CN116437940A - 骨形成组合物和其用途 - Google Patents
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Abstract
提供细胞来源的具有生理活性的组合物。本发明的骨形成组合物包含巨核细胞或其培养物的处理物。
Description
技术领域
本发明涉及骨形成组合物和其用途。
背景技术
作为用于再生医疗的治疗药，正在尝试开发间充质干细胞等促进组织再生的细胞来作为细胞制剂。另外，一般认为前述促进组织再生的细胞是通过释放生长因子等具有生理活性的蛋白来促进组织再生的。
另外，在牙科领域的再生医疗中，骨质增生(生成)治疗等中，使用富血小板血浆。但是，富血小板血浆是从经分离的人血液中通过分离和离心浓缩而制备的，因此血小板数不一致，其效能不明。
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于，提供细胞来源的具有骨形成活性的组合物。
用于解决问题的方案
为了达到前述目的，本发明的骨形成组合物(以下也称为“组合物”)包含巨核细胞或其培养物的处理物。
本发明的骨形成试剂盒(以下也称为“试剂盒”)包含骨形成组合物和骨形成的支架材料，前述骨形成组合物为本发明的骨形成组合物。
发明的效果
根据本发明，可以提供细胞来源的具有骨形成活性的组合物。
附图说明
图1为示出实施例1中的浓缩系统的构成的示意图。
图2为示出实施例1中的细胞增殖活性的图，(A)示出增殖活性的相对值，(B)示出倍增时间。
图3为示出实施例1中的碱性磷酸酶的染色图像的照片。
图4为示出实施例1中的钙的染色图像的照片。
图5为示出实施例1中的培养基中的钙离子浓度的图。
图6为示出实施例2中的细胞增殖活性的图，(A)示出增殖活性的相对值，(B)示出倍增时间。
图7为示出实施例2中的钙的染色图像的照片。
图8为示出实施例2中的钙的染色图像的照片。
图9为示出实施例2中的培养基中的钙离子浓度的图。
图10为示出实施例3中的细胞数的图。
图11为示出实施例3中的ALP活性的图。
图12为示出实施例3中的细胞数的图。
图13为示出实施例3中的ALP活性的图。
图14为示出实施例4中的骨形成的照片。
图15为示出实施例4中的骨形成量或骨质增生量的图。
图16为示出实施例5中的实验概要和细胞因子基因的表达量的示意图和图。
图17为示出实施例5中的实验概要和细胞因子基因的表达量的示意图和图。
图18为示出实施例6中移植后第4周的骨形成的照片。
图19为示出实施例6中移植后第4周的骨量、骨盐量、新生骨量与缺损骨量之比、以及骨密度的图。
具体实施方式
＜骨形成组合物＞
如前所述，本发明的骨形成组合物包含巨核细胞或其培养物的处理物。本发明的组合物的特征在于包含巨核细胞或其培养物的处理物，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的组合物，例如，可以提供细胞来源的具有生理活性的组合物。根据本发明的组合物，例如，可以通过促进向成骨细胞分化而诱导骨形成。
本发明中，“骨形成”可以以下述任一意义来使用：既可以是已经存在的骨的增多、即“骨质增生”(骨生成)；也可以是重新形成骨、即“骨新生”；还可以是已经丧失(缺损)的骨或其一部分的恢复、即“骨再生”。因此，本发明的骨形成组合物也可以称为骨质增生(骨生成)组合物、骨新生组合物和/或骨再生组合物。
如后所述，推测本发明的组合物通过促进、加速(诱导促进)、亢进、增强和/或强化成骨细胞的分化诱导来诱导骨形成。因此，本发明的组合物也可以称为对成骨细胞的分化诱导进行促进、加速(诱导促进)、亢进、增强和/或强化的组合物，另外也可以称为骨形成的诱导、促进、加速(诱导促进)、亢进、增强和/或强化组合物。
本发明中，“巨核细胞”是生物体内存在于骨髓中的最大细胞，是指释放出血小板的细胞和具有同等功能的细胞。前述具有同等功能的细胞是指具有血小板的产生能力的细胞。本发明中，巨核细胞可以是多核化(多倍体化)前的巨核细胞、即未成熟的巨核细胞或增殖期的巨核细胞，可以是多核化后的巨核细胞(多核巨细胞)。作为具体例，前述巨核细胞例如可以是巨核系祖细胞(日语：前巨核芽球)、原巨核细胞、幼巨核细胞、和成熟巨核细胞中的任意者。前述多核化后的巨核细胞所具有的染色体的组数超过2组即可，作为具体例，为16～32组。
前述巨核细胞的来源没有特别限制，可列举例如人和非人动物。前述非人动物可列举例如猴子、大猩猩、黑猩猩、狨猴等灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、兔子、绵羊、马、豚鼠等。前述巨核细胞的来源例如与本发明的组合物的给予对象可以相同也可以不同。
本发明中，前述巨核细胞可以通过细胞表面标记物进行鉴定。前述巨核细胞源自人的情况下，前述细胞表面标记物可列举出CD41a、CD42a和CD42b。即，前述巨核细胞是CD41a、CD42a和CD42b为阳性的细胞。前述巨核细胞源自人的情况下，前述细胞表面标记物例如可以为选自由CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、和CD203c组成的组中的至少1种。
前述巨核细胞可以是从生物体中分离出的巨核细胞，也可以是由多能细胞等与巨核细胞相比未分化的细胞(以下也称为“祖细胞”)诱导的巨核细胞。前述“与巨核细胞相比未分化的细胞”是指具有分化为前述巨核细胞的分化能力的细胞。
前述巨核细胞为从生物体中分离出的巨核细胞时，前述巨核细胞例如存在于骨髓中，因此能够从骨髓中分离。在此情况下，前述巨核细胞可以包含源自生物体的其它细胞。
前述巨核细胞为由祖细胞诱导的巨核细胞时，如后所述，前述巨核细胞可以体外诱导。在此情况下，前述巨核细胞可以包含前述祖细胞。前述祖细胞可列举例如造血干细胞、造血祖细胞、CD34阳性细胞、巨核细胞-红细胞祖细胞(megakaryocyte-erythroidprogenitor：MEP)、巨核细胞祖细胞等。前述祖细胞例如可以从骨髓、脐带血、外周血等中分离，也可以由ES细胞(胚胎干细胞、embryonic stem cells)、诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells、iPS细胞)、核移植ES细胞(ntES细胞)、生殖干细胞、体干细胞、胚胎癌性细胞等多能细胞诱导。
前述巨核细胞为由祖细胞诱导的巨核细胞时，前述巨核细胞优选永生化巨核细胞。前述永生化巨核细胞例如与利用其它巨核细胞诱导方法诱导的巨核细胞相比，细胞分化阶段的均质性高，因此能够抑制得到的处理物中的成分组成的变动。如后所述，前述永生化巨核细胞例如是通过在前述祖细胞中导入癌基因和多梳基因或者导入癌基因、多梳基因和凋亡抑制基因而诱导的巨核细胞。
前述“癌基因”是指可在生物体内诱导细胞的癌变的基因，可列举例如c-MYC、N-MYC、L-MYC等MYC家族基因、SRC家族基因、RAS家族基因、RAF家族基因、c-kit(CD117)、PDGFR(血小板生长因子受体)、Abl(Abelson murine leukemia viral oncogene homolog)等蛋白激酶家族基因等。
前述“多梳基因”是指：已知负调节CDKN2a(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A、INK4a/ARF)而发挥避免细胞老化作用的基因(下述参考文献1～3)。作为具体例，前述多梳基因可列举例如BMI1(多梳复合蛋白BMI-1、多梳家族环指蛋白4(PCGF4)、环指蛋白51(RNF51))、Mel18(多梳家族环指蛋白2)、Ring(环指蛋白)1a/b、Phc(Polyhomeotichomolog，多聚同源同系物)1/2/3、Cbx(色素框)2/4/6/7/8、Ezh2(Zeste 2多梳抑制复合物2亚基的增强子)、Eed(胚胎外胚层发育蛋白)、Suz12(SUZ12多梳抑制复合物2亚基)、HADC(组蛋白脱乙酰基酶类)、Dnmt(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶)1/3a/3b等。
参考文献1：小黑秀行等人，“ポリコーム群蛋白複合体による幹細胞の老化制御”、再生医疗、2007年、第6卷、第4号、26-32页
参考文献2：Jesus Gil et.al,“Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumoursuppressor locus:all for one or one for all”,Nature Reviews Molecular CellBiology,2007,vol.7,pages 667-677
参考文献3：Soo-Hyun Kim et.al.,“Absence of p16 INK4a and truncation ofARF tumor suppressors in chickens”,PNAS,2003,vol.100,No.1,pages 211-216
前述“凋亡抑制基因”是指具有能够抑制细胞凋亡的功能的基因，可列举例如BCL2(B淋巴细胞瘤-2)、Bcl-xL(大B细胞淋巴瘤)、存活蛋白(Survivin，含杆状病毒IAP重复序列蛋白5)、MCL1(BCL2家族凋亡调节剂)等。
前述永生化巨核细胞优选为包含外源性的BMI1基因、MYC基因、和Bcl-xL基因的巨核细胞。前述“外源性”是指从细胞外导入细胞内。前述外源性的基因可以存在于前述细胞的染色体上，也可以存在于核或细胞质内。前述外源性的基因例如可以通过测定该基因的数量来检测。前述基因为常染色体上的基因时，前述基因在各常染色体上存在1个，因此1个细胞中存在2个基因。因此，若不存在前述外源性的基因，则在1个细胞中可检测出2个前述基因。另一方面，存在前述外源性的基因时，在1个细胞中可检测出3个以上前述基因。在此情况下，前述外源性的基因例如可以利用使用了引物的PCR、探针或它们的组合等进行检测。前述外源性的基因具有标签序列、选择标记物时，前述外源性的基因的检测也可以通过前述标签序列的检测或选择标记物的检测来实施。另外，对于前述外源性的基因，例如可以使用抗体等对从前述基因翻译出的蛋白质进行检测。
前述巨核细胞的培养物例如是通过培养前述巨核细胞而产生的培养物。如后所述，前述巨核细胞的培养例如可以通过在培养基存在下培养前述巨核细胞来实施。
前述巨核细胞的培养物是培养前述巨核细胞而得到的物质，因此例如作为细胞成分，是包含前述巨核细胞和由巨核细胞产生的血小板的混合物。前述细胞成分是指细胞和血小板。如前所述，前述巨核细胞可以由与前述巨核细胞相比未分化的细胞来诱导。因此，作为用于生产前述巨核细胞的培养物的巨核细胞，包含由与前述巨核细胞相比未分化的细胞诱导的巨核细胞时，前述巨核细胞的培养物可以包含与前述巨核细胞相比未分化的细胞。
本发明中，前述巨核细胞的培养物可以是培养前述巨核细胞而得到的培养物本身，也可以是将前述培养物加工而成者。前述培养物的加工可列举例如液体级分的去除、细胞成分级分的提取、包含血小板的细胞成分的组成的改变等。前述细胞成分的组成的改变可列举例如前述混合物中的细胞和/或血小板的去除、前述混合物中的细胞和/或血小板的提取、向前述混合物中追加细胞和/或血小板等。
前述“血小板”是血液中的细胞成分之一，是指CD41a和CD42b为阳性的细胞成分。前述血小板例如不具有细胞核，另外，与前述巨核细胞相比，大小较小。因此，前述血小板与前述巨核细胞例如可以根据细胞核的有无和/或大小进行区分。已知：前述血小板在血栓形成和止血中发挥重要的作用、且还参与损伤后的组织再生、炎症的病理生理。另外已知：由于出血等而血小板被激活时，前述血小板在其膜上表达整联蛋白αIIBβ3(glycoproteinIIb/IIIa；CD41a与CD61的复合体)等细胞粘附因子的受体。另外，若前述血小板被激活，则血小板彼此聚集，从血小板中释放出的各种凝血因子使纤维蛋白凝固，由此形成血栓，实现止血。本发明中，前述血小板的来源与前述巨核细胞的来源相同。
本发明中，前述处理物可以由前述巨核细胞制备，也可以由前述巨核细胞的培养物制备。另外，由前述巨核细胞的培养物制备时，前述巨核细胞的培养物可以经过了加工。作为具体例，前述处理物例如可以是前述巨核细胞或其培养物的细胞级分的处理物，也可以是将前述巨核细胞或其培养物加工而成的加工物的处理物。前述处理物的制备中的处理没有特别限制，可列举例如浓缩处理等改变细胞成分的密度的处理；干燥处理、冷冻处理、冷冻干燥处理、溶剂处理、表面活性剂处理、酶处理、蛋白质级分提取处理等提取细胞成分的提取处理；磨碎处理、粉碎处理等破碎处理；等。作为前述处理物的具体例，可列举例如前述巨核细胞或其培养物的浓缩物、干燥物、冷冻物、冷冻干燥物、溶剂处理物、表面活性剂处理物、酶处理物、蛋白质分级物、超声波处理物等提取物；磨碎处理物、粉碎处理物等破碎处理物；前述巨核细胞或其培养物的细胞级分的浓缩物、干燥物、冷冻物、冷冻干燥物、溶剂处理物、表面活性剂处理物、酶处理物、蛋白质分级物、超声波处理物的提取物；磨碎处理物、粉碎处理物等破碎处理物；等。前述处理物可以由1种处理物构成，也可以是2种以上的处理物的混合物。前述混合物没有特别限制，可以制成以任意的处理物的组合和比率混合而成的混合物。
前述处理物例如包含1种以上的生长因子和生长因子受体中的至少一者。另外，前述处理物例如具有细胞的增殖促进活性、成骨细胞的分化促进活性等生理活性。进而，如前所述，前述处理物例如可以通过对前述巨核细胞或其培养物进行处理而制造。因此，本发明中，前述处理物例如可以使用下述条件(1)～(3)来规定。前述处理物例如可以通过下述条件(1)～(3)中的任一者来规定，也可以通过多个条件来规定，也可以通过全部条件来规定。作为具体例，前述处理物例如可以通过条件的组合来规定。
(条件)
(1)生长因子和/或生长因子受体的含量；
(2)处理物的生理活性；
(3)处理物的制造方法
(条件的组合)
条件(1)、(2)、或(3)；
条件(1)和(2)、条件(1)和(3)、或条件(2)和(3)；
条件(1)、(2)、和(3)
(1)条件(1)
如前所述，条件(1)是涉及生长因子和/或生长因子受体的含量的条件。前述条件(1)可以规定前述生长因子的含量或前述生长因子受体的含量，也可以规定前述生长因子的含量和前述生长因子受体的含量。另外，前述条件(1)的规定中使用的生长因子可以是1种，也可以是2种以上。前述条件(1)的规定中使用的生长因子受体可以是1种，也可以是2种以上。
前述条件(1)中，前述生长因子可列举出碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP-6)、胎盘生长因子(PIGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、内分泌腺来源血管内皮生长因子(EG-VEGF)、分化生长因子-15(GDF-15)、双调蛋白(AR)、成骨蛋白-5(BMP-5)、成骨蛋白-7(BMP-7)、肝细胞生长因子(HGF)、TGFβ1(转化生长因子β1)等。
前述条件(1)中，前述生长因子受体可列举出干细胞因子受体(SCFR)、上皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)等。
