CN114829584A - 组合物和其用途 - Google Patents
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Abstract
提供细胞来源的具有生理活性的组合物。本发明的组合物包含巨核细胞或其培养物的处理物。
Description
技术领域
本发明涉及组合物和其用途。
背景技术
作为再生医疗用的治疗药,尝试开发了促进间充质干细胞等组织再生的细胞来作为细胞制剂。另外,认为促进前述组织再生的细胞通过释放生长因子等具有生理活性的蛋白质来促进组织再生。
发明内容
发明要解决的问题
因此,本发明的目的在于提供细胞来源的具有生理活性的组合物。
用于解决问题的方案
为了实现前述目的,本发明的组合物包含巨核细胞或其培养物的处理物。
本发明的细胞增殖促进组合物(以下也称为“增殖促进组合物”)包含前述本发明的组合物。
本发明的成纤维细胞功能促进组合物包含前述本发明的组合物。
本发明的促进皮肤障碍的治愈的组合物包含前述本发明的组合物。
本发明的角质形成细胞功能促进组合物包含前述本发明的组合物。
本发明的毛乳头细胞功能促进组合物包含前述本发明的组合物。
本发明的生发促进组合物包含前述本发明的组合物。
发明的效果
根据本发明,可以提供细胞来源的具有生理活性的组合物。
附图说明
图1是示出实施例1中的浓缩系统的构成的示意图。
图2是示出实施例1中的细胞的增殖活性的图,(A)示出增殖活性的相对值,(B)示出倍增时间。
图3是示出实施例2中的细胞的增殖活性的图,(A)示出增殖活性的相对值,(B)示出倍增时间。
图4是示出实施例3中的成纤维细胞的增殖活性的图。
图5是示出实施例3中的I型胶原蛋白的生成量的图。
图6是示出实施例3中的透明质酸的产生量的图。
图7是示出实施例4中的细胞的相位差图像的照片。
图8是示出实施例4中的角质形成细胞的增殖活性的图。
图9是示出实施例4中的FLG基因的表达量的图。
图10是示出实施例4中的SPTLC1基因的表达量的图。
图11是示出实施例5中的毛乳头细胞的增殖活性的图。
图12是示出实施例5中的FGF7基因的表达量的图。
图13是示出实施例5中的VEGFA基因的表达量的图。
具体实施方式
<组合物>
如前所述,本发明的组合物包含巨核细胞或其培养物的处理物。如前所述,本发明的组合物的特征在于包含巨核细胞或其培养物的处理物,其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的组合物,例如,可以提供细胞来源的具有生理活性的组合物。根据本发明的组合物,例如,能够促进间充质细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、毛乳头细胞等细胞增殖,另外,可期待适宜地用于促进皮肤的溃疡、褥疮、烧烫伤、疤痕、创伤、皮肤的老化等皮肤障碍的治愈、皮肤的屏障功能的维持或改善、生发等。
本发明中,“巨核细胞”是生物体内存在于骨髓中的最大细胞,是指释放出血小板的细胞和具有同等功能的细胞。前述具有同等功能的细胞是指具有血小板的产生能力的细胞。本发明中,巨核细胞可以是多核化(多倍体化)前的巨核细胞、即未成熟的巨核细胞或增殖期的巨核细胞,可以是多核化后的巨核细胞(多核巨细胞)。作为具体例,前述巨核细胞例如可以是巨核系祖细胞(日语:前巨核芽球)、原巨核细胞、幼巨核细胞、和成熟巨核细胞中的任意者。前述多核化后的巨核细胞所具有的染色体的组数超过2组即可,作为具体例,为16~32组。
前述巨核细胞的来源没有特别限制,例如可列举出人和非人动物。前述非人动物例如可列举出猴子、大猩猩、黑猩猩、狨猴等灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、兔子、绵羊、马、豚鼠等。以下,其它细胞的来源也是同样的。
本发明中,前述巨核细胞可以通过细胞表面标记物进行鉴定。前述巨核细胞源自人的情况下,前述细胞表面标记物可列举出CD41a、CD42a和CD42b。即,前述巨核细胞是CD41a、CD42a和CD42b为阳性的细胞。前述巨核细胞源自人的情况下,前述细胞表面标记物例如可以为选自由CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、和CD203c组成的组中的至少1种。
前述巨核细胞可以是从生物体中分离出的巨核细胞,也可以是由多能细胞等与巨核细胞相比未分化的细胞(以下也称为“祖细胞”)诱导的巨核细胞。前述“与巨核细胞相比未分化的细胞”是指具有分化为前述巨核细胞的分化能力的细胞。
前述巨核细胞为从生物体中分离出的巨核细胞时,前述巨核细胞例如存在于骨髓中,因此能够从骨髓中分离。在此情况下,前述巨核细胞可以包含源自生物体的其它细胞。
前述巨核细胞为由祖细胞诱导的巨核细胞时,如后所述,前述巨核细胞可以体外诱导。在此情况下,前述巨核细胞可以包含前述祖细胞。前述祖细胞例如可列举出造血干细胞、造血祖细胞、CD34阳性细胞、巨核细胞-红细胞祖细胞(megakaryocyte-erythroidprogenitor:MEP)、巨核细胞祖细胞等。前述祖细胞例如可以从骨髓、脐带血、外周血等中分离,也可以由ES细胞(胚胎干细胞、embryonic stem cells)、诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells、iPS细胞)、核移植ES细胞(ntES细胞)、生殖干细胞、体干细胞、胚胎癌性细胞等多能细胞诱导。
前述巨核细胞为由祖细胞诱导的巨核细胞时,前述巨核细胞优选永生化巨核细胞。前述永生化巨核细胞例如与利用其它巨核细胞诱导方法诱导的巨核细胞相比,细胞分化阶段的均质性高,因此能够抑制得到的处理物中的成分组成的变动。如后所述,前述永生化巨核细胞例如是通过在前述祖细胞中导入癌基因和多梳基因或者导入癌基因、多梳基因和凋亡抑制基因而诱导的巨核细胞。
前述“癌基因”是指可在生物体内诱导细胞的癌变的基因,例如可列举出c-MYC、N-MYC、L-MYC等MYC家族基因、SRC家族基因、RAS家族基因、RAF家族基因、c-kit(CD117)、PDGFR(血小板生长因子受体)、Abl(Abelson murine leukemia viral oncogene homolog)等蛋白激酶家族基因等。
前述“多梳基因”是指:已知负调节CDKN2a(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A、INK4a/ARF)而发挥避免细胞老化作用的基因(下述参考文献1~3)。作为具体例,前述多梳基因例如可列举出BMI1(多梳复合蛋白BMI-1、多梳家族环指蛋白4(PCGF4)、环指蛋白51(RNF51))、Mel18(多梳家族环指蛋白2)、Ring(环指蛋白)1a/b、Phc(Polyhomeotichomolog,多聚同源同系物)1/2/3、Cbx(色素框)2/4/6/7/8、Ezh2(Zeste 2多梳抑制复合物2亚基的增强子)、Eed(胚胎外胚层发育蛋白)、Suz12(SUZ12多梳抑制复合物2亚基)、HADC(组蛋白脱乙酰基酶类)、Dnmt(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶)1/3a/3b等。
参考文献1:小黑秀行等人,“ポリコーム群蛋白複合体による幹細胞の老化制御”、再生医疗、2007年、第6卷、第4号、26-32页
参考文献2:Jesus Gil et.al,“Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumoursuppressor locus:all for one or one for all”,Nature Reviews Molecular CellBiology,2007,vol.7,pages 667-677
参考文献3:Soo-Hyun Kim et.al.,“Absence of p16 INK4a and truncation ofARF tumor suppressors in chickens”,PNAS,2003,vol.100,No.1,pages 211-216
前述“凋亡抑制基因”是指具有能够抑制细胞凋亡的功能的基因,例如可列举出BCL2(B淋巴细胞瘤-2)、Bcl-xL(大B细胞淋巴瘤)、存活蛋白(Survivin,含杆状病毒IAP重复序列蛋白5)、MCL1(BCL2家族凋亡调节剂)等。
前述永生化巨核细胞优选为包含外源性的BMI1基因、MYC基因、和Bcl-xL基因的巨核细胞。前述“外源性”是指从细胞外导入细胞内。前述外源性的基因可以存在于前述细胞的染色体上,也可以存在于核或细胞质内。前述外源性的基因例如可以通过测定该基因的数量来检测。前述基因为常染色体上的基因时,前述基因在各常染色体上存在1个,因此1个细胞中存在2个基因。因此,若不存在前述外源性的基因,则在1个细胞中可检测出2个前述基因。另一方面,存在前述外源性的基因时,在1个细胞中可检测出3个以上前述基因。在此情况下,前述外源性的基因例如可以利用使用了引物的PCR、探针或它们的组合等进行检测。前述外源性的基因具有标签序列、选择标记物时,前述外源性的基因的检测也可以通过前述标签序列的检测或选择标记物的检测来实施。另外,对于前述外源性的基因,例如可以使用抗体等对从前述基因翻译出的蛋白质进行检测。
前述巨核细胞的培养物例如是通过培养前述巨核细胞而产生的培养物。如后所述,前述巨核细胞的培养例如可以通过在培养基存在下培养前述巨核细胞来实施。
前述巨核细胞的培养物是培养前述巨核细胞而得到的物质,因此例如作为细胞成分,是包含前述巨核细胞和由巨核细胞产生的血小板的混合物。前述细胞成分是指细胞和血小板。如前所述,前述巨核细胞可以由与前述巨核细胞相比未分化的细胞来诱导。因此,作为用于生产前述巨核细胞的培养物的巨核细胞,包含由与前述巨核细胞相比未分化的细胞诱导的巨核细胞时,前述巨核细胞的培养物可以包含由与前述巨核细胞相比未分化的细胞。
本发明中,前述巨核细胞的培养物可以是培养前述巨核细胞而得到的培养物本身,也可以是将前述培养物加工而成者。前述培养物的加工例如可列举出液体级分的去除、细胞成分级分的提取、包含血小板的细胞成分的组成的改变等。前述细胞成分的组成的改变例如可列举出前述混合物中的细胞和/或血小板的去除、前述混合物中的细胞和/或血小板的提取、向前述混合物中追加细胞和/或血小板等。
前述“血小板”是血液中的细胞成分之一,是指CD41a和CD42b为阳性的细胞成分。前述血小板例如不具有细胞核,另外,与前述巨核细胞相比,大小较小。因此,前述血小板与前述巨核细胞例如可以根据细胞核的有无和/或大小进行区分。已知:前述血小板在血栓形成和止血中发挥重要的作用、且还参与损伤后的组织再生、炎症的病理生理。另外已知:由于出血等而血小板被激活时,前述血小板在其膜上表达整联蛋白αIIBβ3(glycoproteinIIb/IIIa;CD41a与CD61的复合体)等细胞粘附因子的受体。另外,若前述血小板被激活,则血小板彼此聚集,从血小板中释放出的各种凝血因子使纤维蛋白凝固,由此形成血栓,实现止血。本发明中,前述血小板的来源与前述巨核细胞的来源相同。
本发明中,前述处理物可以由前述巨核细胞制备,也可以由前述巨核细胞的培养物制备。另外,由前述巨核细胞的培养物制备时,前述巨核细胞的培养物可以经过了加工。作为具体例,前述处理物例如可以是前述巨核细胞或其培养物的细胞级分或液体级分的处理物,也可以是将前述巨核细胞或其培养物加工而成的加工物的处理物。前述处理物的制备中的处理没有特别限制,例如可列举出浓缩处理、分离处理或纯化处理等改变细胞成分的密度的处理;干燥处理、冷冻处理、冷冻干燥处理、溶剂处理、表面活性剂处理、酶处理、蛋白质级分提取处理等提取细胞成分的提取处理;磨碎处理、粉碎处理等破碎处理;等。作为前述处理物的具体例,例如可列举出前述巨核细胞或其培养物的浓缩物、干燥物、冷冻物、冷冻干燥物、溶剂处理物、表面活性剂处理物、酶处理物、蛋白质分级物、超声波处理物等提取物;磨碎处理物、粉碎处理物等破碎处理物;前述巨核细胞或其培养物的细胞级分的浓缩物、干燥物、冷冻物、冷冻干燥物、溶剂处理物、表面活性剂处理物、酶处理物、蛋白质分级物、超声波处理物的提取物;磨碎处理物、粉碎处理物等破碎处理物;等。前述处理物可以由1种处理物构成,也可以是2种以上的处理物的混合物。前述混合物没有特别限制,可以制成以任意的处理物的组合和比率混合而成的混合物。
前述处理物例如包含1种以上的生长因子和生长因子受体中的至少一者。另外,前述处理物例如具有细胞增殖促进活性等生理活性。进而,如前所述,前述处理物例如可以通过对前述巨核细胞或其培养物进行处理而制造。因此,本发明中,前述处理物例如可以使用下述条件(1)~(3)来规定。前述处理物例如可以通过下述条件(1)~(3)中的任一者来规定,也可以通过多个条件来规定,也可以通过全部条件来规定。作为具体例,前述处理物例如可以通过条件的组合来规定。
(条件)
(1)生长因子和/或生长因子受体的含量;
(2)处理物的生理活性;
(3)处理物的制造方法
(条件的组合)
条件(1)、(2)、或(3);
条件(1)和(2)、条件(1)和(3)、或条件(2)和(3);
条件(1)、(2)、和(3)
(1)条件(1)
如前所述,条件(1)是涉及生长因子和/或生长因子受体的含量的条件。前述条件(1)可以规定前述生长因子的含量或前述生长因子受体的含量,也可以规定前述生长因子的含量和前述生长因子受体的含量。另外,前述条件(1)的规定中使用的生长因子可以是1种,也可以是2种以上。前述条件(1)的规定中使用的生长因子受体可以是1种,也可以是2种以上。
前述条件(1)中,前述生长因子可列举出碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP-6)、胎盘生长因子(PIGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、内分泌腺来源血管内皮生长因子(EG-VEGF)、分化生长因子-15(GDF-15)、双调蛋白(AR)、成骨蛋白-5(BMP-5)、成骨蛋白-7(BMP-7)、肝细胞生长因子(HGF)、TGFβ1(转化生长因子β1)等。
前述条件(1)中,前述生长因子受体可列举出干细胞因子受体(SCFR)、上皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)等。
前述含量例如可以是前述处理物中的各生长因子和各生长因子受体的重量,也可以是前述处理物中的、各生长因子和各生长因子受体的重量相对于总蛋白的重量(单位总蛋白中的含量),但优选后者。
前述总蛋白的重量例如可以利用BCA蛋白质定量法进行确定。前述BCA蛋白质定量法是利用了1价铜离子与2分子的二辛可宁酸的配位结合的蛋白质定量方法。供于前述BCA蛋白质定量法的样品例如优选不包含还原剂和/或铜离子的螯合剂。前述BCA蛋白质定量法可以依据下述参考文献4加以实施,例如也可以使用市售的试剂盒等。作为前述BCA蛋白质定量法的试剂盒,可以利用Pierce(商标)BCAProtein Assay Kit(Thermo FisherScientific公司制)等。
参考文献4:长谷俊治等人,“やさしい原理からはいるタンパク質科学実験法1タンパク質をつくる抽出·精製と合成”、化学同人、2008年12月13日
对于前述处理物中的总蛋白浓度,例如,可以根据供于处理的细胞数与处理物中的溶剂的体积进行适宜设定。对于前述处理物中的总蛋白浓度,例如,可以通过增加供于前述处理的细胞数、降低前述处理物中的溶剂的体积、或从前述巨核细胞中提取,从而相对提高前述处理物中的总蛋白浓度。另外,对于前述处理物中的总蛋白浓度,例如,可以通过减少供于前述处理的细胞数、增加前述处理物中的溶剂的体积、或从前述巨核细胞的培养物中提取,从而相对降低前述处理物中的总蛋白浓度。作为具体例,供于前述处理的细胞数为1×108个细胞,前述处理物中的溶剂的体积为100μl的情况下,前述处理物中的总蛋白浓度例如为0.1~200mg/ml。前述溶剂例如为后述的水性溶剂。
