KR20160145174A

KR20160145174A - 골아 세포의 조제 방법 및 골아 세포 유도제

Info

Publication number: KR20160145174A
Application number: KR1020167032139A
Authority: KR
Inventors: 겐타 야마모토; 츠나오 기시다; 도시로 야마모토; 오삼 마즈다
Original assignee: 교토후고리츠다이가쿠호진
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2016-12-19
Also published as: JPWO2015159982A1; CN106459903A; CN106459903B; US11174464B2; EP3133149A4; KR102346489B1; EP3133149A1; JP6705115B2; US20170037374A1; EP3133149B1; WO2015159982A1

Abstract

본 발명은, 골결손의 수복이나, 골 흡수, 골절이나 골다공증 등에 대한 치료에 응용 가능하고, 암화의 위험성이 없는 골아 세포를 조제하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 이러한 과제를 해결하는 수단으로서, 포유 동물의 분화된 체세포를 배지 중, (1) 스타틴 화합물, (2) 카세인 키나아제 1 저해제, (3) cAMP 유도제 및 (4) 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물의 존재하에 배양하여 상기 체세포를 골아 세포로 변환하는 것을 특징으로 하는, 골아 세포를 조제하는 방법을 제공한다.

Description

골아 세포의 조제 방법 및 골아 세포 유도제{METHOD FOR PREPARING OSTEOBLASTS AND OSTEOBLAST INDUCER}

본 발명은, 골아 세포의 조제 방법 및 골아 세포 유도제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 체세포를 골아 세포로 유도하기 위한 키트에 관한 것이다.

골다공증에 수반하는 골절, 관절 류머티즘에 수반하는 관절 파괴, 중증 외상이나 골종양 절제에 수반하는 광범위 골결손, 중증 치주병에 수반하는 치조골 흡수 등, 다양한 질환에서 골 (骨) 의 리모델링이 충분히 기능하지 않고, 골파괴가 진행되거나 골결손이 잔존하는 예가 있다. 특히 고령자에서는, 골절 후의 골재생이 지연되어 장해나 장기 와상 (臥床) 에 빠지는 예도 많아, 의료상, 사회상의 큰 문제가 되고 있다.

골아 세포는, 골의 형성과 리모델링에 중심적인 역할을 하는 세포이다. 골다공증이나 관절 류머티즘에서는 파골 세포가 활성화됨으로써 골밀도 및 강도가 저하되는데, 골아 세포수나 기능을 증강시킬 수 있으면 유용한 예방 또는 치료법이 될 수 있다. 또, 골결손 병변에 자가 골수 세포를 이식하는 치료가 실시되고 있고, 골수 간엽계 간세포로부터 분화된 골아 세포가 골재생을 촉진한다고 생각된다. 그러나, 골수 채취시의 환자에 대한 침습이 크고, 또 얻어지는 세포수가 불충분한 예가 많은 것이 현상황이다. 만약, 환자 유래의 골아 세포를 다수 조정하여 골결손 부위에 자가 이식할 수 있으면, 상기 질환에 대한 효과적인 치료법이 될 가능성이 있다.

비특허문헌 1 은, 인간 ES 세포로의 오스테릭스 (Osterix) 의 렌티바이러스 벡터 도입 ＋ 골원성 (Osteogenic) 배지에서의 골아 세포로의 분화 유도를 실시하고 있지만, 이와 같은 유전자 도입에 의한 골아 세포의 유도에서는, 암화 (癌化) 의 위험성이 있었다.

ES 세포나, MC3T3-E1 세포, 골수 간질 세포 등의 골아 세포의 전구 세포는, 다양한 화합물에 의해 골아 세포로의 분화, 석회화, 골 관련 단백질의 산생을 유도하는 것이 보고되어 있다.

비특허문헌 2, 3 은, 골아 세포의 전구 세포인 MC3T3-E1 에 스타틴 화합물을 작용시켜 골아 세포로 분화 유도하는 것을 기재한다.

비특허문헌 4 는, 마우스 ES 세포에 심바스타틴을 작용시켜 골아 세포로 분화 유도하는 것을 기재한다.

비특허문헌 5 는, 마우스 골수 간질 세포에 옥시스테롤을 작용시켜 골아 세포로 분화 유도하는 것을 기재한다.

비특허문헌 6 은, 마우스 골수 간질 세포에 페나밀을 작용시켜 골아 세포로의 분화와 석회화를 유도하는 것을 기재한다.

비특허문헌 7 은, 심바스타틴과 아토르바스타틴이 초대 인간 골아 세포 및 골육종 세포주 (MG63) 에 있어서의 I 형 콜라겐 및 오스테오칼신의 산생을 촉진하는 것을 기재한다.

비특허문헌 8 은, 심바스타틴이 인간 치근막 간세포의 골아 세포로의 분화를 유도하는 것을 기재한다.

비특허문헌 9 는, 각종 스타틴 화합물이 골밀도를 증대시키는 것을 개시한다.

이들 선행기술문헌은 모두, ES 세포, 골수 간질 세포, 치근막 세포와 같은, 원래 골아 세포로 분화되는 능력이 있는 세포를 골아 세포로 유도한 기술, 혹은 이미 골아 세포인 세포의 골형성능을 증강한 기술로서 개시된 것이다.

Karner E et al. J Cell Physiol. 2009. T. Maeda et al. Journal of Cellular Biochemistry 92 : 458-471 (2004) T. Maeda et al. Biochem Biophys Res Commun 280 : 874-877 (2001) Ling Juan Qiao et al. Mol. Cells 32, 437-444 (2011) Tara L. Aghaloo et al. Journal of Ortho paedic Research 2007, 1488-1497 Kye Won Park et al. Mol. Cell. Biol. vol.29, 2009, p.3905-3914 Silvia Ruiz-Gaspa et al. Journal of Cellular Biochemistry 101 : 1430-1438 (2007) Bing-jiao Zhao et al. Fundamental & Clinical Pharmacology (2013), 1-10 B. Uzzan et al. Bone 40 (2007) 1581-1587

본 발명은, 분화된 체세포를 유전자 도입을 실시하지 않고 골아 세포로 변환하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

스타틴 화합물 등의 저분자 화합물을 사용하여 본래 골아 세포가 될 능력이 없는 정상 체세포를 리프로그램하여 골아 세포로 한 보고는 없다. 스타틴 화합물 등이, 골아 세포로 분화하는 능력이 있는 세포를 골아 세포로 유도하거나, 혹은 이미 골아 세포인 세포의 골형성능을 증강하는 것이 공지라 하더라도, 본래 골아 세포가 될 능력이 없는 체세포를 리프로그램하여 골아 세포로 할 수 있을지의 여부는 다른 문제이며, 본 발명은, 상기 비특허문헌으로부터 예상할 수 없는 것이다. 요컨대, 골아 세포로의 분화능을 갖는 세포가 골아 세포로 분화하는 기구 (機構) 와, 무관계의 세포를 골아 세포로 강제적으로 운명 전환하는 기구는 동일하다는 보증은 없기 때문에, 동일한 화합물이 양방을 실시할 수 있을지의 여부는, 실험해 보지 않으면 알 수 없다. 실제로 예를 들어, ES 세포를 심근 세포로 분화 유도하는 화합물이 알려져 있지만, 이 화합물을 사용하여 선유아 세포를 심근 세포로 전환하였다는 보고는 없다 (Minami I, et al. Cell Rep. 2012 Nov 29 ; 2(5) : 1448-60.).