前述含量例如可以是前述处理物中的各生长因子和各生长因子受体的重量，也可以是前述处理物中的、各生长因子和各生长因子受体的重量相对于总蛋白的重量(单位总蛋白中的含量)，但优选后者。
前述总蛋白的重量例如可以利用BCA蛋白质定量法进行确定。前述BCA蛋白质定量法是利用了1价铜离子与2分子的二辛可宁酸的配位结合的蛋白质定量方法。供于前述BCA蛋白质定量法的样品例如优选不包含还原剂和/或铜离子的螯合剂。前述BCA蛋白质定量法可以依据下述参考文献4加以实施，例如也可以使用市售的试剂盒等。作为前述BCA蛋白质定量法的试剂盒，可以利用Pierce(商标)BCA Protein Assay Kit(Thermo FisherScientific公司制)等。
参考文献4：长谷俊治等人，“やさしい原理からはいるタンパク質科学実験法1タンパク質をつくる抽出·精製と合成”、化学同人、2008年12月13日
对于前述处理物中的总蛋白浓度，例如，可以根据供于处理的细胞数与处理物中的溶剂的体积进行适宜设定。对于前述处理物中的总蛋白浓度，例如，可以通过增加供于前述处理的细胞数、降低前述处理物中的溶剂的体积、或从前述巨核细胞中提取，从而相对提高前述处理物中的总蛋白浓度。另外，对于前述处理物中的总蛋白浓度，例如，可以通过减少供于前述处理的细胞数、增加前述处理物中的溶剂的体积、或从前述巨核细胞的培养物中提取，从而相对降低前述处理物中的总蛋白浓度。作为具体例，供于前述处理的细胞数为1×108个细胞，前述处理物中的溶剂的体积为100μl的情况下，前述处理物中的总蛋白浓度例如为0.1～200mg/ml。前述溶剂例如为后述的水性溶剂。
前述生长因子和生长因子受体的重量例如可以利用夹层ELISA法来确定。前述夹层ELISA法可以依据下述参考文献5来实施，例如，也可以使用市售的试剂盒等。作为前述夹层ELISA法的试剂盒，可以利用Quantibody(注册商标)Human Growth Factor Array 1(RayBiotech公司制)等。
参考文献5：生物化学的测定研究会编辑，“免疫測定法基礎から先端まで”、讲谈社、2014年12月20日
作为前述处理物中的前述生长因子的含量和生长因子受体的含量，可列举例如以下的例子。
前述生长因子为bFGF的情况下，前述处理物例如每1mg总蛋白，包含2000～20000pg、5000～20000pg、或10000～20000pg的bFGF。通过使前述处理物例如含有bFGF，从而如后所述示出细胞增殖促进活性和向成骨细胞的分化促进活性。
前述生长因子为IGFBP-1的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为0～200pg、0.01～200pg、0.01～100pg、或0.01～50pg的IGFBP-1。
前述生长因子为IGFBP-2的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为8000～80000pg、10000～80000pg、或20000～80000pg的IGFBP-2。
前述生长因子为PIGF的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为1～60pg、1～30pg、或1～20pg的PIGF。
前述生长因子为VEGF的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为20～800pg、20～600pg、或20～400pg的VEGF。
前述生长因子为GDF-15的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为1000～10000pg、1000～5000pg、或2000～5000pg的GDF-15。
前述生长因子为AR的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为0～16pg、0.01～16pg、0.1～16pg、或1～16pg的AR。
前述生长因子为HGF的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为0～100pg、0.01～100pg、0.01～50pg、或0.01～30pg的HGF。
前述生长因子为BMP-7的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为0～1000pg、0.01～1000pg的BMP-7。
前述生长因子受体为SCFR的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为200～2000pg、300～1500pg、或400～1000pg的SCFR。
前述生长因子受体为EGFR的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为0～60pg、0.01～60pg、1～50pg、1～45pg、或10～40pg的EGFR。
前述生长因子受体为VEGFR2的情况下，前述处理物包含例如相对于1mg总蛋白为20～400pg、50～350pg、或100～300pg的VEGFR2。
如前所述，前述条件(1)可以以1种或2种以上的生长因子的含量规定，也可以以1种或2种以上的生长因子受体的含量规定，也可以以任意组合规定它们的含量。在此情况下，前述条件(1)例如可以选自由下述条件(A1)～(A9)和(B1)～(B3)组成的组中的至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种或12种条件来规定。作为具体例，作为前述生长因子的含量和/或生长因子受体的含量的组合，可以示例出下述的组合。
(生长因子的含量和/或生长因子受体的含量的组合)
(A1)～(A9)和(B1)～(B3)中的任意1个条件：
(A1)bFGF的含量、(A2)IGFBP-1的含量、(A3)IGFBP-2的含量、(A4)PIGF的含量、(A6)VEGF的含量、(A6)GDF-15的含量、(A7)AR的含量、(A8)HGF的含量、(A9)BMP-7的含量、(B1)SCFR的含量、(B2)EGFR的含量、或(B3)VEGFR2的含量；
(A1)～(A9)和(B1)～(B3)中的任意2个条件：
(A1)和(A2)、(A1)和(A3)、(A1)和(A4)、(A1)和(A5)、(A1)和(A6)、(A1)和(A7)、(A1)和(A8)、(A1)和(A9)、(A1)和(B1)、(A1)和(B2)、(A1)和(B3)、
(A2)和(A3)、(A2)和(A4)、(A2)和(A5)、(A2)和(A6)、(A2)和(A7)、(A2)和(A8)、(A2)和(A9)、(A2)和(B1)、(A2)和(B2)、(A2)和(B3)、
(A3)和(A4)、(A3)和(A5)、(A3)和(A6)、(A3)和(A7)、(A3)和(A8)、(A3)和(A9)、(A3)和(B1)、(A3)和(B2)、(A3)和(B3)、
(A4)和(A5)、(A4)和(A6)、(A4)和(A7)、(A4)和(A8)、(A4)和(A9)、(A4)和(B1)、(A4)和(B2)、(A4)和(B3)、
(A5)和(A6)、(A5)和(A7)、(A5)和(A8)、(A5)和(A9)、(A5)和(B1)、(A5)和(B2)、(A5)和(B3)、
(A6)和(A7)、(A6)和(A8)、(A6)和(A9)、(A6)和(B1)、(A6)和(B2)、(A6)和(B3)、
(A7)和(A8)、(A7)和(A9)、(A7)和(B1)、(A7)和(B2)、(A7)和(B3)、
(A8)和(A9)、(A8)和(B1)、(A8)和(B2)、(A8)和(B3)、
(A9)和(B1)、(A9)和(B2)、(A9)和(B3)、
(B1)和(B2)、(B1)和(B3)、或
(B2)和(B3)。
前述单位总蛋白中的含量例如可以根据本发明的组合物的用途通过追加或去除除前述生长因子和生长因子受体以外的其它蛋白质来进行调整。前述其它蛋白质可列举例如不对前述生长因子和生长因子受体的活性产生影响的蛋白质，作为具体例，可列举出人血清白蛋白等血清白蛋白、人丙种球蛋白等丙种球蛋白等。前述蛋白质的去除可列举例如使用了柱的去除、使用了抗体的去除等。
(2)条件(2)
如前所述，条件(2)是涉及处理物的生理活性的条件。前述条件(2)中，前述处理物的生理活性例如是指调节细胞、组织、或脏器的功能的活性。前述细胞功能可列举例如增殖、分化等。
前述处理物的生理活性可列举例如细胞增殖促进活性、向成骨细胞的分化促进活性、从骨祖细胞向成骨细胞的分化促进活性。在前述细胞增殖促进活性中，前述细胞没有特别限制，可列举例如间充质干细胞等。在前述向成骨细胞的分化促进活性中，前述骨祖细胞可列举例如间充质干细胞、成骨细胞等。前述处理物例如可以具有1种活性，也可以具有多种活性。
前述间充质干细胞是具有自我复制能力且具有能分化为骨、软骨和脂肪细胞的分化能力的细胞。前述间充质干细胞可以通过细胞表面标记物进行鉴定。前述间充质干细胞例如为CD73、CD90、和CD105阳性以及为CD14、CD34和CD45阴性。
前述成骨细胞是能够合成和分泌骨基质的细胞。前述成骨细胞例如可以作为碱性磷酸酶阳性和骨钙蛋白阳性的细胞来进行确定。
前述细胞增殖促进活性例如只要与除未添加本发明的组合物以外同样的对照组相比改善细胞的增殖能力即可，例如，也可以从一开始细胞的增殖能力就降低。在此情况下，前述“增殖促进活性”例如也能够称为增殖活性降低的抑制。作为具体例，前述间充质干细胞的增殖活性随着每次传代而降低。根据本发明的组合物，由于能够抑制前述间充质干细胞的增殖活性的降低，因此例如可以说本发明的组合物显示出增殖促进活性。前述细胞增殖促进活性例如可以在对象细胞增殖的培养条件下进行测定。前述培养条件例如可以根据前述细胞的种类进行适宜设定。
关于前述向成骨细胞的分化促进活性，例如只要与除了未添加本发明的组合物以外均相同的对照组相比向成骨细胞的分化能力提高即可。前述分化能力的提高例如可以为以下任意种含义：前述向成骨细胞的分化速度加快；和，分化为前述成骨细胞的细胞比例提高。前述向成骨细胞的分化例如可以参照日本特开2012-120529号公报。作为具体例，由间充质干细胞诱导成骨细胞的诱导方法例如可以基于后述的实施例2来实施。
(3)条件(3)
如前所述，条件(3)是关于处理物的制造方法的条件。对于本发明的组合物中的处理物的制造方法，可以援用后述的本发明的组合物的制造方法的说明。
本发明的组合物可以以体外方式使用，也可以以体内方式使用。
以体外方式使用本发明的组合物时，前述给予对象可列举例如细胞、组织、器官等，前述细胞可列举例如从生物体中采集的细胞、培养细胞等。
以体内方式使用本发明的组合物时，前述给予对象可列举例如人、或除人外的非人动物。作为前述非人动物，可列举例如小鼠、大鼠、兔子、狗、绵羊、马、猫、山羊、猴子、豚鼠等。
本发明的组合物的使用条件(给予条件)没有特别限制，例如可以根据给予对象的种类等适宜设定给予形态、给予时期、给予量等。
以体外方式使用本发明的组合物时，本发明的组合物例如可以通过添加于作为对象的祖细胞的培养基中而使用。本发明的组合物例如可以添加到维持前述祖细胞时使用的维持培养基中，也可以是在使前述祖细胞分化为前述成骨细胞时使用、添加，还可以添加于前述维持培养基和前述分化培养基这两者中。根据本发明的组合物，例如通过在包含前述组合物的维持培养基维持前述祖细胞，之后使前述祖细胞分化为成骨细胞时也能够促进分化。前述维持培养基中的本发明的组合物来源的总蛋白的终浓度例如为10～1000μg/ml、10～500μg/ml、或10～300μg/ml。前述分化培养基中的本发明的组合物来源的总蛋白的终浓度例如为10～1000μg/ml、10～500μg/ml、或10～300μg/ml。
以体内方式使用本发明的组合物时，例如可以根据给予对象的种类、症状、年龄、给予方法等进行适宜确定。作为具体例，向小鼠给予时，对于每一天的组合物的给予量，前述组合物来源的总蛋白量的合计没有特别限制，例如，可以根据其用途进行适宜设定，作为具体例，可列举10ng～100mg。在对人进行给予时，每1天的组合物给予量中，前述组合物来源的总蛋白量的合计没有特别限制，例如可以根据其用途适宜设定，作为具体例，可列举10ng～100g。每1天的给予次数例如为1～5次、1～3次、1次或2次。
本发明的组合物的给予方式没有特别限制。以体内方式给予本发明的组合物时，可以是经口给予，也可以是非经口给予。前述非经口给予可列举例如静脉注射(静脉内给予)、肌肉注射(肌肉内给予)、经皮给予、皮下给予、皮内给予、经肠给予、直肠给予、经阴道给予、经鼻给予、经肺给予、腹腔内给予、局部给予等。
本发明的组合物的剂型没有特别限制，例如，可以根据前述给予方式进行适宜确定。前述剂型可列举例如液体状或固体状。
本发明的组合物例如根据需要可以包含添加剂。前述添加剂优选为药学上可接受的添加剂或药学上可接受的载体。
本发明的组合物的制造方法(以下也称为“制造方法”)包括对巨核细胞或其培养物进行处理的处理工序。本发明的制造方法中，前述处理工序中的处理对象是巨核细胞或其培养物。因此，本发明的制造方法在前述处理工序之前，可以包括：从与巨核细胞相比未分化的细胞诱导前述巨核细胞的巨核细胞诱导工序和/或生产前述巨核细胞的培养物的生产工序。
前述巨核细胞诱导工序中，前述巨核细胞的诱导方法没有特别限制，可以利用公知的诱导方法实施。作为具体例，前述巨核细胞的诱导方法例如可以参照国际公开第2011/034073号(美国专利申请公开2012/0238023号公报)、国际公开2012/157586号(美国专利申请公开2014/0127815号公报)、国际公开第2014/123242号(美国专利申请公开2016/0002599号公报)等永生化巨核细胞的诱导方法；下述参考文献6中记载的巨核细胞的诱导方法；等，将作为构成本说明书的一部分援用至此。作为具体例，前述巨核细胞诱导工序中，例如，可以使由与前述巨核细胞相比未分化的细胞强制表达前述癌基因和前述多梳基因。由此，前述巨核细胞诱导工序中，例如，能够得到无限增殖的永生化巨核细胞。进而，例如，通过解除前述永生化巨核细胞的前述强制表达，从而能够将前述永生化巨核细胞诱导至多核巨细胞，并产生血小板。另外，前述巨核细胞诱导工序中，例如，也可以使前述巨核细胞祖细胞强制表达前述凋亡抑制基因。由此，前述巨核细胞诱导工序中，能够得到前述永生化巨核细胞。进而，例如，通过解除前述永生化巨核细胞的前述强制表达，从而能够由前述永生化巨核细胞诱导多核巨细胞，产生血小板。
参考文献6：Ann-Kathrin Borger et.al.,“Generation ofHLA-Universal iPSC-Derived Megakaryocytes and Platelets for Survival Under RefractorinessConditions”,Mol.Med.,2016,vol.22,pages 274-288
前述巨核细胞诱导工序中，例如，可以强制表达前述癌基因、前述多梳基因、和前述凋亡抑制基因。在此情况下，前述癌基因、前述多梳基因、和前述凋亡抑制基因的强制表达可以同时进行，也可以独立地进行。作为具体例，前述巨核细胞诱导工序中，强制表达前述癌基因和前述多梳基因后解除前述强制表达，接着强制表达前述凋亡抑制基因，还可以强制表达前述癌基因、前述多梳基因、和前述凋亡抑制基因，也可以强制表达前述癌基因和前述多梳基因，进而表达前述凋亡抑制基因。由此，前述巨核细胞诱导工序中，能够得到前述永生化巨核细胞。进而，例如，通过解除前述永生化巨核细胞的前述强制表达，从而能够由前述永生化巨核细胞诱导多核巨细胞，并产生血小板。