前述生长因子和生长因子受体的重量例如可以利用夹层ELISA法来确定。前述夹层ELISA法可以依据下述参考文献5来实施,例如,也可以使用市售的试剂盒等。作为前述夹层ELISA法的试剂盒,可以利用Quantibody(注册商标)Human Growth Factor Array 1(RayBiotech公司制)等。
参考文献5:生物化学的测定研究会编辑,“免疫測定法基礎から先端まで”、讲谈社、2014年12月20日
作为前述处理物中的前述生长因子的含量和生长因子受体的含量,例如可列举出以下的例子。
前述生长因子为bFGF的情况下,前述处理物例如每1mg总蛋白,包含2000~20000pg、5000~20000pg、或10000~20000pg的bFGF。通过使前述处理物例如含有bFGF,从而如后所述示出细胞增殖的促进活性。
前述生长因子为IGFBP-1的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~200pg、0.01~200pg、0.01~100pg、或0.01~50pg的IGFBP-1。
前述生长因子为IGFBP-2的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为8000~80000pg、10000~80000pg、或20000~80000pg的IGFBP-2。
前述生长因子为PIGF的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为1~60pg、1~30pg、或1~20pg的PIGF。
前述生长因子为VEGF的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为20~800pg、20~600pg、或20~400pg的VEGF。
前述生长因子为GDF-15的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为1000~10000pg、1000~5000pg、或2000~5000pg的GDF-15。
前述生长因子为AR的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~16pg、0.01~16pg、0.1~16pg、或1~16pg的AR。
前述生长因子为HGF的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~100pg、0.01~100pg、0.01~50pg、或0.01~30pg的HGF。
前述生长因子为BMP-7的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~1000pg、0.01~1000pg的BMP-7。
前述生长因子受体为SCFR的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为200~2000pg、300~1500pg、或400~1000pg的SCFR。
前述生长因子受体为EGFR的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~60pg、0.01~60pg、1~50pg、1~45pg、或10~40pg的EGFR。
前述生长因子受体为VEGFR2的情况下,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为20~400pg、50~350pg、或100~300pg的VEGFR2。
如前所述,前述条件(1)可以以1种或2种以上的生长因子的含量规定,也可以以1种或2种以上的生长因子受体的含量规定,也可以以任意组合规定它们的含量。在此情况下,前述条件(1)例如可以选自由下述条件(A1)~(A9)和(B1)~(B3)组成的组中的至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种或12种条件来规定。作为具体例,作为前述生长因子的含量和/或生长因子受体的含量的组合,可以示例出下述的组合。
(生长因子的含量和/或生长因子受体的含量的组合)
(A1)~(A9)和(B1)~(B3)中的任意1个条件:
(A1)bFGF的含量、(A2)IGFBP-1的含量、(A3)IGFBP-2的含量、(A4)PIGF的含量、(A6)VEGF的含量、(A6)GDF-15的含量、(A7)AR的含量、(A8)HGF的含量、(A9)BMP-7的含量、(B1)SCFR的含量、(B2)EGFR的含量、或(B3)VEGFR2的含量;
(A1)~(A9)和(B1)~(B3)中的任意2个条件:
(A1)和(A2)、(A1)和(A3)、(A1)和(A4)、(A1)和(A5)、(A1)和(A6)、(A1)和(A7)、(A1)和(A8)、(A1)和(A9)、(A1)和(B1)、(A1)和(B2)、(A1)和(B3)、
(A2)和(A3)、(A2)和(A4)、(A2)和(A5)、(A2)和(A6)、(A2)和(A7)、(A2)和(A8)、(A2)和(A9)、(A2)和(B1)、(A2)和(B2)、(A2)和(B3)、
(A3)和(A4)、(A3)和(A5)、(A3)和(A6)、(A3)和(A7)、(A3)和(A8)、(A3)和(A9)、(A3)和(B1)、(A3)和(B2)、(A3)和(B3)、
(A4)和(A5)、(A4)和(A6)、(A4)和(A7)、(A4)和(A8)、(A4)和(A9)、(A4)和(B1)、(A4)和(B2)、(A4)和(B3)、
(A5)和(A6)、(A5)和(A7)、(A5)和(A8)、(A5)和(A9)、(A5)和(B1)、(A5)和(B2)、(A5)和(B3)、
(A6)和(A7)、(A6)和(A8)、(A6)和(A9)、(A6)和(B1)、(A6)和(B2)、(A6)和(B3)、
(A7)和(A8)、(A7)和(A9)、(A7)和(B1)、(A7)和(B2)、(A7)和(B3)、
(A8)和(A9)、(A8)和(B1)、(A8)和(B2)、(A8)和(B3)、
(A9)和(B1)、(A9)和(B2)、(A9)和(B3)、
(B1)和(B2)、(B1)和(B3)、或
(B2)和(B3)。
前述单位总蛋白中的含量例如可以根据本发明的组合物的用途通过追加或去除除前述生长因子和生长因子受体以外的其它蛋白质来进行调整。前述其它蛋白质例如可列举出不对前述生长因子和生长因子受体的活性产生影响的蛋白质,作为具体例,可列举出人血清白蛋白等血清白蛋白、人丙种球蛋白等丙种球蛋白等。前述蛋白质的去除例如可列举出使用了柱的去除、使用了抗体的去除等。
(2)条件(2)
如前所述,条件(2)是涉及处理物的生理活性的条件。前述条件(2)中,前述处理物的生理活性例如是指调节细胞、组织、或脏器的功能的活性。前述细胞功能例如可列举出增殖、分化、基因表达的诱导或抑制、蛋白质、糖链等生物体高分子的表达的诱导或抑制等。
前述处理物的生理活性例如可列举出细胞增殖促进活性、成纤维细胞功能促进活性、角质形成细胞功能促进活性、毛乳头细胞功能促进活性等。前述细胞增殖促进活性中,前述细胞没有特别限制,例如可列举出间充质干细胞、成纤维细胞、表皮角质形成细胞等角质形成细胞、头皮毛乳头细胞等毛乳头细胞等。前述处理物例如可以具有1种活性,也可以具有多种活性。
前述间充质干细胞是具有自我复制能力且具有能分化为骨、软骨和脂肪细胞的分化能力的细胞。前述间充质干细胞可以通过细胞表面标记物进行鉴定。前述间充质干细胞例如为CD73、CD90、和CD105阳性、以及CD14、CD34和CD45阴性。
前述成纤维细胞是构成皮肤、肺、心脏之类脏器的结缔组织的一种细胞,是供给纤维成分(胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸等细胞外基质成分)的细胞。前述成纤维细胞可以通过细胞表面标记物进行鉴定。前述成纤维细胞例如为波形蛋白、CD90、TE-7抗体阳性。
前述角质形成细胞是表皮细胞中具有角质化能力的细胞,是在表皮的基底层分裂并有助于形成表皮的细胞。前述角质形成细胞可以通过细胞表面标记物进行鉴定。前述角质形成细胞例如为雄激素受体、细胞角质蛋白阳性。前述角质形成细胞优选表皮角质形成细胞。
前述毛乳头细胞是毛囊基底中存在于毛乳头内的细胞,是对于诱导和维持生发重要的细胞。前述毛乳头细胞能够通过细胞表面标记物和/或基因表达来鉴定。前述毛乳头细胞例如为碱性磷酸酶阳性;SOX2基因、WIF1基因、Noggin基因、BMP4基因、VCAN基因阳性。前述毛乳头细胞优选头皮毛乳头细胞。
前述细胞增殖促进活性例如只要与除未添加本发明的组合物以外同样的对照组相比改善细胞的增殖能力即可,例如,也可以从一开始细胞的增殖能力就降低。在此情况下,前述“增殖促进活性”例如也能够称为增殖活性降低的抑制。作为具体例,前述间充质干细胞的增殖活性随着每次传代而降低。根据本发明的组合物,由于能够抑制前述间充质干细胞的增殖活性的降低,因此例如,可以说本发明的组合物显示出增殖促进活性。前述细胞增殖促进活性例如可以在对象细胞增殖的培养条件下进行测定。前述培养条件例如可以根据前述细胞的种类进行适宜设定。作为具体例,使用间充质干细胞作为前述细胞时,前述细胞的增殖活性例如可以通过在增殖培养基存在下体外培养人来源间充质干细胞从而测定。前述间充质干细胞的增殖活性例如可以基于后述的实施例1进行测定。另外,使用成纤维细胞作为前述细胞时,前述细胞的增殖活性例如可以通过在增殖培养基存在下体外培养人来源成纤维细胞从而进行测定。前述成纤维细胞的增殖活性例如可以基于后述的实施例3进行测定。使用角质形成细胞作为前述细胞时,前述细胞的增殖活性例如可以通过在增殖培养基存在下体外培养人来源表皮角质形成细胞从而进行测定。前述角质形成细胞的增殖活性例如可以基于后述的实施例4进行测定。使用毛乳头细胞作为前述细胞时,前述细胞的增殖活性例如可以通过在增殖培养基存在下体外培养人来源头发毛乳头细胞从而进行测定。前述毛乳头细胞的增殖活性例如可以基于后述的实施例5进行测定。
前述成纤维细胞功能促进活性例如只要与除未添加本发明的组合物以外同样的对照组相比成纤维细胞功能得到改善即可。前述成纤维细胞功能例如可以是前述成纤维细胞的增殖和由成纤维细胞产生细胞外基质中的任意含义。前述细胞外基质例如可列举出I型胶原蛋白等胶原蛋白类、弹性蛋白等纤维性物质;透明质酸、硫酸软骨素等糖胺聚糖、蛋白聚糖、整联蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白之类的细胞粘附性蛋白等基质性物质;等。前述成纤维细胞功能例如可以基于后述的实施例3进行测定。
前述角质形成细胞功能促进活性例如只要与除未添加本发明的组合物以外同样的对照组相比角质形成细胞功能得到改善即可。前述角质形成细胞功能例如可以是前述角质形成细胞的增殖、向表皮细胞的分化、和屏障功能基因的诱导中的任意含义。前述屏障功能基因例如是指具有维持皮肤的屏障功能的功能的基因,作为具体例,可列举出丝聚合蛋白原基因(FLG)、神经酰胺合成酶基因(serine palmitoyltransferase long chain basesubunit 1:SPTLC1)等。作为前述丝聚合蛋白原基因,可列举出人来源丝聚合蛋白原基因,例如可列举出Genbank中由以Accession No.:NM_002016.2注册的碱基序列组成的多聚核苷酸。作为前述神经酰胺合成酶基因,人来源神经酰胺合成酶基因例如可列举出Genbank中由以Accession No.:NM_001281303.2注册的碱基序列组成的多聚核苷酸。前述角质形成细胞功能例如可以基于后述的实施例4进行测定。
前述毛乳头细胞功能促进活性例如只要与除未添加本发明的组合物以外同样的对照组相比毛乳头细胞功能得到改善即可。前述毛乳头细胞功能例如可以是前毛乳头细胞的增殖和生发促进基因的诱导中的任意含义。前述生发促进基因例如可以指具有生发、毛发的生长或维持功能的基因,作为具体例,可列举出FGF7(成纤维细胞生长因子7)基因和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor、VEGF)基因等。前述VEGF例如可列举出VEGFA等。作为前述FGF7基因,人来源前FGF7基因例如可列举出Genbank中由以Accession No.:NM_002009.4注册的碱基序列组成的多聚核苷酸。作为前述VEGFA基因,人来源VEGFA基因例如可列举出Genbank中由以Accession No.:NM_001025366.3注册的碱基序列组成的多聚核苷酸。前述毛乳头细胞功能例如可以基于后述的实施例5进行测定。
(3)条件(3)
如前所述,条件(3)是关于处理物的制造方法的条件。对于本发明的组合物中的处理物的制造方法,可以援用后述的本发明的组合物的制造方法的说明。
本发明的组合物例如可以利用后述的本发明的组合物的制造方法制造。
如后所述,本发明的组合物例如可以用作细胞增殖促进组合物、成纤维细胞功能促进组合物、角质形成细胞功能促进组合物、毛乳头细胞功能促进组合物等。另外,本发明的组合物由于上述的活性例如可适宜地用作促进皮肤障碍的治愈的组合物、生发促进组合物。对于本发明的使用方法,可以援用后述的细胞增殖促进组合物、成纤维细胞功能促进组合物、角质形成细胞功能促进组合物、和毛乳头细胞功能促进组合物的说明。另外,本发明的组合物例如可以用于膝关节损伤、肌腱损伤、或韧带损伤的修复;溃疡、褥疮、烧烫伤、疤痕、或创伤的治疗;肌理改善;增发;和/或美化肌肤;等。
<组合物的制造方法>
本发明的组合物的制造方法(以下也称为“制造方法”)包括对巨核细胞或其培养物进行处理的处理工序。本发明的制造方法的特征在于包括前述处理工序,其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的制造方法,能够制造本发明的组合物。本发明的制造方法可以援用前述本发明的组合物的说明。
本发明的制造方法中,前述处理工序中的处理对象是巨核细胞或其培养物。因此,本发明的制造方法在前述处理工序之前,可以包括:从与巨核细胞相比未分化的细胞诱导前述巨核细胞的巨核细胞诱导工序和/或生产前述巨核细胞的培养物的生产工序。
前述巨核细胞诱导工序中,前述巨核细胞的诱导方法没有特别限制,可以利用公知的诱导方法实施。作为具体例,前述巨核细胞的诱导方法例如可以参照国际公开第2011/034073号(美国专利申请公开2012/0238023号公报)、国际公开2012/157586号(美国专利申请公开2014/0127815号公报)、国际公开第2014/123242号(美国专利申请公开2016/0002599号公报)等永生化巨核细胞的诱导方法;下述参考文献6中记载的巨核细胞的诱导方法;等,将作为构成本说明书的一部分援用至此。作为具体例,前述巨核细胞诱导工序中,例如,可以使由与前述巨核细胞相比未分化的细胞强制表达前述癌基因和前述多梳基因。由此,前述巨核细胞诱导工序中,例如,能够得到无限增殖的永生化巨核细胞。进而,例如,通过解除前述永生化巨核细胞的前述强制表达,从而能够将前述永生化巨核细胞诱导至多核巨细胞,并产生血小板。另外,前述巨核细胞诱导工序中,例如,也可以使前述巨核细胞祖细胞强制表达前述凋亡抑制基因。由此,前述巨核细胞诱导工序中,能够得到前述永生化巨核细胞。进而,例如,通过解除前述永生化巨核细胞的前述强制表达,从而能够由前述永生化巨核细胞诱导多核巨细胞,产生血小板。
参考文献6:Ann-Kathrin Borger et.al.,“Generation of HLA-UniversaliPSC-Derived Megakaryocytes and Platelets for Survival Under RefractorinessConditions”,Mol.Med.,2016,vol.22,pages 274-288
