF-β/p-38 패스웨이에 있어서는, 리간드가 2 량체형의 수용체에 결합하면, TAK, MKK3 또는 MKK6, p-38 패밀리 (특히 p-38α, p-38β) 로, 하류에 시그널이 전달된다. 따라서 본 명세서에서는, TGF-β 슈퍼 패밀리의 사이토카인, TGF-β 유형 I 수용체 패밀리, TGF-β 유형 II 수용체 패밀리, TAB1/2, TAK1, TRAF6, MKK3, MKK6, p38 패밀리 단백 (특히 p38α, p38β) 의 어느 것을 억제하는 분자를, TGF-β/SMAD 패스웨이 저해제라고 부른다.
TGF-β/p38 패스웨이 저해제의 양태의 하나로서, 전술한 ALK 단백질의 저해제가 예시된다.
TGF-β/p38 패스웨이 저해제의 다른 양태로서, TAK1 의 저해제, MKK3 의 저해제, MKK6 의 저해제, p38 의 저해제를 들 수 있다. 그 중에서도, p38 의 저해제가 바람직하다.
TGF-β/RhoA 패스웨이 저해제
본 발명의 방법에 있어서, 다른 체세포를 유도하기 위한 배지 중에서, TGF-β/RhoA 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양한다.
TGF-β/RhoA 패스웨이 저해제는, TGF-β/RhoA 패스웨이에 속하는 단백질의 활성을 저해할 수 있는 화합물을 의미한다. TGF-β/RhoA 패스웨이는 도 19 (Y. E. Zhang, "Non-smad pathways in TGF-β signaling" Cell Research 19 : 128, 2009 에서 인용) 에 모식적으로 나타내는, 당업자에게 공지된 시그널 경로이다.
TGF-β/RhoA 패스웨이는, TGF-β 슈퍼 패밀리에 속하는 단백질로 구성되는 리간드 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC, 액티빈-βE, nodal, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, BMP10, BMP15, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF15, AMH 등), 헤테로 2 량체형의 수용체를 구성하는 TGF-β 유형 I 수용체 패밀리에 속하는 단백질 및 TGF-β 유형 II 수용체 패밀리에 속하는 단백질, 그리고, 세포 내의 시그널 전달 분자인 Par6, PKCζ, Smurf1, RhoA 단백질이 주로 구성한다.
TGF-β/RhoA 패스웨이에 있어서는, 리간드가 2 량체형의 수용체에 결합하면, TAK, MKK3 또는 MKK6, p-38 패밀리 (특히 p-38α, p-38β) 로, 하류에 시그널이 전달된다. 따라서 본 명세서에서는, TGF-β 슈퍼 패밀리의 사이토카인, TGF-β 유형 I 수용체 패밀리, TGF-β 유형 II 수용체 패밀리, Par6, PKCζ, Smurf1, RhoA 의 어느 것을 억제하는 분자를, TGF-β/RhoA 패스웨이 저해제라고 부른다.
TGF-β/RhoA 패스웨이 저해제의 양태의 하나로서, 전술한 ALK 단백질의 저해제가 예시된다.
TGF-β/RhoA 패스웨이 저해제의 다른 양태로서, RhoA 의 저해제, PAK 의 저해제를 들 수 있다. 그 중에서도, RhoA 의 저해제가 바람직하다.
TGF-β 패스웨이 저해제의 바람직한 예로서, ALK5 또는 그 리간드가 되는 TGF-β 패밀리의 사이토카인, 및, ALK 5 의 하류에서 TGF-β/SMAD 패스웨이, TGF-β/Erk 패스웨이, TGF-β/JNK 패스웨이, TGF-β/p38 패스웨이, 또는 TGF-β/RhoA 패스웨이를 구성하는 분자 중, 어느 1 개 이상을 억제하는 저해제를 들 수 있다.
물론, 2 개 이상의 패스웨이를 억제하는 저해제여도 상관없다. TGF-β 리셉터 패밀리의 분자, 또는 그 리간드가 되는 TGF-β 슈퍼 패밀리의 사이토카인을 억제하는 저해제는, TGF-β 패스웨이 중 복수의 패스웨이를 억제하기 때문에 바람직하다.
TGF-β 패스웨이 저해제로는, 공지된 TGF-β 패스웨이 저해제에 한정되지 않는다. 이후 개발되는 TGF-β 패스웨이 저해제는 모두 본 발명의 TGF-β 패스웨이 저해제에 포함된다.
TGF-β 패스웨이 저해제는, 상기의 화합물의 유도체도 포함한다. 예를 들어, WO00/61576호에 기재된 D4476 의 유도체를 사용할 수 있다.
「TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하」 란, 주로 TGF-β 패스웨이 저해제를 배지 중에 함유시키는 양태를 의미하지만, 본 발명의 효과를 저해하지 않는 한 이것에 한정되지 않는다. TGF-β 패스웨이 저해제의 배지 중의 농도는, 당업자가 적절히 설정할 수 있다. 통상적으로는, 0.01 μM ∼ 100μM 정도, 특히 0.1 μM ∼ 10 μM 정도이다.
TGF-β 패스웨이 저해제는, 1 종을 단독으로, 또는, 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 범위에서, 다른 화합물과 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 목적으로 하는 체세포가 조제되는 효율이 높다는 관점에서, TGF-β 패스웨이 저해제와 스타틴 화합물을 병용할 수 있다.
스타틴 화합물로는, HMG-CoA 환원 효소 저해제를 널리 포함하고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 심바스타틴, 아토르바스타틴, 로바스타틴, 플루바스타틴, 프라바스타틴, 세리바스타틴, 피타바스타틴, 로수바스타틴, 디하이드로콤팍틴, 콤팍틴, 베르바스타틴, 칼파스타틴, 크릴바스타틴, 달바스타틴, 글렌바스타틴, 플루인도스타틴, 벨로스타틴, 메바스타틴, 리바스타틴, 시리바스타틴, CI-981 등을 들 수 있다. 이후 개발되는 스타틴 화합물은 모두 본 발명의 스타틴 화합물에 포함된다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 전술한 배지의 성분 이외에 사용하는 TGF-β 패스웨이 저해제 및 다른 화합물의 수는, 10 종 이하, 보다 바람직하게는 4 종 이하, 더욱 바람직하게는 3 종 이하, 특히 바람직하게는 1 종 또는 2 종이다.
배양
본 발명의 방법에 있어서, 포유 동물의 분화한 체세포를 유도 배지 중, TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양한다.
배양은, 세포 및 배지를 격납하기 위한 적절한 용기 중에서 실시할 수 있다. 바람직한 배양을 실시하는 수법으로서, 약 37 ℃ 정도 및 이산화탄소 농도 약 5 ％ 정도의 조건하에서 배양하는 수법이 예시되지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 상기 조건에서의 배양은, 예를 들어 공지된 CO2 인큐베이터를 사용하여 실시할 수 있다.
배양을 실시하는 기간은, 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위에서, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 24 시간 내지 60 일간 정도 바람직하게는 3 ∼ 30 일, 보다 바람직하게는 10 ∼ 20 일 정도, 특히 바람직하게는 14 일 정도로할 수 있다.
TGF-β 패스웨이 저해제는 전체 배양 기간 중의 일부의 기간만 첨가해도 된다.
효과가 높다는 관점에서, 전체 배양 기간 중, 소정 기간 (예를 들어 6 ∼ 10 일 정도, 특히 8 일 정도) 유도 배지 중 상기 화합물의 존재하에서의 배양을 하고, 그 후 유도 배지 중 상기 화합물의 비존재하에서의 배양으로 할 수 있다. 이 경우의 상기 화합물의 존재하에서의 배양은, 전체 배양 기간 중, 배양 개시로부터 여도 되고, 소정 기간 상기 화합물의 비존재하에서 배양한 후여도 된다.
특히 갈색 지방 세포를 조제하는 경우, 전체 배양 기간 중, 배양 개시로부터 소정 기간, 예를 들어 6 ∼ 10 일 정도, 특히 8 일 정도, 유도 배지 중 상기 화합물의 존재하에서의 배양을 하고, 그 후 유도 배지 중 상기 화합물의 비존재하에서의 배양으로 함으로써, 갈색 지방 세포를 효율적으로 조제할 수 있다.
또한, 포유 동물의 분화한 체세포를, 통상 배지 중 TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양한 후에, 유도 배지 중 TGF-β 패스웨이 저해제의 비존재하에서 배양해도 된다. 또한, 통상 배지 중 TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양한 후에, 통상 배지 중 TGF-β 패스웨이 저해제의 비존재하에서 배양하고, 그 후 유도 배지 중 TGF-β 패스웨이 저해제의 비존재하에서 배양해도 된다. 또한, 통상 배지 중 TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양한 후에, 유도 배지 중 TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양하고, 그 후 유도 배지 중 TGF-β 패스웨이 저해제의 비존재하에서 배양해도 된다. 이와 같이, TGF-β 패스웨이 저해제 존재하에서 배양하는 것과, 유도 배지로 배양하는 것의 양방의 과정을 포함하고만 있으면, 그것들은 동시가 아니어도 되고, 각각은 전체 배양 기간의 일부만이어도 된다.
배양에 있어서, 필요에 따라 계대를 실시할 수 있다. 계대를 실시하는 경우에는, 콘플루언트 상태에 도달하기 전 또는 직후에 세포를 회수하고, 세포를 새로운 배지에 파종한다. 또한, 본 발명의 배양에 있어서, 배지를 적절히 교환할 수도 있다.
또한, 완전하게 컨버전이 완료되지 않아도, 배양 도중의 세포를 회수하여, 이식에 사용할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 방법에 의해 컨버전의 트리거가 당겨져, 불가역적인 에피게놈의 변화가 일어남으로써 이식 후에 세포가 목적으로 하는 세포로 컨버트하는 것을 기대할 수 있다.
이렇게 하여, 목적으로 하는 체세포가 조제된다.
목적으로 하는 체세포가 조제된 것은, 마커의 검출 등 공지된 방법에 의해 검증을 할 수 있다.
이하에 그 예를 서술하지만, 모두 하나의 마커만으로 확정할 수 있다고는 한정하지 않고, 몇 가지 마커의 검출을 조합하여 검증하는 것이 바람직하다.
조제한 체세포의 트랜스크립톰 해석 등의 mRNA 발현의 망라적인 해석, 프로테옴 해석 등의 단백질 발현의 망라적인 해석 등을 실시하여, 생체 유래의 목적 체세포의 해석 결과와 비교를 실시하여, 목적으로 하는 체세포가 조제된 것의 평가를 실시할 수도 있다.
예를 들어, 골아세포가 얻어진 것은, ALP (알칼리포스파타아제) 유전자, 오스테오칼신 (Osteocalcin, OC) 유전자, 오스테오폰틴 (Osteopontin) 유전자, Runx2 유전자의 mRNA 의 리얼타임 PCR 에 의한 측정, 알리자린 레드 S 에 의한 염색 (석회화 (미네랄화) 한 골 기질의 산생), 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 전골아세포, 미숙 골아세포, 성숙 골아세포, 골세포 등도 합쳐서 「골아세포」 라고 부르는 것으로 한다.
백색 지방 세포가 얻어진 것은, 오일레드 O (Oil Red O) 염색이나 보디피 (Bodipy) 염색으로 물들일 수 있는, 큰 단방성 지방 방울을 갖는 특유의 형태나, FABP4 유전자, HS 유전자 L, AdipoQ 유전자의 발현에 의해 확인할 수 있다.
갈색 지방 세포가 얻어진 것은, Oil Red O 염색이나 Bodipy 염색으로 물들일 수 있는, 다방성 지방 방울을 갖는 특유의 형태나, UCP-1 유전자, CIDEA 유전자, KCNK3 유전자, PCG-1α 유전자, Cox8b 유전자, Otop 유전자, ELOVL3 유전자 등의 발현에 의해 검출할 수 있다. 그 중에서도, UCP-1 (Uncoupling protein 1) 은, 갈색 지방 세포에 특이적으로 발현하는 유전자이고, 산화적 인산화를 탈공액시키는 미토콘드리아 내막 단백질을 코드하고, 갈색 지방 세포의 기능의 근간을 담당하는 것으로 생각되기 때문에, 갈색 지방 세포의 지표로서 특히 바람직한 1 개이다.
연골 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 SOX9 유전자, COL2A1 (타입 II collgaen) 유전자, aggrecan 유전자, COL11A1 (Type XI collgaen) 유전자, MMP13 유전자의 발현, 연골 기질의 산생, 알시안 블루 염색, 톨루이딘 블루 염색, 사프라닌 O 염색 등에 의해 검출할 수 있다.
근아세포가 얻어진 것은, 예를 들어 MyoD 유전자, Myogenin 유전자, Myf5 유전자, MRF4 유전자의 발현 ; 골격근형 α 액틴 단백질, 골격근형 미오신 단백질의 발현, 근에 특유의 형태 (다핵, 근섬유의 형성, 근관의 형성), 수축성 등에 의해 검출할 수 있다.
