JP6785516B2 - ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から骨芽細胞の製造を目的としたアクチン重合阻害剤による分化誘導技術 - Google Patents
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Description
[1] アクチン重合阻害物質を含む、骨芽細胞分化促准剤。
[2] 骨芽細胞分化が、骨芽細胞分化能を有する幹細胞からの骨芽細胞分化である、[1]に記載の剤。
[3] 骨芽細胞分化能を有する幹細胞が、間葉系幹細胞である、[2]に記載の剤。
[4] 間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞である、[3]に記載の剤。
[5] アクチン重合阻害物質が、ラトランクリンA及び/又はスウィンホリドAである、[1]〜[4]のいずれかに記載の剤。
[6] 骨芽細胞分化能を有する幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養することを含む、骨芽細胞分化誘導方法。
[7] 骨芽細胞分化能を有する幹細胞が、間葉系幹細胞である、[6]に記載の方法。
[8] 間葉系幹細胞が、臍帯由来間葉系幹細胞である、[7]に記載の方法。
[9] 骨分化誘導因子が、骨形成タンパク質である、[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 骨形成タンパク質がBMP−2である、[9]に記載の方法。
[11] アクチン重合阻害物質が、ラトランクリンA及び/又はスウィンホリドAである、[6]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12] 骨分化マーカー遺伝子発現又は骨分化マーカー酵素の活性を測定して骨芽細胞分化能を有する幹細胞の分化状況を確認することを更に含む、[6]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13] 骨分化マーカー遺伝子がALP遺伝子であり、骨分化マーカー酵素がALPである、[12]に記載の方法。
[14] 培養が、5日間以上行われる、[6]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15] 培養開始と同時(0日)、培養開始後1日、2日、3日、4日又は5日に、培地中に骨分化誘導因子を含有させる、[6]〜[14]のいずれかに記載の方法。
[16] 培養開始と同時(0日)、培養開始後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日又は15日に、培地中にアクチン重合阻害物質を含有させる、[6]〜[15]のいずれかに記載の方法。
[17] 骨治療材を製造するための方法である、[6]〜[16]のいずれかに記載の方法。
[18] [1]〜[5]のいずれかに記載の骨芽細胞分化促進剤及び
骨芽細胞分化能を有する幹細胞
を含む、骨治療用キット。
本発明は、アクチン重合阻害物質を含む、骨芽細胞分化促進剤を提供する。
本発明は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養することを含む、骨芽細胞分化誘導方法を提供する。
本発明は、本発明の骨芽細胞分化誘導方法により製造された骨芽細胞を含む、骨治療材を提供する。また、本発明の骨芽細胞分化誘導方法は、骨治療材を製造するための方法であり得る。
本発明は、骨芽細胞分化能を有する幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養し、得られた骨芽細胞を骨欠損部位に移植することを含む、骨再生治療方法も提供する。
本発明は、
上記本発明の骨芽細胞分化促進剤及び
骨芽細胞分化能を有する幹細胞
を含む、骨治療用キットを提供する。
(実験条件)
ゲル上培養における実験条件は以下の通りである。3.0mg/ml,pH3.0に調整された豚腱由来TypeIコラーゲン溶液Cellmatrix TypeI−A 4mlに濃縮培地を0.5ml加え撹拌し、重炭酸ナトリウム及びHEPESを含む0.05N水酸化ナトリウム溶液を加えて更に撹拌したものをコラーゲン混合溶液とし、60mmディッシュ(FALCON社製)に薄く広げて、37℃で20分静置した。そこへ5x104cell/mlのD−MEM(Low−glucose,10% FBS,penicillin(100U/ml),streptomycin(100μg/ml)添加)細胞懸濁液を5ml/ディッシュで播種し、24時間インキュベートした。
また阻害剤実験については、5x104cell/mlのD−MEM(Low−glucose,10% FBS,penicillin(100U/mL),streptomycin(100μg/mL)添加)細胞懸濁液を、5ml/ディッシュで播種し24時間インキュベートした。その後、BMP−2を最終濃度300ng/mlとなるように添加し(この日を培養0日目とする)、培養3日目及び7日目に無血清培地中にスウィンホリドAを100nM、ラトランクリンAを400nMとなるように添加し、6時間作用させた。処理後、再びBMP−2を含む培地に戻し、培養後10日目に細胞を回収しALP遺伝子の発現解析をRT−PCRで行った。
(実験方法)
臍帯MSCを10%FBS、penicillin(100U/mL)、streptomycin(100μg/mL)を含むD−MEM(Low−glucose)とともに100mmディッシュに播種し24時間インキュベートした。その後、BMP−2を最終濃度300ng/mlとなるように添加し400nMラトランクリンAを作用させ骨芽細胞を作製した(この日を培養0日目とする)。培養10日目に0.025%トリプシン溶液を用いて剥離し、3x106cellsの細胞とβ−リン酸三カルシウム(β−TCP)の複合体を形成し、10週齢の雄性ヌードマウス頭蓋骨に移植した。
臍帯MSCを阻害剤処理した骨芽細胞をβ−TCPとともにヌードマウスへ全身麻酔下、頭頂部に移植した。対照群にはBMP−2で分化誘導した骨芽細胞とβ−TCPの複合物を移植した。
Claims (14)
- 臍帯由来間葉系幹細胞を、骨分化誘導因子及びアクチン重合阻害物質と共に培養することを含む、骨芽細胞分化誘導方法。
- コーティングなしの培養器での骨芽細胞分化促進のための、請求項1に記載の方法。
- 培養器が正電荷処理の表面加工をされた培養器である、請求項2に記載の方法。
- 骨分化誘導因子が、骨形成タンパク質である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 骨形成タンパク質がBMP-2である、請求項4に記載の方法。
- アクチン重合阻害物質が、ラトランクリンA及び/又はスウィンホリドAである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- アクチン重合阻害物質が、ラトランクリンAである、請求項6に記載の方法。
- 骨分化マーカー遺伝子発現又は骨分化マーカー酵素の活性を測定して骨芽細胞分化能を有する幹細胞の分化状況を確認することを更に含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 骨分化マーカー遺伝子がALP遺伝子であり、骨分化マーカー酵素がALPである、請求項8に記載の方法。
- 培養が、5日間以上行われる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 培養開始と同時(0日)、培養開始後1日、2日、3日、4日又は5日に、培地中に骨分化誘導因子を含有させる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 培養開始と同時(0日)、培養開始後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日又は15日に、培地中にアクチン重合阻害物質を含有させる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 骨治療材を製造するための方法である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- アクチン重合阻害物質を含む、臍帯由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞分化促進剤及び
臍帯由来間葉系幹細胞
を含む、骨治療用キット。
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