对于前述巨核细胞诱导工序，例如，从能够改善各基因的导入效率的方面考虑，优选包括如下工序：第1表达工序，使与前述巨核细胞相比未分化的细胞强制表达癌基因和多梳基因；第2表达工序，使前述未分化的细胞强制表达Bcl-xL基因等凋亡抑制基因；及解除工序，解除全部前述强制表达。
各基因的强制表达和强制表达的解除例如可以利用国际公开第2011/034073号、国际公开第2012/157586号、国际公开第2014/123242号或下述参考文献7中记载的方法等公知的方法、或依据其的方法来实施，将作为构成本说明的一部分援用至此。作为具体例，各基因的强制表达和强制表达的解除例如可以使用药剂应答性的基因表达诱导系统来实施。前述基因表达诱导系统可列举例如Tet-on(注册商标)系统、Tet-off(注册商标)系统等。使用前述Tet-on系统时，例如，在前述强制表达的工序中，在四环素类抗生素、多西环素等诱导基因表达的药剂存在下实施培养，在解除前述强制表达的工序中，在不存在前述药剂的情况下实施前述培养。
参考文献7：Nakamura S et al,“Expandable megakaryocyte cell linesenable clinically applicable generation of platelets from human inducedpluripotent stem cells.”,Cell Stem Cell,2014,vol.14,No.4,pages 535-548
接着，前述生产工序中，生产前述巨核细胞的培养物。前述生产工序例如可以通过在培养基存在下培养前述巨核细胞来实施。前述巨核细胞的培养例如也可以在饲养层细胞上实施，也可以在没有饲养层细胞的情况下实施。前述巨核细胞例如可以进行悬浮培养，因此可以在没有前述饲养层细胞的情况下进行培养。前述巨核细胞的培养物例如包括前述血小板。
前述巨核细胞的培养条件没有特别限制，可以采用前述巨核细胞的通常的培养条件。作为具体例，培养温度例如为约35～约42℃、约36～约40℃、约37～约39℃。CO2浓度例如为约5～约15％。O2浓度例如为约15～约25％、约20％。培养时间没有特别限制，例如为约1天～约2周、约4天～约8天。
前述培养基没有特别限制，可列举例如适于由前述巨核细胞产生血小板的公知的培养基和依据其的培养基。作为具体例，前述培养基例如可以将动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。前述基础培养基可列举例如IMDM培养基、Medium 199培养基、伊戈尔最低必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)、Ham’s F12培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal(注册商标)培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)等单一培养基或它们的混合培养基。前述培养基例如可以包含血清或血浆，也可以是不包含这些的无血清培养基。前述血清和血浆的来源优选为与前述巨核细胞的来源相同的来源。作为具体例，前述巨核细胞源自人时，前述血清和血浆优选分别源自人。
前述培养基例如可以包含其它成分。前述其它成分没有特别限制，可列举例如白蛋白、胰岛素、运铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、单硫代甘油(MTG)、脂质、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺)、抗坏血酸、肝素、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。前述其它成分例如可以是1种，也可以是2种以上。前述细胞因子例如是促进血细胞系细胞的分化的物质，作为具体例，可列举出血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促血小板生成素(TPO)、各种TPO样作用物质、干细胞因子(Stem Cell Factor，SCF)、ITS(胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸盐)补充剂、ADAM抑制剂、FLT抑制剂、WNT抑制剂、ROCK抑制剂、芳香族烃受体(AhR)抑制剂等。前述培养基例如优选血清、胰岛素、运铁蛋白、丝氨酸、硫代甘油、抗坏血酸、包含TPO的IMDM培养基。前述培养基例如可以进一步包含SCF，也可以进一步包含肝素。前述其它成分的浓度没有特别限制。前述TPO的浓度例如为约10ng/ml～约200ng/ml、约50ng/ml～约100ng/ml。前述SCF的浓度例如为约10ng/ml～约200ng/ml、约50ng/ml。前述肝素的浓度例如为约10U/ml～约100U/ml、约25U/ml。前述培养基例如可以进一步包含佛波酯(例如，佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯；PMA)。
接着，前述处理工序中，对前述巨核细胞或其培养物进行处理。前述处理工序中，例如，通过将前述巨核细胞或其培养物所含有的细胞的细胞膜破坏，从而提取蛋白质等生物高分子。作为具体例，前述处理工序中的处理没有特别限制，可列举例如：浓缩处理等改变细胞成分的密度的处理；干燥处理、冷冻处理、冷冻干燥处理、溶剂处理、表面活性剂处理、酶处理、蛋白质级分提取处理、超声波处理等提取细胞的成分的提取处理；磨碎处理、粉碎处理等破碎处理；等。前述处理工序中实施的处理可以是1种，也可以是2种以上。另外，前述处理工序中，可以实施1次前述处理，也可以实施2次以上。
前述浓缩处理例如可以通过对前述巨核细胞或其培养物进行离心等来实施。前述离心的条件例如可以采用使细胞或血小板沉淀的条件。前述干燥处理例如可以通过用干式喷雾器、滚筒干燥机等使前述巨核细胞或其培养物干燥来实施。前述冷冻干燥处理例如可以使用冷冻干燥机来实施。前述溶剂处理中，前述溶剂例如为苯酚、氯仿等有机溶剂；水、生理盐水、缓冲液等水性溶剂。使用水性溶剂作为前述溶剂时，前述溶剂处理例如优选组合使用后述的表面活性剂处理、酶处理、和/或超声波处理。前述溶剂处理例如可以通过将前述巨核细胞或其培养物与前述溶剂混合来实施。前述表面活性剂处理中，前述表面活性剂可列举例如月桂基硫酸钠等离子系表面活性剂；NP-40、Triton X-100、Tween20、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷等非离子系表面活性剂；CHAPS等两性离子表面活性剂；等。前述表面活性剂的浓度例如是能够破坏前述巨核细胞或其培养物中的细胞成分的细胞膜的浓度。前述表面活性剂处理例如可以通过在水性溶剂存在下使前述巨核细胞或其培养物与前述表面活性剂接触而实施。与前述表面活性剂的接触例如在约0～约10℃下实施。前述水性溶剂可列举例如水、生理盐水、缓冲液等。前述酶处理中的酶可列举例如肽酶、蛋白酶等。前述酶处理例如可以通过在前述水性溶剂存在下使前述巨核细胞或其培养物与前述酶接触而实施。前述酶处理的条件例如是前述酶显示出活性的条件。前述蛋白质级分提取处理例如可以通过对前述巨核细胞或其培养物进行渗透压冲击、冷冻融解等而实施。前述超声波处理例如可以使用超声波发生装置来实施。前述超声波处理的条件例如可以利用将细胞破碎的条件。
各种处理中的处理条件和处理时间例如可以根据前述处理的种类进行适宜确定。另外，前述处理工序中，例如，可以通过调整前述水性溶剂的量来调整前述处理物中的总蛋白的浓度。
前述巨核细胞或其培养物可以在前述处理之前实施加工(预处理)。在此情况下，作为前述巨核细胞的培养物，可以使用培养前述巨核细胞而得到的培养物本身，也可以使用对前述混合物进行加工所得者。前述培养物的加工可列举例如液体级分的去除、细胞成分级分的提取、包含血小板在内的细胞成分的组成的改变等。前述细胞成分的组成的改变可列举例如前述混合物中的细胞和/或血小板的去除、前述混合物中的细胞和/或血小板的提取、向前述混合物中追加细胞和/或血小板等。
本发明的制造方法包括前述预处理时，本发明的制造方法可以包括从前述巨核细胞或其培养物中去除血小板的去除工序。在此情况下，前述处理工序中，使用去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物作为前述巨核细胞或其培养物、或使用去除的血小板来实施处理。放出前述血小板后的巨核细胞例如bFGF的含量高。因此，本发明的制造方法例如可以通过去除前述血小板来制造bFGF的含量高的组合物。通过前述血小板的去除，从而能够将前述血小板与其它细胞级分分离。因此，前述去除工序例如也可以称为血小板的分离工序或血小板与其它细胞成分的分离工序。前述去除工序中，从前述巨核细胞的培养物中分离血小板的方法例如可以利用国际公开第2017/065280号公报(美国专利申请公开2018/282697号公报)中记载的方法等公知的方法、或依据其的方法来实施，将作为构成本说明的一部分援用至此。
前述去除工序中的血小板的去除率(分离率)例如为60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。前述血小板的去除率例如为60～90％。
本发明的制造方法可以具备：保存前述巨核细胞或其培养物、去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物、或去除的血小板的保存工序。前述保存工序中的保存可列举例如冷藏保存(约1～约10℃)、冷冻保存(约-200～约-4℃)。前述保存工序中的保存时间没有特别限制。例如从兼为前述处理工序中的冷冻处理出发，前述保存工序优选冷冻保存。
作为一例，本发明的制造方法可以如下实施。但是，本发明不受以下示例的任何限制。首先，对于包含前述巨核细胞或其培养物的培养基，通过离心进行浓缩处理，将细胞成分浓缩。前述离心处理例如是前述细胞成分沉淀的条件。作为具体例，前述离心处理例如可以通过以1000～3000×g进行5～20分钟离心来实施。接着，在离心后回收沉淀物，将得到的沉淀物迅速冷冻，由此进行冷冻处理。前述冷冻处理例如可以通过使前述沉淀物与液氮等液化气接触而实施。进而，通过用包含前述表面活性剂的水性溶剂溶解冷冻后的沉淀物，从而进行表面活性剂处理。对得到的溶液进行离心、使夹杂物沉淀。前述离心处理例如是细胞膜等夹杂物沉淀的条件。作为具体例，前述离心处理例如可以通过以10000～20000×g进行3～10分钟离心而实施。前述离心后，蛋白质存在于上清液中，因此通过回收上清液来作为蛋白质级分，从而能够得到前述处理物。
本发明的组合物例如如后所述可作为成骨细胞分化促进组合物使用。关于本发明的使用方法，可以援引后述的细胞增殖促进组合物和成骨细胞分化促进组合物的说明。另外，推测本发明的组合物可适宜地用于例如：颌骨肿瘤、囊肿、骨坏死、外伤、骨系统疾病(外胚层发育不良、唇颌腭裂等)引起的颌骨缺损；牙周病或随之而来的牙槽骨缺损、龋齿或外伤引起的牙槽骨缺损等牙槽骨缺损；原发性骨质疏松症(绝经后骨质疏松、老年性骨质疏松等)、继发性骨质疏松症(成骨不全症等)等骨质疏松症；甲状腺功能亢进、Cushing综合征、性腺功能低下症)、外伤等引起的难治性骨折；开胸手术引起的肋骨接合；开颅手术引起的骨缺损；肿瘤切除或囊肿摘除引起的全身性骨缺损；等。
＜成骨细胞分化促进组合物＞
本发明的成骨细胞分化促进组合物如前所述包含前述本发明的组合物。本发明的分化促进组合物的特征在于包含前述本发明的组合物，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的分化促进组合物，能够促进向成骨细胞的分化、特别是从间充质干细胞向成骨细胞的分化。本发明的分化促进组合物可以援引前述本发明的组合物的说明。
本发明的分化促进组合物可以以体外方式使用，也可以以体内方式使用。
以体外方式使用本发明的分化促进组合物时，前述给予对象可列举例如细胞、组织、器官等，前述细胞可列举例如从生物体中采集的细胞、培养细胞等。
以体内方式使用本发明的分化促进组合物时，前述给予对象可列举例如人、或除人外的非人动物。作为前述非人动物，可列举例如小鼠、大鼠、兔子、狗、绵羊、马、猫、山羊、猴子、豚鼠等。
本发明的分化促进组合物的使用条件(给予条件)没有特别限制，例如可以根据给予对象的种类等适宜设定给予形态、给予时期、给予量等。本发明的分化促进组合物的给予条件可以援引前述本发明的组合物的说明。
以体外方式使用本发明的分化促进组合物时，本发明的分化促进组合物例如可以通过添加于作为对象的祖细胞的培养基中而使用。本发明的分化促进组合物例如可以添加到维持前述祖细胞时使用的维持培养基中，也可以是在使前述祖细胞分化为前述成骨细胞时使用、添加，还可以添加于前述维持培养基和前述分化培养基这两者中。根据本发明的分化促进组合物，例如通过在包含前述分化促进组合物的维持培养基维持前述祖细胞，之后使前述祖细胞分化为成骨细胞时也能够促进分化。前述维持培养基中的本发明的分化促进组合物来源的总蛋白的终浓度例如为10～1000μg/ml、10～500μg/ml、或10～300μg/ml。前述分化培养基中的本发明的分化促进组合物来源的总蛋白的终浓度例如为10～1000μg/ml、10～500μg/ml、或10～300μg/ml。
促进祖细胞向成骨细胞分化的作用例如可以通过下述来评价：使间充质干细胞和被检物共存时，与前述被检物不存在时(对照组)相比，是否能够促进前述间充质干细胞向成骨细胞的分化。具体而言，前述促进向成骨细胞分化的作用可以以将前述间充质干细胞分化诱导为成骨细胞后的细胞群的培养基中的钙离子浓度为指标来进行评价。前述间充质干细胞向成骨细胞的分化诱导方法和钙离子浓度的测定方法可以基于后述的实施例1的(6)来实施。并且，在前述评价中，例如前述被检物共存组的钙浓度与前述被检物不存在的组的钙浓度相比为90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、或5％以下时，可以评价为前述被检物具有促进向成骨细胞分化的作用。
就本发明的分化促进组合物而言，例如，在前述间充质干细胞向成骨细胞的分化诱导检测中具有将钙浓度抑制到90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、或5％以下的成骨细胞分化促进活性。前述间充质干细胞向成骨细胞的分化诱导检测可以基于后述的实施例1的(6)来实施。
以体内方式使用本发明的分化促进组合物时，例如可以根据给予对象的种类、症状、年龄、给予方法等适宜决定。作为具体例，向人给予时，对于每一天的分化促进组合物的给予量，前述分化促进组合物来源的总蛋白量的合计没有特别限制，例如，可以根据其用途进行适宜设定。每一天的给予次数例如为1～5次、1～3次、1次或2次。
本发明的分化促进组合物的给予方式没有特别限制。以体内方式给予本发明的分化促进组合物时，可以是经口给予，也可以是非经口给予。前述非经口给予可列举例如静脉注射(静脉内给予)、肌肉注射(肌肉内给予)、经皮给予、皮下给予、皮内给予、经肠给予、直肠给予、经阴道给予、经鼻给予、经肺给予、腹腔内给予、局部给予等。
