KR20210057890A

KR20210057890A - 줄기세포 유래 간오가노이드의 제작 및 제１형 혈우병 세포치료제로서의 용도

Info

Publication number: KR20210057890A
Application number: KR1020190144472A
Authority: KR
Inventors: 김종훈; 손정상
Original assignee: (주) 넥셀
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-05-24
Also published as: KR102281535B1

Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 간오가노이드의 제작 및 제1형 혈우병 세포치료제로서의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 본 발명은 전분화능 줄기세포에서 분화 유도된 혈관내피세포, 간내배엽세포 및 중간엽줄기세포를 이용하여 균일한 크기의 간오가노이드를 형성함으로써 혈우병을 포함한 다양한 간질환 및 신약 개발과 관련 된 약물의 간독성 평가에 활용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 간오가노이드의 제작 및 제１형 혈우병 세포치료제로서의 용도{Generation of liver organoid from stem cells for hemophilia A treatment}

본 발명은 줄기세포 유래 간오가노이드의 제작 및 제1형 혈우병 세포치료제로서의 용도에 관한 것이다.

전체 혈액응고 관련 질환 중 59.7%(2014년 한국혈우재단)를 차지하는 제1형 혈우병(hemophilia A, HA)은 혈액응고인자 8번(Factor VIII, FVIII)의 문제로 발생하는 성염색체 유전질환이다. HA 환자는 일생 동안 재조합 혈액응고인자 8번 제제를 1주일에 2~3번 주사 투여한다. 이러한 방식으로 혈중 FVIII의 농도를 일정수준까지 유지하는 예방요법(prophylaxis)이 현재 가장 널리 이용되는 HA 치료법이자 예방법이다.

1992년에 재조합 혈액응고인자 제재가 개발되었으며 2000년대 이후로는 해당 제제의 반감기와 약효를 증가시키기 위한 노력이 진행되고 있다. 하지만 이는 근본적인 치료가 되지 못하므로 최근 들어 문제가 되는 FVIII 유전자를 교정하는 방식의 접근이 유전자치료, 세포 치료적으로 대두되고 있다.

인간의 체내에서 FVIII을 생산, 분비한다고 생각되는 세포 종류는 오래 전부터 논란이 되어 왔다. 우선 정상인의 간(liver)을 혈우병 환자에게 이식하였을 경우 혈우병 환자의 증상이 완화되는 것을 통해 FVIII의 주요 생산세포가 간 대부분을 구성하는 간세포(hepatocyte)일 것이라 생각하였다. 또한 기존에 알려진 혈액응고인자 10여종 중 FVIII을 제외한 나머지 인자들이 모두 간세포에서 생산된다는 근거가 이러한 가설에 힘을 실어주었다. 하지만 혈우병 마우스의 간을 정상 마우스에 이식하였을 경우 혈우병의 표현형이 유발되지 않는다는 연구결과와 급성, 만성 간질환 환자의 혈중 내 FVIII 수치가 정상인 보다 같거나 높은 것은 앞선 주장을 뒷받침하지 못한다. 불과 최근 2년 전까지도 FVIII을 생산하는 체내 세포 종류에 대해 논란이 있었으며 이는 크게 간세포, 모세혈관세포, 간 동모양 혈관내피세포(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC), 혈관내피세포 그리고 중간엽줄기세포로 견해가 나뉘었다.

본 발명자들은 이전 연구에서 역분화줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 타 연구진의 분화 방법들을 이용하여 혈관내피세포로 분화시킨 후 혈우병 모델 마우스에 이식하여 표현형적 완화를 살펴보았다. 혈우병 표현형을 확인하는 방법으로는 세포이식을 받은 마우스의 꼬리 끝을 잘라 출혈을 유도한 후 사망률을 측정하는 것인데 이 경우 약 40% 만이 생존하였다. 나머지 60%가 사망한 이유는 크게 두 가지로 접근할 수 있다. 첫 번째로, 분화시킨 혈관내피세포의 순도(purity)가 현격히 낮았으며 별도의 정제과정 없이 HA 마우스에 이식하였음에 기인한다. 두 번째로, 이식 후 눈에 띄는 표현형적 완화를 관찰하기에는 분화시킨 혈관내피세포와 이식된 세포의 양이 현저히 적었음에 있다. 이러한 문제점을 해결하고자 본 발명자들은 98% 이상의 혈관내피세포 표지인자 CD31 및 그 밖의 혈관내피세포 표지인자를 발현하는 고증식성 EC를 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화하는 프로토콜을 확립한 바 있으며 분화된 혈관내피세포가 정상 FVIII 단백질을 생산하는 것이 확인하였다.

Cell Stem Cell. 6;17(2):213-20 92015.08.06)

본 발명의 목적은 전분화능 줄기세포에서 분화된 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 이용하여 생체 간조직과 유사한 간오가노이드를 인 비트로에서 제작하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로부터 제작된 간오가노이드 및 혈우병 치료제로서의 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전분화능 줄기세포의 간내배엽세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포로부터 분화 유도된 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 8 내지 12 : 14 내지 18 : 0.5 내지 1.5의 세포수의 비율로 혼합하고 동물유래물질제거 배양배지에서 4시간 내지 12시간 동안 인큐베이션하여 간오가노이드를 형성하는 단계를 포함하는 간오가노이드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기의 방법에 따라 생산된 간오가노이드를 제공한다.

본 발명은 또한 상기의 간오가노이드를 포함하는 혈우병 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기의 간오가노이드의 치료적 유효량을 혈우병 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈우병의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한 줄기세포를 CHIR99021, 액티빈 A(activin A) 및 소듐 부티레이트(sodium butyrate)를 함유한 배지에서 배양하여 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하는 단계;

상기 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 BMP2(bone morphogenetic protein 2), FGF4 및 B27을 함유한 배지에서 배양하여 내배엽성 세포로 분화 유도하는 단계;

상기 내배엽성 세포를 레티노산(retinoic acid, RA) 및 B27을 함유한 배지에서 배양하여 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로 분화 유도하는 단계; 및

상기 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 아스코르브산, 니코틴아미드 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 함유한 배지에서 간내배엽세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 줄기세포의 간내배엽세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명은 전분화능 줄기세포에서 분화 유도된 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 이용하여 균일한 크기의 간오가노이드를 형성함으로써 혈우병을 포함한 다양한 간질환 및 신약 개발과 관련 된 약물의 간독성 평가에 활용될 수 있다.

