CN104039954B - 可抑制iPS细胞的肿瘤化的分化诱导方法 - Google Patents

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Abstract

【课题】本发明的目的在于提供一种抑制iPS细胞的肿瘤化，使之分化诱导为目标分化细胞的技术。【解决手段】通过使用他汀和分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞，能够使之分化为肿瘤化被抑制了的分化细胞。

Description

可抑制iPS细胞的肿瘤化的分化诱导方法
技术领域
本发明涉及在抑制iPS细胞的肿瘤化的情况下使iPS细胞分化为目标分化细胞的技术。
背景技术
人的iPS细胞已被建立(例如，参见非专利文献1以及专利文献1)，人们期待其向再生医疗的应用。iPS细胞是指也被称为人工多功能性干细胞或者诱导多功能性干细胞的、获得了分化多能性的细胞，通过向体细胞(例如，成纤维细胞等)导入编码赋予分化多能性的多种类的转录因子，例如，Oct家族(Oct3/4)、Sox家族(Sox2、Sox1、Sox3、Sox15以及Sox17等)、Klf家族(Klf4、Klf2等)、Myc家族(c-Myc、N-Myc、L-Myc等)、Nanog、LIN28等的基因，获得分化多能性的细胞。
具有分化多能性的细胞除了iPS细胞以外，众所周知还有ES细胞，然而ES细胞因其起源为胚胎而具有生命伦理的问题，在以再生医疗作为目的的使用中存在问题。另一方面，由于iPS细胞可从採取比较容易的皮肤、血液建立，能够避免这样的问题。并且，由于能从需要治疗的患者自身组织获得iPS细胞，而无免疫排斥的问题，期待使再生医疗大步前进。
近年，在牙科、整形外科的领域中，进行了使iPS细胞分化诱导获得成骨细胞，利用于牙槽骨、软骨的再生的尝试。例如，在牙科领域，由于失去了牙的患者下颚消瘦，因此有大量牙科种植治疗、义齿治疗变得困難的情况。在这种情况下，通过将成骨细胞移植至下颚的骨缺损部位，使牙槽骨再生，从而使进行种植埋入等成为可能。从患者本人的体细胞建立iPS细胞、并将其分化诱导而得到的成骨细胞也没有必要担心免疫排斥。并且，已经由本发明者们确认到若利用口腔内上皮细胞、口腔内成纤维细胞，则iPS细胞的建立効率非常高(例如，参考专利文献2)。
但是，iPS细胞正由于其多功能性，在移植后肿瘤化的情况成为重大问题。为了解决该课题，现在提出了以下方法：以iPS细胞的肿瘤形成标记为指标分选肿瘤形成细胞而除去的方法(例如，参考非专利文献2)，通过在试验管内使用FACS等对定向为目标组织的iPS细胞进行细胞分选，选择目标细胞，将其用于移植的方法。然而，这些技术中存在难于确保细胞数量、伴有污染的危险性这些缺点。
这样，虽然人们非常期待iPS细胞向再生医疗的应用，但由于存在上述那样的问题而现在并未被实用化。即，为了iPS细胞的临床应用，人们非常期望解决肿瘤化抑制这一课题。
另一方面，HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀)介由胆固醇合成抑制作用而作为高脂血症治疗药被广泛在临床中使用。近年，确认了他汀对于各种细胞的分化、增殖具有多种多样的药理作用。但是，本领域并不知晓将iPS细胞在他汀的存在下进行培养则肿瘤化被抑制。
先行技术文献
非专利文献
非专利文献1:Takahashi K.,et al.(2007)."Inductionof Pluripotent StemCells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors".Cell131:861-872.
非专利文献2:Tang C et al,An antibody against SSEA-5glycan on humanpluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.NatBiotechnol.2011；29(9):829-34.
专利文献
专利文献1:WO2007/069666
专利文献2:WO2011/024550
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种在抑制iPS细胞的肿瘤化的情况下使iPS细胞分化诱导为目标分化细胞的技术。
用于解决课题的手段
本发明者为了解决上述课题进行了锐意地研究，结果发现通过在他汀的存在下培养iPS细胞，能够抑制iPS细胞的肿瘤化。进而，本发明者确认了通过使用他汀和分化诱导剂，使iPS细胞分化诱导为分化细胞，从而获得了肿瘤化被抑制的分化细胞。本发明是基于这样的见解，进而不断研究的结果而完成的。即，本发明提供下述形态的方法、肿瘤化抑制剂、培养基、肿瘤化被抑制了的iPS细胞、组织再生方法等。
项1.一种iPS细胞的分化诱导方法，所述方法为抑制肿瘤化、同时分化诱导iPS细胞的方法，所述方法包括以下工序：
使用他汀、以及使iPS细胞分化为目标分化细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞的工序。
项2.根据项1所述的分化诱导方法，其中，所述他汀为下述通式(A)所示的化合物：
通式(A)：
[化1]
通式(A)中，
羧基可与3位的羟基之间形成环状结构，
Ri表示下述通式(1)～(6)中任一项所示的基团，
通式(1)：
[化2]
通式(1)中，
R1a和R1b相同或相异，为氢、C1～5的直链或分支链状的烷基，
R1c和R1d相同或相异，为氢、羟基或者C1～5的直链或分支链状的烷基；
通式(2)：
[化3]
通式(2)中，
R2a为卤代苯基，
R2b为C1～5的直链或分支链状的烷基；
通式(3)：
[化4]
通式(3)中，
R3a为卤代苯基，
R3b为C3～5的环烷基；
通式(4)：
[化5]
通式(4)中，
R4a为卤代苯基，
R4b和R4c相同或相异，为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R4d为C1～4的烷基磺酰基；
通式(5)：
[化6]
通式(5)中，
R5a为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R5b、R5c和R5d相同或相异，为苯基或卤代苯基；
通式(6)：
[化7]
通式(6)中，
R6a和R6d相同或相异，为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R6b为C1～5的烷氧基，
R6c为卤代苯基。
项3.根据项1所述的分化诱导方法，其中，所述他汀为选自由辛伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀以及瑞舒伐他汀组成的组中的至少1种。
项4.根据项1所述的分化诱导方法，其中，通过在含有所述他汀和所述分化诱导剂的培养基中培养iPS细胞，使iPS细胞分化为目标分化细胞。
项5.根据项1所述的分化诱导方法，其中，通过在以含有所述他汀的培养基培养iPS细胞后，再以含有所述分化诱导剂的培养基进行培养，使iPS细胞分化为目标分化细胞。
项6.根据项1所述的分化诱导方法，其中，所述他汀的浓度为0.01～10μM。
项7.根据项1所述的分化诱导方法，其中，所述iPS细胞源自口腔粘膜的上皮细胞或口腔粘膜的成纤维细胞。
项8.根据项1所述的分化诱导方法，其中，使用他汀、以及使iPS细胞分化为成骨细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为成骨细胞。
项9.一种含有肿瘤化被抑制了的分化细胞的细胞制剂的制备方法，所述方法包括以下工序：
使用他汀、以及使iPS细胞分化为目标分化细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞的工序，以及
使用在前述工序中得到的分化细胞，制备细胞制剂的工序。
项10.根据项9所述的细胞制剂的制备方法，其中，所述分化细胞为成骨细胞。
项11.一种培养基，所述培养基用于从iPS细胞获得肿瘤化被抑制了的分化细胞，所述培养基含有：
他汀，以及
使iPS细胞分化为目标分化细胞的分化诱导剂。
项12.他汀在培养基的制造中的用途，所述培养基为用于从iPS细胞获得肿瘤化被抑制了的分化细胞的培养基。
项13.一种肿瘤化抑制方法，所述方法为在使iPS细胞分化为分化细胞时抑制肿瘤化的方法，所述方法包含以下工序：
使用他汀、以及使iPS细胞分化为目标分化细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞的工序。
项14.一种iPS细胞的肿瘤化抑制方法，所述方法为抑制iPS细胞的肿瘤化的方法，所述方法包括以下工序：
在他汀的存在下培养iPS细胞的工序。