본 발명은, 이하의 골아 세포의 조제 방법, 골아 세포 유도제 및 키트를 포함한다.

항 1, 포유 동물의 분화된 체세포를 배지 중,

(1) 스타틴 화합물,

(2) 카세인 키나아제 1 저해제,

(3) cAMP 유도제, 및

(4) 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제

로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물의 존재하에 배양하여 상기 체세포를 골아 세포로 변환하는 것을 특징으로 하는, 골아 세포를 조제하는 방법.

항 2, 상기 체세포가 선유아 세포, 치육 (齒肉) 세포 또는 지방 세포인, 항 1 에 기재된 방법.

항 3, 상기 배지가 골아 세포의 유도 배지인, 항 1 또는 2 에 기재된 방법.

항 4, (1) 스타틴 화합물,

(2) 카세인 키나아제 1 저해제,

(3) cAMP 유도제, 및

(4) 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제

로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 포함하는, 분화된 체세포를 골아 세포로 유도하기 위한 유도제.

항 5, (1) 스타틴 화합물,

(2) 카세인 키나아제 1 저해제,

(3) cAMP 유도제, 및

(4) 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제

로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 그리고 배지를 포함하는 분화된 체세포를 골아 세포로 유도하기 위한 키트.

항 6, 상기 배지가 골아 세포의 유도 배지인, 항 5 에 기재된 키트.

본 발명에서는, 저분자 화합물의 작용에 의해 분화된 체세포로부터 단기간에 골아 세포를 제공할 수 있다. 이 골아 세포는, 이식하는 본인의 체세포로부터 용이하게 유도할 수 있기 때문에, 골아 세포 자체 또는 그것으로부터 제조한 골조직을 이식한 경우에도 면역학적인 거절 응답 등의 문제는 발생하지 않는다. 또, iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 골아 세포를 유도할 수 있기 때문에, 암화 등의 다능성 간세포에 기인하는 문제를 회피할 수 있다. 한편, 미리 제조하여 뱅크화해 두고, 그로부터 환자로의 동종 이식 (allotransplantation) 이나 이종 (異種) 이식에 사용하는 것도 가능하다.

도 1 은 알리자린 레드 S 염색 이미지를 나타낸다. (28 일)
도 2 는 알리자린 레드 S 염색 이미지를 나타낸다. (28 일)
도 3 은 알리자린 레드 S 염색 강도를 나타낸다.
도 4 는 알리자린 레드 S 염색 이미지를 나타낸다. (28 일)
도 5 는 알리자린 레드 S 염색 강도를 나타낸다.
도 6 은 알리자린 레드 S 염색 이미지 및 염색 강도를 나타낸다.
도 7 은 알리자린 레드 S 염색 이미지 및 염색 강도를 나타낸다.
도 8 은 리얼타임 RT-PCR 에 의한, Runx2, 오스테오칼신 (Osteocalcin, OC) 및 ALP 의 mRNA 발현량을 나타낸다. 도면 중, FBs : Fibroblasts (선유아 세포), OBs : Osteoblasts (골아 세포), SS : 심바스타틴 (Simvastatin) 을 첨가하여 배양한 세포, SS ＋ D : 심바스타틴과 D4476 을 첨가하여 배양한 세포 ; 를 각각 나타낸다.
도 9 는 DNA 마이크로어레이의 결과를 나타낸다.
도 10 은 알리자린 레드 S 염색 강도를 나타낸다. (28 일)
도 11 은 알리자린 레드 S 염색 이미지 및 강도를 나타낸다. (28 일)
도 12 는 알리자린 레드 S 염색 이미지 및 강도를 나타낸다. (28 일)
도 13 은 리얼타임 RT-PCR 에 의한, ALP mRNA 의 발현량을 나타낸다. (28 일)
도 14 는 리얼타임 RT-PCR 에 의한, ALP mRNA 의 발현량을 나타낸다. (28 일)
도 15 는 리얼타임 RT-PCR 에 의한, ALP mRNA 의 발현량을 나타낸다. (28 일)
도 16 은 리얼타임 RT-PCR 에 의한, 오스테오칼신 (OC) 의 발현량을 나타낸다. (28 일)
도 17 은 리얼타임 RT-PCR 에 의한, Runx2 의 발현량의 측정 결과를 나타낸다. (28 일)
도 18 은 리얼타임 RT-PCR 에 의한, 오스테릭스 (Osterix) 의 발현량의 측정 결과를 나타낸다. (28 일)
도 19 는 알리자린 레드 S 염색 이미지 및 강도를 나타낸다. (28 일)
도 20 은 DNA 마이크로어레이의 결과를 나타낸다. 도면 중, FBs : Fibroblasts (선유아 세포), OBs : Osteoblasts (골아 세포), SS : 심바스타틴 (Simvastatin) 을 첨가하여 배양한 세포, SS ＋ D : 심바스타틴과 D4476 을 첨가하여 배양한 세포 ; 를 각각 나타낸다.
도 21 은 생체 내 골형성을 나타낸다 (μCT 이미지). (좌측 도면 : 선유아 세포) 골결손을 만든 후, 선유아 세포를 이식한 대퇴골. 화살표 헤드는, 인공 골결손을 만들어 이식한 부위에, 골결손이 잔존하고 있는 것을 나타낸다. (우측 도면 : SS ＋ D) 골결손을 만든 후, 심바스타틴과 D4476 을 첨가하여 배양한 세포를 이식한 대퇴골. 검은 화살표는, 인공 골결손을 만들어 이식한 부위에, 재생골이 만들어져 결손이 수복 (修復) 되어 있는 것을 나타낸다. 흰 화살표는 골, 주위에 이식한 부위에, 재생골이 만들어져 있는 것을 나타낸다. 화살표 헤드는, 인공 골결손을 만들어 이식한 부위에, 골결손이 잔존하고 있는 것을 나타낸다.
도 22 는 생체 내 골형성을 나타낸다 (HE 염색 및 알리자린 레드 S 염색). FBs : 골결손을 만든 후, 선유아 세포를 이식한 대퇴골. SS ＋ D : 골결손을 만든 후, 심바스타틴과 D4476 을 첨가하여 배양한 세포를 이식한 대퇴골. 삼각표는 인공 골결손을 만들어 이식한 부위를 나타내며, 골결손이 잔존하고 있다. 화살표는, 인공 골결손을 만들어 이식한 부위를 나타내며, 재생골이 만들어져 결손이 수복되어 있다.
도 23 은 알리자린 레드 S 염색 이미지를 나타낸다. (인간 정상 백색 지방 전구 세포, 21 일)

본 발명은, 분화된 체세포의 배지에 (1) 스타틴 화합물, (2) 카세인 키나아제 저해제, (3) cAMP 유도제 및 (4) 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 저분자 화합물을 공존시킴으로써 분화된 체세포로부터 골아 세포를 얻는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서 골아 세포로 다이렉트·리프로그래밍되는 분화된 체세포로는, 골아 세포를 포함하지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 선유아 세포, 케라티노사이트, 구강 점막 상피 세포, 기도 점막 상피 세포, 위점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포, 혈관 내피 세포, 평활근 세포, 지방 세포, 치육 세포 (치육 선유아 세포, 치육 상피 세포), 백혈구, 임파구, 근세포, 결막 상피 세포, 파골 세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 선유아 세포, 케라티노사이트, 구강 점막 상피 세포, 치육 세포, 백혈구, 임파구, 파골 세포, 지방 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서 추가로 다른 화합물을 병용하여 골아 세포로의 다이렉트·리프로그래밍을 촉진할 수 있다. 이와 같은 화합물로는, (ⅰ) iPS 세포 유도나 세포 리프로그래밍을 촉진하는 저분자 화합물, (ⅱ) Oct4 를 유도하는 화합물, (ⅲ) 메틸트랜스페라아제 저해제, 히스톤 탈메틸화 효소 저해제, 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제 등의 에피제네틱 제어 화합물을 들 수 있다.