도 1은 미분화 상태의 인간 다능성 줄기세포에서 분화 유도된 중간엽줄기세포(MSC), 혈관내피세포(EC) 및 간내배엽세포(HEP)의 세포 형태 및 단백질 발현을 유세포분석 및 면역세포화학을 이용해 특성화한 결과이다.
도 2는 미분화 상태의 인간 다능성 줄기세포에서 분화 유도된 중간엽줄기세포(MSC), 혈관내피세포(EC) 및 간내배엽세포(HEP)의 특이적 마커 유전자의 발현을 qPCR을 이용하여 비교 분석한 결과이다.
도 3은 미분화 상태의 인간 다능성 줄기세포에서 분화 유도된 중간엽줄기세포(MSC), 혈관내피세포(EC) 및 간내배엽세포(HEP)를 혼합하여 간오가노이드를 제작한 6시간 후 사진이다.
도 4a는 스페로디쉬 내에서 형성한 간오가노이드 형성 경과 시기(3시간, 6시간)에 따른 구조와 각 세포 마커 단백질의 발현을 분석한 결과이고, 도 4b는 스페로디쉬 내에서 형성한 간오가노이드 형성 경과 시기(3시간, 6시간, 12시간)에 따른 구조와 각 세포 마커 단백질의 발현 분석을 위한 면역형광염색 결과이다.
도 5는 간오가노이드의 이식 2주 후 혈우병 마우스 모델의 TVTB(Total Bleeding Time) 및 tail clipping(survival rate) 시행에서 얻은 마우스의 표현형 변화를 나타낸 H&E 염색 및 면역형광염색 결과이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 줄기세포로부터 분화 유도된 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 8 내지 12: 14 내지 18: 0.5 내지 1.5의 세포수의 비율로 혼합하고 동물유래물질제거 배양배지에서 4시간 내지 12시간 동안 인큐베이션하여 간오가노이드를 형성하는 단계를 포함하는 간오가노이드의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 간오가노이드의 생산 방법은 전분화능 줄기세포를 이용하여 간을 구성하는 3종 세포, 즉, 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포로 분화 유도하고, 이들 분화된 세포의 조립을 통해 여러 세포로 구성된 간조직과 유사한 간오가노이드를 제작하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 간오가노이드는 전분화능 줄기세포로부터 분화 유도된 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 8 내지 12: 14 내지 18: 0.5 내지 1.5의 세포수의 비율로 혼합하고 동물유래물질제거 배양배지에서 4시간 내지 12시간 동안 인큐베이션하여 형성할 수 있다.

바람직하게는, 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 10:16:1의 세포수의 비율로 혼합하는 것일 수 있다.

상기 동물유래물질제거 배양배지는 Stemline II(Sigma-aldrich) 또는 Stempro34(Invitrogen) 또는 mTeSR®1(STEMCELL Technologies)일 수 있다.

상기 간오가노이드 형성 조건은 친수성 환경에서 수행될 수 있다. 즉, 형성된 오가노이드의 크기에 따른 저/고 산소 조건 하에서 세포사멸과 구조적 미완성은 형성한 간오가노이드를 세포치료제나 약물독성평가용 플랫폼으로 개발함에 있어 큰 걸림돌이 된다. 따라서, 분화 유도된 3종의 세포를 혼합하여 간오가노이드를 제작 시 균일한 크기와 대량의 간오가노이드 수확을 위해 스페로디쉬가 좋다. 스페로디쉬는 정사각형의 웰로 구성되며 각 웰의 깊이와 높이는 약 500 ㎛로 이루어져 최대 지름이 500 ㎛ 정도의 단일 오가노이드가 형성되는 조건을 제공할 수 있다.

또한, 스페로디쉬 내 표면을 친수성 환경으로 만들기 위해 오가노이드 형성 전에 전처리하는 공정을 거칠 수 있다. 이를 위해 에탄올, PBS, 세포배양배지 순으로 처리하는데 각 과정 중에 생성되는 공기방울들을 완벽히 제거하는 작업을 같이 수행한다. 공기방울은 간오가노이드의 수율과 균질도에 영향을 미치므로 기계적으로 공기방울을 제거하며 BSA가 포함된 세포배양배지를 넣은 상태로 1일 간 인큐베이터에서 보관해 둔다.

상기 전처리 코팅된 스페로디쉬 내 배지를 제거하고, 분화 유도된 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 세포수 비율대로 혼합하여 동물유래물질제거 배양배지에 현탁하고 현탁액을 상기 스페로디쉬의 웰에 씨딩하며, 웰의 경사면에 붙은 세포들은 바닥으로 내려주고 웰 바깥쪽에 붙은 세포는 석션을 통해 제거하고 새로운 배지를 제공한다. 이 과정을 5분 간격으로 6회 수행하여 총 30분의 과정이 끝난 후 동물유래물질제거 배양배지를 제공한 상태로 37℃ 인큐베이터에서 4시간을 경과하면 약 500 ㎛의 간오가노이드가 형성된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 간세포 사이사이에 그물망으로 CD31을 발현하는 혈관내피세포가 끼어들어 있는 형태를 확인할 수 있으며, 6시간 경과 후 분리되어 있던 혈관내피세포들이 미세혈관 형태를 띠며 모여드는 것을 확인할 수 있다. 이는 실제 간과 유사한 형태로서 간오가노이드 내의 분화 유도된 혈관내피세포가 구조적 변형을 겪고 있음을 설명하는 것이다(도 4a 참조).

상기 간오가노이드는 VEGF165가 보충된 동물유래물질제거 배양배지에 현탁시켜 혈우병 마우스 모델에 이식 시 사용한다.

본 발명에서, 용어 "줄기세포"는 분화능(potency) 및 자기재생(self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 또는 단일분화능(unipotency)로 나누어진다. 상기 줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 줄기세포는, 포유동물, 예를 들면, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 또는 조직의 환경과는 다른 환경에 존재하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 줄기세포는 미분화 또는 역분화 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem cell, iPSC), 체세포복제줄기세포(somatic cell nuclear transfer, SCNT), 또는 전분화능줄기세포(pluripotent stem cells, PSC) 등에서 선택된다.

줄기세포 배양에 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM(Keratinocyte serum free medium), RPMI-1640 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMEM 배지를 사용할 수 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 줄기세포의 배양 시 동물 유래 혈청을 약 10% 내지 30% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 줄기세포 배양에 사용되는 혈청은 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청일 수 있고, 바람직하게는, 우태아혈청(FBS)일 수 있다. 또한, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.

또한, 줄기세포 배양 시, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다. 항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 펀지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 L-글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

본 발명의 간오가노이드의 생산 방법에 사용되는 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포는 다음과 같이 분화 유도될 수 있다.

제1단계로, 간내배엽세포는 줄기세포를 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하고, 상기 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 내배엽성 세포로 분화 유도한 다음 상기 내배엽성 세포를 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로 분화 유도하고, 마지막으로 간내배엽세포로 분화 유도하여 제조될 수 있다.

보다 구체적으로, 전분화능 줄기세포를 CHIR99021, 액티빈 A(activin A) 및 소듐 부티레이트(sodium butyrate)를 함유한 배지에서 배양하여 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하는 단계;

상기 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 아스코르브산, 니코틴아미드 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 함유한 배지에서 간내배엽세포로 분화 유도하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.

상기 전분화능 줄기세포를 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하기 위해 유도 인자로, CHIR99021 및 액티빈 A를 사용할 수 있다.

상기 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)는 GSK(glycogen synthase kinase) 억제제로 GSK 신호전달과정에 관여하는 GSK1/2의 업스트림 분자인 GSK1/2를 표적으로 하는 물질로, 아미노피리미딘(aminopyrimidine)으로 표시될 수 있다. 상기 CHIR99021은 1 내지 3 μM의 농도로 사용될 수 있다. 더 구체적으로 1.5 내지 2.5 μM의 농도로 사용될 수 있다.

상기 액티빈 A(Activin A)는 TGF-

수퍼패밀리의 구성원으로서, 중배엽 유도, 신경세포 분화, 골 리모델링, 조혈작용 등의 광범위한 생물학적 활성을 갖는 물질로, 상기 액티빈 A는 50 내지 150 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 더 구체적으로 90 내지 120 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다.

추가로, 분화 유도 인자로 히스톤 데아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor)인 소듐 부티레이트가 사용될 수 있으며, 0.2 내지 0.7 μM의 농도로 사용될 수 있다. 더 구체적으로 0.4 내지 0.6 μM의 농도로 사용될 수 있다.

중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도 시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 RPMI 배지를 사용할 수 있다.