심근 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 트로포닌 T(cTnT) 단백질, 트로포미오신 단백질, 심근형 α 액틴 단백질, 심근형 미오신 단백질의 발현 ; ATP2A2 유전자, GJA1 유전자, GJA5 유전자, NPPA 유전자, NPPB 유전자의 발현, 자율적인 수축성 등에 의해 검출할 수 있다.
평활근 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 α 평활근 액틴 (αSMA) 단백질, 평활근 미오신 단백질의 발현에 의해 검출할 수 있다.
간엽계 줄기 세포 (MSC) 가 얻어진 것은, 항 Stro-1, 항 CD90, 항 CD106, 항 CD105, 항 CD146, 항 CD166, 항 CD44 항체에 의해 염색되고, 항 CD19, 항 CD45 항체에 의해 염색되지 않는 등, 복수의 항체를 사용한 세포 표면 항원의 발현 패턴에 의해 검출할 수 있다. 또한 MASP1 유전자, FOSB 유전자의 발현이나, Nestin 단백질, CXCL12 단백질, PDGF 수용체α/Sca-1 단백질, CD51/PDGF 수용체 α 단백질 등의 발현을 조사하여 종합적으로 판정할 수 있다. 또한 다양한 간엽계 세포로의 분화능에 의해 검출할 수 있다.
신경 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 Tuj1 단백질, vGLUT1 단백질, MAP2 단백질의 발현이나 형태, 신경 전달 물질의 합성, 활동 전위에 의해 검출할 수 있다.
글리아 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 올리고덴드로글리아의 경우에는 olig2 단백질, 아스트로사이트의 경우에는 GFAP 단백질, 마이크로 글리아의 경우에는 OX42 단백질의 발현에 의해 검출할 수 있다.
슈반 세포가 얻어진 것은, 형태 (비교적 소형의 핵을 갖는 쌍극, 혹은 다극성의 세포 형태, 세포 폭과 세포 길이의 비), S100β, p75NTR, GFAP, Nestin, NG2 등의 슈반 세포 특이적 마커의 발현의 검출, 공배양한 신경 세포에 대한 신경 돌기 신장의 효과나 미엘린 형성능에 의해 검출할 수 있다.
간 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 알부민, cytochrome P450 의 발현이나 다양한 효소 활성, 약제의 대사, LDL 취입 등의 기능에 의해 검출할 수 있다.
담관 상피 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 AFP(-), Dlk(-), Alb(-), CK19(+), zEpCAM(+), Thy1(-) 라는 캐릭터에 의해 검출할 수 있다.
혈관 내피 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 CD31 항원의 발현, Endoglin, VE-cadherin, VWF, TIE2, ANGPT2 의 발현에 의해 검출할 수 있다.
림프 내피 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 D2-40 항원의 발현, Podoplanin, LYVE-1, PROX-1 의 발현에 의해 검출할 수 있다.
건세포가 얻어진 것은, 예를 들어 Scleraxis (Scx) 와 tenomodulin (T㎚d) 의 발현에 의해 검출할 수 있다.
선유아세포는, COL1A1, COL1A2 의 유전자 발현 등으로 확인할 수 있다.
골수 간질 세포는, 세포 표면 마커의 발현, 유전자 발현 등으로부터 확인할 수 있다.
림프구, 매크로파지, 과립구, 조혈 줄기 세포, 마스트 세포 등이 얻어진 것도, 세포 표면 마커의 발현, 유전자 발현 등으로부터 확인할 수 있다.
요로 상피 세포가 얻어진 것은, 예를 들어 Uroplakin1b, Uroplakin2, CK5, CK17 의 유전자 발현, 비대칭 단위 멤브레인 (Asymmetric Unit Membrane) 의 형성 등에 의해 검출할 수 있다.
치료 또는 예방제 ; 이식재
본 발명의 방법에 의해 조제되는 체세포는, 생체에 이식함으로써, 다양한 질환 또는 상태의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 특별히 명시가 없는 한, 「치료」 라는 용어는, 환자가 특정한 질환 또는 장해를 앓고 있는 동안에 실시하는 처치를 의도하고, 이에 의해 질환 혹은 장해의 중증도, 또는 1 개 혹은 복수의 그 증상이 경감되거나, 또는 질환 혹은 장해의 진행이 지연 또는 감속하는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, 「치료」 에는 「예방」 을 포함하는 것으로 한다.
이식 재료란, 체세포를 세포를 생체 내에 도입하는 재료를 말한다. 이식 재료는, 인비트로로 체세포를 조제한 후, 동일 또는 다른 개체에 이식하는 재료를 포함한다. 또한, 목적으로 하는 체세포를 인비트로로 분화 도중까지 유도하고, 이식 후에 인비보로 최종적으로 목적으로 하는 체세포로 유도되는 이식재도, 본 발명에 포함된다.
예를 들어, 골아세포를 사용하여 치료하는 대상이 되는 질환으로는, 골 종양, 외상이나 골수염 등에 수반하는 골 결손, 또한 골 종양 등의 소파 후의 골 결손, 골절, 골다공증, 치주병, 치조골 흡수, 구순 구개열, 관절 류머티즘, 돌발성 대퇴골두 괴사, 변형성 관절증, 요추 변형성 척추증, 척주관 협착증, 추간판 헤르니아, 척추 분리증, 척추 분리 미끄럼증, 척추 측만증, 경추증성 척수증, 후종 인대 골화증, 척수 손상, 변형성 고관절증, 변형성 슬관절증, 대퇴골두 미끄럼증, 골연화증, 하악 재건술 등의 복잡 골절에 의해 파괴된 골절 부위의 재건술, 수술 후의 뼈의 수복 (심장 수술 후의 흉골의 수복 등), 인공 족관절 수술에 수반하는 결손부의 수복, 골수염, 골 괴사 등을 들 수 있다. 또한, 골아세포를 이식하면, 골 이식, 인공 골 이식, 인공 관절이나 임플란트와 병용하여 치료 효과를 높일 수 있을 가능성이 있다. 또한 골아세포를 3 차원적인 스캐폴드 등을 사용하여 배양하여 다양한 형태의 골 조직을 체외에서 제작하고, 그 골 조직을 이식하는 것에 의해, 상기의 질환의 치료를 실시할 수도 있다. 그 이외에도 골아세포의 결손, 부족 혹은 기능 저하에 관계하는 다양한 질환이 대상이 된다.
질환의 치료에 한정하지 않고, 미용 목적으로 사용할 수도 있다. 예를 들어 사고나 수술 등에 의해 결손된 부위에 골아세포 혹은 그것에 의해 제작된 골 조직을 이식함으로써, 골 기질을 산생시켜 결손 부위를 수복하고, 부풀어오르게 하여 눈에 띄지 않게 할 수 있다. 그 때, 인간에 대한 처치도, 본 명세서에서는 편의상 치료라고 부르고, 「환자」 는 「정상인」 혹은 「인간」, 「질환」 은 「미용」 이라고 바꾸어 읽을 수 있다.
골아세포를 세포 제제로서 환자에게 이식할 수도 있고, 하이드록시 에퍼타이트나 생체 흡수성 세라믹 등의 인공 재료로 이루어지는 기재 (스캐폴드 (scaffold)) 와 함께 이식하거나, 스캐폴드와 함께 배양한 후 이식할 수 있다. 이들의 경우, 스캐폴드는 이식 목적에 따라 다양한 3 차원적인 형상을 만들 수 있다.
또한, 갈색 지방 세포는, 비만, 메타볼릭 신드롬, 혹은 이들에 관련하는 질환 또는 상태의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 대상으로 하는 질환에는, I 형 당뇨병, II 형 당뇨병, 당뇨병성 합병증 (망막증, 말초 신경증, 신증, 대혈관 장해, 당뇨병성 괴저, 골다공증, 당뇨병성 혼수 등), 내당능 이상, 인슐린 저항성, 아시도시스, 케토시스, 케토아시도시스, 비만, 중추성 비만과 그 합병증, 내장 비만 증후군, 고혈압, 식후 고지혈증, 뇌혈관 장해, 동맥 경화증, 아테롬성 동맥 경화증, 메타볼릭·신드롬, 지질 이상증, 고트리글리세리드 혈증, 고콜레스테롤 혈증, 저 HDL 혈증, 신장 질환 (당뇨병성 네프로파시, 네프로제 증후군 등), 동맥 경화증, 혈전성 질환, 심근경색, 허혈성 심질환, 협심증, 심부전, 뇌혈관 장해 (뇌경색, 뇌졸중 등), 말초 혈행 장해, 지각 장애, 고요산 혈증, 통풍, 감염증 (호흡기 감염증, 요로 감염증, 소화관 감염증, 피부 감염증, 연부 조직 감염증 등), 악성 종양, 백내장, 지방간, 비알코올성 지방성 간염, 골다공증이 포함된다. 갈색 지방 세포에 의한 지질의 연소와 당·지질 대사 이상의 개선에 의해, 이들 질환에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
또한, 갈색 지방 세포는, 복부나 턱의 주위, 허벅지 등의 지방을 제거하는 미용적인 용도에도 사용할 수 있다. 갈색 지방 세포는, 유방 등에 도입하는 미용적 처치의 이식 재료로서 사용할 수도 있다.
갈색 지방 세포를 투여하면, 지방량, 특히 내장 지방, 피하 지방 등의 백색 지방 세포가 감소하고, 또한 고칼로리식을 섭취한 경우에도 체중 증가가 억제되기 때문에, 비만, 메타볼릭 신드롬, 혹은 이들이 관련하는 질환 또는 상태의 예방과 치료의 양방에 유용하다. 본 발명은 또한, 질환의 예방 또는 치료에 한정하지 않고, 건강 증진이나 미용 (예를 들어 복부, 턱, 팔, 허벅지 등의 내장 지방, 피하 지방의 제거) 등의 목적으로 사용할 수도 있다. 그 때, 인간에 대한 처치도, 본 명세서에서는 편의상 치료라고 부르고, 「환자」 는 「정상인」 혹은 「인간」, 「질환」 은 「건강 증진」 이나 「미용」 등이라고 바꾸어 읽을 수 있다.
갈색 지방 세포는, 유방 등에 도입하는 미용적 처치의 이식 재료로서 사용할 수도 있다.
백색 지방 세포에 대해서는, 외상, 열상이나 수술 등에 의한 조직의 결손부에 백색 지방 세포를 이식함으로써, 조직의 형태를 개선하고 감염의 예방 등을 실시할 수 있다. 예를 들어 유방암의 적출 수술 후의 결손부에 백색 지방 세포를 이식함으로써, 유방을 재건할 수 있다. 또한 미용적 처치의 이식 재료로서 사용할 수도 있다.
근아세포에 대해서는, 듀켄씨 근 디스트로피, 근 디스트로피, 선천성/원위형 미오파티, 근 강직성 디스트로피 등의 미오토니아 증후군, 미토콘드리아병, 주기성 사지 마비 등의 근원성 질환, 베르드니히·호프만병, 샤르코·마리·투드병, 선천성 미엘린 형성 부전증, 근위축성 측색 경화증 (ALS) 등의 신경원성 근질환, 피부 근염, 다발성 근염, 결절성 다발 동맥염, 류머티스성 다발 근통증, 혼합성 결합 조직병 등의 교원병, 염증성 근질환, 내분비성 근질환, 스테로이드나 고지혈증 치료약 등에 의한 약제성 근질환, 사코페니아, 진행성 골화성 섬유 이형성증 (FOP) 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
연골 세포에 대해서는, 변형성 관절증, 변형성 연골증, 연골 형성 이상증 관절염, 관절 류머티즘, 외상, 추간판 손상, 반월판 손상, 이단성 골연골염, 골 괴사, 신경원성 관절증 등의 연골 질환에 있어서 볼 수 있는 연골 손상이나 연골 결손 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
간엽계 줄기 세포에 대해서는, 간엽계 줄기 세포로부터 분화할 수 있는 골아세포, 지방 세포, 연골 세포, 근아세포 등이 유효한 상기의 많은 질환 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
건세포에 대해서는, 외상이나 수술에 수반하는 건의 단열 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
신경 세포와 글리아 세포에 대해서는, 신경 변성 질환 (파킨슨병, 파킨슨 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증, 진행성 핵상성 마비, 헌팅턴병, 샤이·드래거 증후군, 흑질선조체 변성증, 올리브교 소뇌 위축증, 척수 소뇌 실조증 등), 피질 기저핵 변성증, 루이소체병, 디스토니아, 메이그 증후군, 만발성 소뇌 피질 위축증, 가족성 경성 대마비, 운동 뉴런 질환, 마카도 조셉병, Pick 병, 뇌졸중, 뇌혈관 장해, 탈수 질환 (다발성 경화증, 길랭·바레 증후군, 급성 산재성 뇌척수염, 급성 소뇌염, 횡단성 척수염 등), 뇌종양, 감염에 수반하는 뇌척수 질환 (수막염, 뇌농양, 크로이츠펠트-야콥병 등), 외상 후의 신경 기능 장해, 독물이나 방사선 등에 의한 신경 장해, 정신 질환 (통합 실조증, 조울증 등), 수면 장해 (나르콜렙시, 원발성 과면증, 반복성 과면증, 돌발성 과면증, 불면증 등), 간질 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
슈반 세포를 사용하여 치료하는 대상이 되는 질환으로는, 뇌경색, 척추 손상 등에 의한 중추 신경의 결손 혹은 손상, 외상이나 신경염이나 종양의 절제 등에 수반하는 말초 신경의 결손 혹은 손상 ; 다발성 경화증 시신경 척수염 (Devic 증후군), 동심원 경화증 (Balo 병), 급성 산재성 뇌척수염 (acute disseminated encephalomyelitis, ADEM), 염증성 광범성 경화증 (Schilder 병), 감염성 아급성 경화증 전뇌염 (subacute sclerosing panencephalitis, SSPE), 진행성 다소성 백질 뇌증 (progressive multifocal leukoencephalopathy, PML) 등의 중추 신경계의 질환 ; 길랭·바레 증후군, 피셔 증후군, 만성 염증성 탈수성 다발 근신경염 등의 말초 신경계의 질환 ; Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) 등의 슈반 세포 결손, 부족 혹은 기능 저하에 기초하는 질환 등을 들 수 있다.