本发明的分化促进组合物的剂型没有特别限制，例如，可以根据前述给予方式进行适宜确定。前述剂型可列举例如液体状或固体状。
本发明的分化促进组合物例如根据需要可以包含添加剂。前述添加剂优选为药学上可接受的添加剂或药学上可接受的载体。
＜骨形成试剂盒＞
本发明的骨形成试剂盒包含骨形成组合物和骨形成的支架材料，前述骨形成组合物为前述本发明的骨形成组合物。本发明的试剂盒的特征在于包含前述本发明的骨形成组合物，其它工序和条件没有特别限制。本发明的试剂盒通过组合前述本发明的组合物和前述支架材料，从而可以简便地诱导骨形成。本发明的试剂盒可以援引前述本发明的组合物和分化促进组合物的说明。
本发明的试剂盒中，前述支架材料例如可以使用骨或软骨再生中使用的支架材料。前述支架材料例如也可以称为骨细胞或成骨细胞、或这些的祖细胞能够进行附着、增殖和/或分化的材料。前述支架材料例如为三维的具有中空结构或多孔结构的结构体(结构物)，作为具体例，可列举多孔体、多孔性支撑体、多孔性立体结构体(结构物)、凝胶(水凝胶)、海绵结构物等。
例如从与前述本发明的组合物一起留置在生物体内的角度出发，前述支架材料优选显示生物相容性和/或生物降解性。前述“生物相容性”例如是指：与生物体的组织和/或器官有亲和性，不会引发异物反应、排斥反应等。前述“生物降解性”例如是指：在生物体内，其构成成分能够分解。
前述支架材料的构成成分可列举例如胶原蛋白、明胶、白蛋白、角蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白等蛋白；琼脂糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、黄原胶、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、透明质酸、海藻酸等多糖类；聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸与聚乳酸的共聚物、聚羟基丁酸、聚二噁烷酮、聚乙二醇(PEG)、聚己内酯、聚琥珀酸丁二醇酯、磷酸钙(例如β-磷酸三钙)、碳酸钙、羟基磷灰石、聚醚酮、和聚醚醚酮等。前述构成成分可以单独使用1种，也可以组合使用多种。
前述支架材料例如可以通过使前述支架材料的构成成分进行交联或复合化来制备。
作为前述支架材料，可列举例如NEOBONE(羟基磷灰石制、Aimdic MMT公司制)、APACERAM(注册商标、羟基磷灰石制、HOYA株式会社制)、BONARC(胶原蛋白/磷酸八钙制、东洋纺株式会社制)、OSferion(βTCP制、Olympus Terumo Biomaterials Corporation制)、Cytrans Granules(碳酸磷灰石制、株式会社GC制)、REFIT(胶原蛋白/磷灰石制、HOYA株式会社制)等。
本发明的试剂盒中，前述组合物和前述支架材料既可以独立地存在，也可以一体地存在。后者的情况下，本发明的试剂盒也可以称为例如骨形成支架材料。前述组合物和前述支架材料为一体的情况下，前述组合物例如可以吸附于前述支架材料的表面，也可以包含于前述支架材料内。
本发明的试剂盒中，例如除了前述组合物以外还可以包含生理活性物质。前述生理活性物质例如是促进骨形成、或者成骨细胞或骨细胞的分化的物质。前述生理活性物质可列举例如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、生长分化因子-5(GDF5)、促红细胞生成因子(EPO)、转化生长因子(TGF)和骨形态生成蛋白(BMP)等。前述生理活性物质可以单独使用1种，也可以组合使用多种。
本发明的试剂盒例如可以如下使用：向前述给予对象中想要诱导骨形成的期望位置移植(埋设、包埋)前述组合物和支架材料。具体而言，本发明的试剂盒中前述组合物和前述支架材料独立的情况下，可以通过在前述支架材料中浸渗前述组合物、接着移植前述支架材料的方式使用。另外，本发明的试剂盒中前述组合物与前述支架材料独立的情况下，可以通过移植前述支架材料后向前述移植部位导入前述本发明的组合物的方式使用。另外，本发明的试剂盒中前述组合物和前述支架材料为一体的情况下，可以通过移植前述支架材料的方式使用。
本发明的试剂盒中，前述组合物的含量例如可以基于前述本发明的组合物的给予量来进行设定。
＜抑制免疫细胞活化的组合物＞
本发明在另一方式中提供一种细胞来源的、具有抑制免疫细胞活化的活性的组合物。这种情况下，本发明的抑制免疫细胞活化的组合物(以下也称为“活化抑制组合物”。)包含巨核细胞或其培养物的处理物。本发明的活化抑制组合物的特征在于包含巨核细胞或其培养物的处理物，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的活化抑制组合物，例如可以提供细胞来源的具有抑制免疫细胞活化的活性的组合物。本发明的活化抑制组合物可以援引前述本发明的组合物、分化促进组合物、和骨形成试剂盒的说明。
本发明的活化抑制组合物例如可以抑制免疫细胞产生炎症性细胞因子。因此，本发明的活化抑制组合物例如也可以称为抑制免疫细胞中的炎症性细胞因子的产生的组合物。
本发明中，“免疫细胞活化”例如可以以下述任意含义使用：在免疫细胞中，诱导活化标志物的表达、诱导炎症性细胞因子等细胞因子的表达。前述炎症性细胞因子可列举例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等。
前述抑制免疫细胞活化的作用例如可如下评价：在可活化前述免疫细胞的条件下，使前述免疫细胞和被检物共存时，与前述被检物不存在时相比(对照组)，是否能够抑制前述免疫细胞的培养后的培养基中的炎症性细胞因子的浓度。具体而言，前述抑制免疫细胞活化的作用可以基于炎症性细胞因子的产生量的抑制率来评价。前述免疫细胞的种类、活化的条件、和炎症性细胞因子的产生量可以基于后述的实施例5来测定。并且，在前述评价中例如任意1种以上的细胞因子的产生量的抑制率为10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、或99％以上时，可以评价为前述被检物具有抑制免疫细胞活化的作用。
就本发明的活化抑制组成而言，例如，在前述免疫细胞活化的检测中具有与对照组相比将至少1种炎症性细胞因子的浓度抑制为90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、或5％以下的抑制免疫细胞活化的作用。前述免疫细胞活化的检测可以基于后述的实施例5来实施。
本发明中，前述免疫细胞可列举例如T细胞等淋巴细胞；炎症性巨噬细胞等巨噬细胞；等。
本发明的活化抑制组合物可以以体外方式使用，也可以以体内方式使用。
以体外方式使用本发明的活化抑制组合物时，前述给予对象可列举例如细胞、组织、器官等，前述细胞可列举例如从生物体中采集的细胞、培养细胞等。
以体内方式使用本发明的活化抑制组合物时，前述给予对象可列举例如人、或除人外的非人动物。作为前述非人动物，可列举例如小鼠、大鼠、兔子、狗、绵羊、马、猫、山羊、猴子、豚鼠等。
本发明的活化抑制组合物的使用条件(给予条件)没有特别限制，例如可以根据给予对象的种类等适宜设定给予方式、给予时期、给予量等。
以体外方式使用本发明的活化抑制组合物时，本发明的活化抑制组合物例如可以通过添加于作为对象的细胞的培养基中而使用。以体外方式使用本发明的活化抑制组合物时，前述培养基中的本发明的活化抑制组合物来源的总蛋白的终浓度例如为10～1000μg/ml、10～500μg/ml、或10～300μg/ml。
以体内方式使用本发明的活化抑制组合物时，例如可以根据给予对象的种类、症状、年龄、给予方法等适宜决定。作为具体例，向人给予时，对于每一天的活化抑制组合物的给予量，前述活化抑制组合物来源的总蛋白量的合计没有特别限制，例如，可以根据其用途进行适宜设定。每一天的给予次数例如为1～5次、1～3次、1次或2次。
本发明的活化抑制组合物的给予条件和剂型为可以援引前述本发明的组合物的说明。
＜抗炎症组合物＞
本发明在另一方式中提供一种细胞来源的、具有抗炎症活性的组合物。这种情况下，本发明的抗炎症组合物包含巨核细胞或其培养物的处理物。本发明的抗炎症组合物的特征在于包含巨核细胞或其培养物的处理物，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的抗炎症组合物，例如可提供能够抑制炎症的组合物。本发明的抗炎症组合物可以援引前述本发明的组合物、分化促进组合物、骨形成试剂盒、和活化抑制组合物的说明。
本发明中，“抗炎症”是指抑制炎症，例如，可以以炎症性细胞因子的表达诱导的抑制或炎症性细胞因子的产生抑制等为指标进行研究。
本发明的抗炎症组合物可以以体外方式使用，也可以以体内方式使用。
本发明的抗炎症组合物的给予对象、给予条件、和剂型可以援引前述本发明的组合物和抑制免疫细胞活化的组合物的说明。
＜骨形成方法＞
本发明的骨形成方法使用前述本发明的骨形成组合物。本发明的骨形成方法的特征在于使用前述本发明的组合物，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的骨形成方法，例如可通过促进向成骨细胞的分化、特别是从间充质干细胞向成骨细胞的分化来诱导骨形成。本发明的骨形成方法可以援引前述本发明的组合物、分化促进组合物、和骨形成试剂盒的说明。
本发明的骨形成方法例如包括向给予对象给予本发明的骨形成组合物的给予工序。在通过本发明的骨形成方法以体内方式进行骨形成的情况下，前述本发明的组合物的给予位置可以为要进行骨形成的期望位置。本发明的骨形成方法中，前述给予对象和给予条件可以援引前述本发明的组合物的给予对象和给予条件的说明。
本发明的骨形成方法中，作为前述本发明的骨形成组合物，可以使用前述本发明的骨形成试剂盒。
＜成骨细胞分化促进方法＞
本发明的成骨细胞分化促进方法(以下也称为“分化促进方法”)使用前述本发明的细胞分化促进组合物。本发明的分化促进方法的特征在于使用前述本发明的分化促进组合物，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的分化促进方法，可以促进向成骨细胞的分化、特别是从间充质干细胞向成骨细胞的分化。本发明的分化促进方法可以援引前述本发明的组合物、分化促进组合物、骨形成试剂盒、和骨形成方法的说明。
本发明的分化促进方法例如可以以体外方式实施，也可以以体内方式实施。本发明的分化促进方法例如包括向给予对象给予本发明的分化促进组合物的给予工序。
以体外方式实施本发明的分化促进方法的情况下，本发明的分化促进方法例如包括在前述分化促进组合物存在下使祖细胞分化为成骨细胞的分化工序。本发明的分化促进方法可以在前述分化工序之前包括维持工序，所述维持工序在前述分化促进组合物存在下对祖细胞进行维持培养。前述本发明的分化促进组合物的给予对象和给予条件可以援引例如本发明的分化促进组合物中的给予对象和给予条件的说明。
＜抑制免疫细胞活化的方法＞
本发明在另一方式中提供一种抑制免疫细胞活化的方法。本发明的抑制免疫细胞活化的方法(以下也称为“活化抑制方法”)使用前述本发明的抑制免疫细胞活化的组合物。本发明的活化抑制方法的特征在于使用前述本发明的活化抑制组合物，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的活化抑制方法，能够抑制免疫细胞的活化。本发明的活化抑制方法可以援引前述本发明的组合物、分化促进组合物、骨形成试剂盒、活化抑制组合物、抗炎症组合物、骨形成方法、和分化促进方法的说明。
本发明的活化抑制方法例如可以以体外方式实施，也可以以体内方式实施。本发明的活化抑制方法例如包括向给予对象给予本发明的活化抑制组合物的给予工序。
以体外方式实施本发明的活化抑制方法的情况下，本发明的活化抑制方法例如包括在前述活化抑制组合物存在下培养免疫细胞的培养工序。前述本发明的活化抑制组合物的给予对象、给予条件、和剂型可以援引例如本发明的活化抑制组合物中的给予对象、给予条件、和剂型的说明。
＜炎症抑制方法＞
本发明在另一方式中提供一种抑制炎症的方法。本发明的炎症抑制的方法(以下也称为“抑制方法”)使用前述本发明的抗炎症组合物。本发明的炎症抑制方法的特征在于使用前述本发明的抗炎症组合物，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的炎症抑制方法，可以抑制炎症。本发明的炎症抑制方法可以援引前述本发明的组合物、分化促进组合物、骨形成试剂盒、活化抑制组合物、抗炎症组合物、骨形成方法、分化促进方法、和活化抑制方法的说明。
本发明的炎症抑制方法例如可以以体外方式实施，也可以以体内方式实施。本发明的炎症抑制方法例如包括向给予对象给予本发明的抗炎症组合物的给予工序。
以体外方式实施本发明的炎症抑制方法的情况下，本发明的炎症抑制方法例如包括在前述抗炎症组合物存在下培养给予对象的培养工序。前述本发明的抗炎症组合物的给予对象、给予条件、和剂型可以援引例如本发明的抗炎症组合物中的给予对象、给予条件、和剂型的说明。
＜组合物的使用＞
本发明为用于骨形成的、包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物或其应用。本发明为用于促进成骨细胞分化的、包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物或其应用。本发明用于抑制免疫细胞活化的、包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物或其应用。本发明为用于抑制炎症的、包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物或其应用。本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物的、用于制造骨形成组合物的应用。另外，本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物的、用于制造成骨细胞分化促进组合物的应用。本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物的、用于制造抑制免疫细胞活化的组合物。本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物的、用于制造抗炎症组合物的应用。本发明可以援引前述本发明的组合物、分化促进组合物、骨形成试剂盒、活化抑制组合物、抗炎症组合物、骨形成方法、分化促进方法、活化抑制方法、和炎症抑制方法的说明。
实施例
以下，使用实施例对本发明进行详细地说明，本发明不限定于实施例中记载的方式。
[实施例1]
制造本发明的组合物，确认了包含生长因子和生长因子受体、并且具有细胞增殖促进活性和促进向成骨细胞分化的活性。
(1)永生化巨核细胞的制作
永生化巨核细胞按以下的顺序制作。
(1-1)由iPS细胞制备造血祖细胞
依据下述参考文献8记载的方法，实施了由使用人iPS细胞(TKDN SeV2和NIH5：使用仙台病毒建立的人胚胎皮肤成纤维细胞来源iPS细胞)向血细胞的分化培养。具体而言，将人ES/iPS细胞集落在20ng/ml VEGF(R&DSYSTEMS公司制)存在下与C3H10T1/2饲养层细胞共培养14天而制作了造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cells；HPC)。培养条件以37℃、20％O2、5％CO2实施(只要没有特别记载，以下为相同条件)。