중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로의 분화 유도 조건은 전분화능 줄기세포를 1 내지 3 μM CHIR99021 및 50 내지 150 ng/mL의 액티빈 A를 함유한 배지에서 35 내지 40℃에서 1일 내지 2일 동안 배양한 후, 0.2 내지 0.7 μM 소듐 부티레이트 및 50 내지 150 ng/mL의 액티빈 A를 함유한 RPMI 배지에서 35 내지 40℃에서 1일 내지 2일 동안 추가 배양하는 것일 수 있다.

상기 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 내배엽성 세포로 분화 유도하기 위해, 분화 인자로 BMP2, FGF4 및 B27을 사용할 수 있다.

BMP2(bone morphogenetic protein 2)는 성장인자로, 10 내지 30 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 더 구체적으로 15 내지 25 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다.

FGF4(Fibroblast growth factor4)는 성장인자로, 15 내지 35 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 더 구체적으로 20 내지 30 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다.

B27은 B27 보충물로 언급되며, 21가지 성분, 즉, 카탈라아제, 환원된 글루타티온, 인간 인슐린, 슈퍼록사이드 디스뮤테아제, 인간 Holo-트랜스페린, T3(트리-유오도티로닌), L-카르니틴, 에탄올아민, D+-갈락토오스, 퓨트리신, 소듐 셀레나이트, 코르티코스테론, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 레티놀 아세테이트, DL-알파 토코페롤(Vit E), DL-알파 토코페롤 아세테이트, 올레산, 피페콜산 및 비오틴을 포함한다. B27 보충물은 농축물로서 배양배지에 첨가되거나 배양배지에 첨가하기 전에 희석할 수 있다.

내배엽성 세포로 분화 유도 시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 RPMI 배지를 사용할 수 있다.

내배엽성 세포로의 분화 유도 조건은 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 10 내지 30 ng/mL의 BMP2 및 15 내지 35 ng/mL의 FGF4를 함유한 B27이 보충된 RPMI 배지에서 35 내지 40℃에서 1일 내지 3일 동안 배양하는 것일 수 있다.

상기 내배엽성 세포를 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로 분화 유도하기 위한 분화 인자로 레티노산 및 B27을 사용할 수 있다.

레티노산(Retinoic acid)은 비타민 A(레티놀)의 대사 산물을 지칭한다. 레티노산은 세포 간 신호전달을 하는 분자의 역할을 할 수 있다. 레티노산은 1 내지 3 μM의 농도로 사용할 수 있다. 더 구체적으로 1.5 내지 2.5 μM의 농도로 사용할 수 있다.

전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로 분화 유도 시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM 배지를 사용할 수 있다.

전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로의 분화 유도 조건은 내배엽성 세포를 1 내지 3 μM 레티노산을 함유한 B27이 보충된 DMEM 배지에서 35 내지 40℃에서 1일 내지 3일 동안 배양하는 것일 수 있다.

상기 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 간내배엽세포로 분화 유도하기 위한 분화 인자로 아스코르브산, 니코틴아미드 및 bFGF를 사용할 수 있다.

상기 아스코르브산(ascorbic acid)은 생물학적 분자들의 합성에 필요한 조효소로 작용하며, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 강력한 효능이 있는데, 아스코르브산은 50 내지 150 μM의 농도로 사용될 수 있다. 더 구체적으로 80 내지 120 μM의 농도로 사용될 수 있다.

니코틴아미드(nicotinamide)는 비타민 B 복합체의 일종으로 세포의 산화상태 및/또는 ADP-리보실화에 영향을 미칠 수 있는 분화 인자이다. 니코틴아미드는 0.5 내지 1.5 mM의 농도로 사용될 수 있다. 더 구체적으로 0.8 내지 1.2 mM의 농도로 사용될 수 있다.

bFGF(basic fibroblast growth factor)는 혈관 신생, 상처 치유, 배아 발달 및 다양한 내분비 신호전달경로에 관여하는 인자를 지칭한다. bFGF는 다양한 세포 및 조직의 중식과 분화 과정에서 중요한 역할을 할 수 있다. bFGF는 0.5 내지 1.5 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 더 구체적으로, bFGF는 0.8 내지 1.2 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다.

간내배엽세포로의 분화 유도 시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM 배지를 사용할 수 있다.

간내배엽세포로의 분화 유도 조건은 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 50 내지 150 μM 아스코르브산, 0.5 내지 1.5 mM 니코틴아미드 및 0.5 내지 1.5 ng/mL의 bFGF를 함유한 DMEM 배지에서 35 내지 40℃에서 3일 내지 5일 동안 배양하는 것일 수 있다.

본 발명의 간오가노이드 생산에 사용되는 간내배엽세포는 전분화능 줄기세포로부터 분화 유도 11일차의 세포일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 분화 유도된 간내배엽세포는 간내배엽세포의 마커인 HNF4a와 AFP 단백질을 발현하고 있다(도 1 참조). 아울러, 간내배엽세포는 간내배엽성 전구세포마커(AFP, ALB, HNF4a, ASGPR1)를 발현하고 있다(도 2 참조).

본 발명의 간오가노이드의 생산 방법에 있어서, 제2단계로, 전분화능 줄기세포를 혈관내피세포로 분화 유도할 수 있다. 보다 구체적으로, 전분화능 줄기세포를 중배엽 유도 인자들을 처리하여 중배엽성 세포로 분화 유도한 후 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양배지에서 혈관내피세포로 분화 유도하고, CD31을 이용한 고순도의 CD31 양성 혈관내피세포를 분리 정제하여 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양배지에서 증식함으로써 고증식 혈관내피세포를 얻을 수 있다.

상기 줄기세포를 중배엽성 세포로 분화 유도하기 위해 중배엽 유도 인자, 즉, CHIR99021, Y-27632, 아스코르브산, 액티빈 A 및 ITS를 사용한다.

상기 CHIR99021는 1 내지 8 μM의 농도, 바람직하게는 2 내지 5μM의 농도로 사용될 수 있다.

상기 Y-27632는 Rho associated kinase(Rho 관련 코일드코일 함유 단백질 키나아제)의 저해제로 사용되는 물질로, 저분자 GTP-결합단백질인 Rho의 하류에서 작용하는 세린/트레오닌 키나아제인 ROCK를 억제할 수 있다. 상기 Y-27632는 2 내지 20 μM의 농도, 바람직하게는 8 내지 12 μM의 농도로 포함될 수 있다.

상기 액티빈 A는 0.5 내지 5 ng/mL의 농도, 바람직하게는 1 내지 3 ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.

상기 아스코르브산은 50 내지 300 μM의 농도, 바람직하게는 100 내지 200 μM의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 ITS는 인슐린, 트랜스페린 및 셀레네이트를 적절히 혼합해서 조제한 시판의 ITS supplement를 사용할 수 있다. 상기 ITS는 희석 없이 시판의 ITS supplement를 사용할 수 있다.

중배엽성 세포로의 분화 유도에 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM/F12 배지를 사용할 수 있다.

중배엽성 세포로의 분화 유도 조건은 습도 90 내지 95％, 온도 37℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 1.5일 내지 2.5일 배양할 수 있다.

상기 중배엽성 세포로부터 혈관내피세포를 분화 유도하기 위해 VEGF165를 분화 유도 인자로 사용할 수 있다.

상기 VEGF165는 30 내지 70 ng/mL의 농도로, 바람직하게는 40 내지 60 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다.

상기 중배엽성 세포로부터 혈관내피세포로의 분화 유도 시 사용하는 동물유래물질제거 배양배지는 Stemline II(Sigma-aldrich) 또는 Stempro34(Invitrogen) 또는 mTeSR®1(STEMCELL Technologies)일 수 있다.