스타틴 화합물로는, HMG-CoA 환원 효소 저해제를 널리 포함하며, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 심바스타틴, 아토르바스타틴, 로바스타틴, 플루바스타틴, 프라바스타틴, 세리바스타틴, 피타바스타틴, 로수바스타틴, 디하이드로콤팩틴, 콤팩틴, 베르바스타틴, 카르바스타틴, 크릴바스타틴, 달바스타틴, 글렌바스타틴, 플루인도스타틴, 벨로스타틴, 메바스타틴, 리바스타틴, 시리바스타틴, CI-981 등을 들 수 있다. 향후 개발되는 스타틴 화합물은 모두 본 발명의 스타틴 화합물에 포함된다.

본 발명을 속박하는 것은 아니지만, 스타틴 화합물은, 특히 Runx2 유전자의 발현량 증대 등을 개재하여, 골아 세포로의 다이렉트 리프로그래밍을 촉진한다고 생각된다. 또, 칼슘 침착의 촉진에도 기여한다고 생각된다.

카세인 키나아제 저해제는, 카세인 키나아제 1, 카세인 키나아제 2 등의 서브 타입이 존재하는 카세인 키나아제에 대한 저해제를 널리 포함한다. 골아 세포를 유도하는 효과가 높다는 관점에서, 카세인 키나아제 1 저해제를 바람직한 양태로서 들 수 있다.

카세인 키나아제 1 저해제로는, D4476, IC261, CK1-7, A3, SB-431542, DRB, 하이메니알디신, 마타이레시놀, 5-요오드튜베르시딘, 메리디아닌, SB-203580 등의 화합물 (카세인 키나아제 1 을 특이적으로 저해하는 화합물을 포함한다.) 을, 바람직한 예로서 들 수 있다.

그 외에, 파수딜, 하이드록시파수딜, 펜레티나이드, PKZ-ζ 펩티드 위기질, 디메틸스핑고신, CVS-3989, AG1024, 648450, K252a, C3 트랜스페라아제, 553502, LY333531, 루복시스타우린, Go-6976, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2 등의 카세인 키나아제 1 을 저해하는 활성을 갖는 화합물도 들 수 있다.

카세인 키나아제 2 저해제로는, CX-4945 가 예시된다.

카세인 키나아제 1 저해제로는, 상기 화합물 대신에 그 유도체를 사용할 수도 있다. 유도체는, 반드시 카세인 키나아제를 저해하는 활성을 갖지 않아도 된다. 예를 들어, 카세인 키나아제 1 저해제인 D4476 (4-[4-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드) 대신에, WO00/61576호에 기재된 하기 식 (Ⅰ) 로 나타내는 D4476 의 유도체를 사용할 수 있다 :

[화학식 1]

[식 중, R₁ 은, 할로겐, C_1-6 알콕시 (-O-C_1-6 알킬), C_1-6 알킬티오(-S-C_1-6 알킬), C_1-6 알킬, -O-(CH₂)_n-Ph, -S-(CH₂)_n-Ph, 시아노, 페닐 (Ph), 및 CO₂R (여기서, R 은 수소 또는 C_1-6 알킬이고, n 은 0, 1, 2 또는 3 이다) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 그 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되는 나프틸, 안트라세닐, 또는 페닐이거나 ; 또는 R₁ 은, N, O 및 S 에서 독립적으로 선택되는 2 개까지의 헤테로 원자를 함유하고 있어도 되는 5 ∼ 7 원자의 방향 고리 또는 비방향 고리와 축합한 페닐이고 ;

R₂ 는, H, NH(CH₂)_n-Ph 또는 NH-C_1-6 알킬이고 (여기서, n 은 0, 1, 2 또는 3 이다) ;

R₃ 은, CO₂H, CONH₂, CN, NO₂, C_1-6 알킬티오, -SO₂-C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, SONH₂, CONHOH, NH₂, CHO, CH₂OH, CH₂NH₂, 또는 CO₂R 이고 (여기서, R 은 수소 또는 C_1-6 알킬이다) ;

X₁ 및 X₂ 중 일방은 N 또는 CR' 이고, 타방은 NR' 또는 CHR' 이거나 (여기서, R' 는 수소, OH, C_1-6 알킬, 또는 C_3-7 시클로알킬이다) ; 또는 X₁ 및 X₂ 중 일방이 N 또는 CR' 인 경우, 타방은 S 또는 O 이어도 된다].

C_1-6 알킬로는, 직사슬형 또는 분지 사슬형의 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬, 구체적으로는, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, n-헥실, 이소헥실을 들 수 있다.

C_3-7 시클로알킬로는, 탄소수 3 ∼ 7 의 시클로프로필, 구체적으로는, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸을 들 수 있다.

R₁ 이, N, O 및 S 에서 독립적으로 선택되는 2 개까지의 헤테로 원자를 함유 하고 있어도 되는 5 ∼ 7 원자의 방향 고리 또는 비방향 고리와 축합한 페닐인 경우, 구체예로는, 벤조[1,3]디옥소릴, 2,3-디하이드로벤조[1,4]디옥시닐, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조[1,2,5]옥사디아졸릴, 벤조[1,2,5]티아디아졸릴, 디하이드로벤조푸라닐을 들 수 있다.

이와 같은 D4476 의 유도체로서, 하기 화합물이 예시된다 :

4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(2-피리딜)-1-하이드록시-1H-이미다졸-2-일]벤조니트릴 ;

4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]벤조니트릴 ;

4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]벤조산 ;

4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]벤조산메틸 ;

4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]벤조산에틸 ;

4-(4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-1-하이드록시-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)벤조니트릴 ;

4-(4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)벤조니트릴 ;

4-(4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)벤조산 ;

2-[4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-(4-니트로페닐)-1H-이미다졸-5-일]피리딘 ;

3-(4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)페닐아민 ;

4-[4-(4-플루오로페닐)-2-(4-니트로페닐)-1H-이미다졸-5-일]피리딘 ;

4-[4-(4-플루오로페닐)-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일]페닐아민 ;

4-(4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)페닐]메탄올 ;

4-(4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)벤즈아미드 ;

4-[4-(2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-일)-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일]-벤조니트릴 ;

4-[4-(2,3-디하이드로-벤조푸란-5-일)-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 ;

3-[4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)벤조니트릴 ;

4-[4-(2,3-디하이드로-벤조푸란-6-일)-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일]벤조니트릴 ;

4-[4-(2,3-디하이드로-벤조푸란-6-일)-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 ;

3-(4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)벤조산 ;

4-[4-(4-메톡시페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]벤조니트릴 ;

4-[4-(2,2-디플루오로-벤조[1,3]디옥솔-5-일)-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 ;

4-[4-(2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-일)-1-메틸-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 ;

4-[5-(2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-일)-1-메틸-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 ;

4-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-옥사졸-2-일)벤조니트릴 ;

4-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-옥사졸-2-일)벤즈아미드 ; 및 4-(4-벤조[1,3]디옥솔-5-일-5-피리딘-2-일-1H-피롤-2-일)벤즈아미드.