前述巨核细胞诱导工序中,例如,可以强制表达前述癌基因、前述多梳基因、和前述凋亡抑制基因。在此情况下,前述癌基因、前述多梳基因、和前述凋亡抑制基因的强制表达可以同时进行,也可以独立地进行。作为具体例,前述巨核细胞诱导工序中,强制表达前述癌基因和前述多梳基因后解除前述强制表达,接着强制表达前述凋亡抑制基因,还可以强制表达前述癌基因、前述多梳基因、和前述凋亡抑制基因,也可以强制表达前述癌基因和前述多梳基因,进而表达前述凋亡抑制基因。由此,前述巨核细胞诱导工序中,能够得到前述永生化巨核细胞。进而,例如,通过解除前述永生化巨核细胞的前述强制表达,从而能够由前述永生化巨核细胞诱导多核巨细胞,并产生血小板。
对于前述巨核细胞诱导工序,例如,从能够改善各基因的导入效率的方面考虑,优选包括如下工序:第1表达工序,使由与前述巨核细胞相比未分化的细胞强制表达癌基因和多梳基因;第2表达工序,使前述未分化的细胞强制表达Bcl-xL基因等凋亡抑制基因;及解除工序,解除全部前述强制表达。
各基因的强制表达和强制表达的解除例如可以利用国际公开第2011/034073号、国际公开第2012/157586号、国际公开第2014/123242号或下述参考文献7中记载的方法等公知的方法、或依据其的方法来实施,将作为构成本说明的一部分援用至此。作为具体例,各基因的强制表达和强制表达的解除例如可以使用药剂应答性的基因表达诱导系统来实施。前述基因表达诱导系统例如可列举出Tet-on(注册商标)系统、Tet-off(注册商标)系统等。使用前述Tet-on系统时,例如,在前述强制表达的工序中,在四环素类抗生素、多西环素等诱导基因表达的药剂存在下实施培养,在解除前述强制表达的工序中,在不存在前述药剂的情况下实施前述培养。
参考文献7:Nakamura S et al,“Expandable megakaryocyte cell linesenable clinically applicable generation of platelets from human inducedpluripotent stem cells.”,Cell Stem Cell,2014,vol.14,No.4,pages 535-548
接着,前述生产工序中,生产前述巨核细胞的培养物。前述生产工序例如可以通过在培养基存在下培养前述巨核细胞来实施。前述巨核细胞的培养例如也可以在饲养层细胞上实施,也可以在没有饲养层细胞的情况下实施。前述巨核细胞例如可以进行悬浮培养,因此可以在没有前述饲养层细胞的情况下进行培养。前述巨核细胞的培养物例如包括前述血小板。
前述巨核细胞的培养条件没有特别限制,可以采用前述巨核细胞的通常的培养条件。作为具体例,培养温度例如为约35~约42℃、约36~约40℃、约37~约39℃。CO2浓度例如为约5~约15%。O2浓度例如为约15~约25%、约20%。培养时间没有特别限制,例如为约1天~约2周、约4天~约8天。
前述培养基没有特别限制,例如可列举出适于由前述巨核细胞产生血小板的公知的培养基和依据其的培养基。作为具体例,前述培养基例如可以将动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。前述基础培养基例如可列举出IMDM培养基、Medium 199培养基、伊戈尔最低必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)、Ham’s F12培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal(注册商标)培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)等单一培养基或它们的混合培养基。前述培养基例如可以包含血清或血浆,也可以是不包含这些的无血清培养基。前述血清和血浆的来源优选为与前述巨核细胞的来源相同的来源。作为具体例,前述巨核细胞源自人时,前述血清和血浆优选分别源自人。
前述培养基例如可以包含其它成分。前述其它成分没有特别限制,例如可列举出白蛋白、胰岛素、运铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、单硫代甘油(MTG)、脂质、氨基酸(例如,L-谷氨酰胺)、抗坏血酸、肝素、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。前述其它成分例如可以是1种,也可以是2种以上。前述细胞因子例如是促进血细胞系细胞的分化的物质,作为具体例,可列举出血管内皮细胞生长因子(VEGF)、促血小板生成素(TPO)、各种TPO样作用物质、干细胞因子(Stem Cell Factor,SCF)、ITS(胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸盐)补充剂、ADAM抑制剂、FLT抑制剂、WNT抑制剂、ROCK抑制剂、芳香族烃受体(AhR)抑制剂等。前述培养基例如优选血清、胰岛素、运铁蛋白、丝氨酸、硫代甘油、抗坏血酸、包含TPO的IMDM培养基。前述培养基例如可以进一步包含SCF,也可以进一步包含肝素。前述其它成分的浓度没有特别限制。前述TPO的浓度例如为约10ng/ml~约200ng/ml、约50ng/ml~约100ng/ml。前述SCF的浓度例如为约10ng/ml~约200ng/ml、约50ng/ml。前述肝素的浓度例如为约10U/ml~约100U/ml、约25U/ml。前述培养基例如可以进一步包含佛波酯(例如,佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯;PMA)。
接着,前述处理工序中,对前述巨核细胞或其培养物进行处理。前述处理工序中,例如,通过将前述巨核细胞或其培养物所含有的细胞的细胞膜破坏,从而提取蛋白质。作为具体例,前述处理工序中的处理没有特别限制,例如可列举出:浓缩处理等改变细胞成分的密度的处理;干燥处理、冷冻处理、冷冻干燥处理、溶剂处理、表面活性剂处理、酶处理、蛋白质级分提取处理、超声波处理等提取细胞的成分的提取处理;磨碎处理、粉碎处理等破碎处理;等。前述处理工序中实施的处理可以是1种,也可以是2种以上。另外,前述处理工序中,可以实施1次前述处理,也可以实施2次以上。
前述浓缩处理例如可以通过对前述巨核细胞或其培养物进行离心等来实施。前述离心的条件例如可以采用使细胞或血小板沉淀的条件。前述干燥处理例如可以通过用干式喷雾器、滚筒干燥机等使前述巨核细胞或其培养物干燥来实施。前述冷冻干燥处理例如可以使用冷冻干燥机来实施。前述溶剂处理中,前述溶剂例如为苯酚、氯仿等有机溶剂;水、生理盐水、缓冲液等水性溶剂。使用水性溶剂作为前述溶剂时,前述溶剂处理例如优选组合使用后述的表面活性剂处理、酶处理、和/或超声波处理。前述溶剂处理例如可以通过将前述巨核细胞或其培养物与前述溶剂混合来实施。前述表面活性剂处理中,前述表面活性剂例如可列举出月桂基硫酸钠等离子系表面活性剂;NP-40、Triton X-100、Tween20、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷等非离子系表面活性剂;CHAPS等两性离子表面活性剂;等。前述表面活性剂的浓度例如是能够破坏前述巨核细胞或其培养物中的细胞成分的细胞膜的浓度。前述表面活性剂处理例如可以通过在水性溶剂存在下使前述巨核细胞或其培养物与前述表面活性剂接触而实施。与前述表面活性剂的接触例如在约0~约10℃下实施。前述水性溶剂例如可列举出水、生理盐水、缓冲液等。前述酶处理中的酶例如可列举出肽酶、蛋白酶等。前述酶处理例如可以通过在前述水性溶剂存在下使前述巨核细胞或其培养物与前述酶接触而实施。前述酶处理的条件例如是前述酶显示出活性的条件。前述蛋白质级分提取处理例如可以通过对前述巨核细胞或其培养物进行渗透压冲击、冷冻融解等而实施。前述超声波处理例如可以使用超声波发生装置来实施。前述超声波处理的条件例如可以利用将细胞破碎的条件。
各种处理中的处理条件和处理时间例如可以根据前述处理的种类进行适宜确定。另外,前述处理工序中,例如,可以通过调整前述水性溶剂的量来调整前述处理物中的总蛋白的浓度。
前述巨核细胞或其培养物可以在前述处理之前实施加工(预处理)。在此情况下,作为前述巨核细胞的培养物,可以使用培养前述巨核细胞而得到的培养物本身,也可以使用对前述混合物进行加工所得者。前述培养物的加工例如可列举出液体级分的去除、细胞成分级分的提取、包含血小板在内的细胞成分的组成的改变等。前述细胞成分的组成的改变例如可列举出前述混合物中的细胞和/或血小板的去除、前述混合物中的细胞和/或血小板的提取、向前述混合物中追加细胞和/或血小板等。
本发明的制造方法包括前述预处理时,本发明的制造方法可以包括从前述巨核细胞或其培养物中去除血小板的去除工序。在此情况下,前述处理工序中,使用去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物作为前述巨核细胞或其培养物、或使用去除的血小板来实施处理。放出前述血小板后的巨核细胞例如bFGF的含量高。因此,本发明的制造方法例如可以通过去除前述血小板来制造bFGF的含量高的组合物。通过前述血小板的去除,从而能够将前述血小板与其它细胞级分分离。因此,前述去除工序例如也可以称为血小板的分离工序或血小板与其它细胞成分的分离工序。前述去除工序中,从前述巨核细胞的培养物中分离血小板的方法例如可以利用国际公开第2017/065280号公报(美国专利申请公开2018/282697号公报)中记载的方法等公知的方法、或依据其的方法来实施,将作为构成本说明的一部分援用至此。
前述去除工序中的血小板的去除率(分离率)例如为60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上。前述血小板的去除率例如为60~90%。
本发明的制造方法可以具备:保存前述巨核细胞或其培养物、去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物、或去除的血小板的保存工序。前述保存工序中的保存例如可列举出冷藏保存(约1~约10℃)、冷冻保存(约-200~约-4℃)。前述保存工序中的保存时间没有特别限制。例如从兼为前述处理工序中的冷冻处理出发,前述保存工序优选冷冻保存。
作为一例,本发明的制造方法可以如下实施。但是,本发明不受以下示例的任何限制。首先,对于包含前述巨核细胞或其培养物的培养基,通过离心进行浓缩处理,将细胞成分浓缩。前述离心处理例如是前述细胞成分沉淀的条件。作为具体例,前述离心处理例如可以通过以1000~3000×g进行5~20分钟离心来实施。接着,在离心后回收沉淀物,将得到的沉淀物迅速冷冻,由此进行冷冻处理。前述冷冻处理例如可以通过使前述沉淀物与液氮等液化气接触而实施。进而,通过用包含前述表面活性剂的水性溶剂溶解冷冻后的沉淀物,从而进行表面活性剂处理。对得到的溶液进行离心、使夹杂物沉淀。前述离心处理例如是细胞膜等夹杂物沉淀的条件。作为具体例,前述离心处理例如可以通过以10000~20000×g进行3~10分钟离心而实施。前述离心后,蛋白质存在于上清液中,因此通过回收上清液来作为蛋白质级分,从而能够得到前述处理物。
<制造方法中得到的组合物>
本发明的组合物(以下也称为“第2组合物”)可以利用前述本发明的制造方法得到。本发明的第2组合物的特征在于利用前述本发明的制造方法得到,其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的第2组合物,例如可以提供具有生理活性的组合物。根据本发明的第2组合物,例如能够促进细胞增殖。本发明的第2组合物可以援用前述本发明的组合物和制造方法的说明。
<细胞增殖促进组合物>
本发明在另一例中提供能够促进细胞的增殖的组合物。如前所述,本发明的细胞增殖促进组合物的特征在于包含本发明的组合物。本发明的增殖促进组合物的特征在于包含本发明的组合物,其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的增殖促进组合物,能够促进细胞、特别是间充质干细胞的增殖。本发明的增殖促进组合物可以援用前述本发明的组合物和制造方法的说明。
本发明的增殖促进组合物可以以体外方式使用,也可以以体内方式使用。
以体外方式使用本发明的增殖促进组合物时,前述给药对象例如可列举出细胞、组织、器官等,前述细胞例如可列举出从生物体中采集的细胞、培养细胞等。
以体内方式使用本发明的增殖促进组合物时,前述给药对象例如可列举出人、或除人外的非人动物。作为前述非人动物,例如可列举出小鼠、大鼠、兔子、狗、绵羊、马、猫、山羊、猴子、豚鼠等。
本发明的增殖促进组合物的使用条件(给药条件)没有特别限制,例如可以根据给药对象的种类等适宜设定给药形态、给药时期、给药量等。
以体外方式使用本发明的增殖促进组合物时,本发明的增殖促进组合物例如可以通过添加至成为对象的细胞的培养基中来使用。前述培养基中的本发明的增殖促进组合物来源的总蛋白的终浓度为10~1000μg/ml、10~500μg/ml、10~320μg/ml、10~300μg/ml、或20~300μg/ml。
以体内方式使用本发明的增殖促进组合物时,例如可以根据给药对象的种类、症状、年龄、给药方法等进行适宜确定。作为具体例,向人给药时,对于每一天的增殖促进组合物的给药量,前述增殖促进组合物来源的总蛋白量的总计没有特别限制,例如,可以根据其用途进行适宜设定。每一天的给药次数例如为1~5次、1~3次、1次或2次。
本发明的增殖促进组合物的给药形态没有特别限制。以体内方式给药本发明的增殖促进组合物时,可以是经口给药,也可以是非经口给药。前述非经口给药例如可列举出静脉注射(静脉内给药)、肌肉注射(肌肉内给药)、经皮给药、皮下给药、皮内给药、经肠给药、直肠给药、经阴道给药、经鼻给药、经肺给药、腹腔内给药、局部给药等。
本发明的增殖促进组合物的剂型没有特别限制,例如,可以根据前述给药形态进行适宜确定。前述剂型例如可列举出液体状或固体状。
本发明的增殖促进组合物例如根据需要可以包含添加剂。前述添加剂优选为药学上可接受的添加剂或药学上可接受的载体。
<成纤维细胞功能促进组合物>
本发明在另一例中提供能够促进成纤维细胞功能的组合物。如前所述,本发明的成纤维细胞功能促进组合物包含前述本发明的组合物。本发明的成纤维细胞功能促进组合物的特征在于包含前述本发明的组合物,其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的成纤维细胞功能促进组合物,能够促进成纤维细胞功能。本发明的成纤维细胞功能促进组合物可以援用前述本发明的组合物、制造方法、和增殖促进组合物的说明。
本发明的成纤维细胞功能促进组合物可以以体外方式使用,也可以以体内方式使用。
以体外方式使用本发明的成纤维细胞功能促进组合物时,本发明的成纤维细胞功能促进组合物例如可以通过在成为对象的成纤维细胞的培养基中添加来使用。根据本发明的成纤维细胞功能促进组合物,例如,通过在包含前述成纤维细胞功能促进组合物的培养基中维持前述成纤维细胞,从而能够促进前述成纤维细胞的增殖和/或由成纤维细胞产生细胞外基质。前述培养基中的本发明的成纤维细胞功能促进组合物的总蛋白的终浓度为10~1000μg/ml、10~500μg/ml、或10~300μg/ml。
本发明的成纤维细胞功能促进组合物的给药对象和给药条件可以援用前述本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
<促进皮肤障碍的治愈的组合物>
本发明在另一例中提供能用于促进皮肤障碍的治愈的组合物。本发明中,如前所述,本发明的促进皮肤障碍的治愈的组合物(以下也称为“治愈促进组合物”)包含前述本发明的组合物。本发明的治愈促进组合物的特征在于包含前述本发明的组合物,其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的治愈促进组合物,可期待能够促进皮肤障碍的治愈。本发明的治愈促进组合物可以援用前述本发明的组合物、制造方法、和增殖促进组合物的说明。