상기 중배엽성 세포로부터 혈관내피세포로의 분화 유도 조건은 습도 90 내지 95％, 온도 37℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 3일 내지 4일 배양할 수 있다.

상기 중배엽성 세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포는 MACS(CD31 양성 세포)를 진행하여 99%의 고 순도의 혈관내피세포를 수득할 수 있다.

상기 MACS를 통해 정제된 혈관내피세포는 VEGF165를 함유한 동물유래물질제거 배양배지에서 1회 내지 8회 계대배양함으로써 증식시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 간오가노이드 생산에 사용되는 혈관내피세포는 계대번호 P1 내지 P4의 세포일 수 있다.

상기 줄기세포의 중배엽성 세포 및 혈관내피세포로의 분화 유도 및 증식 시 세포배양은 피브로넥틴이 코팅된 세포배양용기에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 분화 유도된 혈관내피세포는 혈관내피세포 마커인 CD157, CD31, CD34, VE-cad, vVF, FVIII를 발현하고 있다(도 1 및 2 참조).

본 발명의 간오가노이드의 생산 방법에 있어서, 제3단계는 전분화능 줄기세포로부터 중간엽줄기세포를 분화 유도하는 단계이다.

상기 중간엽줄기세포는 전분화능 줄기세포를 혈청 함유 배양배지에서 30 내지 40℃에서 7일 내지 14일 동안 배양하고, 중간엽줄기세포로 구성된 군집이 형성되어 세포가 군집의 주변으로부터 뻗어 나오기 시작하면 중간엽줄기세포의 선별적 배양을 수행하여 얻을 수 있다. 중간엽줄기세포의 선별적 배양은 젤라틴 코팅된 세포배양용기에 선별적으로 부착하는 특성을 이용한다. 구체적으로, 분화 10일 내지 14일 차의 세포에 세포-해리 효소, 예컨대, TrypLE select를 처리하여 배양접시와 분리시킨 후 단일세포화된 세포를 젤라틴 코팅된 세포배양용기에서 씨딩하고(계대번호 P0), 3일 내지 6일 간격으로 계대배양을 통해 선별적으로 중간엽줄기세포를 분리 정제한다. 바람직하게는, 본 발명의 간오가노이드 생산에 사용되는 중간엽줄기세포는 계대번호 P2 내지 P10의 세포일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포로의 분화 유도 시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 10% FBS 함유 α-MEM 배지를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 분화 유도된 중간엽줄기세포는 중간엽줄기세포 마커인 CD29, CD44, CD166, CD73, CD90을 발현하고 있다(도 1 및 2 참조). 다만, 중간엽줄기세포는 여전히 전구세포의 특성을 지니고 있기 때문에 같은 계통인 혈관내피세포와 마커를 일부 공유하고 있는 것을 확인할 수 있다(도 2 참조).

본 발명의 간오가노이드는 CD31, VE-cadherin을 발현하는 혈관 내피세포가 모세혈관화 되며, 간내배엽세포는 마커인 AFP, ALB를 발현하고, a-SMA를 발현하는 중간엽줄기세포는 간세포와 혈관내피세포 사이사이에 존재하며 간 오가노이드 형성을 견고하게 하는 역할을 하고 있다.

그러나, 3종 세포의 인큐베이션 12시간이 경과하면 AFP 발현이 감소하며 모세혈관화 된 혈관내피세포들이 큰 다발 형태로 모여 들기 때문에 3종 세포의 인큐베이션 6시간 경에 회수한 간오가노이드를 혈우병 치료를 위한 이식에 사용할 수 있다.

상기 간오가노이드는 약 500 ㎛의 크기를 가지며, 혈액응고인자 FVIII를 분비할 수 있다.

아울러, 3종 세포의 인큐베이션 6시간 경에 회수한 간오가노이드를 혈우병 마우스 모델에 이식하여 혈우병 표현형 치료 정도를 확인하는 TVTB(Total Bleeding Time)을 시행한 결과, 간오가노이드를 이식받은 혈우병 마우스 모델은 정상 마우스와 유사한 수준으로 돌아왔음을 확인할 수 있다. 하지만 매트리젤만 이식받은 대조군은 혈우병 마우스 모델과 비교하여 표현형 차이가 없다. 또한, 꼬리 끝을 자른 후 생존율을 비교하는 tail clipping 실험 결과, 간오가노이드를 이식받았을 경우 생존율이 90%까지 올라갔으며 이는 TVTB의 결과와 동일한 양상을 보여준다. 이식 부위를 적출하여 H&E 염색을 시행하면, 이식 부위와 마우스의 피부가 맞닿는 부위로 간오가노이드가 밀집되어 이동하는 것을 확인할 수 있다. 이는 호스트(마우스)의 혈관 조직망과의 연결을 통한 FVIII의 생산, 분비에 따른 표현형 변화를 설명할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기의 간오가노이드를 포함하는 혈우병 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 간오가노이드의 치료적 유효량을 혈우병 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈우병의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 혈우병 치료용 조성물은 살아있는 동물 개체에 투입 또는 이식하여 생착될 수 있도록, 본 발명의 방법에 의해 제조된 간오가노이드를 포함하는 조성물을 지칭한다.

상기 혈우병은 제1형 혈우병일 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 있으며, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함하고, 바람직하게는 근육 주사(intramuscular injection) 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 비경구 투여용 조성물(예, 주사제)은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 주입되는 간오가노이드의 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '치료'는 1) 혈우병의 억제, 즉 진행 억제, 및 2) 혈우병의 경감을 의미한다. 구체적으로, 상기 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 혈우병의 치료가 필요한 대상체(subject)의 상처부위에 주입 또는 이식할 경우, 이식 부위와 대상체의 피부가 맞닿는 부위로 간오가노이드가 밀집되어 이동하며, 대상체의 혈관망을 형성하여 상처부위의 출혈을 지혈시킴으로써 혈우병을 치료할 수 있다. 한편, 상기 투여 대상은 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물이 혈우병의 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 물리적 수술 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 혈우병을 치료할 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 CHIR99021, 액티빈 A(activin A) 및 소듐 부티레이트(sodium butyrate)를 함유한 배지에서 배양하여 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하는 단계;

본 발명의 줄기세포의 간내배엽세포로의 분화 유도 방법은 인간 전분화능 줄기세포로부터 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하고, 상기 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 내배엽성 세포로 분화 유도한 다음 상기 내배엽성 세포를 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로 분화 유도하며, 상기 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 간내배엽세포로 분화 유도하는 것을 특징으로 한다.

상기 줄기세포는 미분화 또는 역분화 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem cell, iPSC), 체세포복제줄기세포(somatic cell nuclear transfer, SCNT) 및 전분화능줄기세포(pluripotent stem cells, PSC)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 줄기세포의 간내배엽세포로의 분화 유도 방법은 상기 간오가노이드의 생산 방법에서 구체적으로 기술하였으므로 중복 기재를 피하기 위해 구체적인 설명은 하지 않는다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 간오가노이드 형성

인간 전분화능 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도에 사용되는 미분화 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESC)와 인간 역분화배아줄기세포(human induced pluripotent stem cell, hiPSC)를 상온에서 30분~1시간 matrigel(Corning, USA)로 코팅한 배양접시에 mTeSR™1(Stemcell Technologies, Canada) 배지를 사용하여 지지세포 없이(feeder-free) 배양하였다. 상기 세포를 표준 조건(37℃, 5% CO₂ 및 포화습도)에서 배양하고, 매일 배지를 교체하였다. 계대배양은 ReLeSR(Stemcell Technologies, Canada)를 상온에서 1~2분가량 처리하여 콜로니 형태로 떼어낸 후 1:40의 비율로 수행하였다. 이는 약 5~6일마다 진행되었다.