본 발명을 속박하는 것은 아니지만, 카세인 키나아제 1 저해제는, 특히 ALP (알칼리 포스파타아제) 의 발현량 증대, 칼슘 침착의 촉진 등을 개재하여, 골아 세포로의 다이렉트 리프로그래밍을 촉진한다고 생각된다.

cAMP 유도제 (아데닐산 시클라아제 활성화제라고 환언할 수도 있다.) 로는, 아데닐산 시클라아제의 활성화 작용에 의해 세포 내의 cAMP (사이클릭 AMP) 레벨을 상승시키는 화합물을 널리 포함하며, 예를 들어, 포스콜린 (FRK), 이소프로테레놀 등을 들 수 있다.

본 발명을 속박하는 것은 아니지만, cAMP 유도제는, 특히 Runx2 유전자의 발현량 증대 등을 개재하여, 골아 세포로의 다이렉트 리프로그래밍을 촉진한다고 생각된다. 또, 칼슘 침착의 촉진에도 기여한다고 생각된다.

히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제로는, DZNep (3-deazaneplanocin A), BIX-01294 등을 들 수 있다.

본 발명을 속박하는 것은 아니지만, cAMP 유도제는, 특히 칼슘 침착의 촉진 등을 개재하여, 골아 세포로의 다이렉트 리프로그래밍을 촉진한다고 생각된다.

배지 중의 스타틴 화합물의 농도로는, 골아 세포를 유도할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 100 pM ∼ 10 μM 정도, 바람직하게는 500 pM ∼ 5 μM 정도, 보다 바람직하게는 1 nM ∼ 1 μM 정도, 더욱 바람직하게는 10-100 nM 정도이다.

배지 중의 카세인 키나아제 1 저해제의 농도로는, 골아 세포를 유도할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.01 ∼ 100 μM 정도, 바람직하게는 0.1 ∼ 50 μM 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 μM 정도이다.

배지 중의 cAMP 유도제의 농도로는, 골아 세포를 유도할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.01 ∼ 100 μM 정도, 바람직하게는 0.1 ∼ 50 μM 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 μM 정도이다.

배지 중의 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제의 농도로는, 골아 세포를 유도할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 100 pM ∼ 50 μM 정도, 바람직하게는 1 nM ∼ 10 μM 정도, 보다 바람직하게는 5 nM ∼ 1 μM 정도, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 100 nM 정도이다.

상기 배지 중에 공존시키는 저분자 화합물은, 1 종 단독으로 사용해도, 2 종 이상을 조합하여 사용해도 된다. 2 종 이상을 조합하여 사용하는 경우, 조합은 특별히 한정되지 않는다. 골아 세포를 유도할 수 있는 효과가 높다는 관점에서, 스타틴 화합물과 카세인 키나아제 1 저해제의 조합이 바람직한 조합으로서 예시된다. 물론, 스타틴 화합물과 카세인 키나아제 1 저해제의 조합에, 추가로 cAMP 유도제 및/또는 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제를 조합해도 된다.

2 종 이상의 저분자 화합물을 조합하여 사용할 경우, 배양 기간 중에 2 종 이상을 동시에 공존시켜도, 배양 기간 중의 부분별로 상이한 저분자 화합물 (복수 가능) 을 사용해도 된다. 또, 1 종 이상의 저분자 화합물을 첨가하여 배양한 세포와, 다른 1 종 이상의 저분자 화합물을 첨가하여 배양한 세포를 혼합해도 된다.

골아 세포를 유도하기 위한 배지로는, 특별히 한정되지 않지만, 유도 배지가 바람직하다. 유도 배지로는, 아스코르브산 ; β-글리세로포스페이트 (β-glycerophospahte) ; 덱사메타손 및 하이드로코르티손 등의 당질 코르티코이드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종 ; 혈청 성분 (소 태아 혈청 (FBS), 인간 혈청 (HS) 등) ; 스트렙토마이신 등의 항생제 등을 통상적인 액체 배지 (DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EMEM (Eagle's minimal essential medium) 등.) 에 첨가한 것이 예시된다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 DMEM 등의 통상 배지에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손 (Dexamethasone)(모두 최종 농도), 10 ％ FBS 혹은 5 ％ HS, 추가로 필요에 따라 1 ％ 항생제, 1 ％ NEAA (비필수 아미노산) 를 첨가한 것을 들 수 있다.

배양 온도는 37 ℃ 정도이고, 배양 기간은 1 ∼ 6 주간 정도, 바람직하게는 2 ∼ 5 주간 정도, 보다 바람직하게는 3 ∼ 4 주간 정도이다.

또, 배지에는, DMSO 등의 용매를 사용해도 된다.

본 발명의 키트는, 골아 세포의 배지와 스타틴 화합물, 추가로 필요에 따라 카세인 키나아제 저해제, 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제 등이 포함된다.

본 발명에 의해, 전골아 세포 (pre-osteoblast), 미숙 골아 세포, 성숙 골아 세포, 골세포 등을 조제할 수 있다. 본 명세서에서는 간단히 하기 위해서 이것들을 모두 골아 세포라고 부른다.

본 발명에 의해 얻어지는 골아 세포 (이식 재료) 를 사용하여 치료하는 대상이 되는 질환으로는, 골종양, 외상이나 골수염 등에 수반하는 골결손, 또 골종양 등의 소파 (搔爬) 후의 골결손, 골절, 골다공증, 치주병, 치조골 흡수, 관절 류머티즘, 돌발성 대퇴골두 괴사, 변형성 관절증, 요추 변형성 척추증, 척주관 협착증, 추간판 헤르니아, 척추 분리증, 척추 분리 미끄럼증, 척추 측만증, 경추증성 척수증, 후종인대 골화증, 척수 손상, 변형성 고관절증, 변형성 슬관절증, 대퇴골두 미끄럼증, 골연화증, 하악 재건술 등의 복잡 골절에 의해 파괴된 골절 부위의 재건술, 수술 후의 골의 수복 (심장 수술 후의 흉골의 수복 등), 인공 족관절 수술에 수반하는 결손부의 수복, 골수염, 골괴사 등을 들 수 있다. 또, 골아 세포를 이식하면, 골이식, 인공 골이식, 인공 관절이나 임플란트와 병용하여 치료 효과를 높일 수 있을 가능성이 있다. 또 골아 세포를 3 차원적인 스캐폴드 등을 사용하여 배양하여 다양한 형태의 골조직을 체외에서 제조하고, 그 골조직을 이식함으로써, 상기 질환의 치료를 실시할 수도 있다. 그 이외에도 골아 세포의 결손, 부족 혹은 기능 저하에 관계되는 다양한 질환이 대상이 된다.

본 명세서에 있어서, 특별히 명시가 없는 한, 「치료」라는 용어는, 환자가 특정한 질환 또는 장해를 앓고 있는 동안에 실시하는 처치를 의도하며, 이것에 의해 질환 혹은 장해의 중증도, 또는 하나 혹은 복수의 그 증상이 경감되거나, 또는 질환 혹은 장해의 진행이 지연 또는 감속되는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, 「치료」에는 「예방」을 포함하는 것으로 한다.