参考文献8：Takayama N.et al.,“Transient activation of c-MYC expressionis critical for efficient platelet generation from human induced pluripotentstem cells”,J.Exp.Med.,2010,vol.13,pages 2817-2830
(1-2)基因导入系统
基因导入系统利用慢病毒载体系统。慢病毒载体是四环素调节性的Tet-on(注册商标)基因表达诱导系统载体。可以通过将LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(下述参考文献9)的mOKS盒替换为c-MYC、BMI1、或BCL-xL而制作。将导入了c-MYC、BMI1、或BCL-xL的载体分别称为LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、和LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G。c-MYC、BMI1、和BCL-xL病毒通过用前述慢病毒载体基因导入293T细胞中而制作。通过使目标细胞感染得到的病毒，从而将c-MYC、BMI1、和BCL-xL基因导入目标细胞的基因组序列中。稳定地导入基因组序列中的这些基因可以通过在培养基中加入多西环素(clontech#631311)而强制表达。
参考文献9：Kobayashi,T.et al.,“Generation of rat pancreas in mouse byinterspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells.”,Cell,2010,vol.142,No.5,pages 787-799
(1-3)使c-MYC和BMI1病毒感染造血祖细胞
在预先接种了C3H10T1/2饲养细胞的6孔板上，以成为5×104个细胞/孔的方式接种利用前述(1-1)的方法得到的HPC，利用使用了BMI1病毒和c-MYC病毒的慢病毒法强制表达c-MYC和BMI1。此时，针对1种细胞株使用6个孔。具体而言，分别以成为MOI(multiplicityof infection)20的方式将病毒颗粒添加至培养基中，用自旋感染(Spin infection)(32℃、900rpm、60分钟离心)使其感染。前述自旋感染间隔12小时实施了2次。使用如下培养基：在含有基础培养基(15％胎牛血清(GIBCO)、1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺(GIBCO)、1％胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(ITS-G)(GIBCO)、0.45mmol/l 1-硫代甘油(Sigma-Aldrich)、50μg/mlL-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)的IMDM(Iscove’s改良杜尔贝科培养基)(Sigma-Aldrich))中，以成为50ng/ml人促血小板生成素(TPO)(R&D SYSTEMS)、50ng/ml人干细胞生长因子(SCF)(R&D SYSTEMS)和2μg/ml多西环素(Dox、clontech#631311)的方式添加了各物质的培养基(以下为分化培养基)中，进一步以最终浓度为10μg/ml的方式添加了鱼精蛋白而成的培养基。
(1-4)巨核细胞自增殖株的制作和维持培养
将利用前述(1-3)的方法实施了c-MYC和BMI1病毒的感染之日作为感染第0天，如下所述，通过培养导入了c-MYC基因和BMI1基因的HPC，从而分别制作了巨核细胞自增殖株。c-MYC基因和BMI1基因的强制表达通过在培养基中以成为1μg/ml DOX的方式添加DOX而实施。
·感染第2天～感染第11天
在感染第2天，通过移液回收利用上述的方法得到的已感染病毒的血细胞，以1200rpm、5分钟进行离心操作去除上清液后，用新鲜的分化培养基进行悬浮并接种到新鲜的C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。在感染第9天进行同样的操作，从而实施了传代。前述再次接种时，计数细胞数后，以成为1×105个细胞/2ml/孔的方式接种在C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。
·感染第12天～感染第13天
实施与感染第2天同样的操作。计数细胞数后，以成为3×105个细胞/10ml/100mm培养皿的方式，接种在C3H10T1/2饲养细胞上(100mm培养皿)。
·感染第14天
回收已感染病毒的血细胞，相对于1.0×105个细胞，分别使用2μl、1μl、和1μl的抗人CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人CD42b-PE抗体(eBioscience)、和抗人CD235ab-pacific blue(BioLegend)抗体，使前述血细胞与抗体反应。前述反应后，使用FACS Verse(商标)(BD Biosciences)进行解析。在感染第14天，将CD41a阳性率为50％以上的细胞作为巨核细胞自增殖株。
(1-5)使巨核细胞自增殖株感染BCL-xL病毒
在前述感染第14天的巨核细胞自增殖株中利用使用了BCL-xL病毒的慢病毒法基因导入BCL-xL。以成为MOI 10的方式在培养基中添加病毒颗粒，通过自旋感染(32℃、900rpm、60分钟离心)使其感染。BCL-xL基因的强制表达通过在培养基中以成为1μg/ml DOX的方式添加DOX而实施。
(1-6)巨核细胞永生化株的制作和维持培养
·感染第14天～感染第18天
回收利用前述(1-5)的方法得到的导入了BCL-xL基因的巨核细胞自增殖株，进行1200rpm、5分钟离心操作。前述离心后，用新鲜的分化培养基悬浮沉淀的细胞后，在新鲜的C3H10T1/2饲养细胞上以成为2×105个细胞/2ml/孔的方式接种(6孔板)。
·感染第18天：传代
回收导入BCL-xL基因后的巨核细胞自增殖株，计数细胞数后，以成为3×105个细胞/10ml/100mm培养皿的方式接种。
·感染第24天：传代
回收导入BCL-xL基因后的巨核细胞自增殖株，计数细胞数后，以成为1×105个细胞/10ml/100mm培养皿进行接种。之后，每隔4-7天同样地进行传代，进行维持培养。需要说明的是，进行传代时，悬浮于新鲜的分化培养基上，进行接种。
在感染第24天回收基因导入了BCL-xL的巨核细胞自增殖株，相对于1.0×105个细胞，分别使用2μl、1μl、和1μl的抗人CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人CD42b-PE抗体(eBioscience)、和抗人CD235ab-Pacific Blue(Anti-CD235ab-PB；BioLegend)抗体，在免疫染色后使用FACS Verse(商标)进行解析。此外，感染第24天，将CD41a阳性率为50％以上的株作为永生化巨核细胞株。将感染后能够增殖24天以上的这些细胞作为永生化巨核细胞株SeV2-MKCL和NIH5-MKCL。
将得到的SeV2-MKCL和NIH5-MKCL在10cm培养皿(10ml/培养皿)中静置培养。关于培养基，以IMDM作为基础培养基并加入了以下的成分(浓度为终浓度)。培养条件为37℃、5％CO2。
FBS(Sigma#172012lot.12E261)15％
L-谷氨酰胺(Gibco#25030-081)2mmol/l
ITS(Gibco#41400-045)100倍稀释
MTG(单硫代甘油,sigma#M6145-25ML)450μmol/l
抗坏血酸(sigma#A4544)50μg/ml
嘌呤霉素(sigma#P8833-100MG)2μg/ml
SCF(和光纯药#193-15513)50ng/ml
TPO样作用物质200ng/ml
(2)巨核细胞的培养物的生产
通过在不包含DOX的培养基中培养，从而解除强制表达。具体而言，用PBS(-)将利用前述(1)的方法得到的永生化巨核细胞株(SeV2-MKCL和NIH5-MKCL)清洗2次，悬浮于下述血小板生产培养基。细胞的接种密度为1.0×105个细胞/ml。
关于前述血小板生产培养基，以IMDM作为基础培养基且加入了以下的成分(浓度为终浓度)。
人血浆A6％
L-谷氨酰胺(Gibco#25030-081)4mmol/l
ITS(Gibco#41400-045)100倍稀释
MTG(单硫代甘油,sigma#M6145-25ML)450μmol/l
抗坏血酸(sigma#A4544)50μg/ml
SCF(和光纯药#193-15513)50ng/ml
TPO样作用物质200ng/ml
ADAM抑制剂15μmol/l
GNF351(Calbiochem#182707)500nmol/LY39983(Chemscene LLC#CS-0096)500nmol/l
尿激酶5U/ml
低分子肝素(SANOFI、Clexane)1U/ml
此外，在前述血小板生产培养基存在下培养6天，产生血小板，从而生产巨核细胞的培养物。
(3)纯化血小板的制造
对于前述(2)中得到的巨核细胞的培养物，按照以下的顺序，制造(纯化)血小板。需要说明的是，实施了2次同样的纯化。
(3-1)巨核细胞的培养物的浓缩
对于前述(2)中得到的巨核细胞的培养物，导入培养物袋中。此外，对于前述培养物袋，如图1所示，连接浓缩系统。图1中，清洗保存液袋1和2包含清洗保存液。前述清洗保存液使用：在BICANATE输液(BICARBON输液、大塚制药公司制)中添加20％ACD和2.5％人血清白蛋白且用NaOH调节至pH7.2所得者。此外，依据下述表1，使用中空纤维膜(Plasmaflo.OP、Asahi Kasei Medical Co.,Ltd.制)，将前述巨核细胞的培养物浓缩，将得到的巨核细胞的培养物的浓缩液回收至储藏袋中。
[表1]
(3-2)血小板的离心
首先，使用无菌连接装置，将ACP215一次性套装的废液袋置换成回收用袋。前述回收用袋使用HICALIQ IVH袋(Terumo HC-B3006A)。接着，在前述巨核细胞的培养物的浓缩液中添加10％量的ACD-A液体(Terumo公司制)。前述添加后，将添加了ACD-A液体的浓缩液注入细胞袋中。前述细胞袋使用HICALIQ IVH袋(Terumo HC-B3006A)。
接着，使用无菌连接装置，使包含添加了ACD-A液体的培养物的细胞袋与ACP215一次性套装连接。此外，在服务模式下启动ACP215，将转速设定为2500rpm(350×g)。启动ACP215，以约100ml/分钟将前述细胞袋中的培养物导入分离碗中。将从前述分离碗流出的液体成分回收至回收袋中。将前述细胞袋中的培养物的总量导入分离碗后，进而将500ml的清洗保存液导入前述分离碗中。在前述分离碗导入前述清洗保存液后，停止离心并使用塑管封口机使包含回收液(包含血小板的回收液体成分)的回收袋分开。
使用前述无菌连接装置将包含回收液(包含血小板)的回收袋连接到新的ACP215一次性套装上。在通常模式下启动ACP215。程序设定选择WPC，依据设备的指示，设置连接了前述回收袋的ACP215一次性套装。需要说明的是，包含回收液的回收袋设置于支架上。
接着，将ACP215的离心速度变更为5000rpm(1398.8×g)，开始进行离心。在开始将前述回收液导入前述分离碗中时，从自动注入变更为手动注入。具体而言，以约100ml/分钟的导入速度将前述回收液导入前述分离碗中。将前述回收液总量添加至分离碗中后，进而追加500ml的清洗保存液。
(3-3)血小板的清洗
对于清洗，依据ACP215的程序，用2000ml的前述清洗保存液进行清洗。
(3-4)血小板的回收
依据ACP215的程序，将200ml的经清洗的血小板回收至血小板制剂袋中。
(3-5)血小板的分离
对于前述血小板制剂袋，使用前述中空纤维膜，利用常规方法将血小板分离，回收至回收用袋中。
(4)提取物的制造
作为前述巨核细胞或其培养物，使用利用前述(1)的方法得到的永生化巨核细胞株、前述(3-5)中得到的回收至血小板制剂袋中的血小板、和回收至排液袋中的去除了血小板的巨核细胞的培养物(以下也统称为“原材料”)。对于去除了血小板的巨核细胞的培养物，使用分别制备的4个样品(血小板去除巨核细胞培养物1～4)。
对于各原材料，用清洗液清洗2次。前述清洗液使用：在BICANATE输液中以成为约20(v/v)％的方式添加ACD-A液体后，添加NaOH，将pH调节至7.0～7.4的范围内所得者。前述清洗后，将各原材料在2000×g、10分钟、室温(约25℃)的条件下进行离心。前述离心后，回收沉淀物，使用液氮，将前述沉淀物冷冻。接着，在冷冻的沉淀物中添加细胞溶解缓冲液，在50rpm、4℃下振荡30分钟，由此使其溶解。前述细胞溶解缓冲液使用：在市售的细胞溶解缓冲液(2×Cell Lysis Buffer、RayBiotech公司制、Cat.No.:AA-LYS)中添加了蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail、RayBiotech公司制、Cat.No.:AA-PI)所得者。
对于得到的溶解液，在14000×g、5分钟、4℃的条件下进行离心。前述离心后，将上清液回收作为实施例的处理物。对于由各原材料得到的处理物，使用Pierce(商标)BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制)，测定总蛋白浓度。其结果，使用永生化巨核细胞株时，由2.2×107个细胞提取2.604mg的总蛋白。另外，使用血小板时，由2.5×108个细胞提取1.187mg的总蛋白。进而，使用血小板去除巨核细胞培养物1～4时，由1.97×108个细胞、5.25×108个细胞、3.64×108个细胞、6.22×108个细胞分别提取2.8、5.944、3.6、和4.496mg的总蛋白。此外，将总蛋白浓度调整为5mg/ml后，对于各处理物，使用Quantibody(注册商标)人生长因子阵列1(RayBiotech公司制)，测定生长因子(bFGF、IGFBP-1、IGFBP-2、PIGF、VEGF、GDF-15、AR、BMP-7、HGF)和生长因子受体(SCFR、EGFR、VEGFR2)的浓度(pg/总蛋白5mg)。将这些结果示于下述表2。需要说明的是，下述表2也可以称为每5mg总蛋白的浓度。
[表2]
单位：pg/mL
(5)细胞增殖促进活性的确认