项15.一种iPS细胞的肿瘤化抑制剂，其含有他汀作为有効成分。
项16.根据项15所述的肿瘤化抑制剂，其中，所述抑制剂在使iPS细胞分化为成骨细胞时使用。
项17.他汀在iPS细胞的肿瘤化抑制剂的制造中的用途。
项18.一种肿瘤化被抑制了的iPS细胞，所述细胞通过将iPS细胞在他汀的存在下进行培养而获得。
项19.一种他汀，其用于抑制iPS细胞的肿瘤化。
项20.一种细胞凋亡诱导剂，其以他汀作为有効成分，
用于在分化诱导iPS细胞时，对于具有未分化的性质的iPS细胞诱导细胞凋亡。
项21.一种骨再生剂，其包含成骨细胞，
所述成骨细胞为通过在他汀、以及向成骨细胞分化诱导的分化诱导剂的存在下培养iPS细胞而获得的成骨细胞。
项22.一种组织再生方法，其包括下述工序：
(i)使用他汀、以及使iPS细胞分化为目标分化细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞的工序，
(ii)使用在前述工序中得到的分化细胞，制备细胞制剂的工序，以及
(iii)将前述工序(ii)中得到的细胞制剂向需要组织再生的患者给药的工序。
发明的効果
本发明中所使用的他汀已经作为降胆固醇药广泛普及，关于其药物动力学、对人体的影响被详细地分析。面向使用iPS细胞的再生医疗的实现的重要的课题之一为如何防止iPS细胞在移植处引起的肿瘤化。根据本发明，能够解决该肿瘤化的问题。即，通过使用他汀、以及使iPS细胞分化诱导为目标分化细胞的分化诱导剂，使iPS细胞，能够获得移植后的肿瘤化被显著地抑制了的分化细胞，即使将该细胞移植也没有在生物体内形成畸形瘤(肿瘤化)的担心。因此，本发明对于使用iPS细胞的再生医疗的实现能够具有巨大贡献。
另外，对于通过在他汀以及向成骨细胞的诱导剂的存在下、进行iPS细胞的分化诱导而获得的成骨细胞而言，移植后的肿瘤化被抑制，在骨组织的再生医疗中能够提供实用性高的成骨细胞。另外，根据这样的方法，由于iPS细胞向成骨细胞的分化被充分地定向，因此不用经过为了得到均一分化的细胞的细胞分选等的烦杂的技术，能够高效率地获得肿瘤化被抑制的成骨细胞。
此外，本发明提供一种细胞制剂的制备方法，所述细胞制剂包含在他汀的存在下通过分化诱导剂分化诱导iPS细胞而得到的分化细胞，根据该方法得到的细胞制剂为在生物体内肿瘤化被抑制了的安全性高的制剂。另外，本发明提供一种组织再生方法，所述方法包括将这样的细胞制剂向患者给药的工序。另外，本发明还提供包含他汀和分化诱导剂、用于从iPS细胞获得肿瘤化被抑制了的分化细胞的培养基，在使iPS细胞分化为分化细胞时抑制肿瘤化的方法，iPS细胞的肿瘤化抑制方法，iPS细胞的肿瘤化抑制剂，肿瘤化被抑制了的iPS细胞等。
附图说明
[图1]A：表示未进行向成骨细胞的分化诱导而移植后的小鼠iPS细胞在移植28天后形成的肿瘤(以虚线圈表示)。确认到在摘出后的移植片(白圈)的周边形成有明显的肿瘤(Bar：1cm)。B：表示通过苏木精&伊红(H&E染色)观察从上述A的肿瘤得到的组织切片的结果。确认到肿瘤为含有源自三胚层的各种各样的组织的畸形瘤。C：表示将iPS细胞在成骨细胞分化诱导培养基中分化诱导20、30、40或50天得到的细胞在移植28天后形成的肿瘤(以虚线圈示出)。确认到在摘出的移植片(白圈)的周边形成有明显的肿瘤(Bar：1cm)。D：在从iPS细胞向成骨细胞的分化诱导进行了50天的细胞的移植片周边观察到骨组织的形成。
[图2]表示根据辛伐他汀的源自iPS细胞的肿瘤形成的抑制効果。将小鼠iPS细胞在含有辛伐他汀的成骨细胞分化诱导培养基(+)中进行30～50天分化诱导后进行移植，进行28天饲养，结果未观察到基于移植片的肿瘤形成。另一方面，仅以成骨细胞分化诱导培养基(-)分化诱导后的iPS细胞移植片显示了明显的肿瘤形成(Bar：1cm)。
[图3]表示通过在辛伐他汀以及成骨细胞诱导剂的存在下培养iPS细胞，移植后的肿瘤化被抑制。A：表示将小鼠iPS细胞在成骨细胞分化诱导培养基(不含有辛伐他汀)中进行30天分化诱导后进行移植，28天后摘出的移植片的根据H&E染色的组织图像。在移植后的细胞的集合体(*)的周边观察到畸形瘤所特有的各种各样的组织图像。B：表示将小鼠iPS细胞在含有辛伐他汀的成骨细胞分化诱导培养基中分化诱导30天后进行移植，28天后摘出的移植片的根据H&E染色的组织图像。在移植后的细胞的集合体(*)的周边，仅观察到骨样硬组织的形成以及纤维性的未成熟骨。
[图4]表示将小鼠iPS细胞在添加有辛伐他汀的成骨细胞分化诱导培养基中培养20天、30天、40天或50天后移植至小鼠背部皮下，移植28天后摘出的移植体的H&E染色的照片。
[图5]表示将小鼠iPS细胞在添加有辛伐他汀的成骨细胞分化诱导培养基中培养30天、40天或50天后移植至小鼠背部皮下，移植28天后摘出的移植体的亚甲蓝&冯-科萨(von Kossa)染色的照片。
[图6]表示将iPS细胞在添加有辛伐他汀的成骨细胞分化诱导培养基中培养30天后移植至小鼠背部皮下，移植后3个月或6个月摘出的移植体的H&E染色的照片。
[图7]表示将iPS细胞在添加有疏水性他汀、亲水性他汀或非那明的成骨细胞分化诱导培养基中培养30天后移植至小鼠背部皮下，移植后28天的小鼠的照片，以及摘出的移植体的照片。
[图8]表示将iPS细胞在添加有疏水性他汀、亲水性他汀或非那明的成骨细胞分化诱导培养基中培养30天后移植至小鼠背部皮下，移植28天后摘出的移植体的H&E染色的照片。
[图9]表示在辛伐他汀(0～1000nM)的存在下向成骨细胞分化诱导后的iPS细胞的阿察林(azaline)染色的照片。
[图10]为表示在辛伐他汀(0～10μM)的存在下向成骨细胞分化诱导后的iPS细胞的成骨细胞分化特异性基因的表达量的图表。
[图11]表示在存在或不存在辛伐他汀的情况下，将在非诱导培养基中培养后的iPS细胞聚集体移植至小鼠背部皮下，移植后28天的小鼠的照片，以及摘出的移植体的照片。
[图12]表示在存在或不存在辛伐他汀的情况下，非诱导培养基或成骨细胞诱导培养基中培养后的iPS细胞的培养上清中的浮游细胞数的图表。另外，下栏表示将各培养上清中的细胞用台盼蓝(trypan blue)染色后的照片。
[图13]表示在存在或不存在辛伐他汀的情况下，将在非诱导培养基或成骨细胞诱导培养基中培养后的iPS细胞的生死状态根据LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay进行评价的照片。
具体实施方式
1.iPS细胞的分化诱导方法
本发明提供一种iPS细胞的分化诱导方法，所述方法的特征在于使用他汀、以及用于分化诱导为目标分化细胞的分化诱导剂，在抑制肿瘤化的同时使iPS细胞分化为目标分化细胞。以下，对本方法进行详述。
[他汀]
他汀为通过抑制HMG-CoA还原酶的作用而使血液中的胆固醇值降低的化合物的总称，有时作为高胆固醇血症的治疗药使用。
本发明中使用的他汀如以下的通式所示。
通式(A)：
[化8]
式中，
羧基可与3位的羟基之间形成环状结构。
另外，Ri表示下述通式(1)～(6)中的任一项所示的基团。
通式(1)：
[化9]
式中，
R1a以及R1b相同或相异，表示氢、C1～5的直链或分支链状的烷基；R1c以及R1d相同或相异，表示氢、羟基或者C1～5的直链或分支链状的烷基。
作为上述C1～5的直链或分支链状的烷基，可示例出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基。通式(1)中优选为甲基。
在通式(1)中，优选地，R1a为氢或甲基；R1b为氢、甲基或异丙基；R1c为氢、羟基或甲基；R1d为氢或甲基，作为具体的化合物，可示例出普伐他汀(pravastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、美伐他汀(mevastatin)。
通式(2)：
[化10]
式中，
R2a为卤代苯基，
R2b为C1～5的直链或分支链状的烷基。
作为R2a所示的卤代苯基，为被相同或不同的卤原子取代的苯基。作为卤原子，可举出氟、氯、溴等，优选为氟。另外，卤原子的取代数为1以上，优选为1。作为被卤原子取代的碳的位置为2～6位的任意位置，优选为2～5位的任意位置，更优选为4位。作为卤代苯基，优选为2-氟苯基、4-氟苯基等，更优选为4-氟苯基。
R2b所示的、C1～5的直链或分支链状的烷基如上述通式(1)中定义，优选为异丙基。
在通式(2)中，优选地，R2a为4-氟苯基，R2b为异丙基。作为这样的具体的化合物，可示例出氟伐他汀(fluvastatin)。
通式(3)：
[化11]
式中，
R3a为卤代苯基，
R3b为C3～5的环烷基。
作为R3a所示的卤代苯基，如上述通式(2)中定义，优选为4-氟苯基。
作为R3b所示的、C3～5的环烷基，可举出环丙基、环丁基，优选为环丙基。