본 발명에서 얻어지는 골아 세포는 또한, 질환의 치료에 한정되지 않고, 미용 목적으로 사용할 수도 있다. 예를 들어 사고나 수술 등에 의해 결손된 부위에 골아 세포 혹은 그것에 의해 제조된 골조직을 이식함으로써, 골기질을 산생시켜 결손 부위를 수복하고, 부풀게 하여 눈에 띄지 않게 할 수 있다. 그 때, 인간에 대한 처치도, 본 명세서에서는 편의상 치료라고 부르며, 「환자」는 「건강한 사람」혹은 「인간」, 「질환」은 「미용」으로 바꾸어 읽을 수 있다.

본 발명은 또한, 인간뿐만 아니라, 개, 고양이 등의 애완 동물이나 소, 말, 돼지, 양, 닭 등의 가축을 포함하는 포유 동물의 질환의 치료에도 사용하는 것이 가능하다. 그 경우, 「환자」를 「환축」혹은 「포유 동물」로 바꾸어 읽는 것으로 한다.

이식 재료란, 골조직의 수복, 재건을 위해서 생체 내에 도입하는, 골아 세포를 함유하는 재료를 말한다. 이식 재료는, 인비트로로 부분적 혹은 완전히 골조직을 재생시켜, 동일 또는 다른 개체에 이식하는 재료를 포함한다. 본 발명에서 얻어진 골아 세포는, 이식 재료의 제조에 사용할 수 있다. 골아 세포 자체도 이식 재료가 된다. 따라서, 골아 세포를 세포 제제로서 환자에게 이식할 수도 있고, 하이드록시어퍼타이트나 생체 흡수성 세라믹 등의 인공 재료로 이루어지는 기재 (스캐폴드) 와 함께 이식하거나, 스캐폴드와 함께 배양하고 나서 이식할 수 있다. 이들의 경우, 스캐폴드는 이식 목적에 따라 다양한 3 차원적인 형상을 만들게 할 수 있다.

체세포는, 포유 동물 유래이면 된다. 골아 세포를 생체에 이식하는 경우에는, 이식되는 피험체 유래의 체세포 (자가 세포) 를 사용하는 것이, 감염이나 거절 응답 등의 위험을 저감시키기 위해서 바람직하다. 그러나, 갑작스런 골절 등에 대해 이식하는 것 등의 목적인 경우, 자가 세포가 아닌, 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 미리 준비해 둔 골아 세포를 이식에 사용할 수 있다. 또는 미리 준비해 둔 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 골아 세포를 만들어, 이식에 사용할 수 있다. 즉, 골아 세포 뱅크, 또는 골아 세포 전구 세포의 뱅크를 만들어 두고 이식 목적으로 제공할 수 있다. 이와 같은 경우, 거절 응답 등의 위험을 저감시키기 위해서, 미리 MHC 를 타이핑해 둘 수 있다. 또, 미리 골아 세포의 캐릭터나 조 (造) 종양성 등을 확인해 둘 수 있다.

본 명세서에 있어서, 포유 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 인간, 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 소, 말, 돼지 등을 들 수 있고, 특히 인간을 들 수 있다.

본 발명은 또한, 골아 세포를 사용한 다양한 연구나 기술 개발 등에 사용할 수 있다. 예를 들어 골의 발생과 노화, 형태 형성, 리모델링의 기구, 이것들에 대한 역학적 스트레스, 영양, 면역, 신경, 호르몬의 영향의 해석 등의 기초 연구에 유용하다. 또 스트론튬 90 등의 방사성 물질의 내부 피폭에 있어서의 골에 대한 영향의 해석과 골로부터의 스트론튬 90 의 제거 기술의 개발 등에도 유용하다.

본 발명을 사용하면, 다양한 질환이나 유전적 배경을 갖는 인간이나 동물로부터 간편, 신속, 저가로 골아 세포를 수립할 수 있기 때문에, 질환이나 유전적 배경에 관련된 골아 세포의 이상을 생화학적, 분자 생물학적, 면역학적 등 수법에 의해 해석하는 것이 가능하고, 이것에 의해 질환의 발증 기전의 해명 등의 연구나 진단법의 개발에 도움을 줄 수 있다. 또 이와 같은 골아 세포를 사용하여, 약제의 개발, 약제의 독성 시험 등을 실시하면, 다양한 질환에 대한 신규 치료법의 개발에 도움을 줄 수 있다.

골아 세포가 얻어진 것은, ALP (알칼리 포스파타아제), 오스테오칼신 (Osteocalcin, OC), 오스테오폰틴 (Osteopontin), Runx2 의 mRNA 의 리얼타임 PCR 에 의한 측정, 알리자린 레드 (alizarin red) S 에 의한 염색 (미네랄화된 골기질의 산생) 등에 의해 확인할 수 있다.

Runx2 는 골형성에 있어서 필수의 전사 인자이다. Runx2 는, 생체에서의 간엽계 간세포로부터 골아 세포로의 분화에 있어서 필요 불가결한 역할을 하고 있다. 간엽계 간세포로의 Runx2 의 강제 발현은, OC (오스테오칼신), BSP (Bone sialo-protein), ALP (알칼리 포스파타아제), COL1A1 등의 골아 세포 특이적 유전자를 증대시킨다. Runx2 KO 마우스는, 성숙 골아 세포의 상실로부터 완전히 막성 골화도 연골 내 골화도 나타내지 않는다. 그러나, 이 마우스 유래의 간엽계 간세포는, 지방 세포와 연골 세포로의 유도능은 갖고 있다.

ALP (알칼리 포스파타아제) 는, 골아 세포의 조기부터 중기 분화 마커이다. 골아 세포의 막 표면과 골아 세포로부터 분비되는 기질 소포 (小胞) 에 많이 포함되며, 석회화 기질 산생의 개시에 관여한다.

오스테오칼신 (Osteocalcin, OC) 은 골아 세포 특이적으로 발현하고, 골형성의 촉진에 기여한다고 생각되고 있다.

알리자린 레드 (alizarin red) S 에 의한 염색이나 본 코사 (von Kossa) 염색은, 골형성의 중요한 요소의 하나인 미네랄화된 골기질의 산생, 즉 칼슘의 침착을 검출할 수 있다.

실시예

이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1-1, 알리자린 레드 S 염색 (도 1)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 5 × 10⁴ 세포/웰의 농도로 35 ㎜ 배양 디시에 배양하고, 100 nM 의 심바스타틴 (SS), 또는 100 nM 의 심바스타틴 (SS) 과 1 μM 의 DZnep 를 첨가한 유도 배지에서, 표준 조건하에서 배양하였다. 유도 배지의 조성은, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손 (모두 최종 농도), 10 ％ FBS, 1 ％ 항생제, 1 ％ NEAA, α-MEM 이다. 표준 조건이란, 37 ℃, 5 ％ CO₂, 95 ％ 가습 공기 (humidified air) 이다. 약 4 일에 1 회 배지 교환을 실시하고, 28 일간 배양하였다. 배양 디시로부터 배양액을 흡인 제거하고, 증류수로 2 회 세정을 실시하고, 10 ％ 포르말린으로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 20 분간 정치 (靜置). 멸균 증류수로 세정한 후, 육안 및 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 붉은 염색은 석회화 골기질을 나타내고 있다. SS, 또는 SS 와 DZnep 의 첨가에 의해, 선유아 세포가 석회화 골기질을 다량으로 산생하는 골아 세포로 전환된 것을 알 수 있다.