(1) 간내배엽세포로의 분화

간내배엽세포로의 분화를 위해 사용되는 hESC 및 hiPSC를 지지영양세포(feeder layer)와 공동 배양하여 미분화 상태를 유지하였다. 생쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)에 mitomycin-c(10㎍/mL)를 처리하여 세포 분열 불활성 상태를 만들어서 이를 지지영양세포로 사용하였다. 즉, 젤라틴이 코팅된 배양접시에 MEFs을 하루 전에 씨딩하여 부착시킨 후 익일에 그 위에 hESC를 배양하였다. 이때 사용되는 배지는 20% 넉아웃 혈청대체물(knockout serum replacement, SR), 4 ng/mL의 bFGF, 1% 비필수아미노산 및 100 mM 베타메르캅토에탄올을 포함하는 DMEM/F12 배지이다. hESCs 및 iPSCs는 약 6~8일 정도에 한번씩 계대배양하였다.

간세포 분화를 위한 미분화 세포는 매트리젤이 코팅된 60mm 배양접시에 옮겨주고 mTeSR1(STEMCELL technologies) 배지를 이용하여 지지영양세포없이 배양하였다. 배양접시 전체 면적의 80%가 콜로니로 차게 되면 간세포 분화를 시작하기 위하여 배지를 제거하고 PBS 세척 후에 TrypLE TM select(Invitrogen)를 1분 동안 처리하여 분화된 세포를 제거하였다. 연달아 TrypLE TM select를 3분 동안 처리하여 분리시킨 단일세포를 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 수획하였다. 이후 매트리젤이 코팅된 100-mm 배양접시 위에 10 μM Y-27632(ROCK inhibitor)이 포함된 mTeSR1 배지에 5백만개의 세포를 씨딩하였다. 익일에 Y-27632(ROCK inhibitor)가 포함되지 않은 mTeSR1 배지로 교체 후 2일간 추가 배양한 다음, 간세포 분화를 수행하였다.

1단계: 중내배엽성 세포 및 내배엽성 전구세포로의 분화 유도

간세포는 발생과정 중에 내배엽에서 기원하며 그 중 배쪽 전장에 위치하여 있다. 내배엽은 발달 초기에 중배엽과 내배엽이 나뉘기 전인 일시적인 중내배엽에서 유래한다. 따라서 생체 외 분화 유도 방법에서 전능성 줄기세포를 간 내배엽성 전구세포 및 간세포로 분화시키기 위해서는 그 첫 번째 단계로 높은 효율의 내배엽성 세포를 습득하는 것이 필수적이다. 본 발명에서는 분화 1단계에 미분화 세포를 중내배엽성 세포 및 내배엽성 전구세포로 분화하였다. 100 mm 배양접시에 지지영양세포 없이 3일간 배양한 미분화 세포를 mTeSR1 배지 제거 후에 2 μM CHIR99021 및 100 ng/mL AA(activin A)를 포함하는 RPMI 배지에서 1.5일간 배양하였다. 이후, 0.5 μM 소듐 부티레이트 및 100 ng/mL AA를 포함하는 RPMI 배지에서 추가로 1.5일간 분화 유도하였다.

2단계: 내배엽성 세포로의 분화 유도

1단계에서 얻은 내배엽성 전구세포를 2단계에서 내배엽성 세포로 구체화시킨다. 이를 위해, 20 ng/mL BMP2, 25 ng/mL FGF4 및 B27이 포함된 RPMI 배지에 분화 유도된 내배엽성 전구세포를 2일간 배양하였다.

3단계: 전장 내배엽성 세포로의 분화 유도 및 간 구체화

간 내배엽(hepatic endoderm)은 췌장과 함께 내배엽의 몸 앞쪽에서 발달한다. 2단계에서 얻은 내배엽성 세포를 2 μM 레티노산(retinoic acid)이 첨가된 B27 보충 DMEM 배지에서 2일간 배양하여 간 내배엽으로의 구체화를 일으킨다.

4단계: 간내배엽세포와 미성숙 간세포로의 분화

간 내배엽성 세포는 간을 이루는 실질세포 두 종류(담관세포, 간세포)로 분화할 수 있는 능력을 가진 간내배엽세포로 분화한다. 3단계의 간 내배엽성 세포를 100 μM 아스코르브산(L-ascorbic acid)와 1 mM 니코틴아미드(nicotinamide) 및 1 ng/mL bFGF를 포함하는 DMEM 배지에 4일간 배양하여 간내배엽세포로 분화 유도하였다.

(2) 혈관내피세포로의 분화

제1단계: 중배엽세포로의 분화

혈관내피세포는 중배엽으로부터 기원하며 전분화능 줄기세포의 생체외(in vitro) 분화에서도 이러한 발생학적 과정을 거쳐야 한다. 본 발명에서는 미분화상태의 hESC 및 hiPSC를 2일 동안 중배엽세포로 1차 분화시켰다.

이를 위해, 지지영양세포 없는 상태의(feeder-free) 미분화세포에 TrypLE select(Invitrogen, USA)를 사용하여 3분 동안 단일 세포로 분산시킨 후 원심분리기로 1000 rpm에서 5분간 세포만 분리하여 수확 하였다. 이후 배양접시 cm²당 5500개의 세포를 뿌려 2일간 배양하였다. 이때 분화배지는 1ХITS, 10 μM Y-27632, 3 μM CHIR99021, 2 ng/mL Activin A 및 200 μM 아스코르브산을 포함하는 DMEM/F12 배양배지이며 분화 0일차에서 2일차 사이에 배지를 한 번도 바꾸지 않았다. 중배엽 유도는 중배엽 마커인 T(brachyury)의 qPCR을 통하여 확인하였다.

2단계: 혈관내피세포로의 분화

상기 1단계에서 수득한 중배엽세포를 3일 동안 추가 배양하여 혈관내피세포로 분화시켰다. 분화 2일차의 상기 세포를 50 ng/mL VEGF165가 포함된 Stemline II(sigma, USA) 배지에 3일 동안 배양하여 혈관내피세포로 분화시켰다. 이때 분화 2일차, 3일차에 배지를 각각 한 번씩 바꿔주고 분화 4일차는 생략하였다. 혈관내피세포로의 분화는 CD31, CD34, vWF의 발현을 qPCR로 분석하였다.

분화 5일차에 비-혈관내피세포를 제외한 고순도의 혈관내피세포만을 분리하기 위하여 MACS(magnetic activated cell sorting) 방법을 시행하여 정제하였다. 이때 혈관내피세포/전구세포의 마커인 CD31을 사용하였다. 5일차 세포에 TrypLE를 사용하여 단일 세포로 분산시킨 후 70㎛ strainer에 걸러 완벽하게 단일 세포만을 얻었다. 이후 5 ㎕의 mouse anti human CD31 항체(BD, USA)가 포함된 0.01 g/mL 농도의 BSA/PBS 100 ㎕(MACS buffer)에 세포를 현탁시켜 냉장고에서 30분 반응시켰다. 이후 MACS buffer 3 mL을 이용하여 1번 세척 과정을 거친 후, MACS 버퍼 80 ㎕에 anti-mouse IgG microbead(Miltenyi biotech, Germany) 40 ㎕를 섞은 용액에 세포를 현탁한 후 냉장고에서 20분간 반응시켰다. 이후 MACS manual separator를 이용하여 CD31을 발현하는 혈관내피세포를 분리 정제하였다. MACS 하루 전에 5 ng/mL의 피브로넥틴으로 코팅해 둔 배양접시에 50 ng/mL VEGF165를 포함하는 stemline II 배지를 이용해 배양하였다.