在通式(3)中，优选地，R3a为4-氟苯基，R3b为环丙基。作为这样的具体的化合物，可示例出匹伐他汀(pitavastatin)。
通式(4)：
[化12]
式中，
R4a为卤代苯基，
R4b以及R4c相同或相异，为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R4d为C1～4的烷基磺酰基。
作为R4a所示的卤代苯基如上述通式(2)中定义，优选为4-氟苯基。
R4b或R4c所示的、C1～5的直链或分支链状的烷基如上述通式(1)中定义，优选为甲基或异丙基。
作为R4d所示的、C1～6的烷基磺酰基，可举出甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、异丙基磺酰基、丁基磺酰基、异丁基磺酰基、仲丁基磺酰基、叔丁基磺酰基等，优选为甲基磺酰基。
在通式(4)中，优选地，R4a为4-氟苯基，R4b为异丙基，R4c为甲基，R4d为甲基磺酰基。作为这样的具体的化合物，可示例出瑞舒伐他汀(rosvastatin)。
通式(5)：
[化13]
式中，
R5a为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R5b、R5c以及R5d相同或相异，为苯基或卤代苯基。
R5a所示的C1～5的直链或分支链状的烷基如上述通式(1)中定义，优选为异丙基。
R5b、R5c以及R5d所示的苯基或卤代苯基中，作为卤代苯基，如上述通式(2)中定义，优选为4-氟苯基。在通式(5)中，作为R5b以及R5c优选为苯基，作为R5d优选为4-氟苯基。
在通式(5)中，优选地，R5a为异丙基；R5b以及R5c为苯基；R5d为4-氟苯基。作为这样的具体的化合物，可举出阿托伐他汀(atorvastatin)。
通式(6)：
[化14]
式中，
R6a以及R6d相同或相异，为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R6b为C1～5的烷氧基，
R6c为卤代苯基。
R6a以及R6d所示的C1～5的直链或分支链状的烷基如上述通式(1)中定义，优选为异丙基。
作为R6b所示的C1～5的烷氧基，可举出甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、异丙氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基等，优选为乙氧基。
作为R6c所示的卤代苯基，如上述通式(2)中定义，优选为4-氟苯基。
在通式(6)中，优选地，R6a以及R6d均为异丙基，R6b为乙氧基，R6c为4-氟苯基。作为这样的具体的化合物，可示例出西立伐他汀(Cerivastatin)。
这些的他汀依照物理化学特性以及药物动力学特性，可分为疏水性或亲水性这两种类型。作为疏水性他汀，具体地可示例出辛伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀等。另外，作为亲水性他汀，具体地可示例出洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀等。在本发明中可以使用亲水性或疏水性中的任一种他汀。
在将根据本发明制备的细胞制剂用于人体的情况下，特别适宜使用已经作为高脂血症治疗剂市售、从毒性的观点已经确认了安全性的辛伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀等，优选为辛伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀，更优选为辛伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀。另外，其中可示例出辛伐他汀作为进一步优选的他汀。
上述通式所示的化合物可以药学上可接受的盐的形态使用，也可以水合物的形态使用。或者，还可以上述通式所示的化合物的衍生物的形态使用。
作为“药学上可接受的盐”，在不损害本发明的効果的情况下并无特别限定，可适宜选择，例如包括钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵等的碱金属盐、碱土金属盐、铵盐等。此外，上述盐还可包括利用上述通式所示的化合物与适当的有机酸或无机酸的反应而得到的酸加成盐。作为酸加成盐，例如可示例出盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、草酸盐、硼酸盐、乳酸盐、磷酸盐，柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磺酸盐、乙醇酸盐、抗坏血酸盐、苯磺酸盐等。这些盐可通过本领域周知的方法制备。这些盐中，能够适宜地示例出碱金属盐、碱土金属盐，作为更优选的盐可示例出钠盐、钙盐。
另外，“衍生物”包括在维持上述通式所示的基本骨架的同时、变更了取代基的位置的物质，某分子被取代为其他分子后的物质，附加了特定的取代基后的物质，去除了特定的取代基后的物质等。在本发明中能够使用的衍生物只要是对iPS细胞起作用的物质则没有特别限定，例如优选为内酯、酯。
在本发明中，这些他汀可单独使用1种，也可2种类以上并用。
[分化诱导剂]
使iPS细胞分化诱导为分化细胞的分化诱导剂为公知，在本发明中，可随着目标分化细胞适宜地选择使用分化诱导剂。
例如，作为向成骨细胞的分化诱导剂，可举出抗坏血酸、β-甘油磷酸、地塞米松、BMP-2、氢化可的松琥珀酸酯、视黄酸等；作为向神经细胞的分化诱导剂，可举出NGF(神经生长因子、Nerve growth factor)、Brain Derived Nervegrowth Factor(脑源性神经生长因子、BDNF)，视黄酸等；作为向肝细胞的分化诱导剂，可举出六氯酚、槲皮素、离子霉素等；作为向脂肪细胞的分化诱导剂，可举出异硫氰酸烯丙酯、肉桂醛、Icilin(Icilin的日语原文为“アイシリン”)等；作为向心肌细胞的分化诱导剂，可举出BMP-4、BMP-5、FGF-10、环孢菌素A、抗坏血酸等；作为向上皮细胞的分化诱导剂，可举出ASK1(apotosis signal-regulatingkinase1)等；作为向视网膜色素上皮细胞的分化诱导剂，可举出视黄酸、牛磺酸等。需要说明的是，在向成骨细胞的分化诱导剂中，抗坏血酸可为抗坏血酸-2-磷酸或其盐。另外，在向成骨细胞的分化诱导剂中，代替地塞米松，还可使用氢化可的松琥珀酸酯。向这些各种分化细胞的分化中使用的分化诱导剂可使用单独1种，也可组合2种以上使用。
作为本发明中使用的分化诱导剂的适宜的一个例子，可举出向成骨细胞的分化诱导剂，尤其可举出含有抗坏血酸、β-甘油磷酸以及地塞米松的向成骨细胞分化的分化诱导剂。
[iPS细胞]
“iPS细胞”是指也被称为人工多功能性干细胞或者诱导多功能性干细胞的获得了分化多能性的细胞，其通过向体细胞(例如，成纤维细胞等)导入赋予分化多能性的数种类的转录因子(以下，称为“初始化因子”)，获得了与ES细胞同等的分化多能性。
初始化因子
作为在iPS细胞的建立中使用的初始化因子，已知有各种各样的种类，还存在大量它们的组合。在本发明中，只要能够建立iPS细胞，则可使用任意的现有公知的初始化因子，没有特别限定。另外，还可采用今后发现的初始化因子以及初始化因子的组合。
作为初始化因子，具体可举出Oct3/4、Oct1A、Oct6、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Lin28b、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18、Fbx15、Nanog、Eras、ECAT15-2、TclI、β-catenin、TERT、SV40Large T antigen(SV40LT)、HPV16E6、HPV16E7、Bmil、Lin28、Lin28b、Esrrb等，可从它们中选择1种以上使用。