1-2, 알리자린 레드 S 염색 (도 2 - 3)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 24-웰 플레이트에 배양하고, 100 nM 의 심바스타틴 (SS) 과, 다양한 농도의 하이드록시 코르티손 및 β-글리세로포스페이트를 첨가한 유도 배지에서, 표준 조건하에서 배양하였다 (표 중, ○ 는 각 농도의 화합물을 첨가한 것을 나타낸다). 약 4 일에 1 회 배지 교환을 실시하고, 28 일간 배양하였다. 플레이트로부터 배양액을 흡인 제거하고, 증류수로 2 회 세정을 실시하고, 10 ％ 포르말린으로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 정치. 20 분 후, 염색 반응액을 회수한 후, 멸균 증류수로 세정하고, 육안 및 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다. 또 각 웰로부터 회수한 염색 반응액의 흡광도 (550 ㎚) 를 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다. 100 nM 의 심바스타틴 (SS) 은, 하이드록시 코르티손과 β-글리세로포스페이트의 존재하에, 선유아 세포를 골아 세포로 전환하는 것, 그 때 하이드록시 코르티손은 125 ∼ 4000 nM, β-글리세로포스페이트는 10 ∼ 20 μM 의 농도인 것이 바람직한 것을 알 수 있다.

1-3, 알리자린 레드 S 염색 (도 4 - 5)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 24-웰 플레이트에 배양하고, 100 nM 의 심바스타틴 (SS) 과, 다양한 농도의 덱사메타손 (Dex) 및 β-글리세로포스페이트를 첨가한 유도 배지에서, 표준 조건하에서 배양하였다 (표 중, ○ 는 각 농도의 화합물을 첨가한 것을 나타낸다). 약 4 일에 1 회 배지 교환을 실시하고, 28 일간 배양하였다. 플레이트로부터 배양액을 흡인 제거하고, 증류수로 2 회 세정을 실시하고, 10 ％ 포르말린으로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 정치. 20 분 후, 염색 반응액을 회수한 후, 멸균 증류수로 세정하고, 육안 및 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다. 또 각 웰로부터 회수한 염색 반응액의 흡광도 (550 ㎚) 를 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다. 100 nM 의 심바스타틴 (SS) 은, 덱사메타손과 β-글리세로포스페이트의 존재하에, 선유아 세포를 골아 세포로 유도하는 것, 그 때 덱사메타손은 25 ∼ 800 nM, β-글리세로포스페이트는 10 ∼ 20 μM 의 농도인 것이 바람직한 것을 알 수 있다.

1-4, 알리자린 레드 S 염색 (도 6)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 24-웰 플레이트에 배양하고, 다양한 농도의 심바스타틴 (SS) 을 첨가한 유도 배지에서, 표준 조건하에서 배양하였다. 약 4 일에 1 회 배지 교환을 실시하고, 28 일간 배양하였다. 배양 플레이트로부터 배양액을 흡인 제거하고, 증류수로 2 회 세정을 실시하고, 10 ％ 포르말린으로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 정치. 20 분 후의 염색 반응액을 회수한 후, 멸균 증류수로 세정하고, 육안 및 현미경으로 관찰하였다. 또 회수한 염색 반응액의 흡광도 (550 ㎚) 를 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다. 심바스타틴이 골아 세포를 유도하는 바람직한 농도는 10 ∼ 100 nM 인 것을 알 수 있다.

1-5, 알리자린 레드 S 염색 (도 7)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 24-웰 플레이트에 배양하고, 다양한 농도의 심바스타틴 (SS) 과 D4476 (카세인 키나아제 인히비터) 을 첨가한 유도 배지에서, 표준 조건하에서 배양하였다. 약 4 일에 1 회 배지 교환을 실시하고, 28 일간 배양하였다. 그 후 배양 플레이트로부터 배양액을 흡인 제거하고, 증류수로 2 회 세정을 실시하고, 10 ％ 포르말린으로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 정치. 20 분 후의 염색 반응액을 회수한 후, 멸균 증류수로 세정하고, 육안 및 현미경으로 관찰하였다. 또 회수한 염색 반응액의 흡광도 (550 ㎚) 를 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다. 100 nM 의 심바스타틴에, 2 ∼ 5 μM 의 D4476 이 공존하면, 골아 세포로의 유도 효율이 보다 높아지는 것을 알 수 있다.

1-6, 리얼타임 RT-PCR (도 8)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 12-웰 플레이트에 배양하고, 100 nM 의 심바스타틴 (SS) 과 다양한 농도의 D4476 (카세인 키나아제 인히비터) 을 첨가한 유도 배지에서, 표준 조건하에서 배양하였다 (괄호 내의 숫자는 μM). 약 4 일에 1 회 배지 교환을 실시하고, 21 일간 배양하였다. 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하고, Rever Tra Ace qPCR RT 마스터 믹스를 사용하여 cDNA 를 제작하였다. 리얼타임 PCR 마스터 믹스, 타크만 (Taqman) 프로브, 특이적인 프라이머 및 cDNA 를 혼화하고, AB7300 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여 리얼타임 RT-PCR 을 실시하고, Runx2, 오스테오칼신 (OC), 알칼리 포스파타아제 (ALP) 유전자의 mRNA 를 정량하였다. 컨트롤로서 심바스타틴을 첨가하지 않은 배양을 실시한 선유아 세포로부터 RNA 를 채취하고 동일한 해석을 실시하였다. 또 인간 골아 세포로부터 RNA 를 채취하고 동일한 해석을 실시하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다. 세로축은, 컨트롤 세포의 mRNA 레벨을 1 로 했을 때의 각 유전자의 mRNA 의 상대값이다. 100 nM 의 심바스타틴에 의해 선유아 세포로부터 유도된 골아 세포가, Runx2, 오스테오칼신 (OC), 알칼리 포스파타아제 (ALP) 를 발현하는 것, 또 2 ∼ 5 μM 의 D4476 이 공존하면, 그것들의 발현이 동등 혹은 보다 높아지는 것을 알 수 있다.

1-7, DNA 마이크로어레이 (도 9)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 60 ㎜ 배양 디시에 배양하고, 100 nM 의 심바스타틴 (SS), 또는 100 nM 의 심바스타틴과 2 μM 의 D4476 (SS ＋ D4) 을 첨가한 유도 배지에서, 표준 조건하에서 배양하였다. 약 4 일에 1 회 배지 교환을 실시하고, 21 일간 배양하였다. 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하였다. 인간 선유아 세포 (HDFs) 와 인간 골아 세포 (OBs) 로부터도 동일하게 총 RNA 를 회수하였다. 각 세포의 mRNA 발현 패턴을 에피메트릭스사 (affymetrix) 의 DNA 칩을 사용하여 게놈와이드로 해석하였다. 결과를 도 9 에 나타낸다. SS, SS ＋ D4 모두, 선유아 세포보다 골아 세포에 유사한 망라적 유전자 발현 패턴을 나타내고, SS ＋ D4 가 SS 보다 더 골아 세포에 유사한 망라적 유전자 발현 패턴을 나타내는 것을 알 수 있다.