本发明中,前述皮肤障碍是指例如发生了对皮肤的伤害、损伤等的状态,即正常的皮肤组织的结构受损或被破坏的状态,作为具体例,可列举出皮肤的溃疡、褥疮、烧烫伤、疤痕、创伤、皮肤的老化等。
本发明的治愈促进组合物可以以体外方式使用,也可以以体内方式使用。
以体外方式使用本发明的治愈促进组合物时,本发明的治愈促进组合物例如可以通过在成为对象的细胞的培养基中添加来使用。前述培养基中的本发明的治愈促进组合物的总蛋白的终浓度为10~1000μg/ml、10~500μg/ml、或10~300μg/ml。
本发明的治愈促进组合物的给药对象和给药条件可以援用前述本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。本发明的治愈促进组合物可以以能皮下或经皮给药的剂型使用。
<角质形成细胞功能促进组合物>
本发明在另一例中提供能促进角质形成细胞功能的组合物。如前所述,本发明的角质形成细胞功能促进组合物包含前述本发明的组合物。本发明的角质形成细胞功能促进组合物的特征在于包含前述本发明的组合物,其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的角质形成细胞功能促进组合物,能够促进角质形成细胞功能。本发明的角质形成细胞功能促进组合物可以援用前述本发明的组合物、制造方法、和增殖促进组合物的说明。
本发明的角质形成细胞功能促进组合物可以以体外方式使用,也可以以体内方式使用。
以体外方式使用本发明的角质形成细胞功能促进组合物时,本发明的角质形成细胞功能促进组合物例如可以通过在成为对象的角质形成细胞的培养基中添加来使用。本发明的角质形成细胞功能促进组合物例如可以添加至维持前述角质形成细胞时使用的维持培养基中,可以添加至使前述角质形成细胞分化为表皮细胞等上皮系的细胞的分化培养基中,也可以添加至前述维持培养基和前述分化培养基这两者中。根据本发明的角质形成细胞功能促进组合物,例如,通过在包含前述角质形成细胞功能促进组合物的培养基中维持前述角质形成细胞,从而能够促进前述角质形成细胞的增殖、向表皮细胞的分化、和/或屏障功能基因的诱导。前述培养基中的本发明的角质形成细胞功能促进组合物的总蛋白的终浓度为10~1000μg/ml、10~500μg/ml、或10~300μg/ml。
本发明的角质形成细胞功能促进组合物的给药对象和给药条件可以援用前述本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
如前所述,本发明的角质形成细胞功能促进组合物促进使角质形成细胞分化为表皮细胞等上皮系细胞。因此,本发明的角质形成细胞功能促进组合物例如可期待适宜地用作皮肤的人工培养中的添加剂。另外,如前所述,本发明的角质形成细胞功能促进组合物显示出成纤维细胞功能促进活性。因此,本发明的角质形成细胞功能促进组合物例如通过角质形成细胞和成纤维细胞功能促进活性而促进皮肤组织的更新,从而可期待能够适宜用于老化皮肤的再生。因此,本发明的角质形成细胞功能促进组合物例如可期待适宜地用作化妆品等皮肤外用组合物、用于皮下给药的注射剂等。
<毛乳头细胞功能促进组合物>
本发明在另一例中提供能促进毛乳头细胞功能的组合物。如前所述,本发明的毛乳头细胞功能促进组合物包含前述本发明的组合物。本发明的毛乳头细胞功能促进组合物的特征在于包含前述本发明的组合物,其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的毛乳头细胞功能促进组合物,能够促进角质形成细胞功能。本发明的毛乳头细胞功能促进组合物可以援用前述本发明的组合物、制造方法、和增殖促进组合物的说明。
本发明的毛乳头细胞功能促进组合物可以以体外方式使用,也可以以体内方式使用。
以体外方式使用本发明的毛乳头细胞功能促进组合物时,本发明的毛乳头细胞功能促进组合物例如可以通过在成为对象的毛乳头细胞的培养基中添加来使用。根据本发明的毛乳头细胞功能促进组合物,例如,可以通过在包含前述毛乳头细胞功能促进组合物的培养基维持前述毛乳头细胞,从而能够促进前述毛乳头细胞的增殖和/或生发促进基因的诱导。前述培养基中的本发明的毛乳头细胞功能促进组合物的总蛋白的终浓度为10~1000μg/ml、10~500μg/ml、或10~300μg/ml。
本发明的毛乳头细胞功能促进组合物的给药对象和给药条件可以援用前述本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
<生发促进组合物>
本发明在另一例中提供能促进生发的组合物。如前所述,本发明的生发促进组合物包含前述本发明的组合物。本发明的生发促进组合物的特征在于包含前述本发明的组合物,其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的生发促进组合物,由于毛乳头细胞功能得到促进,因此可期待能够促进生发。本发明的毛乳头细胞功能促进组合物可以援用前述本发明的组合物、制造方法、和增殖促进组合物的说明。
本发明中,“生发促进”是指:使由没有毛发的状态生长出毛发的可能性增强(增加、上升);毛发的生长(例如,毛发的长度和/或粗度的生长)的促进、和/或毛发脱落的减少(抑制、降低)。
本发明的生发促进组合物例如可以用于脱发的预防、抑制、或防止。在此情况下,本发明的生发促进组合物例如也可以成为脱发的预防、抑制、或防止组合物。
本发明的生发促进组合物可以以体外方式使用,也可以以体内方式使用。
本发明的生发促进组合物以体外方式使用时,本发明的生发促进组合物例如可以通过在成为对象的毛乳头细胞的培养基中添加来使用。根据本发明的生发促进组合物,例如,通过在包含前述本发明的组合物的培养基中维持前述毛乳头细胞,从而能够促进前述毛乳头细胞的增殖和/或生发促进基因的诱导,由此可期待促进生发。前述培养基中的本发明的生发促进组合物的总蛋白的终浓度为10~1000μg/ml、10~500μg/ml、或10~300μg/ml。
本发明的生发促进组合物的给药对象和给药条件可以援用前述本发明的增殖促进组合物和后述的生发促进方法中的给药对象和给药条件的说明。
<细胞增殖促进方法>
本发明的细胞增殖促进方法(以下也称为“增殖促进方法”)使用前述本发明的细胞增殖促进组合物。本发明的增殖促进方法的特征在于使用前述本发明的增殖促进组合物,其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的增殖促进方法,能够促进细胞、特别是间充质干细胞的增殖。本发明的增殖促进方法可以援用前述本发明的组合物、制造方法、增殖促进组合物、和分化促进组合物的说明。
本发明的增殖促进方法例如可以以体外方式实施,也可以以体内方式实施。
以体外方式实施本发明的增殖促进方法时,本发明的增殖促进方法例如包括在前述增殖促进组合物存在下培养细胞的培养工序。本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件例如可以援用本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
<成纤维细胞功能促进方法>
本发明在另一例中提供能促进成纤维细胞功能的方法。本发明的成纤维细胞功能促进方法使用前述本发明的组合物。本发明的成纤维细胞功能促进方法的特征在于使用前述本发明的组合物,其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的成纤维细胞功能促进方法,能够促进成纤维细胞功能。本发明的成纤维细胞功能促进方法可以援用前述本发明的组合物、制造方法、增殖促进组合物、和成纤维细胞功能促进组合物的说明。
本发明的成纤维细胞功能促进方法例如可以以体外方式实施,也可以以体内方式实施。
以体外方式实施本发明的成纤维细胞功能促进方法时,本发明的成纤维细胞功能促进方法例如包括在前述组合物存在下培养成纤维细胞的培养工序。前述本发明的组合物的给药对象和给药条件例如可以援用本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
<促进皮肤障碍的治愈的方法>
本发明在另一例中提供能用于促进皮肤障碍的治愈的方法。本发明的促进皮肤障碍的治愈的方法(以下也称为“治愈促进方法”)使用前述本发明的组合物。本发明的治愈促进方法的特征在于使用前述本发明的组合物,其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的治愈促进方法,可期待能够促进皮肤障碍的治愈。本发明的治愈促进方法可以援用前述本发明的组合物、制造方法、增殖促进组合物、和促进皮肤障碍的治愈的组合物的说明。
本发明的促进皮肤障碍的治愈的方法例如也可以称为皮肤障碍的治疗方法或处置方法。
本发明的治愈促进方法例如可以包括向对象给药前述本发明的组合物的给药工序。前述对象例如可列举出出现了皮肤障碍的患者、有皮肤障碍的可能性的患者等。
本发明的治愈促进方法例如可以以体外方式实施,也可以以体内方式实施。
以体外方式实施本发明的治愈促进方法时,本发明的治愈促进方法例如包括在前述组合物存在下培养角质形成细胞、成纤维细胞等与皮肤相关的细胞的培养工序。前述本发明的组合物的给药对象和给药条件例如可以援用本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
<角质形成细胞功能促进方法>
本发明在另一例中提供能促进角质形成细胞功能的方法。本发明的角质形成细胞功能促进方法使用前述本发明的组合物。本发明的角质形成细胞功能促进方法的特征在于使用前述本发明的组合物,其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的角质形成细胞功能促进方法,能够促进角质形成细胞功能。本发明的角质形成细胞功能促进方法可以援用前述本发明的组合物、制造方法、增殖促进组合物、和角质形成细胞功能促进组合物的说明。
本发明的角质形成细胞功能促进方法例如可以以体外方式实施,也可以以体内方式实施。
以体外方式实施本发明的角质形成细胞功能促进方法时,本发明的角质形成细胞功能促进方法例如包括在前述组合物存在下培养角质形成细胞的培养工序。前述本发明的组合物的给药对象和给药条件例如可以援用本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
<毛乳头细胞功能促进方法>
本发明在另一例中提供能促进毛乳头细胞功能的方法。本发明的毛乳头细胞功能促进方法使用前述本发明的组合物。本发明的毛乳头细胞功能促进方法的特征在于使用前述本发明的组合物,其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的毛乳头细胞功能促进方法,能够促进毛乳头细胞功能。本发明的毛乳头细胞功能促进方法可以援用前述本发明的组合物、制造方法、增殖促进组合物、和毛乳头细胞功能促进组合物的说明。
本发明的毛乳头细胞功能促进方法例如可以以体外方式实施,也可以以体内方式实施。
以体外方式实施本发明的毛乳头细胞功能促进方法时,本发明的毛乳头细胞功能促进方法例如包括在前述组合物存在下培养毛乳头细胞的培养工序。前述本发明的组合物的给药对象和给药条件例如可以援用本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
<生发促进方法>
本发明在另一例中提供能促进生发的方法。本发明的生发促进方法使用前述本发明的组合物。本发明的生发促进方法的特征在于使用前述本发明的组合物,其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的生发促进方法,可期待能够促进生发。本发明的生发促进方法可以援用前述本发明的组合物、制造方法、增殖促进组合物、和生发促进组合物的说明。
本发明的生发促进方法例如也可以称为脱发症或毛发稀疏的治疗方法或处置方法。另外,本发明的生发促进方法例如可以用于脱发的预防、抑制、或防止。在此情况下,本发明的生发促进方法例如也可以称为脱发的预防、抑制、或防止方法。
本发明的生发促进方法例如可以包括向对象给药前述本发明的组合物的给药工序。前述对象例如可列举出出现了脱发症的患者、有脱发症的可能性的患者等。前述脱发症的患者例如可列举出男性型脱发症、女性型脱发症、抗癌药治疗后的脱发症等患者。前述有脱发的可能性的患者例如可列举出抗癌药治疗前的患者、遗传性脱发症且开始脱发前的患者等。
本发明的生发促进方法例如可以以体外方式实施,也可以以体内方式实施。
以体外方式实施本发明的生发促进方法时,本发明的生发促进方法例如包括在前述组合物存在下培养毛乳头细胞等与生发相关的细胞的培养工序。前述本发明的组合物的给药对象和给药条件例如可以援用本发明的增殖促进组合物的给药对象和给药条件的说明。
<组合物的应用>
本发明为组合物或其应用,所述组合物用于促进细胞的增殖且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。另外,本发明为组合物或其应用,所述组合物用于促进成纤维细胞功能且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。本发明为组合物或其应用,所述组合物用于促进皮肤障碍的治愈且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。本发明为组合物或其应用,所述组合物用于促进角质形成细胞功能且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。本发明为组合物或其应用,所述组合物用于促进毛乳头细胞功能且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。本发明为组合物或其应用,所述组合物用于促进生发且包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物在制造细胞增殖促进组合物中的应用。另外,本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物在制造成纤维细胞功能促进组合物中的应用。本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物在制造促进皮肤障碍的治愈的组合物中的应用。本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物在制造角质形成细胞功能促进组合物中的应用。本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物在制造毛乳头细胞功能促进组合物中的应用。本发明为包含巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分的组合物在制造生发促进组合物中的应用。
实施例
以下,使用实施例对本发明进行详细地说明,本发明不限定于实施例中记载的方式。
[实施例1]
制造本发明的组合物,确认了包含生长因子和生长因子受体且具有细胞增殖促进活性。
(1)永生化巨核细胞的制作
永生化巨核细胞按以下的顺序制作。
(1-1)由iPS细胞制备造血祖细胞
依据下述参考文献8记载的方法,实施了由使用人iPS细胞(TKDN SeV2和NIH5:使用仙台病毒建立的人胚胎皮肤成纤维细胞来源iPS细胞)向血细胞的分化培养。具体而言,将人ES/iPS细胞集落在20ng/ml VEGF(R&D SYSTEMS公司制)存在下与C3H10T1/2饲养层细胞共培养14天而制作了造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cells;HPC)。培养条件以37℃、20%O2、5%CO2实施(只要没有特别记载,以下为相同条件)。