作为初始化因子的组合的例子，可从现有公知的组合适宜地选择使用，例如可举出(1)Oct3/4、Klf4、c-Myc；(2)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2；(3)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Fbx15、Nanog、Eras、ECAT15-2、TclI、β-catenin；(4)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、SV40LT；(5)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16E6；(6)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16E7；(7)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV6E6、HPV16E7；(8)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、Bmil；(9)Oct3/4、Klf4、Sox2；(10)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28；(11)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT；(12)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28；(13)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40LT；(14)Oct3/4、Klf4；(15)Oct3/4、c-Myc；(16)Oct3/4、Sox2；(17)Oct3/4、Sox2、Nanog；(18)Oct3/4、Sox2、Lin28；(19)Oct3/4、Sox2、c-Myc、Esrrb；(20)Oct3/4、Sox2、Esrrb；(21)Oct3/4、Klf4、L-Myc；(22)Oct3/4、Nanog；(23)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT；(24)Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28等。需要说明的是，在上述初始化因子的组合中，Sox2可以Sox1、Sox3、Sox15、Sox17或Sox18取代，Klf4可以Klf1、Klf2或Klf5取代，c-Myc可以N-Myc或L-Myc取代，Esrrb可以Esrrg取代。在这些初始化因子的组合中，优选为上述(2)、(9)、(24)的组合。
通过将上述初始化因子以编码的基因、mRNA、蛋白质的任意形态导入体细胞，能够进行体细胞的初始化。编码各初始化因子的基因的cDNA序列信息分别可从NCBI等的公知的数据库取得，依照现有公知的方法，能分离所期的配列的cDNA。
对于上述初始化因子而言，除了野生型基因或其基因产物以外，还可为其基因产物的氨基酸序列中的数个(例如，1～10个，优选为1～6个，更优选为1～4个，进一步优选为1～3个，特别优选为1或2个)的氨基酸被取代、缺失、和/或插入、并且具有与野生型的基因产物同等的机能的变异基因产物，或者编码该变异基因产物的变异基因。例如，可举出c-Myc的T58A活性型变异体、β-catenin的S33Y等变异基因产物，编码它们的变异基因。
体细胞
在本发明中，作为用于制作iPS细胞的起始材料能够使用的体细胞可为源自哺乳动物(例如，小鼠或人)的生殖细胞以外的任何细胞。这样的用于制作iPS细胞的体细胞可从例如皮肤、粘膜、肌肉、神经等任何组织中得到。另外，从这些组织得到的细胞的分化的程度没有特别限制，也可以使用包括体性干细胞的未分化的前驱细胞等。在此，作为未分化的前驱细胞，可举出神经干细胞、造血干细胞、间叶系干细胞(源自骨髄、脂肪、牙髄、牙周组织等的间叶系干细胞)。
虽然这些细胞可源自任何的组织或脏器，但在使用源自口腔粘膜的细胞的情况下，iPS细胞的建立効率得到飞跃性提高，因此优选为口腔粘膜的成纤维细胞、口腔粘膜的上皮细胞等，更具体而言，优选为牙龈成纤维细胞以及牙龈上皮细胞，进一步优选为牙龈成纤维细胞。源自口腔粘膜的细胞不仅能够高効率地建立iPS细胞，而且传代培养后的iPS细胞的建立効率也不发生降低，具有便利性优良、向临床的实用性非常高的优点。
在得到的iPS细胞被用于人的再生医疗用途的情况下，从不发生免疫排斥的观点出发，特别优选从患者本人或HLA型相同的他人採取体细胞。
初始化因子的导入
向上述体细胞导入初始化因子，可使用编码初始化因子的基因(核酸分子)或基因产物(蛋白质)中的任一种，从提高iPS细胞的建立効率的观点出发，优选为基因。初始化因子的导入可通过向细胞的转染中通常使用的公知方法进行实施。
如果为使用编码初始化因子的基因的情况，可通过包含编码初始化因子的基因的表达载体导入细胞。例如，在作为表达载体使用病毒载体的情况下，将包含编码初始化因子的基因的质粒，导入适当的包装细胞(例如，Plat-E细胞等)、互补细胞株(例如，293细胞等)，回收培养上清中产生的病毒载体，通过适于各病毒载体的适宜的方法，使该载体感染细胞。作为病毒载体，可以使用腺病毒、逆转录病毒等。
另一方面，在作为表达载体使用质粒载体、附加型载体等的非病毒载体的情况下，可以使用脂质体转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沈淀法、DEAE葡聚糖法、微注射法、基因枪法等，将该载体导入细胞。
上述初始化因子为基因产物(蛋白质)时的向体细胞的导入可依照现有公知的方法进行，例如可举出使用蛋白质导入试剂的方法、使用蛋白质转导结构域(PTD)融合蛋白质的方法、微注射法等。另外，还可使用将初始化因子(蛋白质)与聚精氨酸、CPPs一起导入的方法。
为了提高iPS细胞的建立効率，除了上述初始化因子以外，还可使用丙戊酸(VPA)、曲古抑菌素A、丁酸钠、辛二酞苯胺异羟肟酸等的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂；5'-氮胞苷等的DNA甲基转移酶抑制剂；BIX-01294等的G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂等的低分子化合物。
培养方法
作为起始材料的体细胞在初始化之前，可随细胞的种类以公知的培养基进行前培养。作为这样的培养基，例如可举出含有约5～20％的胎牛血清的最小必需培养基(MEM)、Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等，但并不限于此。
使细胞接触初始化因子(以及上述提高iPS细胞的建立効率的低分子化合物)后，可以在适于ES细胞的培养的条件下进行培养。例如，在小鼠细胞的情况下，可在上述示例的前培养的培养基中添加白血病抑制因子(LIF)作为分化抑制因子进行培养。另一方面，在人细胞的情况下，代替LIF优选添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)等。通常，初始化后的细胞在作为饲养细胞的，以放射线、抗生素进行处理使细胞分裂停止了的源自小鼠胚胎的成纤维细胞(MEF)的共存下进行培养，但也可在无饲养细胞的状态进行培养。
所建立的iPS细胞的选择可依照现有公知的方法实施，例如可举出使用向分化多能性细胞中特异性高表达的基因(例如，Fbx15、Nanog、Oct3/4等，优选为Nanog或Oct3/4)的基因座打靶了耐药性基因及/或报告基因的重组体细胞，选择耐药性及/或报告活性阳性的集落的方法；以基于目视的形态观察进行选择的方法(例如，参见Takahashi et al.,Cell,131,861-872(2007))等。
未分化以及多功能性的确认
优选地对通过上述方法得到的iPS细胞具有未分化的性质，以及为多功能性进行确认。在本说明书中，“iPS细胞具有未分化的性质”或者“多功能性”是指iPS细胞未分化为任何特定细胞的状态，这种iPS细胞在生物体内具有肿瘤化(形成畸形瘤)风险。在此，如后述的关于确认iPS细胞的多功能性的方法而记载的那样，肿瘤化是指向模型动物(SCID小鼠等)移植iPS细胞，形成畸形瘤等的肿瘤的现象。在形成畸形瘤时，确认到在畸形瘤内形成了源自三胚层的细胞集团(组织)。
确认得到的iPS细胞为未分化的方法没有特别限定，可举出以现有公知的未分化标记(例如，内源性的碱性磷酸酶、Oct3/4、Sox2、Nanog、Eras、Esg1等)等作为指标，检测其mRNA的方法。另外，也可将这些指标利用免疫化学的方法(例如，免疫染色法、Western blot法、ELISA法等)进行确认。
另外，虽然对于所得的iPS细胞的多向分化能力的确认方法没有特别限定，但例如可举出向免疫缺陷模型动物(SCID小鼠等)移植iPS细胞，确认有无畸形瘤形成的方法。只要确认到畸形瘤内形成了源自三胚层的细胞集团(组织)，则可判断得到的iPS细胞具有多向分化能力。
在从iPS细胞分化诱导至目标分化细胞，并将其移植的情况下，可采用在进行分化诱导前预先形成iPS细胞的集合体，再分化诱导为目标细胞进行移植的方法。作为形成iPS细胞的集合体的方法，例如可举出依照Sasaki等：Tissue Eng Part A,16(8):2497-504,2010中记载的方法，制备直径0.5～2mm左右的具有凹部的温敏性聚合物poly N-isopropylacrylamide(pNIPAAm)凝胶，在其凹部接种iPS细胞获得所期的尺寸的iPS细胞的集合体的方法。通过利用iPS细胞的集合体进行分化诱导，可不依赖于支架(细胞培养基材)，以被调节为所期的尺寸的细胞的集合体进行移植，因此便利性良好，能够高効率地进行目标组织的再生的可能性高。