간 세포와 담관 상피 세포에 대해서는, 간부전, 극증간염, 간경변, 지방간염, 메타볼릭 신드롬 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다. 또한 간장에 대한 약물의 독성 시험, 대사 시험, 안전성 시험에 유용하다. 또한 당뇨병, 지질 이상증, 메타볼릭 신드롬, 고혈압 등에 대한 약제의 스크리닝, 효과 판정에 유용하다.
폐와 기도의 세포는, 원발성 폐 고혈압증, 폐선유증, 폐기종, 기관지 확장증, 폐 사르코이도시스, 간질성 폐렴, 낭포성 섬유증, 미만성 범세 기관지염, 폐색성 세기관지염, 폐 호산균성 육아종증, 만성 혈전 경색증성 폐고혈압증, 다발성 폐 동정맥루 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
신장의 세포는 신부전, 당뇨병성 신증, 만성 사구체신염, 천성 신장 저형성, 낭포신, IgA 신증, 신경화증, 임신 중독증 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
요로 상피 세포는, 방광암으로 방광 전적한 증례에 있어서의 대용 방광의 형성, 방광 질루로 요로 상피가 결손한 부위에 대한 패치의 구축, 신경인성 방광으로 방광이 섬유화하여 위축된 증례에 대하여 방광 확대술을 실시할 때에, 부분적으로 보완하기 위한 요로 상피의 형성, 고도의 간질성 방광염 (요로 상피의 기능 이상) 에 대한 요로 상피 재생 등에 유용하다.
심근 세포는, 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 심근염, 비대형 심근증, 확장형 심근증 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
림프관 내피는 림프 부종 등에 대한 예방과 치료 효과가 얻어지는 것으로 생각된다.
평활근 세포는, 기도, 소화관, 혈관의 재생 치료시에 유용하다.
혈관 내피 세포는, 혈관의 재생 치료시에 유용하다.
조혈 줄기 세포와 골수 간질 세포는 골수 부전, 재생 불량성 빈혈이나 면역 부전에 유용하다.
림프구, 과립구, 매크로파지, 수상 세포는 면역 부전증에, 또한 항종양 면역에 유용하다. 거핵구는 혈소판 감소에 유용하다. 적아구는 재생 불량성 빈혈에 유용하다.
본 발명은 또한, 인간뿐만 아니라, 개, 고양이 등의 애완 동물이나 소, 말, 돼지, 양, 닭 등의 가축의 질환의 치료에도 사용하는 것이 가능하다. 그 경우, 「환자」 혹은 「인간」 을 「환축」 혹은 「동물」 이라고 바꾸어 읽는 것으로 한다.
본 발명은 또한, 재생 의료뿐만 아니라, 다양한 질환에 대한 약제 (생물학적 제제나 핵산 의약도 포함한다) 의 개발, 약제의 부작용의 평가, 발생이나 병태 해명 등 기초 연구에도 사용할 수 있다.
유도제
본 발명은, TGF-β 패스웨이 저해제를 포함하는, 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키기 위한 유도제도 제공한다. 또한, 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키기 위한, TGF-β 패스웨이 저해제의 사용도 제공한다.
즉, 본 발명은 TGF-β 패스웨이 저해제의 신규의 용도를 제공하는 것이다.
유도제는, TGF-β 패스웨이 저해제 단독이어도 되고, TGF-β 패스웨이 저해제를 포함하는 조성물이어도 된다. 조성물인 경우, TGF-β 패스웨이 저해제를 용해시키기 위한 적절한 용매 (물, DMSO 등) 를 추가로 포함하는 것이어도 된다.
실시예
이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
이하에, 실시예에서 사용한 화합물의 구조를 나타낸다.
[화학식 2]
Figure pct00002
[화학식 3]
Figure pct00003
[화학식 4]
Figure pct00004
[화학식 5]
Figure pct00005
이하, 본 명세서 중 및 도면 중에 있어서, 「ALK5 저해제 II」 를 「ALK5 저해제」, 「ALK5 IH」, 「ALK5 IHII」 또는 「ALK5 i II」 라고 기재하는 경우가 있다.
실시예 1 (도 1)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 5 × 103 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지, 또는 각 화합물을 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 24 일까지 배양하였다.
제 24 일에, 각 웰로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. 그 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이트하였다. 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 촬영하였다.
각 화합물의 농도는 이하와 같다 :
D4476 : 2 μM
ALK5 저해제 II : 2 μM
SB431542 : 2 μM.
결과를 도 1 에 나타낸다. D4476, ALK5 저해제 II, 또는 SB431542 를 첨가한 유도 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 석회화 골 기질 산생능을 갖는 골아세포로 컨버전된 것을 알 수 있다. 특히 ALK5 저해제 II 가 가장 높은 효율로 선유아세포를 골아세포로 컨버전하는 것을 알 수 있다.
TGF-β 시그널에 대해서는, 골아세포의 증식, 생존, 분화와 골 형성에 필수이고, 골아세포의 분화와 골 형성에 촉진적으로 작용하는 것이 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 : Kasagi and Chen, Cell & Bioscience 2013, 3 : 4). 본 발명의 방법에 의해, TGF-β 패스웨이의 억제에 의해 골아세포로의 컨버전을 달성할 수 있는 것은, 의외의 결과였다.
실시예 2 (도 2)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 5 × 103 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 석회화 유도 배지, 또는 각 화합물을 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 24 일까지 배양하였다.
제 24 일에, 각 웰로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이트하였다. 염색 후의 염색액은, 96 웰 플레이트에 회수하고, 흡광도계로 흡광도 (OD : 550 ㎚) 를 측정하였다.
각 화합물의 농도는 이하와 같다 :
D4476 : 2 μM
SB431542 : 2 μM
ALK5 저해제 II : 2 μM.
결과를 도 2 에 나타낸다. D4476, ALK5 저해제 II, 또는 SB431542 를 첨가한 유도 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 석회화 골 기질 산생능을 갖는 골아세포로 컨버전된 것을 알 수 있다. 특히 ALK5 저해제 II 가 가장 높은 효율로 선유아세포를 골아세포로 컨버전하는 것을 알 수 있다.
실시예 3 (도 3)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 5 × 103 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 석회화 유도 배지, 또는 각 화합물을 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 24 일까지 배양하였다.
제 24 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix, 오스테오갈신 (Osteocalcin) 및 알칼리 포스파타제 (Alkaline Phosphatase) 또는 β-액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. 오스테오갈신 (Osteocalcin) 및 알칼리 포스파타제 (Alkaline Phosphatase) 유전자의 mRNA 레벨을 β-액틴 유전자 mRNA 에 대한 비로서 정량하고, 석회화 유도 배지만으로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
각 화합물의 농도는 이하와 같다 :
D4476 : 2 μM
SB431542 : 2 μM
ALK5 저해제 II : 2 μM.
결과를 도 3 에 나타낸다. D4476, ALK5 저해제 II, 또는 SB431542 를 첨가한 유도 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 오스테오칼신과 알칼리포스파타아제 유전자를 발현하는 골아세포로 컨버전된 것을 알 수 있다. 특히 ALK5 저해제 II 가 가장 높은 효율로 선유아세포를 골아세포로 컨버전하는 것을 알 수 있다.
실시예 4 (도 4)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 5 × 103 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 통상 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 24 일까지 배양하였다.
제 24 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 4 ％ 파라포름알데히드로 고정 후, PBS (-) 로 세정하였다. PBS (-) 로 3 회 세정한 후, Blocking One 을 첨가하여, 실온에서 60 분간 인큐베이트하였다.
항 오스테오칼신 (Osteocalcin) 항체를 첨가하여 4 ℃ 에서 over night 로 반응시킨 후, 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. Alexa 488-콘쥬게이트 항-마우스 Ig (Alexa 488-conjugated anti-mouse Ig) 항체를 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, Wash buffer 로 5 회 wash 하였다. 형광 현미경을 사용하여 배율 200 배로 사진 촬영을 실시하였다.
결과를 도 4 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 유도 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 오스테오칼신을 산생하는 골아세포로 컨버전된 것을 알 수 있다.
실시예 5 (도 5)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 또는 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포 (human adipose derived stem cells ; ADSC) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 5 × 103 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 19 일까지 배양하였다.
제 19 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. 그 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이트하였다. 염색 후의 염색액은, 96 웰 플레이트에 회수하고, 흡광도계로 550 ㎚ 의 흡광도 (OD550) 를 측정하였다 (도 5 아래). 또한 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 1 배의 배율, 및 도립 현미경으로 40 배의 배율로 촬영하였다 (도 5 위).
결과를 도 5 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 유도 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포 및 지방 유래 간엽계 줄기 세포가 석회화 골 기질 산생능을 갖는 골아세포로 컨버전된 것을 알 수 있다.
실시예 6 (도 6)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 5 × 103 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 통상 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 24 일까지 배양하였다.
제 19 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 4 ％ 파라포름알데히드로 고정 후, PBS (-) 로 세정하였다. PBS (-) 로 3 회 세정한 후, Blocking One 을 첨가하여, 실온에서 60 분간 인큐베이트하였다.
항 Runx2 항체를 첨가하여 4 ℃ 에서 over night 로 반응시킨 후, 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. Alexa 488-콘쥬게이트 항-마우스 Ig (Alexa 488-conjugated anti-mouse Ig) 항체를 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 세정 버퍼로 5 회 세정하였다. 형광 현미경을 사용하여 배율 200 배로 사진 촬영을 실시하였다.
또한, 통상 배지로 배양한 세포를 HDF, ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 유도 배양한 세포를 dOBs 로서 도면에 나타낸다.
결과를 도 6 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 유도 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 Runx2 를 발현하는 골아세포로 컨버전된 것을 알 수 있다.
실시예 7 (도 7)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 10 × 103 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 4 일째에 배양 상청을 흡인 제거하고, 50 mM ALK5 저해제 II 를 첨가한 유도 배지 (a) (하기) 를 첨가하여 배양을 실시하였다. 6 일째에 유도 배지 (a) 를 제거하고, 50 mM ALK5 저해제 II 를 첨가한 유도 배지 (b) (하기) 를 첨가하여 배양을 계속하였다. 그 후, 9, 12, 14, 16 일째에, 50 mM ALK5 저해제 II 를 첨가한 유도 배지 (b) 를 사용하여 동일하게 배지 교환을 반복하였다.
제 20 일에 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. 보디피 (Bodipy) 로 염색 후, 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 100 배, 200 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 7 에 나타낸다. 위상 콘트라스트 (Phase contrast) 에서도 형광 이미지에서도, 큰 단방성 지방 방울을 포함하는 백색 지방 세포가 확인되어, 인간 정상 피부 유래 선유아세포가 백색 지방 세포로 컨버전된 것을 알 수 있다.
유도 배지 (a) 및 (b) 의 조성은 이하와 같다 :
[유도 배지 (a)]
DMEM (고 글루코오스) : 500 ㎖
FETAL BOVINE SERUM (FBS) : 50 ㎖
MEM 비필수 아미노산 용액 (MEM Non-Essential Amino Acids Solution) : 5 ㎖ 100 mM-피루브산 나트륨 용액 (Sodium Pyruvate Solution) : 5 ㎖
페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액 : 5 ㎖ 인슐린 : 170 nM
3,3',5-트리오도-L-티로닌 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine) : 1 nM
로시글리타존 : 1 uM
IBMX (3-이소부틸-1-메틸크산틴) : 0.5 mM 인도메타신 : 62.5 nM
덱사메타손 (Dexamethasone) : 1 uM
[유도 배지 (b)]
DMEM (고 글루코오스) : 500 ㎖
FOETAL BOVINE SERUM (FBS) : 50 ㎖
MEM 비필수 아미노산 용액 : 5 ㎖ 100 mM-피루브산 나트륨 용액 : 5 ㎖
페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액 : 5 ㎖ 인슐린 : 170 nM
3,3',5-트리오도-L-티로닌 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine) : 1 nM.