参考文献8:Takayama N.et al.,“Transient activation of c-MYC expressionis critical for efficient platelet generation from human induced pluripotentstem cells”,J.Exp.Med.,2010,vol.13,pages 2817-2830
(1-2)基因导入系统
基因导入系统利用慢病毒载体系统。慢病毒载体是四环素调节性的Tet-on(注册商标)基因表达诱导系统载体。可以通过将LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(下述参考文献9)的mOKS盒替换为c-MYC、BMI1、或BCL-xL而制作。将导入了c-MYC、BMI1、或BCL-xL的载体分别称为LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、和LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G。c-MYC、BMI1、和BCL-xL病毒通过用前述慢病毒载体基因导入293T细胞中而制作。通过使目标细胞感染得到的病毒,从而将c-MYC、BMI1、和BCL-xL基因导入目标细胞的基因组序列中。稳定地导入基因组序列中的这些基因可以通过在培养基中加入多西环素(clontech#631311)而强制表达。
参考文献9:Kobayashi,T.et al.,“Generation of rat pancreas in mouse byinterspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells.”,Cell,2010,vol.142,No.5,pages 787-799
(1-3)使c-MYC和BMI1病毒感染造血祖细胞
在预先接种了C3H10T1/2饲养细胞的6孔板上,以成为5×104个细胞/孔的方式接种利用前述(1-1)的方法得到的HPC,利用使用了BMI1病毒和c-MYC病毒的慢病毒法强制表达c-MYC和BMI1。此时,针对1种细胞株使用6个孔。具体而言,分别以成为MOI(multiplicityof infection)20的方式将病毒颗粒添加至培养基中,用自旋感染(Spin infection)(32℃、900rpm、60分钟离心)使其感染。前述自旋感染间隔12小时实施了2次。使用如下培养基:在含有基础培养基(15%胎牛血清(GIBCO)、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺(GIBCO)、1%胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(ITS-G)(GIBCO)、0.45mmol/l 1-硫代甘油(Sigma-Aldrich)、50μg/mlL-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)的IMDM(Iscove’s改良杜尔贝科培养基)(Sigma-Aldrich))中,以成为50ng/ml人促血小板生成素(TPO)(R&D SYSTEMS)、50ng/ml人干细胞生长因子(SCF)(R&D SYSTEMS)和2μg/ml多西环素(Dox、clontech#631311)的方式添加了各物质的培养基(以下为分化培养基)中,进一步以最终浓度为10μg/ml的方式添加了鱼精蛋白而成的培养基。
(1-4)巨核细胞自增殖株的制作和维持培养
将利用前述(1-3)的方法实施了c-MYC和BMI1病毒的感染之日作为感染第0天,如下所述,通过培养导入了c-MYC基因和BMI1基因的HPC,从而分别制作了巨核细胞自增殖株。c-MYC基因和BMI1基因的强制表达通过在培养基中以成为1μg/ml DOX的方式添加DOX而实施。
·感染第2天~感染第11天
在感染第2天,通过移液回收利用上述的方法得到的已感染病毒的血细胞,以1200rpm、5分钟进行离心操作去除上清液后,用新鲜的分化培养基进行悬浮并接种到新鲜的C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。在感染第9天进行同样的操作,从而实施了传代。前述再次接种时,计数细胞数后,以成为1×105个细胞/2ml/孔的方式接种在C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。
·感染第12天~感染第13天
实施与感染第2天同样的操作。计数细胞数后,以成为3×105个细胞/10ml/100mm培养皿的方式,接种在C3H10T1/2饲养细胞上(100mm培养皿)。
·感染第14天
回收已感染病毒的血细胞,相对于1.0×105个细胞,分别使用2μl、1μl、和1μl的抗人CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人CD42b-PE抗体(eBioscience)、和抗人CD235ab-pacific blue(BioLegend)抗体,使前述血细胞与抗体反应。前述反应后,使用FACS Verse(商标)(BD Biosciences)进行解析。在感染第14天,将CD41a阳性率为50%以上的细胞作为巨核细胞自增殖株。
(1-5)使巨核细胞自增殖株感染BCL-xL病毒
在前述感染第14天的巨核细胞自增殖株中利用使用了BCL-xL病毒的慢病毒法基因导入BCL-xL。以成为MOI 10的方式在培养基中添加病毒颗粒,通过自旋感染(32℃、900rpm、60分钟离心)使其感染。BCL-xL基因的强制表达通过在培养基中以成为1μg/ml DOX的方式添加DOX而实施。
(1-6)巨核细胞永生化株的制作和维持培养
·感染第14天~感染第18天
回收利用前述(1-5)的方法得到的导入了BCL-xL基因的巨核细胞自增殖株,进行1200rpm、5分钟离心操作。前述离心后,用新鲜的分化培养基悬浮沉淀的细胞后,在新鲜的C3H10T1/2饲养细胞上以成为2×105个细胞/2ml/孔的方式接种(6孔板)。
·感染第18天:传代
回收导入BCL-xL基因后的巨核细胞自增殖株,计数细胞数后,以成为3×105个细胞/10ml/100mm培养皿的方式接种。
·感染第24天:传代
回收导入BCL-xL基因后的巨核细胞自增殖株,计数细胞数后,以成为1×105个细胞/10ml/100mm培养皿进行接种。之后,每隔4-7天同样地进行传代,进行维持培养。需要说明的是,进行传代时,悬浮于新鲜的分化培养基上,进行接种。
在感染第24天回收基因导入了BCL-xL的巨核细胞自增殖株,相对于1.0×105个细胞,分别使用2μl、1μl、和1μl的抗人CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人CD42b-PE抗体(eBioscience)、和抗人CD235ab-Pacific Blue(Anti-CD235ab-PB;BioLegend)抗体,在免疫染色后使用FACS Verse(商标)进行解析。此外,感染第24天,将CD41a阳性率为50%以上的株作为永生化巨核细胞株。将感染后能够增殖24天以上的这些细胞作为永生化巨核细胞株SeV2-MKCL和NIH5-MKCL。
将得到的SeV2-MKCL和NIH5-MKCL在10cm培养皿(10ml/培养皿)中静置培养。关于培养基,以IMDM作为基础培养基并加入了以下的成分(浓度为终浓度)。培养条件为37℃、5%CO2。
FBS(Sigma#172012lot.12E261)15%
L-谷氨酰胺(Gibco#25030-081)2mmol/l
ITS(Gibco#41400-045)100倍稀释
MTG(单硫代甘油,sigma#M6145-25ML)450μmol/l
抗坏血酸(sigma#A4544)50μg/ml
嘌呤霉素(sigma#P8833-100MG)2μg/ml
SCF(和光纯药#193-15513)50ng/ml
TPO样作用物质200ng/ml
(2)巨核细胞的培养物的生产
通过在不包含DOX的培养基中培养,从而解除强制表达。具体而言,用PBS(-)将利用前述(1)的方法得到的永生化巨核细胞株(SeV2-MKCL和NIH5-MKCL)清洗2次,悬浮于下述血小板生产培养基。细胞的接种密度为1.0×105个细胞/ml。
关于前述血小板生产培养基,以IMDM作为基础培养基且加入了以下的成分(浓度为终浓度)。
人血浆A6%
L-谷氨酰胺(Gibco#25030-081)4mmol/l
ITS(Gibco#41400-045)100倍稀释
MTG(单硫代甘油,sigma#M6145-25ML)450μmol/l
抗坏血酸(sigma#A4544)50μg/ml
SCF(和光纯药#193-15513)50ng/ml
TPO样作用物质200ng/ml
ADAM抑制剂15μmol/l
GNF351(Calbiochem#182707)500nmol/LY39983(Chemscene LLC#CS-0096)500nmol/l
尿激酶5U/ml
低分子肝素(SANOFI、Clexane)1U/ml
此外,在前述血小板生产培养基存在下培养6天,产生血小板,从而生产巨核细胞的培养物。
(3)纯化血小板的制造
对于前述(2)中得到的巨核细胞的培养物,按照以下的顺序,制造(纯化)血小板。需要说明的是,实施了2次同样的纯化。
(3-1)巨核细胞的培养物的浓缩
对于前述(2)中得到的巨核细胞的培养物,导入培养物袋中。此外,对于前述培养物袋,如图1所示,连接浓缩系统。图1中,清洗保存液袋1和2包含清洗保存液。前述清洗保存液使用:在BICANATE输液(BICARBON输液、大塚制药公司制)中添加20%ACD和2.5%人血清白蛋白且用NaOH调节至pH7.2所得者。此外,依据下述表1,使用中空纤维膜(Plasmaflo.OP、Asahi Kasei Medical Co.,Ltd.制),将前述巨核细胞的培养物浓缩,将得到的巨核细胞的培养物的浓缩液回收至储藏袋中。
[表1]
(3-2)血小板的离心
首先,使用无菌连接装置,将ACP215一次性套装的废液袋置换成回收用袋。前述回收用袋使用HICALIQ IVH袋(Terumo HC-B3006A)。接着,在前述巨核细胞的培养物的浓缩液中添加10%量的ACD-A液体(Terumo公司制)。前述添加后,将添加了ACD-A液体的浓缩液注入细胞袋中。前述细胞袋使用HICALIQ IVH袋(Terumo HC-B3006A)。
接着,使用无菌连接装置,使包含添加了ACD-A液体的培养物的细胞袋与ACP215一次性套装连接。此外,在服务模式下启动ACP215,将转速设定为2500rpm(350×g)。启动ACP215,以约100ml/分钟将前述细胞袋中的培养物导入分离碗中。将从前述分离碗流出的液体成分回收至回收袋中。将前述细胞袋中的培养物的总量导入分离碗后,进而将500ml的清洗保存液导入前述分离碗中。在前述分离碗导入前述清洗保存液后,停止离心并使用塑管封口机使包含回收液(包含血小板的回收液体成分)的回收袋分开。
使用前述无菌连接装置将包含回收液(包含血小板)的回收袋连接到新的ACP215一次性套装上。在通常模式下启动ACP215。程序设定选择WPC,依据设备的指示,设置连接了前述回收袋的ACP215一次性套装。需要说明的是,包含回收液的回收袋设置于支架上。
接着,将ACP215的离心速度变更为5000rpm(1398.8×g),开始进行离心。在开始将前述回收液导入前述分离碗中时,从自动注入变更为手动注入。具体而言,以约100ml/分钟的导入速度将前述回收液导入前述分离碗中。将前述回收液总量添加至分离碗中后,进而追加500ml的清洗保存液。
(3-3)血小板的清洗
对于清洗,依据ACP215的程序,用2000ml的前述清洗保存液进行清洗。
(3-4)血小板的回收
依据ACP215的程序,将200ml的经清洗的血小板回收至血小板制剂袋中。
(3-5)血小板的分离
对于前述血小板制剂袋,使用前述中空纤维膜,利用常规方法将血小板分离,回收至回收用袋中。
(4)提取物的制造
作为前述巨核细胞或其培养物,使用利用前述(1)的方法得到的永生化巨核细胞株、前述(3-5)中得到的回收至血小板制剂袋中的血小板、和回收至排液袋中的去除了血小板的巨核细胞的培养物(以下也统称为“原材料”)。对于去除了血小板的巨核细胞的培养物,使用分别制备的4个样品(血小板去除巨核细胞培养物1~4)。
对于各原材料,用清洗液清洗2次。前述清洗液使用:在BICANATE输液中以成为约20(v/v)%的方式添加ACD-A液体后,添加NaOH,将pH调节至7.0~7.4的范围内所得者。前述清洗后,将各原材料在2000×g、10分钟、室温(约25℃)的条件下进行离心。前述离心后,回收沉淀物,使用液氮,将前述沉淀物冷冻。接着,在冷冻的沉淀物中添加细胞溶解缓冲液,在50rpm、4℃下振荡30分钟,由此使其溶解。前述细胞溶解缓冲液使用:在市售的细胞溶解缓冲液(2×Cell Lysis Buffer、RayBiotech公司制、Cat.No.:AA-LYS)中添加了蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail、RayBiotech公司制、Cat.No.:AA-PI)所得者。
对于得到的溶解液,在14000×g、5分钟、4℃的条件下进行离心。前述离心后,将上清液回收作为实施例的处理物。对于由各原材料得到的处理物,使用Pierce(商标)BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司制),测定总蛋白浓度。其结果,使用永生化巨核细胞株时,由2.2×107个细胞提取2.604mg的总蛋白。另外,使用血小板时,由2.5×108个细胞提取1.187mg的总蛋白。进而,使用血小板去除巨核细胞培养物1~4时,由1.97×108个细胞、5.25×108个细胞、3.64×108个细胞、6.22×108个细胞分别提取2.8、5.944、3.6、和4.496mg的总蛋白。此外,将总蛋白浓度调整为5mg/ml后,对于各处理物,使用Quantibody(注册商标)人生长因子阵列1(RayBiotech公司制),测定生长因子(bFGF、IGFBP-1、IGFBP-2、PIGF、VEGF、GDF-15、AR、BMP-7、HGF)和生长因子受体(SCFR、EGFR、VEGFR2)的浓度。将这些结果示于下述表2。需要说明的是,下述表2也可以称为每5mg总蛋白的浓度。
[表2]
单位:pg/mL
(5)细胞增殖促进活性的确认
将人脂肪组织来源间充质干细胞以成为2.4~4.8×105个细胞/10ml培养基/培养皿的方式接种在10cm培养皿中。需要说明的是,作为前述间充质干细胞,使用将市售的人脂肪组织来源间充质干细胞(Takara Bio公司制、Cat.No.:C-12977)进行2次传代培养后回收的细胞。对于前述培养基,在间充质干细胞增殖培养基2(Mesenchymal Stem Cell GrowthMedium 2、Takara Bio公司制、Cat.No.:C-28009)中添加将由血小板去除巨核细胞培养物2制备的组合物冷冻后溶解所得者。前述组合物以培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度成为规定浓度(0、125、250、或500μg/ml)的方式添加。需要说明的是,前述培养基为维持培养基。
前述接种后,将前述间充质干细胞在37℃、5%CO2的湿润下培养3天。前述培养后,回收前述间充质干细胞,在同样的条件下接种,再次在37℃、5%CO2的湿润下培养3天。接着,回收前述培养后的间充质细胞,计数细胞数。此外,计算出以前述接种时的细胞数为基准(1)时的回收时的细胞数的相对值,将其作为增殖活性的相对值。另外,基于前述接种时的细胞数及前述回收时的细胞数,计算出细胞增殖一次所需的时间(倍增时间)。将这些结果示于图2。