정제된 혈관내피세포는 그 특성을 유지하면서 계대배양이 5~8회 가량 가능하다. 따라서 5 ng/mL의 피브로넥틴이 코팅된 배양접시에 VEGF165가 포함된 Stemline II 배지를 이용하여 5~6일 동안 배양하며 TrypLE를 사용하여 계속적으로 계대배양이 가능하다. 계대 시점의 배양밀도는 cm²당 5000개의 세포이다.

(3) 중간엽줄기세포로의 분화

중간엽줄기세포로의 분화 유도에 사용되는 hESC와 hiPSC를 상온에서 30분~1시간 매트리젤(Corning, USA)로 코팅한 배양접시에 mTeSR™1(Stemcell Technologies, Canada) 배지를 사용하여 지지영양세포 없이(feeder-free) 배양하였다. 상기 세포를 표준 조건(37℃, 5% CO₂ 및 포화습도)에서 배양하고, 매일 배지를 교체하였다. 계대배양은 ReLeSR (Stemcell Technologies, Canada)를 상온에서 1~2분가량 처리하여 콜로니 형태로 떼어낸 후 1:40의 비율로 수행하였다. 이는 약 5~6일마다 진행된다.

1단계: 중간엽줄기세포로의 분화

ReLeSR로 콜로니 형태로 분리한 미분화 세포를 2일 뒤의 밀도가 전체 면적의 30%에 도달하도록 씨딩하였다. 미분화 줄기세포가 배양접시의 30%에 도달하였을 때 중간엽줄기세포로의 분화를 시작하며 분화배지는 50 mM 아스코르브산 및 10% FBS를 포함하는 α-MEM으로 통일한다. 해당 배지를 3일 간격으로 교체해주며 10일~2주일 동안 배양하였다. 중간엽줄기세포로 구성된 군집이 형성되어 세포가 군집의 주변으로부터 뻗어 나오기 시작하면 중간엽줄기세포의 선별적 배양을 시작한다.

2단계: 순수한 중간엽줄기세포의 선별적 배양 및 증식 배양

중간엽줄기세포의 선별적 배양은 젤라틴이 코팅된 배양접시에 선별적으로 부착하는 특성을 이용한다. 분화 10일~2주일 차의 세포에 TrypLE select(Invitrogen, USA)를 3분 간 처리하여 배양접시와 분리시킨 후 단일세포화 된 세포들을 젤라틴이 코팅된 배양접시에 씨딩하였다. 이때 1단계 분화를 100mm 배양접시 1개로 진행하고 있었다면 2단계에는 60mm 배양접시 1개로 씨딩한다. 즉 선별적 분리 계대배양의 비율은 2:1이며 첫 번째로 젤라틴이 코팅된 배양접시에 뿌려진 세포들을 MSC (P0)로 명명하며 이후 계대배양이 진행됨에 따라 P1, P2, P3 등의 순서로 계대번호가 증가하게 된다. 배치에 따라 증식력의 차이는 존재하지만 일반적으로 3일~6일 간격으로 계대배양을 지속해준다. P0와 마찬가지로 P1 이후의 계대배양도 동일한 방법으로 젤라틴이 코팅된 배양접시에 뿌려주면 되며 P1부터는 계대의 비율이 1:3~1:9로 증가한다. 이는 첫 번째 젤라틴 선별 과정에서는 세포수가 급격히 줄어들지만 이후 과정부터는 증식이 활발하게 일어남에 따라 계대 비율이 증가하게 되는 것이다.

(4) 간오가노이드 형성

형성된 오가노이드의 크기에 따른 저/고 산소 조건 하에 세포 사멸과 구조적 미완성은 형성한 간오가노이드를 세포치료제나 약물독성평가용 플랫폼으로 개발함에 있어 큰 걸림돌이 된다. 분화시킨 3종의 세포를 섞어 다양한 플랫폼에서 간오가노이드를 제작한 결과, 구조와 생존에 최적화된 균질한 크기와 대량의 간오가노이드를 수획할 수 있는 플랫폼으로 스페로디쉬(spherodish; incyto, ISF-361-5, USA)을 선정하였다. 1개의 스페로디쉬는 정사각형의 가로/세로 각 19개의 웰로 구성되어 있으며, 1개 웰의 깊이와 높이는 모두 500 ㎛로 이루어져 최대 지름 500 ㎛ 크기의 오가노이드 1개가 형성되는 조건을 제공한다. 따라서 1개의 스페로디쉬 당 지름 500 ㎛ 크기의 361개의 오가노이드가 형성된다.

스페로디쉬 내 표면을 친수성 환경으로 만들기 위해 오가노이드 형성 1일 전에 전처리 과정을 실시하였다. 스페로디쉬 1장을 60-mm 배양접시 바닥에 단단히 고정시킨 후 100% 에탄올(7 mL, 1회), PBS(7 mL, 3회), 배지(DMEM, 7 mL, 1회)를 순서대로 처리하는 과정을 거치게 된다. 이때 모든 과정 중간에 마이크로파이펫과 1 mL 블루 팁을 사용해 공기방울(버블)을 제거하는 작업을 거친다. 각 과정 중에 생성되는 큰 공기방울과 작은 공기방울을 완벽히 제거하지 못하면 최종적으로 만들어진 간오가노이드의 수율과 균질도에 영향을 끼치게 된다. 전처리 과정이 끝나면 filtered 3% BSA in DMEM(7 mL)을 처리한 상태에서 인큐베이터에서 1일 간 보관하였다.

간오가노이드는 생체 내 간을 모사하는 생체 외 모사조직이기 때문에 실제 간을 구성하는 세포들의 비율과 유사하게 혼합하여 오가노이드를 만들게 된다. 따라서 1개의 스페로디쉬를 사용해 간오가노이드를 만들 때, 상기에서 분화시킨 3종의 세포, 즉, 미분화 줄기세포로부터 분화시킨 간내배엽세포(분화 11일차), 혈관내피세포(P1~P4) 및 중간엽줄기세포(P2~P10)를 각각 150만개:250만개:15만개 = 10:16:1의 비율로 섞었다.

분화시킨 혈관내피세포와 중간엽줄기세포는 각 세포의 계대배양 방법과 동일하게 효소를 처리하여 세포를 배양접시와 단일세포로 분리시킨 후, stemline II 배지에 현탁하였다. 분화 11일차의 간내배엽성 전구세포는 TrypLE select(Invitrogen, USA)을 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 4분간 인큐베이션 후 단일 세포로 분리시켜 stemline II 배지에 현탁하였다.

150만개, 혈관내피세포 250만개 그리고 중간엽줄기세포 15만개를 stemline II 배지 7 mL에 섞어 현탁한 후, filtered 3% BSA in DMEM 배지가 들어가 있는 전일 코팅된 스페로디쉬에 배지를 제거하고 3종의 세포가 포함된 stemline II 배지 7 mL 전체를 씨딩하였다. 이후 추가 30분 동안 스페로디쉬 내 마이크로웰의 경사면에 붙어 있는 세포들을 마이크로웰의 아래쪽으로 내려주고 마이크로웰 바깥쪽의 세포를 제거하는 작업을 진행하게 된다. 처음 3종의 세포가 포함된 배지 7 mL을 씨딩하고 5분 뒤에 60-mm 배양접시를 손으로 쳐서 경사면에 붙어 있는 세포들을 부양시켰다. 그리고 웰 바깥쪽에 위치한 불필요한 세포들을 제거하기 위해 배지를 석션(suction)하고 추가로 7 mL의 stemline II 배지를 넣어주었다. 해당 과정을 5분 간격으로 약 6번 반복하게 되면 웰 아래쪽에 500 ㎛ 크기의 오가노이드가 형성된다. 앞서 언급한 공기방울을 빼주는 과정과 경사면의 세포를 가라앉히는 작업 그리고 웰 바깥쪽의 세포를 제거해주는 작업 중 단 하나의 작업이라도 실수하게 되면 오가노이드가 형성되지 않는 웰이나 1개의 웰에 작은 오가노이드 2개가 생성되는 등의 문제점이 발생할 수 있다. 총 30분 (5분×6회)의 과정이 끝난 후에 stemline II 배지 7 mL이 들어 있는 상태로 37℃ 인큐베이터에서 4시간을 경과하게 되면 균일한 크기의 간오가노이드가 형성된다.