실시예 8 (도 8)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 2 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 싸이클릭 피피트린-α (Cyclic Pifithrin-α) 또는 ALK5 저해제 II 를 첨가한 연골 유도 배지 (StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit : Thermo Fisher Scientific 사 제조) 를 1000 ㎕/웰 첨가하였다.
2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 18 일까지 배양하였다.
제 18 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix, Sox9 및 Aggrican 또는 β-액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. Sox9 및 Aggrican 유전자의 mRNA 레벨을 β-액틴 유전자 mRNA 에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
각 화합물의 농도는 이하와 같다 :
싸이클릭 피피트린-α (Cyclic Pifithrin-α) : 5 μM
ALK5 저해제 II : 2 μM.
결과를 도 8 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 의 존재하, 연골 유도 배지로 배양을 실시함으로써, 인간 정상 피부 유래 선유아세포를, Sox9 와 Aggrican 유전자를 발현하는 연골 세포로, 컨버전할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 싸이클릭 피피트린-α (Cyclic Pifithrin-α) 는, 선유아세포로부터 iPS 세포로의 리프로그래밍을 촉진시키는 것이 알려져 있지만, 선유아세포로부터 연골 세포로의 컨버전은 촉진시키지 않는 것을 알 수 있다.
액티빈을 개재한 TGF-β 리셉터 시그널은, MSC 의 증식을 확실하게 제어하는 것이나, TGF-β 리셉터 시그널이 MSC 로부터 골아세포나 연골 세포로의 분화를 촉진시키는 것이 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 : W. G. Li and X. X. Xu, Chin J Traumatol. 2005 ; 8(6) : 349-51., 문헌 : F. Ng et al., Blood. 2008 ; 112(2) : 295-307.). 본 발명의 방법에 의해, TGF-β 패스웨이의 억제에 의해 연골 세포로의 컨버전을 달성할 수 있는 것은, 의외의 결과였다.
실시예 9 (도 9)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 2 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 연골 유도 배지, 또는 2 μM ALK5 저해제 II 를 첨가한 연골 유도 배지를, 1000 ㎕/웰 첨가하였다.
2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 18 일까지 배양하였다. 이 세포를 PBS (-) 로 2 회 세정한 후 3 ％ 아세트산 용액으로 1 회 세정한 후 나칼라이 테스크사의 PH 2.5 알시안 블루 염색액을 첨가하여 1 시간, 실온에서 염색하였다. PBS (-) 로 3 회 세정한 후 현미경으로 관찰하였다.
결과를 도 9 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 의 존재하, 연골 유도 배지로 배양을 실시함으로써, 인간 정상 피부 유래 선유아세포를, 푸르게 염색되는 연골 기질을 산생하는 연골로, 컨버전할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 10 (도 10)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 2 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 2 μM ALK5 저해제 II 와 2 μM D4476 을 첨가한 골격 근세포 증식 배지 (5 ％ FBS, 50 microG/㎖ Bovine Fetuin, 10 nG/㎖ hEGF, 1 nG/㎖ bFGF, 10 microG/㎖ 인슐린, 0.4 microG 덱사메타손을 첨가한 Ham's/F10 배지) 를 1000 ㎕/웰 첨가하였다. 2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 28 일까지 배양하였다.
제 28 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix, MyoD1 및 Myogenin 또는 β-액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. MyoD1 및 Myogenin 유전자의 mRNA 레벨을 β-액틴 유전자 mRNA 에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 10 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 의 존재하, 골격근 세포 증식 배지로 배양을 실시함으로써, 인간 정상 피부 유래 선유아세포를, Myogenin 과 MyoD1 유전자를 발현하는 근아세포로, 컨버전할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 11 (도 11)
인간 정상 피부 선유아세포주 HDFs 를, 5 × 103 세포/웰의 농도로 24 웰 플레이트에 파종하였다 (제 0 일). 다음날, 각 웰의 배양액을 버리고, 500 ㎕/웰의 새로운 배지로 교환하였다. 골아세포 유도 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손에 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS) 을 첨가한 것이다.
도면 중에 나타내는 바와 같이, 스타틴 화합물인 심바스타틴 (Simvastatin, SS) 또는 프라바스타틴 (Pravastatin, PrS) (종농도 100 nM) 를 배지에 추가로 첨가하였다.
배양 28 일 후에, 각 웰 로부터 배양액을 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하고, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 실시간 PCR Master Mix 와, 인간 알칼리포스파타아제 (ALP) 유전자에 특이적인 Taqman 프로브와 프라이머를 첨가하고, AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 실시간 RT-PCR 을 실시하였다.
결과를 도 14 에, 정상 인간 선유아세포의 값을 1 로 한 상대치로 나타낸다. SS, PrS 를 D4476 과 함께 첨가하면 D4476 단독보다 더욱 ALP 발현을 강하게 유도한 것을 알 수 있다.
실시예 12 (도 12)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 지방 세포 유도 배지, 또는 화합물 등을 첨가한 지방 세포 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
지방 세포 유도 배지는, 10 ％ FBS 첨가 DMEM ＋ MDI 배지 (0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 및 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한, 10 ％ FBS 첨가 DMEM) 이다.
첨가물의 농도는 이하와 같다 :
T3 : 1 nM
로시글리타존 : 1 μM
D4476 : 2 μM
피피트린-α (Pifithrin alpha) [p53 저해제] : 5 μM
SB431542 : 2 μM
ALK5 저해제 II : 2 μM.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 14 일까지 배양하였다.
제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정한 후, Oil Red O 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이트하였다. 그 후 멸균 증류수로 세정하고, 위상차 현미경으로 100 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 12 에 나타낸다. T3 및 로시글리타존에 더하여, D4476, SB431542, ALK5 저해제 II 의 어느 것을 첨가 배양함으로써, 선유아세포가 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 13 (도 13)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 습공기 (humid air) 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 지방 세포 유도 배지, 또는 각 화합물 등을 첨가한 지방 세포 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
지방 세포 유도 배지는, 10 ％ FBS 첨가 DMEM ＋ MDI 배지 (0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 및 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한, 10 ％ FBS 첨가 DMEM) 이다.
첨가물의 농도는 이하와 같다 :
T3 : 1 nM
로시글리타존 : 1 μM
D4476 : 2 μM
피피트린-α (Pifithrin alpha) [p53 저해제] : 5 μM
SB431542 : 2 μM
ALK5 저해제 II : 2 μM.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 14 일까지 배양하였다. 제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix 와, CIDEA 유전자 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. CIDEA 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
그 결과를 도 13 에 나타낸다. T3 및 로시글리타존에 더하여, D4476, SB431542, 또는 ALK5 저해제 II 의 어느 것을 첨가 배양함으로써, 선유아세포가 CIDEA 유전자의 mRNA 를 발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 14 (도 14)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 습공기 (humid air) 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 지방 세포 유도 배지, 또는 각 소분자 화합물 등을 첨가한 지방 세포 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
지방 세포 유도 배지는, 10 ％ FBS 첨가 DMEM ＋ MDI 배지 (0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 및 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한, 10 ％ FBS 첨가 DMEM) 이다.
첨가물의 농도는 이하와 같다 :
T3 : 1 nM
로시글리타존 : 1 μM
D4476 : 2 μM.
피피트린-α (Pifithrin alpha) [p53 저해제] : 5 μM
PD0325901 : 1 μM
SB431542 : 2 μM
ALK5 저해제 II : 2 μM.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 14 일까지 배양하였다.
제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix, 및, AdipoQ 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. AdipoQ 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
그 결과를 도 14 에 나타낸다. T3 및 로시글리타존에 더하여, D4476, PD0325901, SB431542 또는 ALK5 저해제 II 의 어느 것을 첨가 배양함으로써, 선유아세포가 AdipoQ 유전자의 mRNA 를 발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 15 (도 15)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 지방 세포 유도 배지, 또는 각 소분자 화합물 등을 첨가한 지방 세포 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
지방 세포 유도 배지는, 10 ％ FBS 첨가 DMEM ＋ MDI 배지 (0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 및 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한, 10 ％ FBS 첨가 DMEM) 이다.
첨가물의 농도는 이하와 같다 :
T3 : 1 nM
로시글리타존 : 1 μM
D4476 : 2 μM
SB431541 : 2 μM
ALK5 저해제 II : 2 μM.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 14 일까지 배양하였다.
제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 그 후, 4 ％ 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS (-) 로 세정한 후, BODIPY 493/503 (Invitrogen)/PBS 용액으로 실온에서 5 분간 반응시키고, PBS 로 3 회 Wash 하였다. 형광 현미경을 사용하여 배율 200 배로 사진 촬영을 실시하고, 또한 형광 강도를 계측하였다.
그 결과를 도 15A (형광 현미경 이미지) 와 도 15B (형광 강도) 에 나타낸다. T3 및 로시글리타존에 더하여, D4476, SB431541, 또는 ALK5 저해제 II 의 어느 것을 첨가 배양함으로써, 선유아세포가 BODIPY 로 염색되는 지방 방울을 갖는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 16 (도 20)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 또는 인간 간엽계 줄기 세포 (human mesenchymal stem cells ; MSC) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지 (Normal medium), 석회화 유도 배지 (OB medium), 또는 ALK5 저해제 II (ALK5 i II) 를 4 μM 의 농도로 첨가한 석회화 유도 배지 (OB medium + ALK5 i II) 를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 18 일까지 배양하였다.
제 18 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. 알리자린 레드 S (Alizarin Red S) 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 40 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 20 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양함으로써, 인간 피부 유래 선유아세포가 석회화 골 기질을 다량으로 산생하는 골아세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 17 (도 21)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지, 또는 ALK5 저해제 II 및/또는 TGF-β를 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 13 일까지 배양하였다.
제 13 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 고정액으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. ALP 염색 (ALP staining) 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 40 배의 배율로 촬영하였다.
배지에 첨가한 화합물과 사이토카인의 농도는 이하와 같다.
ALK5 저해제 II : 4 μM
TGF-β : 50 ng/㎖.
결과를 도 21 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양함으로써, 인간 피부 유래 선유아세포가 높은 ALP 활성을 갖는 골아세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 18 (도 22)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 또는 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포 (human adipose derived stem cells ; ADSCs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 18 일까지 배양하였다.
제 18 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix, 및 오스테오칼신 (Osteocalcin), 알칼리 포스파타제 (Alkaline Phosphatase) 또는 β-액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다.
오스테오칼신 (Osteocalcin, Oc) 및 알칼리 포스파타제 (Alkaline Phosphatase, ALP) 유전자의 mRNA 레벨을 β-액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, 석회화 유도 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 22 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양함으로써, 인간 피부 유래 선유아세포가 오스테오칼신 유전자와 ALP 유전자를 발현하는 골아세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 도면 중, * 및 ** 는, 석회화 유도 배지 (OB medium) 에 대하여, 각각 p < 0.05 및 p < 0.01 인 것을 나타낸다 (*p < 0.05 and **p < 0.01 vs. the OB medium. Values are means ± S.D. (n=4).).
실시예 19 (도 23)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 또는 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포 (human adipose derived stem cells ; ADSCs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 2 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지 (Normal medium), MDI medium (선유아세포용의 지방 세포 유도 배지), 또는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 MDI 배지 (MDI medium + ALK5 i II) 를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
MDI 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 및 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 14 일까지 배양하였다.
제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. Oil Red O 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 40 배, 100 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 23 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 MDI 배지로 배양함으로써, 인간 피부 유래 선유아세포가 지방 방울을 다량으로 축적하는 백색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 20 (도 24)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 또는 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포 (human adipose derived stem cells ; ADSCs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) (Normal medium) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, MDI 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 MDI 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
MDI 배지 (3-이소부틸-1-메틸크산틴/덱사메타손/인슐린-포함 배지) 는, 10 ％ FBS DMEM 에 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 및 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 14 일까지 배양하였다.
제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix, 및 AdipoQ, FABP4 또는 β-액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. AdipoQ 및 FABP4 유전자의 mRNA 레벨을 β-액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, MDI 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 24 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 MDI 배지로 배양함으로써, 인간 피부 유래 선유아세포가 AdipoQ 유전자와 FABP4 유전자를 발현하는 백색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 21 (도 25)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 또는 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포 (human adipose derived stem cells ; ADSCs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 피브로넥틴 코팅된 (fibronectin coated) 24-웰 플레이트의 중심부에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 연골 유도 배지 (Chondrocyte medium), 또는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 연골 유도 배지 (Chondrocyte medium + ALK5 i II) 를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
연골 유도 배지는, 1 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 1 ％ 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (insulin-transferrin-selenium), 10 ng/㎖ BMP-2, 10 ng/㎖ TGF-β, 10 ng/㎖ GDF5, 10 ng/nl b-FGF 를 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 21 일까지 배양하였다.