[向目标分化细胞的iPS细胞的分化]
通过使用他汀和分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞，可得到在移植处的肿瘤化被抑制的分化细胞。
在本发明的分化诱导方法中，为了从iPS细胞得到肿瘤化被抑制的分化细胞，可使他汀和分化诱导剂依次或同时与iPS细胞接触进行培养。具体可举出，(1)在含他汀和分化诱导剂的培养基中培养iPS细胞，使之分化为目标分化细胞的；或者(2)以含他汀的培养基培养iPS细胞，将所得的iPS细胞以含有分化诱导剂的培养基进行培养，使之分化为目标分化细胞的方法等。从更高效地获得肿瘤化被抑制了的分化细胞的观点出发，优选前者的(1)的方法。
作为使iPS细胞与他汀接触时的他汀浓度(即，培养基中的他汀浓度)，只要为肿瘤化抑制被充分进行的浓度则没有特别限定，但通常为10-2～102μM，优选为0.01～10μM，更优选为0.1～10μM，进一步优选为0.5～10μM，进一步优选为1～10μM，进一步优选为1～5μM。例如，在使iPS细胞向成骨细胞分化诱导为目的的情况下，通过在上述浓度范围使用他汀，能够在高効率地诱导向成骨细胞的分化的同时，更高效地抑制将所得的成骨细胞移植时的肿瘤化。
关于使iPS细胞与分化诱导剂接触时的分化诱导剂的浓度(即，培养基中的分化诱导剂浓度)，可随使用的分化诱导剂的种类、目标分化细胞的种类等而适宜设定。例如，当使用向成骨细胞的分化诱导剂时，通常为10-3～106μM，优选为10-2～105μM，更优选为10-2～104μM。更具体而言，在组合使用抗坏血酸、β-甘油磷酸以及地塞米松作为向成骨细胞的分化诱导剂的情况下，可举出抗坏血酸1～103μM，β-甘油磷酸103～106μM，地塞米松10-3～1μM。
在同时接触他汀和分化诱导剂、使iPS细胞分化的情况下，可使用含有前述浓度的他汀和分化诱导剂的培养基，进行iPS细胞的培养。另外，在依次接触他汀和分化诱导剂、使iPS细胞分化的情况下，可在使用含有前述浓度的他汀的培养基培养iPS细胞后，再替换为含有前述浓度的分化诱导剂的培养基进行培养。
对于依次或同时接触他汀和分化诱导剂进行培养时的iPS细胞的浓度没有特别限制，通常为1×105～1×107个/mL，优选为1×106～5×106个/mL，更优选为4×106个/mL。
对于分别或同时添加有他汀和分化诱导剂的培养基而言，只要iPS细胞可以生长则没有特别限制，但例如可举出含有10％胎牛血清、100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素、250ng/ml两性霉素β的Minimum Essential Medium Eagle，Alpha Modification(α-MEM培养基)。
对于使iPS细胞分化为目标分化细胞的培养条件而言，可随目标分化细胞的种类等而适宜设定。例如，在使他汀和分化诱导剂同时与iPS细胞接触进行培养时，可使用同时含有他汀和分化诱导剂的培养基，对iPS细胞进行1～50天左右，优选为10～30天左右培养。另外，例如，在使他汀和分化诱导剂依次与iPS细胞接触进行培养时，可在使用含有他汀的培养基对iPS细胞进行1～20天左右，优选为3～10天左右培养后，在使用含有分化诱导剂的培养基进行1～50天左右，优选为10～30天左右培养。
特别是，作为使iPS细胞分化诱导为成骨细胞时的适宜的例子，可举出将iPS细胞在含有成骨细胞诱导剂以及他汀的培养基中培养10～50天左右，优选为15～50天左右，更优选为15～40天左右，进一步优选为20～30天左右的条件。
需要说明的是，在使他汀和分化诱导剂依次或同时与iPS细胞接触而进行培养时，为了防止iPS细胞向培养皿的附着，可使用起伏型生物反应器等，一边摇晃培养皿一边进行培养。
这样通过使用他汀和分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞，可以得到移植处的肿瘤化被抑制了的分化细胞。
关于得到了目标分化细胞的情况，可基于细胞形态、各分化细胞的表面标记等进行确认。例如，在目标分化细胞为成骨细胞的情况下，可以如下情况为指标进行确认：碱性磷酸酶(ALP)活性为阳性；利用冯-科萨(von·Kossa)染色或茜素红染色观察到细胞外基质的石灰化；利用RT-PCR分析等观察成骨细胞特异性基因(collagen1、osteocalcin、BSP、osterix等)的表达。另外，通过在移植成骨细胞后，利用活组织检查(生物体组织诊断)採取移植部位的组织，确认石灰化的骨组织的形成，可进行根据成骨细胞的骨再生的确认。骨组织的形成可依据冯-科萨诊染色、苏木精·伊红(H&E)染色等的现有公知的确认方法进行。
作为能够适用本发明的分化诱导方法的分化细胞，没有特别限制，例如可举出成骨细胞、神经细胞、肝细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、树突细胞等的免疫细胞等。尤其是，本发明的分化诱导方法适宜用于向成骨细胞的分化。
[所得的分化细胞的用途]
根据本发明的分化诱导方法得到的分化细胞可随该分化细胞的种类应用于各种的再生医疗。根据本发明的分化诱导方法得到的分化细胞，由于能够在移植后抑制肿瘤化，在临床领域实用性非常优异。
例如，在分化细胞为成骨细胞的情况下，在以骨再生为目的的整形外科、牙科等的领域的治疗中适宜使用。骨再生包括软骨、牙槽骨、大腿骨等的再生。在牙科领域中，失去牙的患者的下颚骨消瘦，牙科种植治疗、义齿治疗变得困難，但通过将根据本发明的分化诱导方法得到的成骨细胞移植至骨缺损部分，能够再建牙槽骨，使进行种植的埋入等成为可能。所得的成骨细胞的移植方法依照现有公知的方法即可，可根据移植位点的形状、状态进行适宜选择。此时，在目标移植位点可直接移植成骨细胞和/或其集落，但为了提高成骨细胞的在移植位点的存活率，例如可举出在混合本发明的分化诱导方法所得的成骨细胞和纤维蛋白原之后，添加凝血酶使之凝胶化，将其移植至需要骨再生的位点的方法。另外，作为移植成骨细胞的方法，还可举出将成骨细胞混合至以羟基磷灰石、β-TCP(β-磷酸三钙)构成的骨修复材料等进行移植的方法。
2.含有肿瘤化被抑制了的分化细胞的细胞制剂的制备方法
本发明提供一种含有肿瘤化被抑制了的分化细胞的细胞制剂的制备方法，所述方法包括以下工序：使用他汀以及分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞的工序；以及使用在前述工序中得到的分化细胞，制备细胞制剂的工序。
在本制备方法中，对于使iPS细胞分化为目标分化细胞的工序而言，与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中记载的相同。另外，在本制备方法中，制备细胞制剂的工序，通过回收从iPS细胞分化后的目标分化细胞，作为细胞制剂进行制备而进行。分化细胞的回收方法没有特别限定，使用胰蛋白酶等酶的方法、基于离心分离的方法等，可从现有公知的方法适宜选择地进行。
根据本发明的方法制备的细胞制剂可为肿瘤化被抑制了的分化细胞其本身，但在不损害细胞的组织再生能力以及自我增殖能力的范围内，可为分化细胞悬浊在任意地添加了白蛋白等蛋白质、其他的添加剂的培养基、等渗液、PBS(磷酸缓冲溶液)等中的状态的制剂。另外，还可将这样制备的分化细胞装入小瓶等容器中，来作为细胞制剂。另外，关于根据本发明的方法制备的细胞制剂的用途与上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”记载的相同。
根据本发明的细胞制剂的制备方法，得到了含有肿瘤化被抑制了的分化细胞的细胞制剂。这样操作得到的细胞制剂可以根据该分化细胞的种类应用于各种的再生医疗。作为本发明的细胞制剂的制备方法的一个实施方式，可举出通过将iPS细胞在他汀和向成骨细胞分化诱导的分化诱导剂的存在下进行培养而使之分化为成骨细胞，将其作为细胞制剂进行制备的方法。而且，这样操作得到的细胞制剂能够作为骨再生剂使用。
3.在使iPS细胞分化为分化细胞时抑制肿瘤化的方法
本发明提供一种在使iPS细胞分化为分化细胞时抑制肿瘤化的方法，所述方法包含以下工序：使用他汀以及上述分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞的工序。关于在该肿瘤化抑制方法中所采用的iPS细胞、他汀、分化诱导剂、使iPS细胞分化为目标分化细胞时的条件等，与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中记载的相同。