将人脂肪组织来源间充质干细胞以成为2.4～4.8×105个细胞/10ml培养基/培养皿的方式接种在10cm培养皿中。需要说明的是，作为前述间充质干细胞，使用将市售的人脂肪组织来源间充质干细胞(Takara Bio公司制、Cat.No.:C-12977)进行2次传代培养后回收的细胞。对于前述培养基，在间充质干细胞增殖培养基2(Mesenchymal Stem Cell GrowthMedium 2、Takara Bio公司制、Cat.No.:C-28009)中添加将由血小板去除巨核细胞培养物2制备的组合物冷冻后溶解所得者。前述组合物以培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度成为规定浓度(0、125、250、或500μg/ml)的方式添加。需要说明的是，前述培养基为维持培养基。
前述接种后，将前述间充质干细胞在37℃、5％CO2的湿润下培养3天。前述培养后，回收前述间充质干细胞，在同样的条件下接种，再次在37℃、5％CO2的湿润下培养3天。接着，回收前述培养后的间充质细胞，计数细胞数。此外，计算出以前述接种时的细胞数为基准(1)时的回收时的细胞数的相对值，将其作为增殖活性的相对值。另外，基于前述接种时的细胞数及前述回收时的细胞数，计算出细胞增殖一次所需的时间(倍增时间)。将这些结果示于图2。
图2是示出细胞的增殖活性的图。图2中，(A)示出增殖活性，(B)示出倍增时间。图2的(A)中，横轴表示前述组合物来源的总蛋白浓度，纵轴表示增殖活性的相对值。图2的(B)中，横轴表示前述组合物来源的总蛋白浓度，纵轴表示倍增时间，图中的数值表示倍增时间。如图2的(A)所示，添加本发明的组合物时，间充质干细胞的增殖活性依赖于前述组合物来源的总蛋白浓度地增加。另外，虽未图示，但未添加前述组合物的间充质干细胞中，第3次传代后的倍增时间为21小时。如图2的(B)所示，未添加本发明的组合物时，间充质干细胞的倍增时间延长至约1.5倍。相对于此，如图2的(B)所示，添加了本发明的组合物时，依赖于前述组合物来源的总蛋白浓度地，间充质干细胞增殖一次所需的时间缩短。另外，在未添加本发明的组合物的培养基中培养时，间充质干细胞在得到传代次数时倍增时间延长。相对于此，添加了本发明的组合物时，前述倍增时间的延长基本得到抑制。因此，可知本发明的组合物显示出细胞增殖促进活性、和能够抑制增殖活性的降低。
(6)分化促进活性的确认
与前述(5)同样地对前述间充质干细胞进行维持培养。接着，将各孔的培养基更换成等量的分化培养基(分化开始第0天)。前述分化培养基是向间充质干细胞成骨细胞分化培养基(Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium、Takara Bio公司制、Cat.No.:C-28013)中添加将由血小板去除巨核细胞培养物2制备的组合物的冷冻后溶解而得的物质而成的。以分化培养基中前述组合物来源的总蛋白浓度达到规定浓度(0、125、或250μg/ml)且与维持培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度的组合为下述表3的组合的方式来添加前述组合物。
[表3]
○：实施
NT：未实施
在前述接种后，将前述间充质干细胞在37℃、5％CO2且湿润下培养14天。在前述培养中，每隔3天或4天进行培养基更换。分化开始后第7天，对于各样品，通过使用染色试剂盒(TRACP&ALP double-stain Kit、Takara Bio公司制、Cat.No.:MK300)进行染色来确认碱性磷酸酶的表达。阴性对照中，代替前述分化培养基而仅添加前述维持培养基，除此以外同样地实施。将其结果示于图3。
图3示出ALP染色图像。如图3所示，任意样品的情况下均为ALP阳性，可以确认诱导了向成骨细胞的分化。另外，将本发明的组合物添加于维持培养基或分化培养基的情况下，与未将本发明的组合物添加于维持培养基和分化培养基的情况以及阴性对照相比，培养后的间充质干细胞被ALP强烈染色，表明向成骨细胞的分化得到促进。
另外，分化开始后第14天，对于各样品，使用茜素红S对钙进行染色，由此来确认骨基质的形成。阴性对照中，代替前述分化培养基而仅添加前述维持培养基，除此以外同样地实施。将其结果示于图4。
图4示出钙的染色图像。如图4所示，维持培养基和分化培养基中均未添加本发明的组合物的样品和阴性对照中，钙基本未染色。与此相对地，维持培养基和分化培养基的至少一者中添加了本发明的组合物的样品中，钙被染色，可以确认发生了骨基质的形成。即，可知本发明的组合物促进了向成骨细胞的分化。
进而，在分化开始后第10、14和18天，测定培养基中的钙离子浓度。前述培养基中的钙离子浓度使用离子选择型电极(BIOPROFILE(注册商标)FLEX、NOVA BIOMEDICAL公司制)来进行测定。需要说明的是，培养开始时的培养基中的钙离子浓度为0.88mmol/l。另外，前述间充质干细胞分化成了成骨细胞和成骨细胞时，利用培养基中的钙而形成骨基质。因此，可以以钙离子浓度下降为指标来评价向成骨细胞和骨细胞的分化。将这些结果示于图5。
图5为示出培养基中的钙离子浓度的图。图5中，横轴表示维持培养基和分化培养基中的组合物来源的总蛋白浓度、以及各测定日的钙离子浓度实测值，纵轴表示钙离子浓度。如图5所示，在分化开始第10天，添加了本发明的组合物的样品的钙离子浓度与未添加本发明的组合物的样品为同等程度或者更低。另外，在分化开始第14天，添加了本发明的组合物的样品的钙离子浓度与未添加本发明的组合物的样品相比显著下降。并且，在分化开始第18天，添加了本发明的组合物的样品的钙离子浓度与未添加本发明的组合物的样品为同等或更低。由这些结果可知，添加本发明的组合物时，更早地进行向成骨细胞和骨细胞的分化，培养基中的钙的摄入也更早开始。由这些结果可知，本发明的组合物具有促进向成骨细胞分化的活性。
[实施例2]
确认了本发明的组合物具有细胞增殖促进活性和促进向成骨细胞分化的活性。
(1)细胞增殖促进活性的确认
作为前述间充质干细胞，在2次传代培养后，回收并进行冷冻保存。使用将前述冷冻保存的细胞解冻后传代培养1次的细胞，以使前述维持培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度成为规定浓度(0、0.2、1.3、31.3、62.5、或125μg/ml)的方式进行添加，除此以外与前述实施例1(5)同样地，计算出增殖活性和倍增时间。将这些结果示于图6。
图6是示出细胞的增殖活性的图。图6中，(A)示出增殖活性，(B)示出倍增时间。图6的(A)中，横轴表示前述组合物来源的总蛋白浓度，纵轴表示增殖活性的相对值。图6的(B)中，横轴表示前述组合物来源的总蛋白浓度，纵轴表示倍增时间。如图6的(A)所示，添加了本发明的组合物时，间充质干细胞的增殖活性依赖于前述组合物来源的总蛋白浓度地增加，特别是，总蛋白浓度为31.3μg/ml以上时，间充质干细胞的增殖活性显著增加。另外，虽未图示，但未添加前述组合物的间充质干细胞中，第3次传代后的倍增时间为17小时。如图6的(B)所示，未添加本发明的组合物时，间充质干细胞的倍增时间延长至约1.5倍。相对于此，如图6的(B)所示，添加了本发明的组合物时，依赖于前述组合物来源的总蛋白浓度地，间充质干细胞增殖一次所需的时间缩短，特别是，总蛋白浓度为31.3μg/ml以上时，间充质干细胞增殖一次所需的时间显著缩短。另外，在未添加本发明的组合物的培养基中培养时，间充质干细胞得到传代次数时倍增时间延长。相对于此，添加了本发明的组合物时，前述倍增时间的延长基本得到抑制，将前述组合物来源的总蛋白浓度设为31.3μg/ml以上时，该效果是显著的。因此，可知：本发明的组合物显示出细胞增殖促进活性、和能够抑制增殖活性的降低。
(2)分化促进活性的确认
与前述实施例2的(1)同样地对前述间充质干细胞进行维持培养。接着，将各孔的培养基更换为等量的分化培养基(分化开始第0天)。前述分化培养基是向间充质干细胞成骨细胞分化培养基中添加将由血小板去除巨核细胞培养物2制备的组合物冷冻后溶解而得的物质而成的。以分化培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度成为规定浓度(0、0.2、1.3、31.3、62.5、或125μg/ml)且与维持培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度的组合为下述表4的组合的方式添加前述组合物。
[表4]
○：实施
NT：未实施
在前述接种后，与前述实施例1的(6)同样地进行培养。接着，在分化开始后第14和18天，对于各样品，与前述实施例1的(6)同样地对钙进行染色，由此确认骨基质的形成。将其结果示于图7和8。
图7和8示出钙的染色图像。如图7和8所示，维持培养基和分化培养基中均未添加本发明的组合物的样品和阴性对照中，钙基本未染色。与此相对地，维持培养基和分化培养基的至少一者中添加了本发明的组合物的样品中，钙被染色，可以确认发生了骨基质的形成。即，可知本发明的组合物促进了向成骨细胞的分化。
进而，在分化开始后第6、10、14和18天，与前述实施例1的(6)同样地测定培养基中的钙离子浓度。将这些结果示于图9。
图9为示出培养基中的钙离子浓度的图。图9中，横轴表示维持培养基和分化培养基中的组合物来源的总蛋白浓度、以及各测定日的钙离子浓度实测值，纵轴表示钙离子浓度。如图9所示，在分化开始第6天和第10天，添加了本发明的组合物的样品的钙离子浓度与未添加本发明的组合物的样品为同等程度或者更低。另外，在分化开始第14天，添加了本发明的组合物的样品的钙离子浓度与未添加本发明的组合物的样品相比显著下降，在前述分化培养基中的组合物来源的总蛋白浓度为1.3μg/ml的样品中特别显著。并且，在分化开始第18天，添加了本发明的组合物的样品的钙离子浓度与未添加本发明的组合物的样品为同等或更低。由这些结果可知，添加本发明的组合物时，更早地进行向成骨细胞和骨细胞的分化，培养基中的钙的摄入也更早开始。另外可知，本发明的组合物的促进向成骨细胞分化的活性即使在组合物来源的总蛋白浓度低至0.2μg/ml的条件下也可得到。由这些结果可知，本发明的组合物具有促进向成骨细胞分化的活性。
[实施例3]
确认本发明的组合物具有细胞增殖促进活性和促进向成骨细胞分化的活性。
(1)细胞的增殖促进活性的确认
将人骨髓来源间充质干细胞(BMMSC、PromoCell公司制、Cat No.C-12974)以5×104个细胞/孔接种于24孔板并培养7天。培养基更换通过每3天将培养基的2/3量更换为新的培养基来实施。需要说明的是，在以前述接种密度开始进行培养时，为约7天左右达到80％汇合的细胞密度。BMMSC的基本培养基设为含有10％FBS和1％抗菌药(Ab)的DMEM培养基(low-glucose)。
在前述培养开始后24小时时，以前述基本培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度成为规定浓度(0、125、250、或500μg/ml)的方式添加前述实施例1的(4)中制备的血小板去除巨核细胞培养物来源的组合物。然后在添加前述组合物后第3、5、或7天，使用细胞数计数试剂盒(WST8、Cell Counting Kit-8、Dojindo公司制、Cat No.347-07621)按照附带的说明书计算细胞数。另外，使用对硝基苯基磷酸酯(SIGMAFAST(商标)对硝基苯基磷酸酯板、SIGMA公司制、Cat No.N1891)，通过测定405nm处的吸光度来研究ALP活性。然后计算每1个细胞的ALP活性值。将这些结果示于图10和图11。
图10为示出细胞数的图。图10中，横轴表示组合物添加后的天数，纵轴表示细胞数。另外，图中的浓度表示总蛋白浓度(以下也同样。)。如图10所示，在用包含本发明的组合物的培养基进行培养时，浓度依赖性地促进细胞增殖。需要说明的是，添加500μg/ml的组在第7天时，细胞数减少，这是由于在第5天达到了汇合。
接着，图11为示出ALP活性的图。图11的(A)中，横轴表示组合物添加后的天数，纵轴表示ALP活性(吸光度OD405)。图11的(B)中，横轴表示组合物添加后的天数，纵轴表示ALP活性(相对于细胞数的ALP活性值)。如图11的(B)所示，在以孔为单位时ALP活性在第5天达到最大，在第7天开始下降。另一方面，如图11的(A)所示，在以细胞为单位时，任一培养条件下ALP活性均经时下降。通常，MSC会随着增殖而进行分化，因此ALP活性会经时上升。但是可推测，在本发明的组合物存在时，一方面诱导了强增殖，另一方面抑制了ALP活性，因此分化诱导得到抑制。由这些可知，本发明的组合物显示出细胞的增殖促进活性。
(2)分化促进活性的确认
与前述实施例3的(1)同样地对人骨髓来源间充质干细胞进行7天培养。
在前述培养后，将各孔的培养基更换为前述基本培养基或者更换为含有作为成骨细胞分化因子的100μg/ml的抗坏血酸和前述组合物的基本培养基(分化培养基)，培养2周，从而诱导成骨细胞。培养基更换通过每3天将培养基的2/3量更换为新的培养基来实施。以前述基本培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度成为规定浓度(0、125、250、或500μg/ml)的方式添加前述组合物。前述组合物使用前述实施例1的(4)中制备的血小板去除巨核细胞培养物来源的组合物。
以前述诱导开始日为基准，在7、10或14天测定细胞数和ALP活性。前述细胞数使用前述细胞数计数试剂盒，按照附带的说明书进行计算。通过使用对硝基苯基磷酸酯(SIGMAFAST(商标)对硝基苯基磷酸酯板、SIGMA公司制、Cat No.N1891)测定405nm处的吸光度，来研究ALP活性。然后计算每1个细胞的ALP活性值。将这些结果示于图12和13。
图12为示出细胞数的图。图12中，横轴表示成骨细胞分化诱导开始后的天数，纵轴表示细胞数。如图12的(A)所示，不含成骨细胞分化因子时，用包含本发明的组合物的培养基进行培养时，可观察到细胞数经时而增加。另一方面，如图12的(B)所示，包含成骨细胞分化因子时，用包含本发明的组合物的培养基进行培养时，浓度依赖性地抑制细胞数的经时减少。
接着，图13为示出ALP活性的图。图13的(A)和(C)中，横轴表示成骨细胞分化诱导开始后的天数，纵轴表示ALP活性(吸光度OD405)。在图13的(B)和(D)中，横轴表示组合物添加后的天数，纵轴表示ALP活性(相对于细胞数的ALP活性值)。如图13的(A)和(B)所示，不含成骨细胞分化因子时，用包含本发明的组合物的培养基进行培养时，ALP活性经时而增加，但是在与不含本发明的组合物的比较例的培养基(0μg/ml)之间未观察到ALP活性差异。另一方面，如图13的(C)和(D)所示，包含成骨细胞分化因子时，用包含本发明的组合物的培养基进行培养时，在分化诱导开始后第14天，与用不含本发明的组合物的比较例的培养基(0μg/ml)进行培养的情况相比ALP活性显著上升。需要说明的是，对于比较例的培养基(0μg/ml)，在分化诱导开始后第10天观察到吸光度上升，推测这是细胞增殖、从而细胞数增加所引起的。由这些结果可知，本发明的组合物在利用抗坏血酸的成骨细胞分化诱导体系中也能够促进成骨细胞的分化诱导。另外可知，本发明的组合物促进向由成骨细胞分化因子诱导的成骨细胞的分化诱导。因此，本发明的组合物具有促进向成骨细胞分化的活性。
[实施例4]
确认本发明的组合物以体内方式促进骨形成和骨生成。
作为骨形成模型，使用在裸小鼠颅骨上进行骨形成的模型。具体而言，在全身麻醉(3种混合)下，将本发明的组合物与人工骨材料一起作为移植试样移植到裸小鼠(8周龄BALB/cAJCL-nu/nu)的颅骨上(骨膜下)。具体而言，设定下述4组。