제 21 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. 알시안블루 (Alcian blue) 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 100 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 25 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 연골 유도 배지로 배양함으로써, 인간 피부 유래 선유아세포가 연골 기질을 다량으로 산생하는 연골 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 22 (도 26)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 또는 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포 (human adipose derived stem cells ; ADSCs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 피브로넥틴 코팅된 (fibronectin coated) 24-웰 플레이트의 중심부에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 연골 유도 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 연골 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
연골 유도 배지는, 1 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 1 ％ 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (insulin-transferrin-selenium), 10 ng/㎖ BMP-2, 10 ng/㎖ TGF-β, 10 ng/㎖ GDF5, 10 ng/nl b-FGF 를 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 21 일까지 배양하였다.
제 21 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix, 및 Aggrecan, 타입 II collgaen 또는 β-액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. Aggrecan (ACAN), 및 타입 II collagen 유전자의 mRNA 레벨을 β-액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, 연골 유도 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 26 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 연골 유도 배지로 배양함으로써, 인간 피부 유래 선유아세포가 Aggrecan 유전자와 2 형 콜라겐 유전자를 발현하는 연골 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 23 (도 27)
인간 정상 잇몸 유래 선유아세포 (human gingival fibroblasts ; GFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 18 일까지 배양하였다.
제 18 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. 알리자린 레드 S (Alizarin Red S) 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 40 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 27 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양함으로써, 인간 잇몸 유래 선유아세포가 석회화 골 기질을 다량으로 산생하는 골아세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 24 (도 28)
인간 정상 잇몸 유래 선유아세포 (human gingival fibroblasts ; GFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 18 일까지 배양하였다.
제 18 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 고정액으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. ALP 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 40 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 28 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양함으로써, 인간 잇몸 유래 선유아세포가 높은 ALP 활성을 갖는 골아세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 25 (도 29)
동물 실험은 소속 기관의 인가를 얻어 실시하였다. 8 주령 수컷의 NOD/SCID 마우스 (Charles River) 를 마취하였다. 주수하에서 치과 드릴을 사용하여 좌대퇴골 골간에 직경 약 7 mm 의 부분골 결손을 제조하였다. 후술하는 실시예 16 과 동일한 방법으로, HDFs 를 ALK5 저해제 II 존재하에서 13 일간 배양한 세포 (CdOBs ; Chemical-mediated directly converted osteoblasts) 를, 마트리겔 (BD Bioscience, San Jose, CA) 과 함께 현탁하고, 골 결손부와 그 주변의 골 표면에 5 × 105 세포/마우스의 농도로 이식하였다. 또한, 동일하게 골 결손을 만든 후, 선유아세포를 마트리겔에 현탁하여 이식한 마우스도 준비하였다. 21 일 후에 마우스를 안락사시키고, 대퇴를 절제하여, 중성 포르말린으로 고정 후, X-ray CT device (Scan Xmate-L090, Com Scan Techno, Yokohama, Japan) 를 사용하여 마이크로·컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 을 실시하였다.
μCT 의 단층 이미지를 도 29 에 나타낸다. CdOB 가 마우스의 체내에서 골 결손부에 있어서 골 형성을 실시한 것을 알 수 있다.
실시예 26 (도 30)
실시예 25 의 μCT 이미지를 3 차원 구축한 이미지를 도 30 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가하여 배양한 세포는, 생체 내에서 골 형성능을 갖는 것이 나타났다. CdOB 가 마우스의 체내에서 골 결손부에 있어서 골 형성을 실시한 것을 알 수 있다.
실시예 27 (도 31)
동물 실험은 소속 기관의 인가를 얻어 실시하였다. 상기 실시예 25 와 동일하게 이식 실험을 실시하였다. 또한, 선유아세포를 이식한 마우스도 준비하였다. 21 일 후에 마우스를 안락사시키고, 실시예 25 와 동일하게 대퇴를 절제하여, 중성 포르말린으로 고정 후, 골 조직을 SCEM (Leica Microsystem) 컴파운드 (compound) 로 포매하여, 급속 동결시켰다. 6 ㎛ 의 절편으로 슬라이스 후, 연속 절편을 헤마톡실린·에오신 (H＆E) 염색 및 알리자린 레드 S (Alizarin Red S) 로 염색하였다.
결과 (40 배의 현미경 이미지) 를 도 31 에 나타낸다. CdOB 가 마우스의 체내에서 골 결손부에 있어서 골 형성을 실시한 것을 알 수 있다.
실시예 28 (도 32)
인간 정상 피부 선유아세포주 HDFs 를, 60 ㎜ 배양 디쉬에 배양하고, 통상 배지로 배양하였다 (-). 또한, HDFs 를 4 μM 의 ALK5 저해제 II 를 첨가한 통상 배지로 3 또는 7 일간 배양하였다. 이들 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하였다. 각 세포의 mRNA 발현 패턴을 Affymetrix 사의 DNA 칩을 사용하여 게놈 와이드로 해석하였다. MSC 마커의 발현량을 나타낸 히트 맵을 도 32 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 배지로 배양함으로써 선유아세포가 간엽계 줄기 세포 (MSCs) 로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 29 (도 33)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지, 또는 각 소분자 화합물을 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 DMEM 이다.
배지에 첨가한 화합물과 그 농도는 이하와 같다.
I-BET151 : 2 μM
Pifthrin-α : 5 μM
PD0325901 : 2 μM
2-Me-5HT : 2 μM
CX4945 : 2 μM
CHIR99021 : 2 μM
Forskolin : 2 μM
DZnep : 50 nM
D4476 : 2 μM
SB431542 : 2 μM
ALK5 i II : 2 μM.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 28 일까지 배양하였다.
제 28 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정한 후, 알리자린 레드 S (Alizarin Red S) 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이트하였다. 염색 후의 염색액은, 96 웰 플레이트에 회수하고, 실시예 30 의 실험에 사용하였다. 그 후 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 촬영하였다.
결과를 도 33 에 나타낸다.
실시예 30 (도 34)
실시예 29 의 실험에 있어서, 알리자린 레드 S (Alizarin Red S) 염색액으로 염색한 후의 액을, 96 웰 플레이트에 회수하고, 흡광도계로 흡광도 (OD550 ㎚) 를 측정하였다.
결과를 도 34 에 나타낸다.
도 33 과 도 34 에 나타낸 결과로부터, TGF-β 패스웨이 저해제인 D4476, SB431542 와 ALK5 i II 는, 모두 석회화 유도 배지에 첨가함으로써, 선유아세포로부터 골아세포로의 컨버전을 유도하는 것을 알 수 있었다. 그러나, 선유아세포로부터 iPS 세포로의 유도를 촉진시키는 것이 보고되어 있는 TGF-β 패스웨이 저해제 이외의 화합물 (I-BET, Pifthrin-α, PD0325901, 2-Me-5HT, CHIR, Forskolin 이나 DZnep) 에서는, TGF-β 패스웨이 저해제와 동일한 조건으로 첨가 배양해도, 선유아세포로부터 골아세포로의 컨버전은 유도하지 않는 것을 알 수 있다. TGF-β 패스웨이 저해제 중에서도, 특히 ALK5 i II 가, 가장 강력하게 선유아세포로부터 골아세포로의 컨버전을 유도하였다.
실시예 31 (도 35)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지 (OB 배지), 또는 각 소분자 화합물 혹은 사이토카인을 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 DMEM 이다.
배지에 첨가한 화합물과 그 농도는 이하와 같다.
D4476 : 1 또는 4 μM
LY2157299 : 1 또는 4 μM
LY364947 : 1 또는 4 μM
SB431542 : 1 또는 4 μM
SB525334 : 1 또는 4 μM
SD208 : 1 또는 4 μM
ALK5 i II : 1 또는 4 μM
TGF-β : 10 ng/㎖.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 21 일까지 배양하였다.
제 21 일에, 일부의 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 고정액으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. ALP 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정하여 촬영하였다.
또한 제 21 일에, 나머지의 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정한 후, 알리자린 레드 S (Alizarin Red S) 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이트하였다. 염색 후의 염색액은, 96 웰 플레이트에 회수하고, 실시예 32 의 실험에 사용하였다. 그 후 웰을 멸균 증류수로 세정하여 촬영하였다.
결과를 도 35 에 나타낸다.
실시예 32 (도 36)
실시예 31 의 실험에 있어서, 알리자린 레드 S (Alizarin Red S) 염색액으로 염색한 후의 액을, 96 웰 플레이트에 회수하고, 흡광도계로 흡광도 (OD550 ㎚) 를 측정하였다.
결과를 도 36 에 나타낸다.
도 35 와 도 36 에 나타낸 결과로부터, 다양한 TGF-β 패스웨이 저해제를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포를 골아세포로 컨버트할 수 있는 것을 알 수 있었다. 특히 SD208 과 ALK5 i II 가 강력하게 인간 선유아세포를 골아세포로 컨버트할 수 있는 것을 알 수 있었다. 그 중에서도 ALK5 i II 가 가장 강력하게 인간 선유아세포를 골아세포로 컨버트할 수 있는 것을 알 수 있었다.
TGF-β 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양하면, 인간 선유아세포는 골아세포로 컨버트하지 않았다.
실시예 33 (도 37)
다양한 개인에서 유래하는 인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDF45 (KURABO 로부터 구입), HDF69 (PromoCell 로부터 구입), HDF22 (PromoCell 로부터 구입)) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 통상 배지, 석회화 유도 배지, 또는 ALK5 i II 를 4 μM 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 DMEM 이다.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 10 일, 제 15 일까지 배양하였다.
제 10 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 고정액으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. ALP 염색 후, 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 40 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 37 에 나타낸다.
실시예 34 (도 38)
다양한 개인에서 유래하는 인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDF45, HDF69, HDF22) 를 사용하여, 실시예 33 과 동일한 배양을 실시하였다.
제 15 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정하였다. Alizarin Red S 염색 후, 웰을 멸균 증류수로 세정하고, 도립 현미경으로 40 배의 배율로 촬영하였다.
결과를 도 38 에 나타낸다.
도 37 과 도 38 의 결과로부터, 상이한 개인에서 유래하는 어느 인간 정상 피부 유래 선유아세포도, ALK5 i II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양함으로써, 골아세포로 컨버트하는 것을 알 수 있었다.
실시예 35 (도 39)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면 중에 기재된 바와 같이, 석회화 유도 배지 (OB 배지), 또는 각 소분자 화합물 및/또는 사이토카인을 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 DMEM 이다.
첨가한 소분자 화합물 혹은 사이토카인의 농도는 이하와 같다.
ALK5 i II : 4 μM
1α,25-디하이드로 비타민 D3 (VD3) (1α,25-dihydroxy Vitamin D3 (VD3)) : 5 nM
인간 인슐린 유사 성장인자 (Human insulin-like growth factor-1, IGF-1) : 100 ng/㎖.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 18 일까지 배양하였다.
제 18 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 세정 후, 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix, 및 알칼리 포스파타제 (Alkaline Phosphatase), 오스테오칼신 (Osteocalcin), 본사이알로프로테인 (Bonesialoprotein) 또는 β-액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. 알칼리 포스파타제 (Alkaline Phosphatase), 오스테오칼신 (Osteocalcin, OC), 본사이알로프로테인 (Bonesialoprotein) 유전자의 mRNA 레벨을 β-액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, ALK5 i II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 39 에 나타낸다. ALP 의 mRNA 발현은, ALK5 i II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양한 세포에서 유의하게 상승하였다. OC 의 mRNA 발현은, 석회화 유도 배지로 배양한 세포에 비하여, ALK5 i II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양한 세포에서는 상승해 있었지만, ALK5 i II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양한 세포에 비하여, ALK5 i II 와 VD3 을 첨가한 석회화 유도 배지로 배양한 세포에서 더욱 유의하게 상승하였다. BSP 의 mRNA 발현은, 석회화 유도 배지로 배양한 세포에 비하여, ALK5 i II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양한 세포에서는 상승해 있었지만, ALK5 i II 를 첨가한 석회화 유도 배지로 배양한 세포에 비하여, ALK5 i II 와 IGF-1 을 첨가한 석회화 유도 배지로 배양한 세포에서 더욱 유의하게 상승하였다. 수치는 평균치 ±S.D. 이다 (Values are means ± S.D. (n = 4).).
실시예 36 (도 40)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 1 × 104 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 통상 배지, 또는 ALK5 i II, VD3, IGF-1 을, 각각 4 μM, 5 nM, 100 ng/㎖ 의 농도로 첨가한 석회화 유도 배지를, 500 ㎕/웰 첨가하였다.
석회화 유도 배지는, 10 ％ FBS, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손을 첨가한 DMEM 이다.
3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 18 일까지 배양하였다.