4.iPS细胞的肿瘤化抑制方法
此外，本发明提供一种抑制iPS细胞的肿瘤化的方法，所述方法包括在他汀的存在下培养iPS细胞的工序。根据本肿瘤化抑制方法，能够向iPS细胞本身赋予肿瘤化抑制効果。该肿瘤化抑制方法通过在含有他汀的培养基中培养iPS细胞而进行。在该肿瘤化抑制方法中，关于所使用的iPS细胞、他汀、含有他汀的培养基中的培养条件等，与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中记载的相同。
5.用于从iPS细胞获得肿瘤化被抑制了的分化细胞的培养基
本发明提供一种培养基，所述培养基含有他汀和上述分化诱导剂，且用于从iPS细胞获得肿瘤化被抑制了的分化细胞。该培养基适宜用于从iPS细胞获得肿瘤化被抑制了的分化细胞。另外，本发明还提供他汀在培养基的制造中的用途，所述培养基为用于从iPS细胞获得肿瘤化被抑制了的分化细胞的培养基。该培养基的种类、培养基中所含的他汀以及分化诱导剂等与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中记载的相同。
6.iPS细胞的肿瘤化抑制剂
本发明提供一种iPS细胞的肿瘤化抑制剂，其含有他汀作为有効成分。通过在培养iPS细胞时将该肿瘤化抑制剂添加至培养基中，能够得到肿瘤化被抑制了的iPS细胞。
另外，通过在使该肿瘤化抑制剂与规定的分化诱导剂共存的状态下使iPS细胞分化诱导为所期的细胞，能够得到移植后的肿瘤化被抑制了的分化细胞。关于该肿瘤化抑制剂的使用方法等，与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中的他汀的使用方法等相同。此外，本发明提供他汀在iPS细胞的肿瘤化抑制剂的制造中的用途。在此，关于他汀、他汀的浓度等，与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中记载的相同。
7.肿瘤化被抑制了的iPS细胞
此外，本发明提供一种肿瘤化被抑制了的iPS细胞，所述细胞通过将iPS细胞在他汀的存在下进行培养而获得。关于为了得到肿瘤化被抑制了的iPS细胞的培养条件等，与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中记载的相同。
8.组织再生方法
此外，本发明提供包含下述工序的组织再生方法。
(i)使用他汀、以及使iPS细胞分化为目标分化细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为目标分化细胞的工序，
(ii)使用在前述工序中得到的分化细胞，制备细胞制剂的工序，以及
(iii)将前述工序(ii)中得到的细胞制剂向需要组织再生的患者给药的工序。
本发明的组织再生方法中使用的iPS细胞、他汀、他汀的浓度、培养条件等，与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”等中记载的相同。在工序(iii)中，将治疗的有効量的细胞制剂向需要组织再生的患者给药。给药形态没有特别限定，可根据期待再生的组织的种类、位置、范围、患者的年龄等从现有公知的方法中适宜选择。例如可举出，将分化细胞的集合体移植至期待再生的部位的方法，将分化细胞作为细胞悬浊液注入至期待再生的部位的方法，与成为载体的生物体材料混合、向期待再生的部位注入的方法。
9.其他
在本发明中他汀用于抑制iPS细胞的肿瘤化。即，本发明还提供用于抑制iPS细胞的肿瘤化的他汀的使用。对于他汀的使用而言，iPS细胞、他汀、他汀的浓度等与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中记载的相同。
虽然不为本发明的限定的解释，因为推测在分化诱导iPS细胞时他汀选择性地对未分化细胞诱导细胞凋亡，所以本发明还提供一种以他汀作为有効成分的细胞凋亡诱导剂，其用于在分化诱导iPS细胞时，对于未分化细胞诱导细胞凋亡。在细胞凋亡诱导剂中，他汀、他汀的浓度等与在上述“1.iPS细胞的分化诱导方法”中记载的相同。
实施例
以下，示出实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不受这些实施例的限定。
试验例1.小鼠iPS细胞的制备以及向成骨细胞的分化
(1)小鼠iPS细胞的制作
使从10周龄的雄性C57BL/6J小鼠採取的上腭粘膜组织片(0.5cm方形)紧贴在0.1％明胶涂布处理后的组织培养板上放置，加入MF-start培养基(Toyobo)，在5％CO2的存在下，37℃下静置。在目视下能确认成纤维细胞从组织片充分游走·增殖的时刻，进行1次传代培养，将培养基更换为FP培养基〔含有10％胎牛血清(Sigma)、50units/ml青霉素、50μg/ml链霉素(invitrogen)的Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM培养基，不含有丙酮酸钠：Nacalai Tesque)〕，持续7天～14天培养。
使用该成纤维细胞，依据Egusa等人的报道〔PLoS ONE,5(9):e12743,2010〕建立了iPS细胞株。在初始化诱导中，使用了插入有Oct3/4，Sox2以及Klf4基因的逆转录病毒载体(pMXs-IRES-puro：Addgene)以及Platinum-E包装细胞的体系〔Takahashi等人：NatProtoc,2(12):3081-9,2007〕。所建立的iPS细胞株使用ES培养基〔含有15％胎牛血清(invitrogen)、2mM L-Glutamine(invitrogen)、1×10-4M非必需氨基酸(invitrogen)、1×10-4M 2-巯基乙醇(invitrogen)、50U青霉素、50μg/ml链霉素(invitrogen)的DMEM培养基(Nacalai Tesque)〕，在以丝裂霉素C处理后的SNLP76.7-4饲养细胞上一边进行18～20次传代，一边进行维持·培养。在此，iPS细胞已经建立的确认依据Egusa等人：PLoS ONE,5(9):e12743,2010中记载的方法进行。
(2)小鼠iPS细胞聚集体的制作
在iPS细胞聚集体的制作中，使用了温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)(polyN-isopropylacrylamide)(pNIPAAm)凝胶的细胞容器〔Sasaki等人：Tissue Eng Part A,16(8):2497-504,2010〕。在制作容器时，使用了三维建模软件(Free Form,Sensable,MA)以及三维打印体系(Eden,Objet,Israel)，制作了表面具有直径1.5mm的凸部的模型。
然后，在将使用己烷精制的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)(和光纯药)溶解在超纯水而制备的7mmol/l的NIPAAm溶液，以及作为交联剂的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(Sigma)的混合溶液中，添加作为聚合引发剂的过硫酸铵(APS)(最终浓度1.6mg/ml：Nacalai Tesque公司)以及N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)(最终浓度1μl/ml：Nacalai Tesque公司)，灌入所制作的模型中。通过将其在4℃下静置8小时，得到在表面具有直径1.5mm的凹部的pNIPAAm凝胶的细胞容器。将该凝胶依次用超纯水，70％乙醇以及磷酸缓冲生理食盐水(PBS)洗涤，在4℃下保管至接种iPS细胞为止。
另一方面，将在组织培养六孔板(0.1％明胶涂布处理)上以约0.5×105～0.5×106个/ml的浓度接种后的小鼠iPS细胞(18～20次传代培养后的细胞)通过0.25％胰蛋白酶处理进行回收。将该小鼠iPS细胞悬浊液(约1×104～1×105个/ml)移至含有ES培养基的10cm低粘接性培养皿，再进行2天浮游培养。在培养第3天，以离心操作(300rpm，2分钟)回收iPS细胞，使用含有1μM视黄酸(all-transretinoic acid：Sigma)的ES培养基，接种至低粘接性培养皿上(1×104～1×105个/ml)。再进行2天的浮游培养后，将利用离心操作(同上)回收的4×106个的iPS细胞悬浮至ES培养基(0.1～10ml)，接种至所准备的pNIPAAm凝胶的凹部。通过再进行2天培养，诱导iPS细胞的集聚后，通过使周围温度低至25℃，使凝胶膨胀，获得球状的三维细胞聚集体。
(3)小鼠iPS细胞聚集体向成骨细胞的分化诱导