실시예 2

2-1, 알리자린 레드 S 염색 (도 10)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 5 × 10³ 세포/웰의 농도로 24 웰 플레이트에 파종하였다 (0 일). 다음날, 각 웰의 배양액을 버리고, 500 ㎕/웰의 새로운 배지로 교환하였다. 유도 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손에 10 ％ 소 태자 혈청 (FBS) 을 첨가한 것이다. 또 기재된 소분자 화합물을 첨가하였다. 단, AS 는 아토르바스타틴 (Atorvastatin), LS 는 로바스타틴 (Lovastatin), RS 는 로수바스타틴 (Rosuvastatin), PiS 는 피타바스타틴 (Pitavastatin), SS 는 심바스타틴 (Simvastatin), PrS 는 프라바스타틴 (Pravastatin), FSK 는 포스콜린 (forskolin) 을 나타낸다. AS 는 LKT 라보레토리즈 (St Pau, USA), LS 는 케이맨 케미컬 (Cayman chemical) (Ann Arbor, USA), RS 는 케이맨 케미컬 (Ann Arbor, USA), PiS 는 케이맨 케미컬 (Ann Arbor, USA), SS 는 시그마 (Sigma) (St Louis, USA), PrS 는 케이맨 케미컬 (Ann Arbor, USA), FSK 는 시그마 (St Louis, USA) 로부터 각각 구입하였다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 교환하여 배양하였다.

본 실시예에서 사용한 화합물을 하기에 나타낸다.

[화학식 2]

[화학식 3]

배양 28 일 후에, 각 웰의 배양액을 흡인하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이션하였다. 각 웰로부터 액을 회수하여 96 웰 플레이트에 옮기고, 흡광도계로 흡광도 (OD 550 ㎚ - 650 ㎚) 를 측정하였다.

결과를 도 10 에 나타낸다. AS, LS, RS, SS, PrS, FSK, D4476 을 첨가한 배양에 의해, 선유아 세포에 석회화 기질 산생능이 유도된 것을 알 수 있다.

또, 10 nM PiS 를 첨가한 배양에 의해서도, 다른 스타틴 화합물과 동일한 결과를 관찰할 수 있었다.

2-2, 알리자린 레드 S 염색 (도 11)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 5 × 10³ 세포/웰의 농도로 24 웰 플레이트에 파종하였다 (0 일). 다음날, 각 웰의 배양액을 버리고, 500 ㎕/웰의 새로운 배지로 교환하였다. 유도 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손에 10 ％ FBS 를 첨가한 것이다. 또 기재된 소분자 화합물을 첨가하였다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 교환하여 배양하였다.

배양 28 일 후에, 각 웰의 배양액을 흡인하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이션하였다. 각 웰로부터 액을 회수하여 96 웰 플레이트에 옮기고, 흡광도계로 흡광도 (OD 550 ㎚ - 650 ㎚) 를 측정하였다. 또 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정한 후에 사진 촬영을 실시하였다.

결과를 도 11 에 나타낸다. 붉은 염색은 석회화 골기질을 나타내고 있다. D4476 을 첨가한 배양에 의해, 선유아 세포에 석회화 기질 산생능이 유도된 것을 알 수 있다.

2-3, 알리자린 레드 S 염색 (도 12)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 5 × 10³ 세포/웰의 농도로 24 웰 플레이트에 파종하였다 (0 일). 다음날, 각 웰의 배양액을 버리고, 500 ㎕/웰의 새로운 배지로 교환하였다. 유도 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손에 5 ％ 인간 혈청을 첨가한 것이다. 또 기재된 소분자 화합물을 첨가하였다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 교환하여 배양하였다.

결과를 도 12 에 나타낸다. 붉은 염색은 석회화 골기질을 나타내고 있다. D4476 을 첨가한 배양에 의해, 선유아 세포에, 보다 높은 석회화 기질 산생능이 유도된 것을 알 수 있다.

2-4, 리얼타임 RT-PCR (도 13)

상기 「2-1,」과 동일한 배양을, 기재된 화합물을 첨가하여 실시하였다.

배양 28 일 후에, 각 웰로부터 배양액을 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하고, Rever Tra Ace qPCR RT 마스터 믹스를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 리얼타임 PCR 마스터 믹스와, 인간 알칼리 포스파타아제 (ALP) 유전자에 특이적인 타크만 프로브와 프라이머를 첨가하고, AB7300 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여 리얼타임 RT-PCR 을 실시하였다. 또, 정상 인간 골 유래 골아 세포로부터도 총 RNA 를 추출하고, 동일하게 해석하였다.

결과를 도 13 에, 정상 인간 선유아 세포의 값을 1 로 한 상대값으로 나타낸다. AS, LS, RS, SS, PrS, D4476 을 첨가한 배양에 의해, ALP 유전자의 mRNA 발현이 유도된 것을 알 수 있다.

2-5, 리얼타임 RT-PCR (도 14)

배양 28 일 후에, 실시예 3 과 동일한 방법으로, 각 웰의 세포의 ALP 유전자의 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR 로 해석하였다. 또, 정상 인간 골 유래 골아 세포로부터도 총 RNA 를 추출하고, 동일하게 해석하였다.

결과를 도 14 에, 정상 인간 선유아 세포의 값을 1 로 한 상대값으로 나타낸다. SS, PrS 를 D4476 과 함께 첨가하면 D4476 단독보다 더욱 ALP 발현을 강하게 유도한 것을 알 수 있다.

2-6, 리얼타임 RT-PCR (도 15)

배양 28 일 후에, 상기 「2-3,」과 동일한 방법으로, 각 웰의 세포의 ALP 유전자의 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR 로 해석하였다. 또, 정상 인간 골 유래 골아 세포로부터도 총 RNA 를 추출하고, 동일하게 해석하였다.

결과를 도 15 에, 정상 인간 선유아 세포의 값을 1 로 한 상대값으로 나타낸다. SS, PrS 를 D4476 과 함께 첨가하면, D4476 을 단독으로 첨가한 경우보다 더욱 ALP 발현을 강하게 유도한 것을 알 수 있다.

2-7, 리얼타임 RT-PCR (도 16)

상기 「2-6,」과 동일한 배양을, 기재된 화합물을 첨가하여 실시하였다.

배양 28 일 후에, 각 웰로부터 배양액을 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하고, Rever Tra Ace qPCR RT 마스터 믹스를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 리얼타임 PCR 마스터 믹스와, 인간 오스테오칼신 (OC) 유전자에 특이적인 타크만 프로브와 프라이머를 첨가하고, AB7300 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여 리얼타임 RT-PCR 을 실시하였다.

결과를 도 16 에 나타낸다. RS, PrS 의 어느 것을 첨가하여 배양하면, 오스테오칼신 유전자의 mRNA 발현이 유도된 것을 알 수 있다.

2-8, 리얼타임 RT-PCR (도 17)

상기 「1,」과 동일한 배양을, 기재된 화합물을 첨가하여 실시하였다.

배양 28 일 후에, 각 웰로부터 배양액을 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하고, Rever Tra Ace qPCR RT 마스터 믹스를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 리얼타임 PCR 마스터 믹스와, 인간 Runx2 유전자에 특이적인 타크만 프로브와 프라이머를 첨가하고, AB7300 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여 리얼타임 RT-PCR 을 실시하였다.

결과를 도 17 에 나타낸다. AS, LS, RS, SS, PrS, 또는 FSK 를 첨가하여 배양함으로써, Runx2 유전자의 mRNA 발현이 유도된 것을 알 수 있다.

2-9, 리얼타임 RT-PCR (도 18)

배양 28 일 후에, 각 웰로부터 배양액을 제거하고, PBS (-) 로 세정하였다. 세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하고, Rever Tra Ace qPCR RT 마스터 믹스를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. 리얼타임 PCR 마스터 믹스와, 인간 오스테릭스 유전자에 특이적인 타크만 프로브와 프라이머를 첨가하고, AB7300 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여 리얼타임 RT-PCR 을 실시하였다.