제 18 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 4 ％ 파라포름알데히드로 고정 후, PBS (-) 로 세정하였다. PBS (-) 로 3 회 세정한 후, Blocking One 을 첨가하여, 실온에서 60 분간 인큐베이트하였다.
항 오스테오칼신 (Osteocalcin) 항체를 첨가하여 4 ℃ 에서 over night 로 반응시킨 후, 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. Alexa 488-콘쥬게이트 항-마우스 Ig (Alexa 488-conjugated anti-mouse Ig) 항체를 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. 그 후 DAPI 를 사용하여 핵 염색을 실시하고, 형광 현미경을 사용하여 배율 200 배로 사진 촬영을 실시하였다. 또한 BZ-H3C, BZ-H3CM (KEYENCE) 을 사용하여 OC 양성 세포수/DAPI 수를 계산하였다.
결과를 도 40 에 나타낸다. HDFs 에서는, DAPI 로 염색되는 세포핵이 다수 보였지만, 항 OC 항체로 명확하게 염색되는 세포는 거의 존재하지 않았다. 다른 한편, CdOB 는, 많은 세포가 항 OC 항체에 의해 강하게 염색되었다. 핵이 DAPI 로 염색되는 세포수를 분모로 하고, 항 OC 항체로 염색되는 세포수를 분자로 하는 비를 계산하면, 인간 선유아세포의 약 87 ％ 가 오스테오칼신 단백을 발현하는 골아세포로 컨버전된 것을 알 수 있다. 도면 중, ** 는 HDF 에 대하여 p < 0.01 인 것을 나타낸다 (**p < 0.01 vs. the HDF.).
실시예 37 (도 41)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면에 나타내는 바와 같이, 군 1 에는 통상 배지를 1 ㎖/웰 첨가하였다. 군 2 에는 로시글리타존을 포함하지 않는 지방 세포 유도 배지 (지방 세포 유도 배지 (R-)) 를 1 ㎖/웰 첨가하였다. 군 3 에는 지방 세포 유도 배지를 1 ㎖/웰 첨가하였다. 군 4 에는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 지방 세포 유도 배지 (R-) 를 1 ㎖/웰 첨가하였다. 군 5 ∼ 9 에는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 지방 세포 유도 배지를 1 ㎖/웰 첨가하였다.
지방 세포 유도 배지는, (1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 및 10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 이다.
지방 세포 유도 배지 (R-) 는, (1 nM T3, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 및 10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 이다.
2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하였다. 군 5 ∼ 9 에서는, 도면에 기재한 바와 같이, 각각 0 - 2 일, 0 - 4 일, 0 - 6 일, 0 - 8 일, 0 - 10 일의 기간만 ALK5 저해제 II 를 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양하고, 그 후에는 ALK5 저해제 II 를 첨가하지 않은 지방 세포 유도 배지로 배양하였다. 제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 Qiagen 사 제조 RNA easy Mini Kit 를 사용하여 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix 와, UCP-1 유전자 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. UCP1 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 41 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양함으로써, 선유아세포가 UCP1 유전자를 강발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히 ALK5 저해제 II 를 0 - 8 일간 첨가하고, 그 후, ALK5 저해제 II 를 포함하지 않는 지방 세포 유도 배지로 4 일간 배양함으로써, 가장 강하게 선유아세포의 갈색 지방 세포로의 컨버전을 유도할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 38 (도 42)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 군 1 에는 통상 배지를 1 ㎖/웰 첨가하였다 (컨트롤 (Control)). 군 2 에는 지방 세포 유도 배지를 1 ㎖/웰 첨가하였다. 군 3 ∼ 8 에는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 지방 세포 유도 배지를 1 ㎖/웰 첨가하였다.
지방 세포 유도 배지는, (1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린, 및 10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 이다. 2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하였다. 군 3 ∼ 7 에서는, 도면에 기재한 바와 같이, 각각 0 - 2 일, 0 - 4 일, 0 - 6 일, 0 - 8 일, 0 - 10 일의 기간만 ALK5 저해제 II 를 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양하고, 그 후에는 ALK5 저해제 II 를 첨가하지 않은 지방 세포 유도 배지로 배양하였다. 제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 4 ％ 파라포름알데히드로 고정 후, PBS (-) 로 세정하고, Perm Buffer (0.2 ％ Triton-X 첨가 PBS) 를 첨가하여 15 분간 인큐베이트하였다. PBS (-) 로 3 회 세정한 후, Blocking One 을 첨가하여, 실온에서 60 분간 인큐베이트하였다. 항 UCP-1 항체 (RD MAB6158) 를 첨가하여 실온에서 2 시간 반응시킨 후, 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. CF488-콘쥬게이트 항-마우스 Ig (CF488-conjugated anti-mouse Ig) 항체 (Biotum 20014) 를 첨가하여 실온에서 2 시간 반응시킨 후, PBS (-) 로 3 회 세정하였다. Lifetechnology 사 제조 DAPI 를 포함하는 SlowFade Gold antifade 시약으로 핵 염색한 후 형광 현미경을 사용하여 배율 100 배로 사진 촬영을 실시하였다.
형광 현미경 이미지를 도 42 에 나타낸다. 군 1 과 군 2 의 세포는 거의 항 UCP1 항체로 염색되지 않았다. 군 3 ∼ 8 에서는 항 UCP1 항체로 염색되는 세포가 다수 확인되었다. 특히 군 6 에서는, 항 UCP1 항체로 염색되는 세포의 밀도가 가장 높았다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양함으로써, 선유아세포가 UCP1 단백을 고발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히 ALK5 저해제 II 를 0 - 8 일간 첨가하고, 그 후, ALK5 저해제 II 를 포함하지 않는 지방 세포 유도 배지로 4 일간 배양함으로써, 가장 강하게 선유아세포의 갈색 지방 세포로의 컨버전을 유도할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 39 (도 43)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 통상 배지, 지방 세포 유도 배지 (BA medium), 또는 화합물 ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431542, D4476 을 첨가한 지방 세포 유도 배지를, 1 ㎖/웰 첨가하였다. 화합물의 첨가 농도는 4 μM, 8 μM, 12 μM, 또는 16 μM 이다. 지방 세포 유도 배지는, (1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 및 10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 이다. 2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 1 일 - 제 8 일까지 배양하였다. 그 후, 제 9 일 - 제 14 일까지는, ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431542, D4476 을 모두 포함하지 않는 배지로 배양하였다. 제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 Qiagen 사 제조 RNA easy Mini Kit 를 사용하여 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix 와, UCP-1 유전자 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. UCP1 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 43 에 나타낸다. ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431541, D4476 의 어느 것을 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양함으로써, 선유아세포가 UCP1 유전자를 강발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히 ALK5 저해제 II 가 가장 강하게 선유아세포의 갈색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것, LY2157299 가 그 뒤를 잇는 것을 알 수 있다.
실시예 40 (도 44)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 도면과 같이 군 1 에는 통상 배지를, 군 2 에는 지방 세포 유도 배지를, 군 3 ∼ 6 에는 화합물 ALK5 저해제 II (4 μM), LY2157299 (8 μM), SB431542 (4 μM), D4476 (4 μM) 를 각각 첨가한 지방 세포 유도 배지를, 1 ㎖/웰 첨가하였다. 지방 세포 유도 배지는, (1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 및 10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 이다. 2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 1 일 - 제 8 일까지 배양하였다. 그 후, 제 9 일 부터 제 14 일은, ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431542, D4476 을 모두 포함하지 않는 지방 세포 유도 배지로 배양하였다. 제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 4 ％ 파라포름알데히드로 고정 후, PBS (-) 로 세정하고, Perm Buffer (0.2 ％ Triton-X 첨가 PBS) 를 첨가하여 15 분간 인큐베이트하였다. PBS (-) 로 3 회 세정한 후, Blocking One 을 첨가하여, 실온에서 60 분간 인큐베이트하였다. 항 UCP-1 항체 (RD MAB6158) 를 첨가하여 실온에서 2 시간 반응시킨 후, 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. CF488-콘쥬게이트 항-마우스 Ig (CF488-conjugated anti-mouse Ig) 항체 (Biotum 20014) 를 첨가하여 실온에서 2 시간 반응시킨 후, PBS (-) 로 3 회 wash 하였다. Lifetechnology 사 제조 DAPI 를 포함하는 SlowFade Gold antifade 시약으로 핵 염색한 후 형광 현미경을 사용하여 배율 100 배로 사진 촬영을 실시하였다.
결과를 도 44 (형광 현미경 이미지) 에 나타낸다. 모든 군에서, DAPI 로 염색되는 세포핵이 다수 확인되었다. 군 1 과 군 2 에서는, 항 UCP1 항체로 염색되는 세포는 거의 보이지 않았다. 한편, 군 3 ∼ 6 에서는, 항 UCP1 항체로 염색되는 세포가 다수 확인되었다. 특히 군 3 은, 항 UCP1 항체로 염색되는 세포가 가장 높은 밀도로 확인되고, 군 4 가 그 뒤를 이었다. 따라서, ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431541, D4476, 의 어느 것을 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양함으로써, 선유아세포가 UCP1 단백을 발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히, AKL5 저해제 II 가 가장 강하게 선유아세포의 갈색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것, LY2157299 가 그 뒤를 잇는 것을 알 수 있다.
실시예 41 (도 45)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 통상 배지, 지방 세포 유도 배지, 혹은 화합물 ALK5 저해제 II (4 μM) 또는 LY2157299 (8 μM) 를 첨가한 지방 세포 유도 배지를, 1 ㎖/웰 첨가하였다. 지방 세포 유도 배지는, (1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 및 10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 이다. 2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 1 일 - 제 8 일까지 배양하였다. 그 후, 제 9 일 - 제 14 일까지는, ALK5 저해제 II 도 LY2157299 를 포함하지 않는 배지로 배양하였다. 제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 Qiagen 사 제조 RNA easy Mini Kit 를 사용하여 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix 와, UCP-1 유전자, CIDEA 유전자, KCNK3 유전자 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. UCP1 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 45 에 나타낸다. ALK5 저해제 II, 또는 LY2157299 의 어느 것을 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양함으로써, 선유아세포가 UCP1 유전자, CIDEA 유전자, KCNK3 유전자 발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히, AKL5 저해제 II 가 보다 강력하게 선유아세포의 갈색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것을 알 수 있다.
실시예 42 (도 46)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (HDFs) 를 통상 배지 (10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 통상 배지, 지방 세포 유도 배지, 또는 ALK5 저해제 II 를, 4 μM 의 농도로 첨가한 지방 세포 유도 배지를, 1 ㎖/웰 첨가하였다. 지방 세포 유도 배지는, (1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 및 10 ％ FBS 를 첨가한 DMEM) 이다. 2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 1 일 - 제 8 일까지 배양하였다. 그 후, 제 9 일 - 제 14 일까지는, ALK5 저해제 II 를 포함하지 않는 배지로 배양하였다. 제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 4 ％ 파라포름알데히드로 고정 후, PBS (-) 로 세정하고, Perm Buffer (0.2 ％ Triton-X 첨가 PBS) 를 첨가하여 15 분간 인큐베이트하였다. PBS (-) 로 3 회 세정한 후, Blocking One 을 첨가하여, 실온에서 60 분간 인큐베이트하였다. 항 UCP-1 항체 (RD MAB6158) 를 첨가하여 실온에서 2 시간 반응시킨 후, 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. CF488-콘쥬게이트 항-마우스 Ig (CF488-conjugated anti-mouse Ig) 항체 (Biotum 20014) 를 첨가하여 실온에서 2 시간 반응시킨 후, PBS (-) 로 3 회 세정하였다. Lifetechnology 사 제조 DAPI 를 포함하는 SlowFade Gold antifade 시약으로 핵 염색한 후 형광 현미경을 사용하여 배율 100 배로 사진 촬영을 실시하였다. 촬영한 화상을 Keyence BZ-H3A 소프트웨어를 사용하여 DAPI 양성 세포 중의 UCP1 양성 세포의 퍼센티지를 산출하였다.
결과를 도 46 에 나타낸다. 통상 배지로 배양한 HDFs 와, ALK5 저해제 II 를 첨가하지 않은 지방 세포 유도 배지로 배양한 세포에서는, DAPI 로 염색되는 세포핵이 다수 보였지만, 항 UCP1 항체로 염색되는 세포는 거의 존재하지 않았다. 다른 한편, ALK5 저해제 II 를 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양한 세포는, 많은 세포가 항 UCP1 항체에 의해 강하게 염색되었다. 핵이 DAPI 로 염색되는 세포수를 분모로 하고, 항 UCP1 항체로 염색되는 세포수를 분자로 하는 비를 계산한 결과, ALK5 저해제 II 를 첨가한 지방 세포 유도 배지로 배양함으로써, 90 ％ 를 초과하는 선유아세포가, UCP1 단백질을 고발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 43 (도 47)
정상 인간 표피 각화 세포 (Human Epidermal Keratinocyte ; NHEK (AD)) 를 정상 인간 표피 각화 세포 증식용 무혈청 액체 배지 (HuMedia-KG2 ; Kurabo 사 제조) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, HuMedia-KG2 배지 (Ctrl medium), K-지방 세포 유도 배지 (케라티노사이트용 지방 세포 유도 배지), 또는, ALK5 저해제 II (4 μM) 혹은 LY2157299 (8 μM) 를 첨가한 K-지방 세포 유도 배지를, 1 ㎖/웰 첨가하였다.