图2是示出细胞的增殖活性的图。图2中,(A)示出增殖活性,(B)示出倍增时间。图2的(A)中,横轴表示前述组合物来源的总蛋白浓度,纵轴表示增殖活性的相对值。图2的(B)中,横轴表示前述组合物来源的总蛋白浓度,纵轴表示倍增时间,图中的数值表示倍增时间。如图2的(A)所示,添加本发明的组合物时,间充质干细胞的增殖活性依赖于前述组合物来源的总蛋白浓度地增加。另外,虽未图示,但未添加前述组合物的间充质干细胞中,第3次传代后的倍增时间为21小时。如图2的(B)所示,未添加本发明的组合物时,间充质干细胞的倍增时间延长至约1.5倍。相对于此,如图2的(B)所示,添加了本发明的组合物时,依赖于前述组合物来源的总蛋白浓度地,间充质干细胞增殖一次所需的时间缩短。另外,在未添加本发明的组合物的培养基中培养时,间充质干细胞在得到传代次数时倍增时间延长。相对于此,添加了本发明的组合物时,前述倍增时间的延长基本得到抑制。因此,可知本发明的组合物显示出细胞增殖促进活性、和能够抑制增殖活性的降低。
[实施例2]
确认了本发明的组合物具有细胞增殖促进活性。
作为前述间充质干细胞,在2次传代培养后,回收并进行冷冻保存。使用将前述冷冻保存的细胞解冻后传代培养1次的细胞,以使前述维持培养基中的前述组合物来源的总蛋白浓度成为规定浓度(0、0.2、1.3、31.3、62.5、或125μg/ml)的方式进行添加,除此以外与前述实施例1(5)同样地,计算出增殖活性和倍增时间。将这些结果示于图3。
图3是示出细胞的增殖活性的图。图3中,(A)示出增殖活性,(B)示出倍增时间。图3的(A)中,横轴表示前述组合物来源的总蛋白浓度,纵轴表示增殖活性的相对值。图3的(B)中,横轴表示前述组合物来源的总蛋白浓度,纵轴表示倍增时间。如图3的(A)所示,添加了本发明的组合物时,间充质干细胞的增殖活性依赖于前述组合物来源的总蛋白浓度地增加,特别是,总蛋白浓度为31.3μg/ml以上时,间充质干细胞的增殖活性显著增加。另外,虽未图示,但未添加前述组合物的间充质干细胞中,第3次传代后的倍增时间为17小时。如图3的(B)所示,未添加本发明的组合物时,间充质干细胞的倍增时间延长至约1.5倍。相对于此,如图3的(B)所示,添加了本发明的组合物时,依赖于前述组合物来源的总蛋白浓度地,间充质干细胞增殖一次所需的时间缩短,特别是,总蛋白浓度为31.3μg/ml以上时,间充质干细胞增殖一次所需的时间显著缩短。另外,在未添加本发明的组合物的培养基中培养时,间充质干细胞得到传代次数时倍增时间延长。相对于此,添加了本发明的组合物时,前述倍增时间的延长基本得到抑制,将前述组合物来源的总蛋白浓度设为31.3μg/ml以上时,该效果是显著的。因此,可知:本发明的组合物显示出细胞增殖促进活性、和能够抑制增殖活性的降低。
[实施例3]
确认了本发明的组合物具有成纤维细胞功能促进活性。
(1)成纤维细胞的培养
对于正常人皮肤成纤维细胞(nHDF、KURABO公司制、Cat.No.:KF-4109),使用增殖培养基在T-75烧瓶(Sumilon公司制)中唤醒,在CO2培养箱中在规定培养条件(5%CO2、37℃、湿润条件下,以下同样。)内进行培养。前述增殖培养基是含有10%胎牛血清(FBS、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:172012)和1%青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific公司制、Cat.No.:15140-122)的DMEM培养基(nacalai tesque公司制、Cat.No.:08456-65)。前述培养时,每隔1~2天进行培养基更换。在达到80%左右的汇合的时间点,回收前述细胞,用于之后的试验。如以下所述实施了前述细胞的传代。首先,用磷酸缓冲液(PBS)(-/-)(nacalai tesque公司制、Cat.No.:14249-95)清洗前述细胞后,使用剥离液(2.5g/l-Trypsin/1mmol/l-EDTASolution,with Phenol Red(0.25%Trypsin-EDTA)、ThermoFisher Scientific公司制、Cat.No.:32777-44)剥离细胞,加入增殖培养基来中和胰蛋白酶。接着,将细胞悬浮液回收至15ml离心管中,使用离心机(多功能冷却离心机、TOMY公司制、Cat.No.:CAX-571),进行离心(室温、1000rpm、5分钟)。在前述离心后,去除上清液,新加入增殖培养基并搅拌细胞,利用台盼蓝法进行活细胞数的计数。使用前述增殖培养基调整至目标细胞浓度,接种在之后的试验中使用的培养器中。
(2)成纤维细胞的细胞增殖促进活性的确认
对于前述细胞,以5×103个细胞/0.1ml/孔的密度接种在96孔板(Sumilon公司制、Cat.No.:MS-8096F)中,在前述的培养条件下培养1天。前述培养后,以成为规定浓度(各被检物质处理浓度:0.5%、1%、2.5%、5%、10%)的方式将培养基更换为包含由前述血小板去除巨核细胞培养物(MDF)或血小板(PLT)制备的组合物(总蛋白浓度为5mg/ml、实施例4和5也是同样)的DMEM培养基。因此,各培养液中的源自前述组合物的总蛋白的浓度为25μg/ml(0.5%)、50μg/ml(1%)、125μg/ml(2.5%)、250μg/ml(5%)、和500μg/ml(10%)(以下同样)。需要说明的是,由血小板去除巨核细胞培养物制备的组合物使用2种(iMDF1、iMDF2)。前述培养基更换后,培养48小时。
前述培养后,对于各孔的细胞,通过利用WST-8法测定活细胞数,从而测定增殖活性。首先,将培养基更换为含有10%的显色试剂(Cell Count Reagent SF、nacalai tesque公司制、Cat.No.:07553-15)的DMEM培养基,在前述培养条件下进行孵育。使用酶标仪(Varioskan Flash、Thermo Fisher Scientific公司制、Cat.No.:5250040)测定在前述孵育开始的30分钟后至90分钟的60分钟内的吸光度(450nm)的变化量(各组n=3)。阴性对照(NC)除未添加前述组合物之外同样地实施。阳性对照(FBS)中,代替前述组合物,以成为1%或10%的方式添加FBS,除此以外同样地实施。进而,参考例(ASA、Mes)中,代替前述组合物,以成为2mmol/l的方式添加具有胶原蛋白产生促进活性的L-抗坏血酸(L-Ascorbic Acid(ASA)、Fujifilm-Wako公司制、Cat.No.:013-19641),或以成为10mmol/l的方式添加具有透明质酸产生促进活性的N-甲基-L-丝氨酸(N-Methyl-L-serine(MeS)、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:73156),除此以外同样地实施。另外,将阴性对照中的细胞生存率设为100%,将各样品的细胞生存率设为相对的增殖活性值。此外,将在与阴性对照相比的学生T检验(双侧检验,非配对)中p值低于0.05的情况判定为显著。将这些结果示于图4。
图4是示出成纤维细胞的增殖活性的图。图4中,横轴表示样品的种类和浓度,纵轴表示细胞生存率(增殖活性)。如图4所示,在添加了由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT、PLTMax Human Platelet Lysate、EMD Millipore公司制、Cat.No.:SCM141)制备的组合物中的任意者的情况下,均观察到浓度依赖性地细胞增殖促进效果。另外,认为本发明的组合物的细胞增殖促进活性在相同浓度的情况下高于FBS。
(3)细胞外基质的产生促进活性的确认
前述实施例3的(2)的48小时培养后,回收各孔的培养上清液,在-80℃下保存至用于后述的I型胶原蛋白和透明质酸产生促进试验。
接着,使用I型胶原蛋白测定试剂盒(Human Collagen type I,ELISA kit(without pepsin)、ACEL公司制、Cat.No.:EC1-E105)测定前述培养上清液(各组n=3)中的I型胶原蛋白量。另外,使用透明质酸测定试剂盒(Hyaluronan DuoSet ELISA、R&D Systems公司制、Cat.No.:DY3614)测定前述培养上清液中的透明质酸量。使用了各试剂盒的测定方法依据随附的方案进行。阴性对照(NC)除未添加前述组合物之外同样地实施。对于FBS添加组(FBS),与前述实施例3的(2)同样地实施。阳性对照(ASA或Mes)中,对于I型胶原蛋白测定中使用的样品,代替前述组合物,以成为2mmol/l的方式添加具有胶原蛋白产生促进活性的L-抗坏血酸(L-Ascorbic Acid(ASA)、Fujifilm-Wako公司制、Cat.No.:013-19641),对于透明质酸测定中使用的样品,代替前述组合物,以成为10mmol/l的方式添加具有透明质酸产生促进活性的N-甲基-L-丝氨酸(N-Methyl-L-serine(MeS)、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:73156),除此以外同样地实施。此外,将在与阴性对照相比的学生T检验(双侧检验,非配对)中p值低于0.05的情况判定为显著。将这些结果示于图5和图6。
图5是示出I型胶原蛋白的生成量的图。图5中,横轴表示样品的种类,纵轴表示I型胶原蛋白的产生量。需要说明的是,图中的ASA的数值表示参考例(ASA)中的胶原蛋白产生量(μg/ml)。如图5所示,由前述血小板去除巨核细胞培养物或血小板制备的组合物中的任意者的情况下,均观察到I型胶原蛋白的产生量呈浓度依赖性增加。推测:与前述实施例3的(2)的细胞增殖促进活性的结果相比,前述I型胶原蛋白的产生促进活性起因于细胞增殖促进活性。
接着,图6是示出透明质酸的产生量的图。图6中,横轴表示样品的种类和浓度,纵轴表示透明质酸的产生量。如图6示,由前述血小板去除巨核细胞培养物或血小板制备的组合物中的任意者的情况下,均观察到透明质酸的产生量呈浓度依赖性增加。推测:与前述细胞增殖促进活性相比,前述透明质酸的产生促进活性是不依赖于细胞增殖促进活性的活性,即,本发明的组合物作用于成纤维细胞,促进了透明质酸的产生。
由以上的结果可知:本发明的组合物具有成纤维细胞增殖促进活性、I型胶原蛋白和透明质酸等细胞外基质成分的产生促进活性。在皮肤等出现障碍的情况下,前述成纤维细胞迁移到障碍部位,通过细胞分裂和分泌细胞外基质成分而帮助障碍部位的治愈。本发明的组合物促进成纤维细胞的这些功能,因此可期待能够促进皮肤障碍的治愈。
[实施例4]
确认了本发明的组合物具有角质形成细胞功能促进活性。
(1)角质形成细胞的培养
对于正常人表皮角质形成细胞(nHEK、KURABO公司制、Cat.No.:KK-4109),使用增殖培养基在T-75烧瓶(Sumilon公司制)中唤醒,在CO2培养箱中在规定培养条件(5%CO2、37℃、湿润条件下,以下同样。)内进行培养。前述增殖培养基为Humedia-KG2培养基(KURABO公司制、Cat.No.:KK-2150S)。对于前述培养,每隔1~2天进行培养基更换。在达到80%左右的汇合的时间点,回收前述细胞,用于之后的试验。如以下所述实施了前述细胞的传代。首先,用磷酸缓冲液(PBS)(-/-)(nacalai tesque公司制、Cat.No.:14249-95)清洗前述细胞后,使用剥离液(2.5g/l-Trypsin/1mmol/l-EDTA Solution,with Phenol Red(0.25%Trypsin-EDTA)、Thermo Fisher Scientific公司制、Cat.No.:32777-44)剥离细胞,加入增殖培养基来中和胰蛋白酶。接着,将细胞悬浮液回收至15ml离心管中,使用离心机(多功能冷却离心机、TOMY公司制、Cat.No.:CAX-571),进行离心(室温、1000rpm、5分钟)。在前述离心后,去除上清液,新加入增殖培养基并搅拌细胞,利用台盼蓝法进行活细胞数的计数。使用前述增殖培养基调整至目标细胞浓度,接种在之后的试验中使用的培养器中。
(2)角质形成细胞的细胞增殖促进活性的确认
对于前述细胞,以1×103个细胞/0.1ml/孔的密度接种在96孔板(Sumilon公司制、Cat.No.:MS-8096F),在前述的培养条件下培养1天。前述培养后,以成为规定浓度(各被检物质处理浓度:0.5%、1%、2.5%、5%、10%)的方式将培养基更换为包含由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物的维持培养基(Humedia-KB2、KURABO公司制、Cat.No.:KK-2350S)。需要说明的是,由血小板去除巨核细胞培养物制备的组合物使用2种。前述培养基更换后,培养48小时。
前述培养后,对于各孔的细胞,使用相位差显微镜(OLYMPUS公司制、Cat.No.:CKX53)观察各细胞的形态。另外,对于各孔的细胞,与前述实施例3的(2)同样地测定吸光度(450nm)的变化量(各组n=3)。阴性对照(NC)除未添加前述组合物之外同样地实施。对于阳性对照(添加剂),代替包含前述组合物的维持培养基,使用前述增殖培养基,除此以外同样地实施。进而,对于参考例(JTC或NA),代替前述组合物,添加具有FLG基因的表达促进活性的JTC-801(JTC、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:J3955、终浓度100nmol/l)或具有SPTLC1基因的表达促进活性的烟酰胺(NA、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:N0636-100G、终浓度30μmol/l),除此以外同样地实施。另外,将阴性对照中的细胞生存率设为100%,将各样品的细胞生存率设为相对的增殖活性值。此外,将在与阴性对照相比的学生T检验(双侧检验,非配对)中p值低于0.05的情况判定为显著。将这些结果示于图7和图8。
图7是示出各孔的细胞的相位差图像的照片。需要说明的是,对于添加由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物的组,示出10%添加组的例子作为代表例。如图7所示,阴性对照中,角质形成细胞的边界是明确的,未观察到向上皮(表皮)层的细胞(表皮细胞)分化。另一方面,由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物中,角质形成细胞在孔板上延伸,细胞边界变得不清楚。这是由于角质形成细胞分化为上皮(表皮)层的细胞(表皮细胞)所致。另外,由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物的情况下,上皮(表皮)层的细胞的比例呈浓度依赖性增加,特别是,使用了前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)的情况下,观察到显著增加。由这些结果可知,本发明的组合物促进角质形成细胞向上皮层的细胞分化。
图8是示出角质形成细胞的增殖活性的图。图8中,横轴表示样品的种类和浓度,纵轴表示细胞生存率(增殖活性)。如图8所示,添加由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物中的任意者的情况下,均观察到细胞增殖促进效果。另外,认为本发明的组合物的细胞增殖促进活性在相同浓度的情况下高于FBS。
(3)屏障功能基因的诱导促进活性的确认