将所制作的iPS细胞聚集体接种至含有添加了他汀(1μM辛伐他汀：Sigma公司制)的成骨细胞分化诱导培养基〔含有10％胎牛血清(invitrogen)、0.1μM地塞米松(Sigma)、10mMβ-甘油磷酸(Sigma)以及50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸(Sigma)、100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素、250ng/ml两性霉素B(invitrogen)的Minimum Essential Medium Eagle，Alpha Modification(α-MEM培养基：Nacalai Tesque)〕的60mm组织培养皿上，为了防止向培养皿的附着，在起伏型生物反应器(30°倾斜，周期0.5Hz，振幅12.5mm)上一边摇动，一边在37℃，5％CO2的存在下培养20天、30天、40天或50天，得到分化诱导为成骨细胞的iPS细胞聚集体。另外，作为对照，用不含有他汀的成骨细胞分化诱导培养基培养iPS细胞聚集体。
(4)小鼠iPS细胞聚集体的肿瘤形成
将分化诱导为成骨细胞的10个iPS细胞聚集体与20mg/ml纤维蛋白原溶液(Sigma)(0.05～1ml)混合，在加入同量的12.5U/ml凝血酶溶液(Sigma)后，在5％CO2存在下，37℃下静置30分钟，诱导了凝胶化。
对5周龄的雄性的免疫缺陷小鼠(C.B-17SCID：CLEA Japan)实施二乙醚吸入的麻醉，将所制作的含有iPS细胞聚集体的纤维蛋白凝胶移植至背部皮下。然后，在小鼠未感染特定病原体的条件下，以饮水以及摄食为自由的状态下进行了饲养。
在移植28天后摘出移植片，通过其尺寸评价肿瘤形成。结果在图1以及2中示出。另外，将移植片用10％中性缓冲福尔马林溶液浸渍固定后进行脱钙，从石蜡包埋后的样品中制作3μm厚的切片。对切片样品实施苏木精以及伊红(H&E)染色或亚甲蓝&冯-科萨染色，进行组织学的观察。H&E染色的结果在图3(分化诱导期间30天)以及图4(分化诱导期间20、30、40或50天)中示出，亚甲蓝&冯-科萨染色的结果在图5(分化诱导期间30、40或50天)中示出。
另外，将iPS细胞聚集体在辛伐他汀(1μM)的存在下进行30天分化诱导得到成骨细胞，将其移植至小鼠背部皮下。採取从移植开始3个月或6个月后摘出的移植体，通过与上述同样的方法进行石蜡包埋，制作了3μm厚的组织切片。对这样获得的组织切片进行H&E染色，进行组织学的观察。结果在图6中示出。
(5)结果
iPS细胞的移植所惹起的肿瘤的形成
在上述“(4)小鼠iPS细胞聚集体的肿瘤形成”中记载的方法中，代替将iPS细胞分化诱导为成骨细胞所得的细胞，将上述(2)中获得的iPS细胞聚集体(即，未进行向成骨细胞的分化诱导的iPS细胞聚集体)移植至小鼠，在移植28天后为了评价肿瘤形成进行了组织学的观察。未进行向成骨细胞的分化诱导而移植的细胞，在移植28天后在移植片的周围形成了明显的肿瘤(图1A)。组织学的观察的结果显示，在该肿瘤内含有各种各样的外胚层系组织(表皮组织、神经组织)，中胚层系组织(软骨组织)，内胚层系组织(肠道上皮组织)(图1B)，该肿瘤为源自移植时未分化的iPS细胞的畸形瘤。
另外，在上述(3)中，在将iPS细胞在不含辛伐他汀的成骨细胞分化诱导培养基中进行20天、30天、40天或50天分化诱导后进行移植的情况下，也观察到同样的肿瘤的形成(图1C)。
在将由iPS细胞向成骨细胞的分化诱导进行了50天的细胞进行移植的情况下，移植片周边观察到骨组织的形成(图1D)，显示出肿瘤的尺寸变小的倾向(图1C)。但是，显示出即使在分化诱导进行了50天的情况下也不能避免肿瘤的形成。
根据辛伐他汀的源自iPS细胞的肿瘤形成的抑制
将小鼠iPS细胞在含有辛伐他汀的成骨细胞分化诱导培养基中进行30天、40天或50天分化诱导后进行移植，饲养28天，结果完全没观察到由于细胞移植片导致的肿瘤形成(图2中以+表示)。另一方面，仅用成骨细胞分化诱导培养基(未添加辛伐他汀)进行分化诱导后的细胞移植片显示出明显的肿瘤形成(图2中以－表示)。
利用H&E染色的组织学的观察结果，在仅用成骨细胞分化诱导培养基分化诱导后的细胞移植片的周围，观察到畸形瘤所特有的各种各样的组织图像(图3A的*号周边)，在含有辛伐他汀的成骨细胞分化诱导培养基中分化诱导的情况下，在移植片的周围仅观察到骨样硬组织的形成以及纤维性的未成熟骨(图3B的*号周边)。另外，如图4所示，在分化诱导期间为20天的移植体周围观察到纤维性的未成熟骨(*号)的形成。进而，在分化诱导期间为30、40、50天的移植体周围，观察到成熟的骨组织的形成。在任一分化诱导期间中，均未观察到骨组织以外的组织的存在(肿瘤化)。
进而，利用亚甲蓝&冯-科萨染色的组织学的观察的结果，在30～50天的任一的分化诱导期间的情况下，在移植将iPS细胞分化诱导为成骨细胞而获得的细胞的部位的周边，观察到显示石灰化的骨组织(箭头号)(图5)。另一方面，未观察到骨组织以外的组织的存在(肿瘤化)。
另外，如图6所示，在移植进行了30天分化诱导的骨细胞的情况下，即使在移植后3个月或6个月的任一时期，在移植体(*)周围观察到成熟的骨组织的形成。另一方面，在任一情形下均未观察到骨组织以外的组织的存在(肿瘤化)。
以上的结果显示，与未存在辛伐他汀的情形下分化诱导的成骨细胞相比，在辛伐他汀的存在下使iPS细胞聚集体分化诱导而得的成骨细胞明显地抑制了移植后的肿瘤形成。
试验例2.根据他汀的肿瘤形成抑制効果
依据上述试验例1.(1)以及(2)中记载的方法制备iPS细胞聚集体，在他汀的存在下使用成骨细胞分化诱导培养基进行了向成骨细胞的分化诱导。分化诱导的条件以试验例1.(3)中记载的条件进行，作为他汀使用了疏水性他汀(辛伐他汀或者氟伐他汀)或亲水性他汀(洛伐他汀)(均为1μM：Sigma公司制)。他汀还作为成骨细胞分化诱导促进化合物被知晓，具有将iPS细胞向成骨细胞分化的作用。作为比较对照，使用了在不属于他汀(HMG-CoA还原酶抑制剂)的成骨细胞分化诱导促进化合物(phenamil：非那明1μM)的存在下分化诱导而得到的成骨细胞。
将在他汀或非那明的存在下进行30天分化诱导而获得的成骨细胞移植至小鼠背部皮下(两侧)。在图7中示出结果。图7中，上栏为移植后第28天的小鼠的照片，下栏为摘出的移植体的照片。另外，移植后第28天摘出的移植体中的组织切片的H&E染色图像在图8示出。
如图7所示，虽然疏水性以及亲水性他汀可见肿瘤抑制作用，但非他汀化合物(非那明)的情况下形成了肿瘤。另外，如图8所示，在任一化合物情况下在iPS细胞移植体(*)周围均可见成熟的骨组织的形成。然而，虽然在用疏水性以及亲水性他汀分化诱导后的移植体周围未观察到骨组织以外的组织的存在(肿瘤化)，但在用非他汀化合物(非那明)的请下观察到骨组织以外的组织的形成(畸形瘤)。
如本试验例的结果所示，如非那明这样的其他的成骨细胞分化诱导促进化合物未观察到肿瘤形成的抑制作用。即，显示出肿瘤形成抑制是即便是在成骨细胞分化诱导促进化合物中也为他汀所特有可见的作用。
试验例3.根据辛伐他汀的成骨细胞的分化，以及成骨细胞分化特异性基因的表达
将依照试验例1.(1)中记载的方法得到的小鼠iPS细胞，使用试验例1.(3)中记载的成骨细胞分化诱导培养基，在辛伐他汀(0.1～1000nM)的存在下，向成骨细胞进行了14～28天分化诱导。分化诱导后，使用茜素染色观察了细胞外基质的石灰化。茜素染色依据Pagkalos等人的方法(Pagkalos J.et al.Journal of Bone and Mineral Research,Vol.25,No.11,pp2470？2478)进行。石灰化后的细胞外基质通过阿察林染色被染红。进行了染色的细胞照片在图9中示出。由图9示出，依赖于辛伐他汀的浓度地被染成红色的部分增加，小鼠iPS细胞的向成骨细胞的分化被促进。
另外，将依照试验例1.(1)中记载的方法得到的小鼠iPS细胞，使用试验例1.(3)中记载的成骨细胞分化诱导培养基，在辛伐他汀(0.1～10μM)的存在下进行向成骨细胞的28天分化诱导，用SYBR Green实时RT-PCR法(Thunderbird(注册商标)SYBR(注册商标)qPCRMix，TOYOBO)分析了成骨细胞分化特异性基因(Osterix、Collagen I、Runx2、Osteocalcin)的表达。
用于SYBR Green实时RT-PCR法的引物的碱基序列如下。
Osterix正向引物:5'-CTCGTCTGACTGCCTGCCTAG-3'(序列编号1)
Osterix反向引物:5'-GCGTGGATGCCTGCCTTGTA-3'(序列编号2)
Collagen I正向引物:5'-TGTCCCAACCCCCAAAGAC-3'(序列编号3)
Collagen I反向引物:5'-CCCTCGACTCCTACATCTTCTGA-3'(序列编号4)