K-지방 세포 유도 배지는, (1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손, 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한 HuMedia-KG2) 이다.
2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 1 일 - 제 8 일까지 배양하였다. 그 후, 제 9 일 - 제 14 일까지는, ALK5 저해제 II 도 LY2157299 를 포함하지 않는 배지로 배양하였다. 제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 Qiagen 사 제조 RNA easy Mini Kit 를 사용하여 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix 와, UCP-1 유전자, CIDEA 유전자, 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. UCP1 유전자와 CIDEA 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 47 에 나타낸다. ALK5 저해제 II, LY2157299, 의 어느 것을 첨가한 K-지방 세포 유도 배지로 배양함으로써, 정상 인간 표피 각화 세포가 UCP1 유전자, CIDEA 유전자 발현하는 갈색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 44 (도 48)
정상 인간 표피 각화 세포 (Human Epidermal Keratinocyte ; NHEK (AD)) 를 정상 인간 표피 각화 세포 증식용 무혈청 액체 배지 (HuMedia-KG2 ; Kurabo 사 제조) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, HuMedia-KG2 배지 (Ctrl medium), K-골아세포 유도 배지 (케라티노사이트용 골아세포 유도 배지), 또는 화합물 ALK5 저해제 II (4 μM) 를 첨가한 K-골아세포 유도 배지를, 1 ㎖/웰 첨가하였다. K-골아세포 유도 배지는, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산 (ascorbic acid), 10 mM β-glycerol phosphate (β-글리세롤 포스페이트), 및 100 nM 덱사메타손을 첨가한 HuMedia-KG2 이다. 2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 14 일까지 배양하였다. 그 후, 제 14 일 - 제 28 일까지는, 어느 세포도 ALK5 저해제 II 를 포함하지 않는 배지로 배양하였다. 제 28 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 Qiagen 사 제조 RNA easy Mini Kit 를 사용하여 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix 와, Runx2 유전자 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. Runx2 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 선유아세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 48 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 K-골아세포 유도 배지로 배양함으로써, 정상 인간 표피 각화 세포가 Runx2 유전자를 발현하는 골아세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 45 (도 49)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 컨트롤 (Control) 배지에 현탁하였다. 이것을 104 세포/㎟ 의 농도로 48-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 제 4 일에 배양 상청을 흡인 제거하고, 웰을 5 군으로 나누어, 도면 중에 기재된 배지를 첨가하였다. 즉,
군 1 : Control 배지
군 2 : WA 배지
군 3 : 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지
군 4 : 16 μM 의 ALK5 저해제 II 를 첨가한 WA 배지
군 5 : 16 μM 의 ALK5 저해제 II 와 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지.
배지의 조성은 이하와 같다.
컨트롤 (Control) 배지는, 10 ％ FBS, 100 mM 비필수 아미노산 (non-essential amino acids, NEAA), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin), 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin) 을 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM 이다.
WA 배지는, 10 ％ FBS, 100 mM 비필수 아미노산 (non-essential amino acids ,NEAA), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin), 0.5 mM IBMX (3-이소부틸-1-메틸크산틴), 62.5 nM 인도메타신, 1 μM 덱사메타손, 및 170 nM 인슐린을 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM 이다.
5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 계속하였다. 제 6, 8, 10 일에 동일한 조성의 프레쉬한 배지로 각각 교환하였다.
제 12 일에 이하와 같이 BODIPY 염색을 실시하였다.
(1) 웰 내의 배양액을 제거 후, PBS 로 각 웰을 1 회 세정.
(2) 각 웰에 4 ％ 포름알데히드액을 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 하룻밤 고정.
(3) PBS 로 2 회 세정.
(4) 각 웰에 BODIPY 염색액을 50 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치 (靜置).
(5) 웰 내로부터 염색액을 제거 후, 실온에서 30 분간 정치.
형광 현미경으로 촬영한, 위상차 이미지와 녹색 형광 이미지를 도 49 에 나타낸다. 컨트롤 (Control) 배지로 배양한 세포는 거의 보디피 (Bodipy) 로는 염색되지 않고, 로시글리타존을 첨가한 WA 배지로 배양한 군에는 매우 약하게 염색되는 세포가 낮은 빈도로 존재한다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 WA 배지로 배양한 군에서는 보다 강하게 염색되는 세포가 보다 많이 확인된다. ALK5 저해제 II 와 로시글리타존의 양방을 첨가한 WA 배지로 배양한 군에서는, 가장 많은 세포가 강하게 보디피 (BODIPY) 로 염색되었다. 따라서, ALK5 저해제 II 를 첨가한 WA 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 백색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히 로시글리타존의 공존하에서, AKL5 저해제 II 가 보다 강력하게 선유아세포의 백색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것을 알 수 있다.
실시예 46 (도 50)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 컨트롤 (Control) 배지에 현탁하였다. 이것을 104 세포/㎟ 의 농도로 48-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 제 4 일에 배양 상청을 흡인 제거하고, 웰을 7 군으로 나누어, 도면 중에 기재된 배지를 첨가하였다. 즉,
군 1 : 컨트롤 (Control) 배지
군 2 : WA 배지
군 3 : 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지
군 4 : 8 μM 의 ALK5 저해제 II 를 첨가한 WA 배지
군 5 : 16 μM 의 ALK5 저해제 II 를 첨가한 WA 배지
군 6 : 8 μM 의 ALK5 저해제 II 와 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지.
군 7 : 16 μM 의 ALK5 저해제 II 와 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지.
배지의 조성은 실시예 45 와 동일하다.
5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 계속하였다. 제 6, 8, 10 일에 동일한 조성의 프레쉬한 배지로 각각 교환하였다.
제 12 일에, 실시예 45 와 동일하게 BODIPY 로 염색하고, 지방 방울을 형광 염색하였다. 형광 현미경 BZ-9000 (Keyence) 을 사용하여 100 배로 촬영하였다. BZ-II Analyzer 소프트웨어 (Keyence, Osaka, Japan) 로 보디피 (BODIPY) 양성 세포수를 산출하고, 각 군 사이의 비교를 실시하였다.
결과 (평균 ± 표준 편차) 를 도 50 에 나타낸다. 컨트롤 (Control) 배지로 배양한 세포는 거의 보디피 (BODIPY) 로 염색되지 않았지만, 1 μM 의 로시글리타존 혹은 16 μM 의 ALK5 저해제 II 의 어느 것을 첨가한 WA 배지로 배양한 군에는 염색되는 세포가 낮은 빈도로 존재하였다. 8 μM 또는 16 μM 의 ALK5 저해제 II 와, 1 μM 의 로시글리타존을 공첨가한 WA 배지로 배양한 군에서는, 염색되는 세포가 보다 많이 확인되었다. 따라서, ALK5 저해제 II 를 첨가한 WA 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 백색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히 로시글리타존의 공존하에서, AKL5 저해제 II 가 보다 강력하게 선유아세포의 백색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것을 알 수 있다.
실시예 47 (도 51)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 컨트롤 (Control) 배지에 현탁하였다. 이것을 104 세포/㎟ 의 농도로 6-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 제 4 일에 배양 상청을 흡인 제거하고, 웰을 5 군으로 나누어, 실시예 45 와 동일하게 도면 중에 기재된 배지를 첨가하였다. 배지의 조성은 실시예 45 와 동일하다.
5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 계속하였다. 제 6, 8, 10 일에 동일한 조성의 프레쉬한 배지로 각각 교환하였다.
제 12 일에, 세포로부터 RNA 를 회수하였다. AdipoQ, FABP4 (성숙 지방 세포 마커), 및 PPAR-γ (지방 전구 세포 마커) 유전자에 각각 특이적인 TaqMan 프로브와 Primer 를 이용하여, 리얼타임 PCR 을 실시하여 mRNA 를 정량하였다.
결과 (평균) (상대치) 를 도 51 에 나타낸다. AdipoQ 와 FABP4 는, ALK5 i II 단독 첨가 배양으로 경도로 발현 유도되고, ALK5 i II 와 로시글리타존의 공첨가로 강하게 발현 유도되었다. PPAR-γ 는 WA 배지에서의 배양으로도 경도 발현이 유도되고, ALK5 i II 혹은 로시글리타존의 어느 것의 첨가로 중등도 발현 유도되고, ALK5 i II 와 로시글리타존의 공첨가로 강하게 발현 유도되었다.
따라서, ALK5 저해제 II 를 첨가한 WA 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 백색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히 로시글리타존의 공존하에서, AKL5 저해제 II 가 보다 강력하게 선유아세포의 백색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것을 알 수 있다.
실시예 48 (도 52)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 Control 배지에 현탁하였다. 이것을 104 세포/㎟ 의 농도로 48-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 제 4 일에 배양 상청을 흡인 제거하고, 웰을 10 군으로 나누어, 도면 중에 기재된 배지를 첨가하였다. 즉,
군 1 : WA 배지
군 2 : 16 μM 의 ALK5 저해제 II (ALK5 i II) 를 첨가한 WA 배지
군 3 : 16 μM 의 LY2157299 를 첨가한 WA 배지
군 4 : 16 μM 의 SB431542 를 첨가한 WA 배지
군 5 : 16 μM 의 D4476 을 첨가한 WA 배지
군 6 : 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지.
군 7 : 16 μM 의 ALK5 저해제 II (ALK5 i II) 와 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지.
군 8 : 16 μM 의 LY2157299 와 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지.
군 9 : 16 μM 의 SB431542 와 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지.
군 10 : 16 μM 의 D4476 과 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지.
배지의 조성은 실시예 45 와 동일하다.
5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 계속하였다. 제 6, 8, 10 일에 동일한 조성의 프레쉬한 배지로 각각 교환하였다.
제 12 일에, 실시예 45 와 동일하게 보디피 (BODIPY) 로 염색하여, 지방 방울을 형광 염색하였다. 형광 현미경 BZ-9000 (Keyence) 을 사용하여 100 배로 촬영하였다. BZ-II Analyzer 소프트웨어 (Keyence, Osaka, Japan) 로 지방 세포수를 산출하고, 각 군간 비교를 실시하였다. 결과를 도 52 에 나타낸다.
ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431542, 혹은 D4476 을 각각 단독으로 첨가한 WA 배지로 배양한 세포는, 소수의 세포만 보디피 (Bodipy) 로 염색되는 지방 방울을 가지고 있었지만, ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431542, D4476 의 어느 것과 로시글리타존의 양자를 첨가한 WA 배지로 배양한 군에는, 염색되는 세포가 다수 확인되었다. 따라서, TGF-β 패스웨이 저해제를 첨가한 WA 배지로 배양하면, 인간 선유아세포가 백색 지방 세포로 컨버트하는 것을 알 수 있다. 또한 TGF-β 패스웨이 저해제와 로시글리타존의 양자를 첨가한 WA 배지로 배양하면, 인간 선유아세포가 TGF-β 패스웨이 저해제 단독보다 보다 효율적으로 백색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히 TGF-β 패스웨이 저해제 중에서도 AKL5 저해제 II 가, 가장 강력하게 선유아세포의 백색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것을 알 수 있다.
실시예 49 (도 53)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 Control 배지에 현탁하였다. 이것을 104 세포/㎟ 의 농도로 6-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 제 4 일에 배양 상청을 흡인 제거하고, 웰을 10 군으로 나누어, 실시예 48 과 동일하게, 도면 중에 기재된 배지를 첨가하였다. 배지의 조성은 실시예 45 와 동일하다.
5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 계속하였다. 제 6, 8, 10 일에 동일한 조성의 프레쉬한 배지로 각각 교환하였다.
제 12 일에, 실시예 48 과 동일하게 보디피 (BODIPY) 로 염색하여, 지방 방울을 형광 염색하였다. 형광 현미경 BZ-9000 (Keyence) 을 사용하여 100 배로 촬영하였다. BZ-II Analyzer 소프트웨어 (Keyence, Osaka, Japan) 로 보디피 (BODIPY) 양성 세포수, 보디피 (BODIPY) 로 염색된 면적, 및 보디피 (BODIPY) 에 의한 염색의 강도를 산출하고, 각 군 사이의 비교를 실시하였다.