·阴性对照组(n＝5)
移植仅由25mg的β-TCP(β-磷酸三钙)颗粒(β-TCP granules、OSferion G1、OympusTerumo公司制)制备的移植试样。
·阳性对照组(n＝9)
移植25mg的β-TCP颗粒和富血小板血浆(PRP)。富血小板血浆使用由小鼠的外周血以外周血中的血小板浓度成为6倍浓度的方式浓缩血小板而得者制备移植试样并进行移植。
·实施例4A(n＝5)
使用25mg的β-TCP颗粒和包含与阳性对照相同数量细胞(1.65×108个)的由血小板去除巨核细胞培养物制备的组合物(总蛋白约2mg)制备移植试样并进行移植。
·实施例4B(n＝16)
使用25mg的β-TCP颗粒和包含阳性对照的5倍细胞(8.25×108个)的由血小板去除巨核细胞培养物制备的组合物制备移植试样并进行移植。
各人工骨材料如下所述地制备。
·阴性对照组
玻璃混料杯(Dappen glass)上，将灭菌后的TCP 25mg与50μl牛纤维蛋白原(10mg/ml)(Sigma,F8630)混合，添加5μl牛凝血酶(100U/ml)(Sigma,T9549)而凝胶化。为了在凝胶化后迅速进行移植，这些工序在动物中心内实施。
·阳性对照组
在低蛋白吸附性管中，使100μl的前述富血小板血浆(PRP)浸渗于25mg的β-TCP颗粒中。在前述浸渗后，混合10μl的自体血清(10mg/ml)，添加5μl凝血酶(100U/ml)而凝胶化。为了在凝胶化后迅速进行移植，这些工序在动物中心内实施。
·实施例4A
在低蛋白吸附性管中将8μl的本发明的组合物和32μl的灭菌水(DW)混合，接着使其浸渗到25mg TCP中。在前述浸渗后，混合10μl纤维蛋白原(10mg/ml)，添加5μl凝血酶(100U/ml)而凝胶化。为了在凝胶化后迅速进行移植，这些工序在动物中心内实施。
·实施例4B
在低蛋白吸附性管中，使25mg TCP浸渗于40μl的本发明的组合物中。在前述浸渗后，混合10μl纤维蛋白原(10mg/ml)，添加5μl凝血酶(100U/ml)而凝胶化。为了在凝胶化后迅速进行移植，这些工序在动物中心内实施。
在前述移植后第4周或第8周，摘除包含周围颅骨的移植试样后，进行基于HE染色的组织学观察。另外，一并使用软件(ImageJ)对发生了骨形成或骨质增生的区域以像素单位进行计数，由此研究骨形成量和骨生成量。需要说明的是，骨形成量是以移植试样内新形成的新生骨部为对象区域，骨生成量是以新生骨、骨髓和其周围的人工骨为对象区域。需要说明的是，骨形成量和骨质增生量通过阴性对照组的骨形成量和骨质增生量进行了校正。将这些结果示于图14和15。
图14为示出骨形成的照片。图14中，各照片从左侧起为示出实施例4A、实施例4B、阳性对照组和阴性对照组的结果的照片。另外，各组的照片中，上排为用倍率20倍的物镜拍摄的照片，下排为用倍率100倍的物镜拍摄的照片，为上排的虚线部所示区域的放大照片。如图14的(A)～(C)所示，实施例4的(A)和(B)以及阳性对照中，在浅灰色的人工骨的残存部的周围，在深灰色所示区域新形成了骨。
接着，图15为示出骨形成量和骨质增生量的图。图15中，(A)表示骨形成量，(B)表示骨质增生量。图15的(A)中，横轴表示移植材料移植后的时间，纵轴表示骨形成量。另外，图15的(B)中，横轴表示移植材料移植后的时间，纵轴表示骨质增生量。如图14和图15所示，实施例4A在移植后第4～8周确认到与阳性对照组同等程度的新生骨形成、和新生骨周围的包括骨髓和人工骨的骨质增生。进而，实施例4B在移植后第4周确认到超过阳性对照组的骨形成量和骨质增生量，但是在移植后第8周时为与阳性对照组同等程度的骨形成量和骨质增生量。推测这是由于，实施例4B在移植后第4周已经达到了与阳性对照组和实施例4A同等程度的骨形成量和骨质增生量的平台。
[实施例5]
确认本发明的组合物具有抗炎症活性。
(1)免疫细胞的活化
免疫细胞的活化如图16的(A)和图17的(A)所示那样实施。具体而言，首先向24孔板中接种包含15ng/ml的抗人CD3抗体(eBioscience公司制、Cat No.：2045756)和5ng/ml的抗人CD28抗体(eBioscience公司制、Cat No.：1928813)的磷酸缓冲液，孵育过夜(约12小时)，由此使这些抗体固相化于平板。接着使用Ficoll(Histopaque(注册商标)1077、SigmaAldrich)从采自志愿者的外周血分离外周血单核细胞。将前述外周血单核细胞以2.5×106细胞/孔接种到前述24孔板中，开始进行培养。前述外周血单核细胞的培养基使用含有10％FBS和1％Ab的RPMI培养基(gibco公司制、Cat No.：20621736)。
在前述培养开始后1小时时，向各孔中以前述培养基中的组合物来源的总蛋白浓度成为规定浓度(0、125、250、或500μg/ml)的方式添加组合物(iMDF)。前述组合物使用前述实施例1的(4)中制备的血小板去除巨核细胞培养物来源的组合物。添加前述组合物后，进一步培养1小时或3小时。在前述培养后回收前述外周血单核细胞，接着使用mRNA提取试剂(Trizol(注册商标)、Thermo Fisher Scientific公司制)从前述外周血单核细胞中提取总RNA。使用得到的RNA和逆转录酶(SuperScript(商标)III First-Strand SynthesisSystem、Thermo Fisher Scientific公司制)合成cDNA。
(2)细胞因子表达量的测定
使用得到的cDNA、下述引物组和DNA聚合酶(Takara-Taq、宝生物公司制)，利用qPCR装置(Mx3000P QPCR System、安捷伦科技株式会社制)测定各基因的mRNA的表达量。在前述测定后，基于内标基因(GAPDH基因)的表达量算出各基因的相对表达量。阴性对照除了未固相化抗CD3抗体和抗CD28抗体以外(Unstimulated，未刺激)同样地实施。将这些结果示于图16和图17。
·TNF-α用引物组
正向引物(序列号1)
5'-AATGGCGTGGAGCTGAGA-3'
反向引物(序列号2)
5'-TAGACCTGCCCAGACTCGG-3'
·IFN-γ用引物组
正向引物(序列号3)
5'-CTGTTACTGCCAGGACCCAT-3'
反向引物(序列号4)
5'-ACACTCTTTTGGATGCTCTGGT-3'
·IL-1β用引物组
正向引物(序列号5)
5'-CACAGACCTTCCAGGAGAAT-3'
反向引物(序列号6)
5'-TTCAACACGCAGGACAGGTA-3'
·IL-6用引物组
正向引物(序列号7)
5'-GTACATCCTCGACGGCATC-3'
反向引物(序列号8)
5'-AGCCACTGGTTCTGTGCCT-3'
·GAPDH用引物组
正向引物(序列号9)
5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3'
反向引物(序列号10)
5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'
图16和图17为示出实验概要和细胞因子基因的表达量的示意图和图。在图16的(B)～(E)和图17的(B)～(E)中，横轴表示样品种类，纵轴表示各基因的相对表达量。如图17的(B)～(E)所示，本发明的组合物刺激后3小时时，浓度依赖性地抑制外周血单核细胞对TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的表达的诱导。另一方面，如图16的(B)～(E)所示，本发明的组合物刺激后1小时时，浓度依赖性地抑制外周血单核细胞对TNF-α、IL-1β和IL-6的表达的诱导。需要说明的是，刺激后1小时时不抑制IFN-γ的表达诱导，但是在刺激后3小时时抑制IFN-γ的表达诱导，由此可知，本发明的组合物对IFN-γ的表达诱导的抑制在晚于其它炎症性细胞因子的时机表现出效果。本实施例中使用的抗CD3抗体和抗CD28抗体活化T细胞，因此可推断，本发明的组合物是通过抑制T细胞等免疫细胞的细胞因子基因的表达诱导来抑制T细胞等免疫细胞的活化的。
[实施例6]
确认本发明的组合物以体内方式促进颅骨缺损部位的骨形成和骨生成。
作为骨形成模型，使用在裸大鼠颅骨缺损部进行骨形成的模型。具体而言，在全身麻醉(3种混合)下在裸大鼠(8周龄、F344/NJcl-rnu/nu)的颅骨处制作4mm的缺损部位，将本发明的组合物与人工骨材料一起作为移植试样进行移植。具体而言，设定下述2组。
·阴性对照组(n＝17)
移植使PBS浸渗于直径4mm的磷酸八钙(Octacalcium phosphate：OCP)/胶原蛋白(Col)载体而制备的移植试样。
·实施例6(n＝8)
将相当于8.25×108个富血小板血浆的、由血小板去除巨核细胞培养物制备的组合物(总蛋白约25mg)浸渗/吸附于OCP/Col载体，由此制备移植试样并进行移植。
各人工骨材料如下制备。
·阴性对照组
将OCP颗粒(直径300～500μm)和3％猪来源端胶原(telocollagen)混合，在前述混合后进行冷冻干燥。在前述冷冻干燥后进行热交联，由此制作OCP/Col载体(OCP载体、含有重量比77％的OCP；直径5mm、厚度1mm)。
·实施例6
使20μl的本发明的组合物(相当于8.25×108个富血小板血浆)浸渗于OCP载体，得到包含本发明的组合物的OCP载体。
对于阴性对照组和实施例6，以移植于前述缺损部位时为基准，在第4周或第8周摘除包含周围颅骨的移植试样后，对于得到的摘除部进行μCT拍摄。在前述拍摄后，由前述摘除部制作标本，进行基于HE染色或马松三色(Masson trichrome)染色的组织学观察和免疫染色。另外，评价由移植材料新生的骨(新生骨)的骨量和骨盐量、由移植材料新生的骨的骨量(BR)相对于制作缺损部位时摘除的骨的骨量(BS)的比(BR/BS)、以及骨密度。在前述评价中，使用3D骨分析软件(TRI/3D-BON；Ratoc System Engineering公司制)，进行骨形态(骨量：BV(cm3)、骨盐量：BMC(mg)、骨密度：BMD(mg/cm3))的计测。以将缺损骨量设为100％时的比形式来计算前述由移植材料新生的骨的骨量(BR)相对于制作缺损部位时摘除的骨的骨量(BS)的比(BR/BS)。将这些结果示于图18和图19。
图18为生成移植后第4周的骨形成的照片。图18中，各照片的上排表示阴性对照组，下排为示出实施例6的组的结果的照片。另外，各组的照片中，从左侧起为前述摘除部整体、前述缺损部位中的左侧、前述缺损部位中的右侧、和前述摘除部中包含缺损部位的截面的照片。如图18所示，可知在实施例6的组中在颅骨缺损部位新形成了骨。
接着，图19为示出移植后第4周的骨量、骨盐量、新生骨量与缺损骨量的比、和骨密度的图。图19中，(A)表示骨量，(B)表示骨盐量，(C)表示新生骨量与缺损骨量的比(BR/BS)，(D)表示骨密度。图19的(A)中，横轴表示实验组的种类，纵轴表示骨量(BV)(cm3)。图19的(B)中，横轴表示实验组的种类，纵轴表示骨盐量(BMC)(mg)。图19的(C)中，横轴表示实验组的种类，纵轴表示新生骨量与缺损骨量的比(％)。图19的(D)中，横轴表示实验组的种类，纵轴表示骨密度BMD(mg/cm3)。如图19所示，与阴性对照组相比，实施例6中缺损部的左右侧的骨量、骨盐量、新生骨量与缺损骨量的比、和骨密度均增加。由以上可知，本发明的组合物能够在颅骨缺损部位重新形成骨。
由以上可知，本发明的组合物能够诱导骨形成和骨质增生、以及使其成分含量增加，由此能够促进骨形成和骨质增生。
以上，参照实施方式和实施例对本发明进行说明，但本发明不限定于上述实施方式和实施例。本发明的构成、详细情况可以在本申请发明的范围内进行本领域技术人员能够理解的各种变更。
该申请主张以2020年10月27日提出申请的日本申请特愿2020-180042为基础的优先权，将其公开的全部内容引用于此。
＜附录＞
上述的实施方式和实施例的一部分或全部可以如以下的附录所记载，但不限定于以下。
(附录1)
一种骨形成组合物，其包含巨核细胞或其培养物的处理物。
(附录2)
根据附录1所述的骨形成组合物，其中，前述处理物为巨核细胞或其培养物的细胞级分的提取物。
(附录3)
根据附录1或2所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为2000～20000pg的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
(附录4)
根据附录1至3中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为8000～80000pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)。
(附录5)
根据附录1至4中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为1～60pg的胎盘生长因子(PIGF)。
(附录6)
根据附录1至5中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为200～2000pg的干细胞因子受体(SCFR)。
(附录7)
根据附录1至6中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为20～800pg的血管内皮生长因子(VEGF)。
(附录8)
根据附录1至7中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为20～400pg的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)。
(附录9)
根据附录1至8中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为1000～10000pg的分化生长因子-15(GDF-15)。
(附录10)
根据附录1至9中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～1000pg的成骨蛋白-7(BMP-7)。
(附录11)
根据附录1至10中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～16pg的双调蛋白(AR)。
(附录12)
根据附录1至11中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～60pg的上皮生长因子受体(EGFR)。
(附录13)
根据附录1至12中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～100pg的肝细胞生长因子(HGF)。
(附录14)
根据附录1至13中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～200pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)。
(附录15)
根据附录1至14中任一项所述的骨形成组合物，其具有细胞增殖促进活性。
(附录16)
根据附录15所述的骨形成组合物，其中，前述细胞为间充质干细胞。
(附录17)