以5×104个细胞/0.5ml/孔的密度接种在24孔板(Sumilon公司制、Cat.No.:MS-8024),除此以外与前述实施例4(2)同样地培养角质形成细胞。前述培养后,使用RNA提取试剂盒(RNeasy 96Kit、QIAGEN公司制、Cat.No.:74181),由细胞回收和纯化总RNA。RNA的提取依据试剂盒随附的方案。得到的纯化RNA使用分光光度计(NanoDrop One、Thermo FisherScientific公司制、Cat.No.:ND-ONE-W)测定浓度,且通过A260/A280确认纯度,直至用于逆转录反应之前,保存在-80℃下。
使用逆转录试剂盒(QuantiTect Reverse Transcription Kit、QIAGEN公司制),由前述纯化RNA合成cDNA。逆转录反应依据试剂盒随附的方案。得到的cDNA保存在-30℃下。接着,使用得到的cDNA、下述GAPDH基因、FLG基因或SPTLC1基因用的引物对和qPCR试剂盒(TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)、Takara公司制、Cat.No.:RR820A),实施了定量PCR。PCR反应中,以95℃、30秒进行加热处理后,将95℃、5秒、60℃、30秒作为1次循环实施40次循环后,使得到的PCR产物解离。前述qPCR使用qPCR装置(LightCycler96Instrument、Roche公司制、Cat.No.:05815916001)来实施。阴性对照(NC)除未添加前述组合物之外同样地实施。阳性对照(JTC或NA)中,对于FLG基因的表达测定中使用的样品,代替前述组合物,以成为100nmol/l的方式添加具有FLG基因的表达促进活性的JTC-801(JTC、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:J3955),对于SPTLC1基因的表达测定中使用的样品,代替前述组合物,以成为30μmol/l的方式添加具有SPTLC1基因的表达促进活性的烟酰胺(NA、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:N0636-100G),除此以外同样地实施。另外,阴性对照和阳性对照中,准备添加了添加剂的组,同样地实施。由得到的测定数据利用ΔΔCt法,计算出用GAPDH基因的表达量校正的各基因的表达量,进而,计算出将阴性对照的表达量设为1的相对的表达量。将与阴性对照相比在学生T检验(两侧检验,非配对)中p值低于0.05的情况判定为显著。将这些结果示于图9和图10。
·GAPDH基因用引物对
正向引物(序列号1)
5’-CATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCC-3’
反向引物(序列号2)
5’-CCAGGATGCCCTTGAGGGGGCCCTC-3’
·FLG基因用引物对
正向引物(序列号3)
5’-TCGGCAAATCCTGAAGAATCCAGA-3’
反向引物(序列号4)
5’-GCTTGAGCCAACTTGAATACCATCAG-3’
·SPTLC1基因用引物对
正向引物(序列号5)
5’-ACAAAGCAAGAATCTTCCTGGAGGAAAGCC-3’
反向引物(序列号6)
5’-AAACCTCCAATAGAAGCAAGTGCATTCTCC-3’
图9是示出FLG基因的表达量的图。图9中,横轴表示样品的种类和浓度,纵轴表示FLG基因的表达量。如图9所示,添加由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物中的任意者的情况下,均观察到FLG基因的表达促进效果。另外,认为本发明的组合物的FLG基因的表达促进活性在同一浓度的情况下高于作为阳性对照的JTC801。
接着,图10是示出SPTLC1基因的表达量的图。图10中,横轴表示样品的种类和浓度,纵轴表示SPTLC1基因的表达量。如图10所示,添加由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物中的任意者的情况下,均观察到SPTLC1基因的表达促进效果。另外,认为本发明的组合物的SPTLC1基因的表达促进活性在同一浓度的情况下高于作为阳性对照的烟酰胺(NA)。
由以上的结果可知:本发明的组合物具有角质形成细胞增殖促进活性、促进向表皮细胞的分化和促进FLG基因、SPTLC1基因等屏障功能基因表达的活性。已知前述角质形成细胞的增殖、向表皮细胞的分化、和屏障功能基因的表达诱导对于皮肤组织和其屏障功能的维持是重要的。因此,由于本发明的组合物促进角质形成细胞的这些功能,因此可期待能够用于皮肤功能的维持、皮肤的屏障功能的维持等肌肤调理的维持。
[实施例5]
确认了本发明的组合物具有毛乳头细胞功能促进活性。
(1)毛乳头细胞的培养
对于人头发毛乳头细胞(HFDPC、TOYOBO公司制、Cat.No.:CA60205a),使用增殖培养基在T-75烧瓶(Sumilon公司制)中唤醒,在CO2培养箱中在规定培养条件(5%CO2、37℃、湿润条件下,以下同样。)内进行培养。前述增殖培养基为在毛乳头细胞增殖培养基(PCGM、TOYOBO公司制、Cat.No.:TMTPGM-250S)中添加了随附的添加剂而成的。对于前述培养,每隔1~2天进行培养基更换。在达到80%左右的汇合的时间点,回收前述细胞,用于之后的试验。如以下所述实施了前述细胞的传代。首先,用磷酸缓冲液(PBS)(-/-)(nacalai tesque公司制、Cat.No.:14249-95)清洗前述细胞后,使用剥离液(2.5g/l-Trypsin/1mmol/l-EDTASolution,with Phenol Red(0.25%Trypsin-EDTA)、Thermo Fisher Scientific公司制、Cat.No.:32777-44)剥离细胞,加入增殖培养基来中和胰蛋白酶。接着,将细胞悬浮液回收至15ml离心管中,使用离心机(多功能冷却离心机、TOMY公司制、Cat.No.:CAX-571),进行离心(室温、1000rpm、5分钟)。在前述离心后,去除上清液,新加入增殖培养基并搅拌细胞,利用台盼蓝法进行活细胞数的计数。使用前述增殖培养基调整至目标细胞浓度,接种在之后的试验中使用的培养器中。
(2)毛乳头细胞的细胞增殖促进活性的确认
对于前述细胞,以5×103个细胞/0.1ml/孔的密度接种在96孔板(Sumilon公司制、Cat.No.:MS-8096F)中,在前述的培养条件下培养1天。前述培养后,以成为规定浓度(各被检物质处理浓度:0.5%、1%、2.5%、5%、10%)的方式将培养基更换为包含由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物的毛乳头细胞增殖培养基。需要说明的是,由血小板去除巨核细胞培养物制备的组合物使用2种。前述培养基更换后,培养48小时。
前述培养后,对于各孔的细胞,与前述实施例3的(2)同样地,测定吸光度(450nm)的变化量(各组n=3)。阴性对照(NC)除未添加前述组合物之外同样地实施。对于阳性对照(添加剂),使用包含前述添加剂的毛乳头细胞增殖培养基,除此以外同样地实施。参考例(Mx或Ad)中,代替前述组合物,添加已知作为生发剂的米诺地尔(Minoxidil(Mx)、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:M4145、终浓度30μmol/l)或腺苷(Adenosine(Ad)、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:A9251、终浓度100μmol/l),除此以外同样地实施。另外,将阴性对照中的细胞生存率设为100%,将各样品的细胞生存率设为相对的增殖活性值。此外,将在与阴性对照相比的学生T检验(双侧检验,非配对)中p值低于0.05的情况判定为显著。将这些结果示于图11。
图11是示出毛乳头细胞的增殖活性的图。图11中,横轴表示样品的种类和浓度,纵轴表示细胞生存率(增殖活性)。如图11所示,添加由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物中的任意者的情况下,均观察到细胞增殖促进效果。另外,启示了建议添加量为2.5~5%。
(3)生发促进基因的诱导促进活性的确认
以2.5×104个细胞/0.5ml/孔的密度接种在24孔板(Sumilon公司制、Cat.No.:MS-8024),除此以外与前述实施例5的(2)同样地培养毛乳头细胞。前述培养后,与前述实施例4的(3)同样地,合成了cDNA。
接着,作为引物对,使用前述GAPDH基因、下述FGF7基因或VEGFA基因用的引物对,除此以外与前述实施例4的(3)同样地,实施了qPCR。阴性对照除未添加前述组合物之外同样地实施。参考例中,代替前述组合物,添加已知作为生发剂的米诺地尔(Minoxidil、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:M4145、终浓度30μmol/l)或腺苷(Adenosin、Sigma-Aldrich公司制、Cat.No.:A9251、终浓度100μmol/l),除此以外同样地实施。由得到的测定数据利用ΔΔCt法,计算出用GAPDH基因的表达量校正的各基因的表达量,进而,计算出将阴性对照的表达量设为1的相对的表达量。将与阴性对照相比在学生T检验(两侧检验,非配对)中p值低于0.05的情况判定为显著。将这些结果示于图12和图13。
·FGF7基因用引物对
正向引物(序列号7)
5’-TCTGTCGAACACAGTGGTACCTGAG-3’
反向引物(序列号8)
5’-GCCACTGTCCTGATTTCCATGA-3’
·VEGFA基因用引物对
正向引物(序列号9)
5’-AAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCG-3’
反向引物(序列号10)
5’-CTTGTCACATCTGCAAGTACGTTCG-3’
图12是示出FGF7基因的表达量的图。图12中,横轴表示样品的种类,纵轴表示FGF7基因的表达量。如图12所示,添加由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)制备的组合物时,观察到FGF7基因的表达促进效果。另外,认为本发明的组合物的FGF7基因的表达促进活性在同一浓度的情况下与公知的生发剂为相同程度。
接着,图13是示出VEGFA基因的表达量的图。图13中,横轴表示样品的种类,纵轴表示VEGFA基因的表达量。如图13所示,添加由前述血小板去除巨核细胞培养物(iMDF1、iMDF2)或血小板(PLT)制备的组合物时,观察到VEGFA基因的表达促进效果。另外,认为本发明的组合物的VEGFA基因的表达促进活性在同一浓度的情况下与公知的生发剂为相同程度。
由以上的结果可知:本发明的组合物具有毛乳头细胞增殖促进活性、和FGF7基因、VEGFA基因等生发基因的表达促进活性。已知前述毛乳头细胞的增殖和生发基因的表达诱导对于生发、毛发的生长和维持是重要的。因此,由于本发明的组合物促进毛乳头细胞的这些的功能而可期待能够用于生发。
以上,参照实施方式和实施例对本发明进行说明,但本发明不限定于上述实施方式和实施例。本发明的构成、详细情况可以在本申请发明的范围内进行本领域技术人员能够理解的各种变更。
该申请主张以2019年12月13日申请的日本申请特愿2019-225959为基础的优先权,将其公开的全部内容引用至此。
<附录>
上述的实施方式和实施例的一部分或全部可以如以下的附录所记载,但不限定于以下。
<组合物>
(附录1)
一种组合物,其包含巨核细胞或其培养物的处理物。
(附录2)
根据附录1所述的组合物,其中,前述处理物为巨核细胞或其培养物的细胞级分的提取物。
(附录3)
根据附录1或2所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为2000~20000pg的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
(附录4)
根据附录1至3中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为8000~80000pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)。
(附录5)
根据附录1至4中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为1~60pg的胎盘生长因子(PIGF)。
(附录6)
根据附录1至5中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为200~2000pg的干细胞因子受体(SCFR)。
(附录7)
根据附录1至6中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为20~800pg的血管内皮生长因子(VEGF)。
(附录8)
根据附录1至7中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为20~400pg的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)。
(附录9)
根据附录1至8中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为1000~10000pg的分化生长因子-15(GDF-15)。
(附录10)
根据附录1至9中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~1000pg的成骨蛋白-7(BMP-7)。
(附录11)
根据附录1至10中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~16pg的双调蛋白(AR)。
(附录12)
根据附录1至11中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~60pg的上皮生长因子受体(EGFR)。
(附录13)
根据附录1至12中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~100pg的肝细胞生长因子(HGF)。
(附录14)
根据附录1至13中任一项所述的组合物,其中,前述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~200pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)。
(附录15)
根据附录1至14中任一项所述的组合物,其具有细胞增殖促进活性。
(附录16)
根据附录15所述的组合物,其中,前述细胞为间充质干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、和/或毛乳头细胞。
(附录17)
根据附录1至16中任一项所述的组合物,其具有成纤维细胞功能促进活性。
(附录18)
根据附录17所述的组合物,其中,前述成纤维细胞功能是成纤维细胞的增殖和/或由成纤维细胞产生细胞外基质。
(附录19)
根据附录18所述的组合物,其中,前述细胞外基质包含胶原蛋白和/或透明质酸。
(附录20)
根据附录1至19中任一项所述的组合物,其具有角质形成细胞功能促进活性。
(附录21)
根据附录20所述的组合物,其中,前述角质形成细胞功能是角质形成细胞的增殖、向表皮细胞的分化、和/或屏障功能基因的诱导。
(附录22)
根据附录21所述的组合物,其中,前述屏障功能基因包含丝聚合蛋白原基因和/或神经酰胺合成酶基因。
(附录23)
根据附录1至22中任一项所述的组合物,其具有毛乳头细胞功能促进活性。
(附录24)
根据附录23所述的组合物,其中,前述毛乳头细胞功能是毛乳头细胞的增殖和/或生发促进基因的诱导。
(附录25)