(5) 혈우병 마우스 모델로의 간오가노이드 이식 및 치료 효과

간오가노이드 형성 6시간 뒤에 마이크로파이펫을 이용하여 15 mL 튜브에 모은 후 상등액을 모두 제거하였다. 이때, 간오가노이드는 점성 때문에 마이크로 팁의 벽면에 붙는 성질이 있어 마이크로파이펫을 이용해 간오가노이드를 다루기 바로 직전에는 BSA가 포함된 PBS로 팁을 코팅한 후 항상 작업을 진행한다. 스페로디쉬 8개 분량의 간오가노이드 (2888개)를 50 ng/mL VEGF165를 포함하는 stemline II 배지 50 ㎕에 현탁시켰다. 이를 매트리젤 200 ㎕와 섞은 후에 16G syringe로 혈우병 모델 마우스 허벅지 부근 피하에 주사하여 간오가노이드를 이식하였다. 이식 2주 후에 TVTB(tail vein transection bleeding time)과 생존율을 측정하였다.

(6) 실험방법

(역전사 PCR(RT-PCR) 및 정량적 PCR(qRT-PCR))

총 RNA를 세포에서 추출하기 위하여 Trizol 시약을 사용하여 수득하고, 역전사 시스템(Promega Corp., USA)을 사용한 역전사 과정을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 94℃ 5분, 35사이클(94℃ 30초, 50-57℃ 30초 및 72℃ 30초) 및 72℃ 10분으로 설정하였다.

qRT-PCR 분석은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응물은 12.5 ㎕ SYBR Green PCR Master Mix, 각각 0.8 ㎕ 10 mM의 프라이머, 10.4 ㎕ 증류수 및 0.5 ㎕ 주형 cDNA를 포함하는 25 ㎕로 구성하여 각 프라이머에 맞는 조건에서 증폭하여 확인하였다. 각 유전자의 상대적인 발현수준은 GAPDH를 사용하여 정규화하여 측정하였다. 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다(표 1).

(면역세포화학)

분화된 혈관내피세포는 4% PFA(paraformaldehyde)를 포함하는 PBS를 처리하여 고정시켰다. 0.1%(세포 표면 단백질; 표 2 참조) 또는 0.3%(세포 내부 단백질; 표 2 참조) Triton X-100/PBS 및 10% 혈청을 포함하는 PBS로 처리하여 블로킹 및 천공시킨 다음, 1차 항체를 처리하고, 4℃에서 12시간~16시간 동안 반응시켰다. 동형 마우스 IgG 또는 정상 당나귀 혈청을 음성 대조군으로 사용하였는데, 상기 음성 대조군에서는 형광이 검출되지 않았다. 1차 항체 반응 후 PBS로 3회 세척하고 PBS에 1:400으로 희석한 Alexa Fluor 488 또는 594를 1시간 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 이후 1 ㎍/mL DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 세포의 핵을 염색하였다. 위 과정을 끝마친 샘플은 형광현미경을 통해 해당 단백질의 발현을 확인하였다.

(유세포 분석)

배양접시 위 세포에 TrypLE를 가하여 단일세포로 분리 후 70 ㎛ strainer에 걸러 단일세포만 얻었다. 이후 0.1% BSA를 포함하는 PBS에 1차 항체를 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 3번의 세척 과정 후 0.1% BSA를 포함하는 PBS에 2차 항체를 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 3번의 세척 과정 후 BD accuri C6(BD, USA) 장비를 사용하여 분석하였다. 각 마커별로 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 사용된 항체의 서열은 다음과 같다(표 2).

<실험예 1> 분화 유도된 간내배엽세포(HEP), 혈관내피세포(EC) 및 중간엽줄기세포(MSC)의 세포 형태 및 단백질 발현 양상 분석

상기 실시예 1에서 미분화 상태의 인간 다능성 줄기세포로부터 분화 유도된 간내배엽세포(HEP), 혈관내피세포(EC) 및 중간엽줄기세포(MSC)의 세포 형태 및 단백질 발현 양상을 분석한 유세포분석 및 면역세포화학 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 분화 유도된 역분화줄기세포 유래 중간엽줄기세포는 중간엽줄기세포 마커인 CD29, CD44와 CD166 단백질을 발현하고 있고, 혈관내피세포는 혈관내피세포 마커인 CD157, CD31, VE-cad 그리고 FVIII 단백질을 발현하고 있으며, 간내배엽세포는 간내배엽세포의 마커인 HNF4a와 AFP 단백질을 발현하고 있었다.

또한, 간내배엽성 전구세포 마커(AFP, ALB, HNF4a, ASGPR1), 혈관내피세포 마커(CD31, CD34, VE-cad, vWF) 및 중간엽줄기세포 마커(CD29, CD44, CD73, CD90)의 발현을 qPCR 비교 분석한 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 분화시킨 세포는 각각의 세포의 마커에 부합하는 마커를 발현하고 있었다. 다만, 중간엽줄기세포는 여전히 전구세포의 특성을 지니고 있기 때문에 같은 계통(lineage)인 혈관내피세포와 마커를 일부 공유하고 있는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 2> 간오가노이드 형성

상기 실시예 1에서 분화 유도된 3종 세포를 스페로디쉬 내에서 섞어 간오가노이드를 제조하였다.

도 3의 아래쪽 줄의 사진을 보게 되면 스페로디쉬에서 분리한 후에 간오가노이드의 사진에서도 볼 수 있듯이, 간오가노이드 형성 6시간 차임에도 불구하고 일정한 크기를 이루며 단단한 형태를 이루고 있는 것이 확인 가능하다. 마지막 사진은 1.5 mL의 마이크로튜브에 옮겨 1마리의 혈우병 모델 마우스에 이식하는 간오가노이드의 양을 확인할 수 있다.

또한, 스페로디쉬 내에서 형성한 간오가노이드 형성 경과 시기(3시간, 6시간)에 따른 구조와 각 세포 마커 단백질의 발현을 분석하기 위하여, 간내배엽세포 마커(ALB, AFP) 그리고 혈관내피세포 마커(CD31, VE-cadherin)의 면역형광염색을 시행하였다.

도 4a에 도시한 바와 같이, 간오가노이드 형성 3시간 차에도 충분히 간세포 사이사이에 그물망으로 CD31을 발현하는 혈관내피세포가 끼어들어 있는 형태를 확인할 수 있다. 6시간 경과하면 분리되어 있던 혈관내피세포들이 미세혈관(microvessel) 형태를 띠며 모이는 것을 확인할 수 있다. 이는 실제 간과 유사한 형태로 간오가노이드 내의 분화시킨 혈관내피세포가 구조적 변형이 일어나고 있음을 설명한다.