결과를 도 18 에 나타낸다. FSK 를 첨가하여 배양함으로써, 오스테릭스 유전자의 mRNA 발현이 유도된 것을 알 수 있다.

2-10, 알리자린 레드 S 염색 (도 19)

실시예 1 과 동일한 배양을, 기재된 화합물을 첨가하여 실시하였다. DZnep 는 케이맨 케미컬 (Ann Arbor, USA), CX-4945 는 바이오비전 (Biovision) (Zurich, Switzerland) 으로부터 구입하여 사용하였다.

배양 28 일 후에, 실시예 2 와 동일한 방법으로, 알리자린 레드 S 염색을 실시하고, 흡광도 (OD 550 ㎚ - 650 ㎚) 의 측정과 사진 촬영을 실시하였다.

결과를 도 19 에 나타낸다. D4476, FSK, 또는 DZnep 를 첨가한 배양에 의해, 선유아 세포에 석회화 기질 산생능이 유도된 것을 알 수 있다. CX-4945 는 영향을 주지 않았다.

2-11, DNA 마이크로어레이 (도 20)

인간 정상 피부 선유아 세포주 HDFs 를, 60 ㎜ 배양 디시에 배양하고, 100 nM 의 심바스타틴 (SS), 또는 100 nM 의 심바스타틴과 2 μM 의 D4476 (SS ＋ D4) 을 첨가한 유도 배지에서, 표준 조건하에서 배양하였다. 3 ∼ 4 일에 1 회 배지 교환을 실시하고, 21 일간 배양하였다.

세포로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하였다. 인간 선유아 세포 (HDFs) 와 인간 골아 세포 (OBs) 로부터도 동일하게 총 RNA 를 회수하였다. 각 세포의 mRNA 발현 패턴을 아피매트릭스사의 DNA 칩을 사용하여 게놈와이드로 해석하였다.

결과를 도 20 에 나타낸다. SS 첨가 배양한 세포와, SS ＋ D4 첨가 배양한 세포는, 모두 선유아 세포보다 골아 세포에 유사한 망라적 유전자 발현 패턴을 나타내고, 후자가 전자에 비해 보다 골아 세포에 유사성이 높은 망라적 유전자 발현 패턴을 나타내는 것을 알 수 있다.

2-12, 생체 내 골형성 (도 21)

동물 실험은, 교토 부립 의과대학의 인가를 얻어 실시하였다. 8 주령 수컷인 NOD/SCID 마우스 (Charles River) 의 복강 내에 펜토바르비탈을 주사하여 마취하였다. 주수 (注水) 하에 치과 드릴을 사용하여 좌측 대퇴골 골간에 직경 약 4 ㎜ 의 부분 골결손을 제조하였다. 실시예 11 과 동일한 방법으로, HDFs 를 심바스타틴과 D4476 존재하에서 21 일간 배양한 세포를, 50 ㎕ 의 배지와 50 ㎕ 의 마트리겔 (BD Bioscience, San Jose, CA) 의 1 : 1 혼합액에 현탁하고, 골결손부와 그 주변의 골 표면에 5 × 10⁵ 개/마우스의 농도로 이식하였다. 또, 동일하게 골결손을 만든 후 선유아 세포를 이식한 마우스도 준비하였다. 21 일 후에 마우스를 안락사시켜, 대퇴를 절제하고, 중성 포르말린으로 고정 후, X-ray CT 장치 (Scan Xmate-L090, Com Scan Techno, Yokohama, Japan) 를 사용하여 마이크로·컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 하였다.

도 21 에 3 차원 구축한 μCT 이미지를 나타낸다. 검정색 화살표 : 인공 골결손을 만들어 이식한 부위에, 재생골이 만들어져 결손이 수복 (修復) 되어 있다. 흰색 화살표 : 골 주위에 이식한 부위에 재생골이 만들어져 있다. 화살표 헤드 : 인공 골결손을 만들어 이식한 부위에, 골결손이 잔존하고 있다. 심바스타틴 (SS) ＋ D4476 (D) 을 첨가하여 배양한 세포는, 생체 내에서 골형성능을 갖는 것이 나타났다.

2-13, 생체 내 골형성 (도 22)

동물 실험은, 교토 부립 의과대학의 인가를 얻어 실시하였다. 상기 「2-12,」와 동일하게 이식 실험을 실시하였다. 또, 선유아 세포를 이식한 마우스도 준비하였다. 21 일 후에 마우스를 안락사시켜, 실시예 11 과 동일하게 대퇴를 절제하고, 중성 포르말린으로 고정 후, 골조직을 SCEM (Leica Microsystem) 컴파운드로 포매 (包埋) 하고, 급속 동결하였다. 6 μM 의 절편으로 슬라이스 후, 연속 절편을 헤마톡실린·에오진 (H ＆ E) (좌측) 및 알리자린 레드 S (우측) 로 염색하였다.

도 22 에 결과를 나타낸다. SS ＋ D4476 첨가 배양한 세포는, 생체 내에서 골형성능을 갖는 것이 나타났다.

2-14, 인간 정상 백색 지방 전구 세포로부터의 유도 (도 23)

인간 정상 백색 지방 전구 세포 (HWPs) 를, 5 × 10⁴ 세포/디시의 농도로 35 ㎜ 디시에 파종하였다 (0 일). 다음날, 각 웰의 배양액을 버리고, 2 ㎖/웰의 새로운 배지 (통상 배지, 또는 기재된 소분자 화합물을 첨가한 유도 배지) 로 교환하였다. 통상 배지는, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 에 10 ％ FBS 를 첨가한 배지이고, 유도 배지는 DMEM 에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손 및 10 ％ FBS 를 첨가한 것이다. 3 ∼ 4 일에 1 번, 배양액을 교환하여 배양하였다.

배양 21 일 후에, 각 웰의 배양액을 흡인하고, PBS (-) 로 세정 후, 10 ％ 포르말린으로 고정시켰다. 멸균 증류수로 3 회 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이션하였다. 염색 후의 웰을 멸균 증류수로 세정한 후에 사진 촬영을 실시하였다.

결과를 도 23 에 나타낸다. 붉은 염색은 석회화 골기질을 나타내고 있다. D4476 을 첨가한 배양에 의해, HWPs 의 석회화 기질 산생능이 강하게 유도된 것을 알 수 있다.

Claims

포유 동물의 분화된 체세포를 배지 중,
(1) 스타틴 화합물,
(2) 카세인 키나아제 1 저해제,
(3) cAMP 유도제, 및
(4) 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물의 존재하에 배양하여 상기 체세포를 골아 세포로 변환하는 것을 특징으로 하는 골아 세포를 조제하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 체세포가 선유아 세포, 치육 세포 또는 지방 세포인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배지가 골아 세포의 유도 배지인 방법.
(1) 스타틴 화합물,
(2) 카세인 키나아제 1 저해제,
(3) cAMP 유도제, 및
(4) 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 포함하는 분화된 체세포를 골아 세포로 유도하기 위한 유도제.
(1) 스타틴 화합물,
(2) 카세인 키나아제 1 저해제,
(3) cAMP 유도제, 및
(4) 히스톤 메틸트랜스페라아제 저해제
로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 그리고 배지를 포함하는 분화된 체세포를 골아 세포로 유도하기 위한 키트.
제 5 항에 있어서,
상기 배지가 골아 세포의 유도 배지인 키트.