根据附录1至16中任一项所述的骨形成组合物，其具有促进从成骨细胞的祖细胞向成骨细胞分化的能力。
(附录18)
根据附录17所述的骨形成组合物，其中，前述成骨细胞的祖细胞为间充质干细胞。
(附录19)
根据附录1至18中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述巨核细胞的培养物为去除了血小板的培养物。
(附录20)
根据附录1至19中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述巨核细胞为永生化巨核细胞。
(附录21)
根据附录20所述的骨形成组合物，其中，前述永生化巨核细胞为包含外源性的BMI1基因、MYC基因和Bcl-xL基因的巨核细胞。
(附录22)
根据附录1至21中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述巨核细胞为体外诱导的巨核细胞。
(附录23)
根据附录1至22中任一项所述的骨形成组合物，其中，前述巨核细胞源自多能细胞。
(附录24)
根据附录23所述的骨形成组合物，其中，前述多能细胞为诱导多能干(iPS)细胞。
(附录25)
根据附录1至24中任一项所述的骨形成组合物，其中，
前述处理物为：
对巨核细胞或其培养物进行处理，
前述处理为浓缩处理、干燥处理、冷冻处理、冷冻干燥处理、溶剂处理、表面活性剂处理、酶处理、蛋白质级分提取处理、超声波处理和/或破碎处理。
(附录26)
根据附录25所述的骨形成组合物，其中，
前述处理物为：
从前述巨核细胞或其培养物中去除血小板，
对去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物进行处理。
(附录27)
根据附录26所述的骨形成组合物，其中，
前述处理物为：
保存去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物，
对前述经保存的巨核细胞或其培养物进行处理。
(附录28)
根据附录27所述的骨形成组合物，其中，
前述处理物为：
保存前述巨核细胞或其培养物，
对前述经保存的巨核细胞或其培养物进行破碎处理。
(附录29)
一种骨形成试剂盒，其包含骨形成组合物和骨形成的支架材料，
前述骨形成组合物为附录1至28中任一项所述的骨形成组合物。
(附录30)
根据附录29所述的试剂盒，其中，前述支架材料显示生物相容性和/或生物降解性。
(附录31)
根据附录29或30所述的试剂盒，其中，前述支架材料由选自胶原蛋白、明胶、白蛋白、角蛋白、葡聚糖、羧甲基纤维素、黄原胶、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、透明质酸、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙醇酸与聚乳酸的共聚物、聚羟基丁酸、聚二噁烷酮、聚己内酯、聚琥珀酸丁二醇酯、磷酸钙、羟基磷灰石、聚醚酮和聚醚醚酮所组成的组中的至少1种构成。
(附录32)
根据附录29至31中任一项所述的试剂盒，其中，前述支架材料具有多孔结构。
(附录33)
根据附录29至32中任一项所述的试剂盒，其包含生理活性物质。
(附录34)
根据附录29至33中任一项所述的试剂盒，其包含选自由血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、生长分化因子-5(GDF5)、促红细胞生成因子(EPO)、转化生长因子(TGF)和骨形态生成蛋白组成的组中的至少1种。
(附录35)
一种成骨细胞分化促进组合物，其包含附录1至28中任一项所述的骨形成组合物。
(附录36)
一种抑制免疫细胞活化的组合物，其包含巨核细胞或其培养物的处理物。
(附录37)
根据附录36所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物为巨核细胞或其培养物的细胞级分的提取物。
(附录38)
根据附录36或37所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含2000～20000pg的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
(附录39)
根据附录36至38中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含8000～80000pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)。
(附录40)
根据附录36至39中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含1～60pg的胎盘生长因子(PIGF)。
(附录41)
根据附录36至40中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含200～2000pg的干细胞因子受体(SCFR)。
(附录42)
根据附录36至41中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含20～800pg的血管内皮生长因子(VEGF)。
(附录43)
根据附录36至42中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含20～400pg的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)。
(附录44)
根据附录36至43中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含1000～10000pg的分化生长因子-15(GDF-15)。
(附录45)
根据附录36至44中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含0～16pg的双调蛋白(AR)。
(附录46)
根据附录36至45中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含0～60pg的上皮生长因子受体(EGFR)。
(附录47)
根据附录36至46中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含0～100pg的肝细胞生长因子(HGF)。
(附录48)
根据附录36至47中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述处理物相对于1mg总蛋白包含0～200pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)。
(附录49)
根据附录36至48中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述免疫细胞为T细胞。
(附录50)
根据附录36至49中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述巨核细胞为永生化巨核细胞。
(附录51)
根据附录36至50中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物，其中，前述巨核细胞为体外诱导的巨核细胞。
(附录52)
一种抗炎症组合物，其包含附录36至51中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物。
(附录53)
一种成骨细胞分化促进方法，其使用附录1至28中任一项所述的骨形成组合物。
(附录54)
根据附录53所述的成骨细胞的分化促进方法，其中，以体外方式或以体内方式使用前述骨形成组合物。
(附录55)
一种成骨细胞分化促进方法，其使用附录35所述的成骨细胞分化促进组合物。
(附录56)
根据附录55所述的成骨细胞的分化促进方法，其中，以体外方式或以体内方式使用前述成骨细胞分化促进组合物。
(附录57)
一种抑制免疫细胞活化的方法，其使用附录36至51中任一项所述的抑制免疫细胞活化的组合物。
(附录58)
根据附录57所述的成骨细胞的分化促进方法，其中，以体外方式或以体内方式使用前述抑制免疫细胞活化的组合物。
(附录59)
一种炎症抑制方法，其使用附录52所述的抗炎症组合物。
(附录60)
根据附录59所述的炎症抑制方法，其中，以体外方式或以体内方式使用前述抗炎症组合物。
(附录61)
一种组合物，其用于骨形成且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
(附录62)
一种组合物，其用于促进成骨细胞分化且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
(附录63)
一种组合物，其用于抑制免疫细胞活化且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
(附录64)
一种组合物，其用于抑制炎症且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
产业上的利用可能性
如上所述，根据本发明可以提供细胞来源的具有骨形成活性的组合物。另外，本发明的组合物例如具有细胞增殖促进活性和促进向成骨细胞分化的活性。因此，本发明在医药领域、再生医疗领域等中极有用。
序列表
<110> 国立大学法人长崎大学（NAGASAKI UNIVERSITY）
株式会社美加细胞（MEGAKARYON CORPORATION）
<120> 骨形成组合物和其用途
<130> TF20104WO
<140> JP2020-180042
<141> 2020-10-27
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物，用于TNF-alpha
<400> 1
aatggcgtgg agctgaga 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物，用于TNF-alpha
<400> 2
tagacctgcc cagactcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物，用于INF-gamma
<400> 3
ctgttactgc caggacccat 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物，用于IFN-gamma
<400> 4
acactctttt ggatgctctg gt 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物，用于IL-1beta
<400> 5
cacagacctt ccaggagaat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物，用于IL-1beta
<400> 6
ttcaacacgc aggacaggta 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物，用于IL-6
<400> 7
gtacatcctc gacggcatc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物，用于IL-6
<400> 8
agccactggt tctgtgcct 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物，用于GAPDH
<400> 9
ggagtccact ggcgtcttca c 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物，用于GAPDH
<400> 10
gctgatgatc ttgaggctgt tgtc 24
Claims (20)
1.一种骨形成组合物，其包含巨核细胞或其培养物的处理物。
2.根据权利要求1所述的骨形成组合物，其中，所述处理物为巨核细胞或其培养物的细胞级分的提取物。
3.根据权利要求1或2所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为2000～20000pg的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为8000～80000pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为1～60pg的胎盘生长因子(PIGF)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为200～2000pg的干细胞因子受体(SCFR)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为20～800pg的血管内皮生长因子(VEGF)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为20～400pg的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为1000～10000pg的分化生长因子-15(GDF-15)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～16pg的双调蛋白(AR)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～60pg的上皮生长因子受体(EGFR)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～100pg的肝细胞生长因子(HGF)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述处理物包含相对于1mg总蛋白为0～200pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的骨形成组合物，其具有细胞增殖促进活性。
15.根据权利要求14所述的骨形成组合物，其中，所述细胞为间充质干细胞。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的骨形成组合物，其具有促进从成骨细胞的祖细胞向成骨细胞分化的能力。
17.根据权利要求16所述的骨形成组合物，其中，所述成骨细胞的祖细胞为间充质干细胞。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述巨核细胞为永生化巨核细胞。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的骨形成组合物，其中，所述巨核细胞为体外诱导的巨核细胞。
20.一种骨形成试剂盒，其包含骨形成组合物和骨形成的支架材料，
所述骨形成组合物为权利要求1至19中任一项所述的骨形成组合物。
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