Runx2正向引物:5'-CGGGCTACCTGCCATCAC-3'(序列编号5)
Runx2反向引物:5'-GGCCAGAGGCAGAAGTCAGA-3'(序列编号6)
Osteocalcin正向引物:5'-CCGGGAGCAGTGTGAGCTTA-3'(序列编号7)
Osteocalcin反向引物:5'-AGGCGGTCTTCAAGCCATACT-3'(序列编号8)
另外，作为内部标准利用了GAPDH。针对GAPDH的引物的碱基序列如下所示。
GAPDH正向引物:5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'(序列编号9)
GAPDH反向引物:5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'(序列编号10)
各基因的表达量在图10的图表中示出。成骨细胞分化特异性基因的mRNA表达量作为与GAPDH的mRNA的表达量的比例而表示。如图10所示，对于辛伐他汀而言，依赖于浓度地促进这些成骨细胞分化特异性基因的表达。
通过以上的结果显示，辛伐他汀依赖于浓度地促进源自iPS细胞的成骨细胞中的细胞外基质的石灰化，以及成骨细胞分化特异性基因的表达，具有iPS细胞的成骨细胞分化促进作用。
试验例4.根据辛伐他汀的非诱导iPS细胞聚集体的肿瘤形成抑制
In vivo的非诱导iPS细胞的肿瘤形成抑制
将依照试验例1.(1)以及(2)中记载的方法得到的小鼠iPS细胞聚集体，使用存在或不存在辛伐他汀(1μM)的非诱导培养基(ES培养基；组成记载于试验例1.(1)中)，进行了20天培养。将这些iPS细胞聚集体移植至小鼠背部皮下(左侧：不存在辛伐他汀下培养，右侧：存在辛伐他汀下培养)。将移植后第28天的小鼠照片(左图)以及摘出的移植体(右图)照片在图11中示出。
由图11可知，虽然使用非诱导培养基培养的iPS细胞无论辛伐他汀的有无均形成了肿瘤，但通过在存在辛伐他汀下培养使得该肿瘤形成更小。即，显示了辛伐他汀在非分化诱导系中也发挥iPS细胞的肿瘤抑制作用。
根据辛伐他汀的iPS细胞的细胞死亡
为了研究辛伐他汀对于培养iPS细胞的细胞死亡所带来的影响，将依照试验例1.(1)中记载的方法得到的小鼠iPS细胞，在存在或不存在辛伐他汀(1μM)的非诱导培养基(ES培养基)，或者成骨细胞分化诱导培养基中培养10天。每2天进行一次培养基更换，更换时用细胞计数分析装置(Z1D：Beckman Coulter公司)测定培养上清中存在的细胞数量。以各培养上清中的细胞数量为纵轴，以培养天数为横轴表示为图表(参见图12)。
如图12的图表所示，在非诱导培养基(ES培养基)中，iPS细胞保持了比较没有剥離地粘接的状态。另一方面，在以成骨细胞分化诱导培养基进行培养的情况下，或者通过用添加了辛伐他汀的培养基进行培养，显示了粘接的iPS细胞在2天以内剥離，转移至培养上清中的倾向。对于通过向成骨细胞分化诱导培养基中添加辛伐他汀而进行了向成骨细胞分化的iPS细胞而言，在4天后细胞的剥離比其他条件变少。
另外，对培养上清中的细胞的生死状态用台盼蓝染色进行研究的结果，由于确认到在任一条件下90％以上的细胞死亡(图12下栏的照片)，可认为培养上清中的细胞为由于死亡而剥離的细胞。通过这些结果，暗示了辛伐他汀通过对于未分化的iPS细胞(即，具有肿瘤形成能力的万能干细胞)引发细胞死亡而显示肿瘤抑制効果，促进其余iPS细胞的成骨细胞分化的可能性。
未分化iPS细胞中的根据辛伐他汀的细胞凋亡的诱导
将小鼠iPS细胞用存在或不存在辛伐他汀(1μM)的非诱导培养基(ES培养基)或成骨细胞分化诱导培养基培养10天，用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay(Invitrogen公司)研究了细胞的生死状态。LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay依照Egusa等人的报道(Egusa H.et al.,Tissue Eng.2007；13(10):2589-2600.)进行，活细胞染成绿色，死细胞染成红色。染色后的细胞的照片如图13所示。
通过图13观察到在辛伐他汀的存在下，无论分化诱导的有无，在未分化的iPS细胞大量存在的细胞集聚块的中心部位存在较多的死细胞(箭头号)。此结果显示，辛伐他汀通过将具有自我复制能力的未分化iPS细胞(具有肿瘤形成能力的万能干细胞)选择性地导向细胞凋亡，具有肿瘤抑制作用的可能性。
通过以上的试验例1～4的结果可知对于在辛伐他汀以及成骨细胞诱导剂的存在下使iPS细胞分化而得到的成骨细胞而言，移植后的肿瘤化被抑制。即，显示了他汀对由iPS细胞得到的分化细胞的肿瘤形成的抑制有效地起作用。另外，显示出这样的肿瘤形成抑制的効果即便在公知的成骨细胞诱导剂中也为他汀所特有确认的作用。进而，虽然不为本发明的限定性解释，推测辛伐他汀通过将具有自我复制能力的未分化的iPS细胞选择性地导向细胞凋亡而显示肿瘤抑制効果，促进其余的iPS细胞的成骨细胞分化。
序列表自由文档
序列编号1表示Osterix正向引物。
序列编号2表示Osterix反向引物。
序列编号3表示Collagen I正向引物。
序列编号4表示Collagen I反向引物。
序列编号5表示Runx2正向引物。
序列编号6表示Runx2反向引物。
序列编号7表示Osteocalcin正向引物。
序列编号8表示Osteocalcin反向引物。
序列编号9表示GAPDH正向引物。
序列编号10表示GAPDH反向引物。

Claims (10)

1.一种iPS细胞的分化诱导方法，所述方法为抑制肿瘤化、同时分化诱导iPS细胞的方法，所述方法包括以下工序：
使用他汀、以及使iPS细胞分化为成骨细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为成骨细胞的工序。
2.根据权利要求1所述的分化诱导方法，其中，所述他汀为下述通式(A)所示的化合物：
通式(A)：
[化1]
通式(A)中，
羧基可与3位的羟基之间形成环状结构，
Ri表示下述通式(1)～(6)中任一项所示的基团，
通式(1)：
[化2]
通式(1)中，
R1a和R1b相同或相异，为氢、C1～5的直链或分支链状的烷基，
R1c和R1d相同或相异，为氢、羟基或C1～5的直链或分支链状的烷基；
通式(2)：
[化3]
通式(2)中，
R2a为卤代苯基，
R2b为C1～5的直链或分支链状的烷基；
通式(3)：
[化4]
通式(3)中，
R3a为卤代苯基，
R3b为C3～5的环烷基；
通式(4)：
[化5]
通式(4)中，
R4a为卤代苯基，
R4b和R4c相同或相异，为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R4d为C1～4的烷基磺酰基；
通式(5)：
[化6]
通式(5)中，
R5a为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R5b、R5c和R5d相同或相异，为苯基或卤代苯基；
通式(6)：
[化7]
通式(6)中，
R6a和R6d相同或相异，为C1～5的直链或分支链状的烷基，
R6b为C1～5的烷氧基，
R6c为卤代苯基。
3.根据权利要求1所述的分化诱导方法，其中，
所述他汀为选自由辛伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀以及瑞舒伐他汀组成的组中的至少1种。
4.根据权利要求1所述的分化诱导方法，其中，
通过在含有所述他汀和所述分化诱导剂的培养基中培养iPS细胞，使iPS细胞分化为成骨细胞。
5.根据权利要求1所述的分化诱导方法，其中，
通过在以含有所述他汀的培养基培养iPS细胞后，再以含有所述分化诱导剂的培养基进行培养，使iPS细胞分化为成骨细胞。
6.根据权利要求1所述的分化诱导方法，其中，
所述他汀的浓度为0.01～10μM。
7.根据权利要求1所述的分化诱导方法，其中，
所述iPS细胞源自口腔粘膜的上皮细胞或口腔粘膜的成纤维细胞。
8.一种含有肿瘤化被抑制了的成骨细胞的细胞制剂的制备方法，所述方法包括以下工序：
使用他汀、以及使iPS细胞分化为成骨细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为成骨细胞的工序，以及
使用在前述工序中得到的成骨细胞，制备细胞制剂的工序。
9.一种肿瘤化抑制方法，所述方法为在使iPS细胞分化为成骨细胞时抑制肿瘤化的方法，所述方法包含以下工序：
使用他汀、以及使iPS细胞分化为成骨细胞的分化诱导剂，使iPS细胞分化为成骨细胞的工序。
10.他汀在用于使iPS细胞分化为成骨细胞时抑制肿瘤化的肿瘤化抑制剂的制造中的用途。
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