根据附录24所述的组合物,其中,前述生发基因为FGF7基因和/或VEGF基因。
(附录26)
根据附录1至25中任一项所述的组合物,其中,前述巨核细胞的培养物为去除了血小板的培养物。
(附录27)
根据附录1至26中任一项所述的组合物,其中,前述巨核细胞为永生化巨核细胞。
(附录28)
根据附录27所述的组合物,其中,前述永生化巨核细胞为包含外源性的BMI1基因、MYC基因、和Bcl-xL基因的巨核细胞。
(附录29)
根据附录1至28中任一项所述的组合物,其中,前述巨核细胞是体外诱导的巨核细胞。
(附录30)
根据附录1至29中任一项所述的组合物,其中,前述巨核细胞为多能细胞来源。
(附录31)
根据附录30所述的组合物,其中,前述多能细胞为诱导多能干(iPS)细胞。
(附录32)
根据附录1至31中任一项所述的组合物,其中,
前述处理物为:
对巨核细胞或其培养物进行处理,
前述处理为浓缩处理、干燥处理、冷冻处理、冷冻干燥处理、溶剂处理、表面活性剂处理、酶处理、蛋白质级分提取处理、超声波处理、和/或破碎处理。
(附录33)
根据附录32所述的组合物,其中,
前述处理物为:
从前述巨核细胞或其培养物中去除血小板,
对去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物进行处理。
(附录34)
根据附录33所述的组合物,其中,
前述处理物为:
保存去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物,
对前述经保存的巨核细胞或其培养物进行处理。
(附录35)
根据附录34所述的组合物,其中,
前述处理物为:
保存前述巨核细胞或其培养物,
对前述经保存的巨核细胞或其培养物进行破碎处理。
<组合物的制造方法>
(附录36)
一种组合物的制造方法,其包括对巨核细胞或其培养物进行处理的处理工序,
前述处理工序中的处理是浓缩处理、干燥处理、冷冻处理、冷冻干燥处理、溶剂处理、表面活性剂处理、酶处理、蛋白质级分提取处理、超声波处理、和/或破碎处理。
(附录37)
根据附录36所述的制造方法,其包括从前述巨核细胞或其培养物中去除血小板的去除工序,
前述处理工序中,对去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物进行处理。
(附录38)
根据附录37所述的制造方法,其包括保存去除了前述血小板的巨核细胞或其培养物的保存工序,
前述处理工序中,对前述经保存的巨核细胞或其培养物进行处理。
(附录39)
根据附录38所述的制造方法,其包括保存前述巨核细胞或其培养物的保存工序,
前述处理工序中,对前述经保存的巨核细胞或其培养物进行破碎处理。
(附录40)
一种组合物,其利用附录36至39中任一项所述的制造方法而得到。
<细胞增殖促进组合物>
(附录41)
一种细胞增殖促进组合物,其包含附录1至35中任一项所述的组合物。
(附录42)
根据附录41所述的细胞增殖促进组合物,其中,前述细胞为间充质干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、和/或毛乳头细胞。
<细胞增殖促进方法>
(附录43)
一种细胞增殖促进方法,其使用附录41或42所述的细胞增殖促进组合物。
(附录44)
根据附录43所述的细胞增殖促进方法,其中,前述细胞为间充质干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、和/或毛乳头细胞。
(附录45)
根据附录43或44所述的细胞增殖促进方法,其中,以体外方式或以体内方式使用前述细胞增殖促进组合物。
<成纤维细胞功能促进组合物>
(附录46)
一种成纤维细胞功能促进组合物,其包含附录1至35中任一项所述的组合物。
(附录47)
根据附录46所述的功能促进组合物,其中,前述成纤维细胞功能是成纤维细胞的增殖和/或由成纤维细胞产生细胞外基质。
(附录48)
根据附录47所述的功能促进组合物,其中,前述细胞外基质包含胶原蛋白和/或透明质酸。
<成纤维细胞功能促进方法>
(附录49)
一种成纤维细胞功能促进方法,其使用附录46至48中任一项所述的成纤维细胞功能促进组合物。
(附录50)
根据附录49所述的成纤维细胞功能促进方法,其以体外方式或以体内方式使用前述成纤维细胞功能促进组合物。
<促进皮肤障碍的治愈的组合物>
(附录51)
一种促进皮肤障碍的治愈的组合物,其包含附录1至35中任一项所述的组合物。
(附录52)
根据附录51所述的治愈促进组合物,其中,前述皮肤障碍为皮肤的溃疡、褥疮、烧烫伤、疤痕、和/或创伤。
<促进皮肤障碍的治愈的方法>
(附录53)
一种促进皮肤障碍的治愈的方法,其使用附录51或52所述的促进皮肤障碍的治愈的组合物。
(附录54)
根据附录53所述的促进皮肤障碍的治愈的方法,其以体外方式或以体内方式使用前述促进皮肤障碍的治愈的组合物。
<角质形成细胞功能促进组合物>
(附录55)
一种角质形成细胞功能促进组合物,其包含附录1至35中任一项所述的组合物。
(附录56)
根据附录55所述的功能促进组合物,其中,前述角质形成细胞功能是角质形成细胞的增殖、向表皮细胞的分化、和/或屏障功能基因的诱导。
(附录57)
根据附录56所述的功能促进组合物,其中,前述屏障功能基因包含丝聚合蛋白原基因和/或神经酰胺合成酶基因。
<角质形成细胞功能促进方法>
(附录58)
一种角质形成细胞功能促进方法,其使用附录55至57中任一项所述的角质形成细胞功能促进组合物。
(附录59)
根据附录58所述的角质形成细胞功能促进方法,其以体外方式或以体内方式使用前述角质形成细胞功能促进组合物。
<毛乳头细胞功能促进组合物>
(附录60)
一种毛乳头细胞功能促进组合物,其包含附录1至35中任一项所述的组合物。
(附录61)
根据附录60所述的功能促进组合物,其中,前述毛乳头细胞功能是毛乳头细胞的增殖和/或生发促进基因的诱导。
(附录62)
根据附录61所述的功能促进组合物,其中,前述屏障功能基因包含丝聚合蛋白原基因和/或神经酰胺合成酶基因。
<毛乳头细胞功能促进方法>
(附录63)
一种毛乳头细胞功能促进方法,其使用附录60至62中任一项所述的毛乳头细胞功能促进组合物。
(附录64)
根据附录63所述的毛乳头细胞功能促进方法,其以体外方式或以体内方式使用前述毛乳头细胞功能促进组合物。
<生发促进组合物>
(附录65)
一种生发促进组合物,其包含附录1至35中任一项所述的组合物。
<生发促进方法>
(附录66)
一种生发促进方法,其使用附录65所述的生发促进组合物。
(附录67)
根据附录66所述的生发促进方法,其以体外方式或以体内方式使用前述生发促进组合物。
<组合物的应用>
(附录68)
一种组合物,其用于促进细胞的增殖,以巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
(附录69)
一种组合物,其用于促进成纤维细胞功能,以巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
(附录70)
一种组合物,其用于促进皮肤障碍的治愈,以巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
(附录71)
一种组合物,其用于促进角质形成细胞功能,以巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
(附录72)
一种组合物,其用于促进毛乳头细胞功能,以巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
(附录73)
一种组合物,其用于促进生发,以巨核细胞或其培养物的处理物作为有效成分。
产业上的可利用性
如上所述,根据本发明,可以提供细胞来源的具有生理活性的组合物。另外,本发明的组合物例如可期待用于能够促进例如间充质细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、毛乳头细胞等的细胞增殖,另外可期待适宜地促进皮肤的溃疡、褥疮、烧烫伤、疤痕、创伤等皮肤障碍的治愈、皮肤的屏障功能的维持或改善、生发等。因此,本发明在医药领域、再生医疗领域等中是极其有用的。
序列表
<110> 株式会社美加细胞(MEGAKARYON CORPORATION)
<120> 组合物和其用途
<130> TF19291WO
<150> JP2019-225959
<151> 2019-12-13
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH基因的正向引物
<400> 1
catccctgcc tctactggcg ctgcc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH基因的反向引物
<400> 2
ccaggatgcc cttgaggggg ccctc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FLG基因的正向引物
<400> 3
tcggcaaatc ctgaagaatc caga 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FLG基因的反向引物
<400> 4
gcttgagcca acttgaatac catcag 26
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SPTLC1基因的正向引物
<400> 5
acaaagcaag aatcttcctg gaggaaagcc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SPTLC1基因的反向引物
<400> 6
aaacctccaa tagaagcaag tgcattctcc 30
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF7基因的正向引物
<400> 7
tctgtcgaac acagtggtac ctgag 25
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FGF7基因的反向引物
<400> 8
gccactgtcc tgatttccat ga 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VEGFA基因的正向引物
<400> 9
aaagcatttg tttgtacaag atccg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VEGFA基因的反向引物
<400> 10
cttgtcacat ctgcaagtac gttcg 25
Claims (34)
1.一种组合物,其包含巨核细胞或其培养物的处理物。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述处理物为巨核细胞或其培养物的细胞级分的提取物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为2000~20000pg的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为8000~80000pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为1~60pg的胎盘生长因子(PIGF)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为200~2000pg的干细胞因子受体(SCFR)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为20~800pg的血管内皮生长因子(VEGF)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为20~400pg的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为1000~10000pg的分化生长因子-15(GDF-15)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~16pg的双调蛋白(AR)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~60pg的上皮生长因子受体(EGFR)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~100pg的肝细胞生长因子(HGF)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物,其中,所述处理物包含相对于1mg总蛋白为0~200pg的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物,其具有细胞增殖促进活性。
15.根据权利要求14所述的组合物,其中,所述细胞为间充质干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、和/或毛乳头细胞。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物,其具有成纤维细胞功能促进活性。
17.根据权利要求16所述的组合物,其中,所述成纤维细胞功能是成纤维细胞的增殖和/或由成纤维细胞产生细胞外基质。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物,其具有角质形成细胞功能促进活性。
19.根据权利要求18所述的组合物,其中,所述角质形成细胞功能是角质形成细胞的增殖、向表皮细胞的分化、和/或屏障功能基因的诱导。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物,其具有毛乳头细胞功能促进活性。
21.根据权利要求20所述的组合物,其中,所述毛乳头细胞功能是毛乳头细胞的增殖和/或生发促进基因的诱导。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物,其中,所述巨核细胞为永生化巨核细胞。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物,其中,所述巨核细胞是体外诱导的巨核细胞。
24.一种细胞增殖促进组合物,其包含权利要求1至23中任一项所述的组合物。
25.根据权利要求24所述的细胞增殖促进组合物,其中,所述细胞为间充质干细胞。
26.一种成纤维细胞功能促进组合物,其包含权利要求1至23中任一项所述的组合物。
27.根据权利要求26所述的功能促进组合物,其中,所述成纤维细胞功能是成纤维细胞的增殖和/或由成纤维细胞产生细胞外基质。
28.一种促进皮肤障碍的治愈的组合物,其包含权利要求1至23中任一项所述的组合物。
29.根据权利要求28所述的促进皮肤障碍的治愈的组合物,其中,所述皮肤障碍为皮肤的溃疡、褥疮、烧烫伤、疤痕、和/或创伤。
30.一种角质形成细胞功能促进组合物,其包含权利要求1至23中任一项所述的组合物。
31.根据权利要求30所述的功能促进组合物,其中,所述角质形成细胞功能是角质形成细胞的增殖、向表皮细胞的分化、和/或屏障功能基因的诱导。
32.一种毛乳头细胞功能促进组合物,其包含权利要求1至23中任一项所述的组合物。
33.根据权利要求32所述的功能促进组合物,其中,所述毛乳头细胞功能是毛乳头细胞的增殖和/或生发促进基因的诱导。
34.一种生发促进组合物,其包含权利要求1至23中任一项所述的组合物。
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