결과 (평균 ± 표준 편차) 를 도 53 에 나타낸다. 컨트롤 (Control) 배지로 배양한 세포는 거의 보디피 (BODIPY) 로 염색되지 않았지만, 1 μM 의 로시글리타존 혹은 16 μM 의 ALK5 저해제 II 의 어느 것을 첨가한 WA 배지로 배양한 세포는 소량의 지방을 축적하고 있었다. 16 μM 의 ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431542 와 D4476 은 모두, 로시글리타존과 공첨가함으로써, 로시글리타존 단독보다 강하게 지방 축적을 유도하였다. ALK5 저해제 II 와 1 μM 의 로시글리타존을 공첨가한 WA 배지로 배양한 군에서는, 가장 다량의 지방을 축적하는 세포가 확인되었다. 따라서, TGF-β 패스웨이 저해제를 첨가한 로시글리타존을 포함하는 WA 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가 효율적으로 백색 지방 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다. 특히 TGF-β 패스웨이 저해제 중에서도 AKL5 저해제 II 가, 가장 강력하게 선유아세포의 백색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것을 알 수 있다.
실시예 50 (도 54)
인간 정상 피부 유래 선유아세포 (human dermal fibroblasts ; HDFs) 를 Control 배지에 현탁하였다. 이것을 104 세포/㎟ 의 농도로 6-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 제 4 일에 배양 상청을 흡인 제거하고, 웰을 5 군으로 나누어, 도면 중에 기재된 배지를 첨가하였다. 즉,
군 1 : 1 μM 로시글리타존을 첨가한 WA 배지
군 2 : 1 μM 로시글리타존과 16 μM 의 ALK5 저해제 II (ALK5 i II) 를 첨가한 WA 배지
군 3 : 1 μM 로시글리타존과 16 μM 의 LY2157299 (LY) 를 첨가한 WA 배지
군 4 : 1 μM 로시글리타존과 16 μM 의 SB431542 (SB) 를 첨가한 WA 배지
군 5 : 1 μM 로시글리타존과 16 μM 의 D4476 (D4) 를 첨가한 WA 배지.
배지의 조성은 실시예 45 와 동일하다. 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 계속하였다. 제 6, 8, 10 일에 동일한 조성의 프레쉬한 배지로 각각 교환하였다.
제 12 일에, 세포로부터 RNA 를 회수하고, 실시예 47 과 동일하게, AdipoQ, FABP4 (성숙 지방 세포 마커), 및 PPAR-γ (지방 전구 세포 마커) 유전자의 mRNA 를 정량하였다.
결과 (평균) 를 도 54 에 나타낸다. 군 2 ∼ 5 의 세포는, AdipoQ, FABP4 혹은 PPAR-γ 의 어느 1 개 이상의 유전자의 mRNA 를 중 정도 ∼ 고도 발현하고 있었다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 세포가, 이들 3 개의 유전자 모두를 가장 강하게 발현하고 있었다.
따라서, ALK5 저해제 II, LY2157299, SB431542 와 D4476 은, 모두 인간 선유아세포가 백색 지방 세포로 컨버트시킨 것을 알 수 있다. 특히 TGF-β 패스웨이 저해제 중에서도 AKL5 저해제 II 가, 가장 강력하게 선유아세포의 백색 지방 세포로의 컨버전을 유도한 것을 알 수 있다.
실시예 51 (도 55)
인간 선유아세포 aHDF45 를 24 웰 플레이트에 1.0 × 104 세포/500 ㎕/웰 씩 파종하였다. 다음날, 웰을 2 군으로 나누어, 1 군은 배지를 하기의 Control 배지로 교환하고, 다른 1 군은 4 μM 의 Alk5 i II 를 첨가한 하기의 SC 배지로 교환하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2/95 ％ 대기하에서 14 일간 배양하였다. 배지 교환은 주 2 회 실시하였다.
컨트롤 (Control) 배지 : 10 ％ FBS, 100 mM 비필수 아미노산 (non-essential amino acids, NEAA), 1 mM 피루브산 나트륨 (Sodium Pyruvate), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin), 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin) 을 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM.
SC (Schwann cell) 배지 : 10 ％ FBS, 10 ng/㎖ rhbFGF (basic fibroblast growth factor), 5.7 ㎍/㎖ Forskolin, 200 ng/㎖ rhHeregulin beta-1, 5 ng/㎖ rhPDGF-AA, 100 mM 비필수 아미노산 (non-essential amino acids, NEAA), 1 mM 피루브산 나트륨 (Sodium Pyruvate), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin), 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin) 을 첨가한 Dulbecco's modified minimum essential medium ; DMEM.
8 일째 및 14 일째에 각 세포로부터 RNeasy Mini QIAcube Kit (QIAGEN) 를 사용하여 RNA 를 추출하고, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) 를 사용하여 역전사 반응을 실시하여 cDNA 를 합성하였다. 얻어진 cDNA 를 사용하여, StepOnePLUS (Applied Biosystems) 에 의한 EGR2 및 S100β 유전자의 mRNA 발현의 real time RT-PCR 해석을 실시하였다.
결과를 도 55 에 나타낸다. 4 μM 의 Alk5 i II 를 첨가한 SC 배지로 배양함으로써, 인간 선유아세포가, S100β 와 EGR2 를 공발현하는 슈반 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 52 (도 56)
정상 인간 표피 각화 세포 (Human Epidermal Keratinocyte ; NHEK (AD)) 를 정상 인간 표피 각화 세포 증식용 무혈청 액체 배지 (HuMedia-KG2 ; Kurabo 사 제조) 에 현탁하였다. 이것을 3 × 104 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, HuMedia-KG2 배지, 인간 표피 기저 세포 증식용 배지 (CnT-PR ; CELLnTEC 사 제조), 또는 ALK5 저해제 II 를 1 μM 또는 10 μM 의 농도로 첨가한 인간 표피 기저 세포 증식용 배지를, 각각 1 ㎖/웰 첨가하였다. 2 일에 1 번, 배양액을 프레쉬한 것으로 치환하여, 제 21 일까지 배양하였다. 제 21 일에 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 Qiagen 사 제조 RNA easy Mini Kit 를 사용하여 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix 와, Uroplakin 1b 유전자, Uroplakin 3b 유전자 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. Uroplakin 1b 유전자와 Uroplakin 3b 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, HuMedia-KG2 배지로 배양한 인간 표피 각화 세포의 값을 1 로 하여 산출하였다. 그 결과를 도 56 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 CnT-PR 배지로 배양함으로써, 인간 표피 각화 세포가, Uroplakin 1b 유전자와 Uroplakin 3b 유전자를 발현하는 요로 상피 세포로 컨버트한 것을 알 수 있다.
실시예 53
인간 정상 말초혈 단핵 세포 (human peripheral blood mononuclear cells ; PBMCs) 를 컨트롤 배지 (control medium) (10 ％ FBS 를 첨가한 RPMI1640 배지) 에 현탁하였다. 이것을 2.5 × 105 세포/웰의 농도로 12-웰 플레이트에 파종하고 (제 0 일), 5 ％ CO2/95 ％ 가습 공기 (humidified air), 37 ℃ 에서 배양을 개시하였다. 다음날, 배양 상청을 흡인 제거하고, 군 1 에는 컨트롤 배지 (Control medium) 를 1 ㎖/웰 첨가하였다. 군 2 에는 P-지방 세포 유도 배지 (말초혈 단핵 세포용 지방 세포 유도 배지) 를 1 ㎖/웰 첨가하였다. 군 3 에는 ALK5 저해제 II 를 4 μM 의 농도로 첨가한 P-지방 세포 유도 배지를 1 ㎖/웰 첨가하였다. P-지방 세포 유도 배지는, 10 ％ FBS, 30 U/㎖ 재조합체 (recombinant) hIL-2, 1 nM T3, 1 μM 로시글리타존, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.5 μM 덱사메타손 및 1 ㎍/㎖ 인슐린 을 첨가한 RPMI1640 배지이다. 2 일에 1 번, 배양액의 50 ％ 를 프레쉬한 것으로 치환하였다.
제 14 일에, 각 웰 로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS (-) 로 세정 후, 세포로부터 Qiagen 사 제조 RNA easy Mini Kit 를 사용하여 총 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 로부터, Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 이 cDNA 에 실시간 PCR Master Mix 와, FABP4 유전자 또는 β 액틴 유전자에 특이적인 프라이머와 Taqman 프로브를, 혼화하였다. AB7300 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 을 실시하였다. FABP4 유전자의 mRNA 레벨을 β 액틴 유전자 mRNA 레벨에 대한 비로서 정량하고, 통상 배지로 배양한 인간 정상 말초혈 단핵 세포의 값을 1 로 하여 산출하였다.
결과를 도 57 에 나타낸다. ALK5 저해제 II 를 첨가한 P-지방 세포 유도 배지로 배양함으로써, 인간 정상 말초혈 단핵 세포가 FABP4 유전자를 발현하는 백색 지방 세포로 컨버트하는 것이 분명해졌다.

Claims (15)

  1. 포유 동물의 분화한 체세포를, 상기 분화한 체세포 이외의 다른 체세포를 분화 유도하기 위한 배지 중에서, TGF-β 패스웨이 저해제의 존재하에서 배양하여, 상기 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    TGF-β 패스웨이 저해제가, D4476, SB431542, LY2157299, SD208, 또는 ALK5 저해제 II 인, 체세포를 조제하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    TGF-β 패스웨이 저해제가, ALK5 저해제 II 인, 체세포를 조제하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선유아세포를 간엽계의 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선유아세포 또는 케라티노사이트를 골아세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선유아세포 또는 말초혈 단핵 세포를 백색 지방 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선유아세포 또는 케라티노사이트를 갈색 지방 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    체세포를 분화 유도하기 위한 배지가, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ (PPAR-γ) 아고니스트를 포함하는, 체세포를 조제하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선유아세포를 연골 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선유아세포를 근아세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선유아세포를 슈반 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    케라티노사이트를 요로 상피 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    선유아세포를 간엽계 줄기 세포로 컨버트시키는 것을 특징으로 하는, 체세포를 조제하는 방법.
  14. TGF-β 패스웨이 저해제를 포함하는, 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키기 위한 유도제.
  15. 분화한 체세포를 다른 체세포로 컨버트시키기 위한 키트로서, TGF-β 패스웨이 저해제 및 상기 다른 체세포를 분화 유도하기 위한 배지를 포함하는 키트.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024053957A1 (ko) * 2022-09-07 2024-03-14 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 케미컬로 유도된 골형성세포와 이의 질병모델링에의 이용 및 골 이식용 스캐폴드

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112119154A (zh) * 2018-05-28 2020-12-22 雀巢产品有限公司 褐色脂肪细胞的产生
WO2020086667A1 (en) 2018-10-25 2020-04-30 American University Method for promoting adipocyte differentiation and obesity-related disease treatment
KR102304483B1 (ko) * 2019-05-08 2021-09-24 성균관대학교산학협력단 저분자 화합물을 이용한 갈색 지방 세포 유사 세포로의 직접분화 방법 및 조성물
CN110218699B (zh) * 2019-06-30 2020-07-28 北京佑仁生物科技集团有限公司 脂肪干细胞快速培养及分化方法
WO2021039972A1 (ja) * 2019-08-30 2021-03-04 セルアクシア株式会社 尿路上皮細胞への誘導剤及び尿路上皮細胞の誘導方法
WO2021106698A1 (ja) * 2019-11-25 2021-06-03 株式会社片岡製作所 培地用組成物
CN111849884B (zh) * 2020-07-30 2021-02-19 山东天川精准医疗科技有限公司 一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法
CN116867892A (zh) * 2021-02-15 2023-10-10 凸版印刷株式会社 三维组织体的制造方法和脂肪来源干细胞的分化促进方法
CN114317401B (zh) * 2021-12-07 2022-10-04 浙江大学 一种促进胰岛前体细胞长期稳定传代的方法
CN114480252B (zh) * 2022-01-24 2023-04-25 四川大学华西医院 功能增强型内皮细胞的驯化方法及驯化得到的细胞制剂
CN115948331A (zh) * 2022-10-17 2023-04-11 中国人民解放军西部战区总医院 一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100482784C (zh) * 2004-02-25 2009-04-29 上海组织工程研究与开发中心 诱导成纤维细胞形成软骨细胞的方法
JP4604076B2 (ja) 2007-11-07 2010-12-22 国立大学法人静岡大学 燃料電池用電解質膜
EP2279243B1 (en) 2008-03-17 2016-01-06 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
US8298825B1 (en) 2008-08-25 2012-10-30 The General Hospital Corporation TGF-beta receptor inhibitors to enhance direct reprogramming
CN104278008B (zh) * 2013-07-12 2020-08-21 北京宏冠再生医学科技有限公司 一种通过小分子化合物处理来制备多潜能干细胞的方法、试剂盒和用途
MX2016000557A (es) * 2013-07-23 2016-04-20 Hoffmann La Roche Conversion basada en moleculas pequeñas de celulas somaticas en celulas de cresta neural.
WO2015038704A1 (en) * 2013-09-11 2015-03-19 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Compositions for preparing cardiomyocytes
WO2017019702A1 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for producing pancreatic beta cells

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024053957A1 (ko) * 2022-09-07 2024-03-14 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 케미컬로 유도된 골형성세포와 이의 질병모델링에의 이용 및 골 이식용 스캐폴드

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