다음으로, 스페로디쉬 내에서 형성한 간오가노이드 형성 경과 시기(3시간, 6시간, 12시간)에 따른 구조와 각 세포 마커 단백질의 발현을 분석을 통해 최적의 마우스 이식 시기를 결정짓기 위하여 면역형광염색을 시행하였다.

도 4b에 도시된 바와 같이, 도 4a의 결과와 마찬가지로 형성 3시간 차에는 AFP의 발현이 확인되지 않다가 6시간 차에 AFP가 확인되기 시작하였다. 또한 6시간 차에 간오가노이드 내 CD31, VE-cadherin을 발현하는 혈관내피세포가 모세혈관화 되는 것을 확인할 수 있다. a-SMA를 발현하는 중간엽줄기세포는 간세포와 혈관내피세포 사이사이에 존재하며 간오가노이드 형성을 견고하게 하는 역할을 하고 있다. 하지만 시간이 보다 경과한 12시간 차에는 AFP 발현이 감소하며 모세혈관화 한 혈관내피세포들이 큰 다발 형태로 모여듦을 확인할 수 있다. 이는 이식을 위한 간오가노이드 형성 최적의 시간이 6시간임을 반증한다.

<실험예 3> 혈우병 마우스 모델에 이식된 간오가노이드의 변화

상기 실시예 1에서 제조된 간오가노이드의 이식 2주 후에 혈우병 마우스 모델의 표현형 변화를 TVTB(Total Bleeding Time), tail clipping(survival rate)을 시행하여 확인하였다. 그리고 이식한 부위에 이식 부위를 적출하여 H&E 염색과 면역형광염색을 시행하여 이식 부위의 간오가노이드의 구조를 확인하였다. TVTB는 꼬리지름 2.5mm인 부위의 측맥(lateral vein)의 횡단면 부위로 메스로 베는 상처를 줘서 출혈 시간을 측정하는 것이다. 5분 간격으로 자연 지혈된 부위의 딱지를 떼어 주는 작업을 통해 인위적인 출혈을 계속 유도하며 1시간 동안의 총 출혈 시간을 측정하여 혈우병 표현형 치료 정도를 확인하는 작업이다.

도 5에 도시된 바와 같이, 간오가노이드를 이식 받은 혈우병 마우스 모델은 정상 마우스와 유사한 수준으로 돌아왔음을 확인할 수 있다. 하지만 매트리젤만 이식 받은 sham 그룹에서는 혈우병 마우스 모델과 표현형 차이가 전혀 없었다. 또한, 꼬리 끝을 자른 후 생존율을 비교하는 tail clipping 실험을 진행하였을 때, 간오가노이드를 이식 받았을 경우에 생존율이 90%까지 올라갔으며 이는 TVTB의 결과와 동일한 양상을 보여준다. 아울러, 이식 부위를 적출하여 H&E 염색을 시행하였을 때 간 이식 부위와 마우스의 피부가 맞닿는 부위로 간오가노이드가 밀집되어 이동하는 것을 확인할 수 있다. 이는 호스트(마우스)의 혈관 조직망과의 연결을 통한 FVIII의 생산, 분비에 따른 표현형 변화를 설명할 수 있다.

Claims

줄기세포로부터 분화 유도된 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 8 내지 12 : 14 내지 18 : 0.5 내지 1.5의 세포수의 비율로 혼합하고 동물유래물질제거 배양배지에서 4시간 내지 12시간 동안 인큐베이션하여 간오가노이드를 형성하는 단계를 포함하는 간오가노이드의 생산 방법.
제1항에 있어서,
간오가노이드는 간내배엽세포, 혈관내피세포 및 중간엽줄기세포를 10:16:1의 세포수의 비율로 혼합하여 형성되는, 간오가노이드의 생산 방법.
제1항에 있어서,
줄기세포는 미분화 또는 역분화 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem cell, iPSC), 체세포복제줄기세포(somatic cell nuclear transfer, SCNT) 및 전분화능줄기세포(pluripotent stem cells, PSC)로 이루어진 군에서 선택되는, 간오가노이드의 생산 방법.
제1항에 있어서, 간내배엽세포는
줄기세포를 CHIR99021, 액티빈 A(activin A) 및 소듐 부티레이트(sodium butyrate)를 함유한 배지에서 배양하여 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하는 단계;
상기 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 BMP2(bone morphogenetic protein 2), FGF4 및 B27을 함유한 배지에서 배양하여 내배엽성 세포로 분화 유도하는 단계;
상기 내배엽성 세포를 레티노산(retinoic acid, RA) 및 B27을 함유한 배지에서 배양하여 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로 분화 유도하는 단계; 및
상기 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 아스코르브산, 니코틴아미드 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 함유한 배지에서 간내배엽세포로 분화 유도하는 단계를 거쳐 제조한 것인, 간오가노이드의 생산 방법.
제4항에 있어서, 줄기세포를 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하는 단계는
1 내지 3 μM CHIR99021 및 50 내지 150 ng/mL의 액티빈 A를 함유한 배지에서 35 내지 40℃에서 1일 내지 2일 동안 배양한 후,
0.2 내지 0.7 μM 소듐 부티레이트 및 50 내지 150 ng/mL의 액티빈 A를 함유한 배지에서 35 내지 40℃에서 1일 내지 2일 동안 추가 배양하는 것인, 간오가노이드의 생산 방법.
제4항에 있어서,
중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 내배엽성 세포로 분화유도 하는 단계는 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 10 내지 30 ng/mL의 BMP2 및 15 내지 35 ng/mL의 FGF4를 함유한 B27 보충 배지에서 35 내지 40℃에서 1일 내지 3일 동안 배양하는 것인, 간오가노이드의 생산 방법.
제4항에 있어서,
내배엽성 세포를 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로 분화 유도하는 단계는 1 내지 3 μM 레티노산을 함유한 B27 보충 배지에서 35 내지 40℃에서 1일 내지 3일 동안 배양하는 것인, 간오가노이드의 생산 방법.
제4항에 있어서,
전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 간내배엽세포로 분화 유도하는 단계는 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 50 내지 150 μM 아스코르브산, 0.5 내지 1.5 mM 니코틴아미드 및 0.5 내지 1.5 ng/mL의 bFGF를 함유한 배지에서 35 내지 40℃에서 3일 내지 5일 동안 배양하는 것인, 간오가노이드의 생산 방법.
제1항의 방법에 따라 생산된 간오가노이드.
제9항의 간오가노이드를 포함하는 혈우병 치료용 조성물.
제10항에 있어서,
혈우병은 제1형 혈우병인, 혈우병 치료용 조성물.
줄기세포를 CHIR99021, 액티빈 A(activin A) 및 소듐 부티레이트(sodium butyrate)를 함유한 배지에서 배양하여 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포로 분화 유도하는 단계;
상기 중내배엽성 및 내배엽성 전구세포를 BMP2(bone morphogenetic protein 2), FGF4 및 B27을 함유한 배지에서 배양하여 내배엽성 세포로 분화 유도하는 단계;
상기 내배엽성 세포를 레티노산(retinoic acid, RA) 및 B27을 함유한 배지에서 배양하여 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포로 분화 유도하는 단계; 및
상기 전장 내배엽성 세포 및 간 구체화세포를 아스코르브산, 니코틴아미드 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 함유한 배지에서 간내배엽세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 줄기세포의 간내배엽세포로의 분화 유도 방법.
제12항에 있어서,
줄기세포는 미분화 또는 역분화 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem cell, iPSC), 체세포복제줄기세포(somatic cell nuclear transfer, SCNT) 및 전분화능줄기세포(pluripotent stem cells, PSC)로 이루어진 군에서 선택되는, 줄기세포의 간내배엽세포로의 분화 유도 방법.