KR102400263B1 - 줄기세포 초기 수율 촉진을 위한 줄기세포 배양 방법 - Google Patents
줄기세포 초기 수율 촉진을 위한 줄기세포 배양 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 1~8%의 산소분압을 갖는 저산소 조건 및 1.0~8.0 PSI의 압력 조건하에서 초기 배양하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 배양 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 배양 방법은 줄기세포의 분화가 억제됨으로써 줄기세포성을 유지할 수 있고, 특히 현저하게 높은 증식율을 달성할 수 있다.
Description
본 발명은 줄기세포 배양 방법에 관한 것으로 줄기세포 생산의 초기 수율을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
줄기세포는 다양한 세포로 분화할 수 있고, 이러한 줄기세포의 특성을 이용한 세포치료법의 활용가능성에 관한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 그 결과 줄기세포 치료제의 논문, 특허, 임상 실험 건수는 증가하는 추세일 뿐 아니라, 세계 줄기세포 치료제의 시장규모를 2018년 기준 1,000억 달러 이상으로 전망하고 있다 (Transparency Market Research, 2019).
다분화능이 있는 배아줄기세포는 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 세포치료제로 주목받고 있었지만, 안전성 및 윤리적 문제로 실제 활용되기에는 어려움이 있다.
이러한 배아줄기세포의 안전성 및 윤리적인 문제를 회피하기 위하여 연구자들은 배아줄기세포를 대체할 수 있는 성체줄기세포에 관심을 갖게 되었고, 그 중 높은 자기복제능력과 다양한 조직으로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포를 이용한 연구를 활발히 진행하고 있다.
중간엽 줄기세포는 분화를 통해 근육, 연골, 골 조직, 인대, 골수 기질 등으로 재생할 수 있을 뿐 아니라, 그 자체가 분비하는 다양한 단백질들이 치료효과를 가진다.
구체적으로는, 중간엽 줄기세포가 분비하는 다양한 단백질들의 주변분비작용 (paracrine)을 통해 병변 부위에서 염증 억제 및/또는 면역 조절 등 개체의 향상성 회복을 유도하는 작용이 알려져있다. 이러한 주변분비 작용 때문에 중간엽 줄기세포를 "Drug store" 혹은 "Drug Factory"라 칭하고 있다.
중간엽 줄기세포 치료제는 현재 전세계적으로 7가지 치료제가 시판되고 있으며, 그 중 4가지 제품이 국내에서 최초 허가되어 시판되었다. 윤리적인 문제가 없는 성체 줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발을 위해서는, 세포의 줄기세포성 (Stemness)을 유지하면서 효과적으로 증식시킬 수 있는 배양 방법을 확립하는 것이 필수적이다.
그러나, 성체줄기세포는 증식율이 낮기 때문에, 한 조직에서 얻을 수 있는 세포의 수가 한정적이라는 문제가 있다. 일반적으로 골수 유래의 성체줄기세포는 다양한 조직으로의 분화능이 극히 제한적이며 많은 세포를 얻는 것도 쉽지 않는 것으로 알려져 있다. 다른 종류의 성체줄기세포들, 즉 제대혈이나 지방줄기세포는 상대적으로 세포를 얻기가 쉬우나 골수 유래 성체줄기세포와 마찬가지로 분화능이 제한적이다.
일반적으로 줄기세포 치료제가 임상에 적용되기 위해서는 일정 수준 이상의 세포 수 (최소 1X109 cells)가 필요하고, 이를 위해서는 줄기세포의 대량 배양이 필수적이다. 하지만, 줄기세포의 배양 과정에서, 배양 기간이 길어질수록 필연적으로 줄기세포의 노화가 발생되고, 이는 증식능 또는 분화능과 같은 줄기세포능과 치료 효능의 감소로 이어진다. 또한, 배양 기간이 길어짐에 따라 재료비, 인건비 등의 생산원가가 높아지는 단점이 있기 때문에 중간엽 줄기세포의 줄기세포능을 유지한 채로 증식시키는 배양 방법에 대한 필요성이 증대되고 있다.
최근 연구자들의 관심을 받고 있는 탯줄 유래 줄기세포는 다른 성체줄기세포에 비해 침습적인 시술이 필요없고, 면역원성이 낮아 자기 (autologous) 뿐 아니라, 동종 (allogenic) 줄기세포이식이 가능하다는 등의 장점을 가지고 있다. 하지만, 하나의 탯줄에서 분리할 수 있는 세포의 수가 한정적이기 때문에, 그 세포의 수를 증가시키기 위해 세포 배양을 하는 경우 세포 노화 및 세포 증식이 유지되는 시간이 줄어들어서 결국 얻을 수 있는 세포의 수가 적다는 문제점을 그대로 가지고 있다.
따라서, 성체줄기세포 즉 중간엽 줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발을 위하여, 줄기세포성 (stemness)을 유지한 채 효과적으로 증식시킬 수 있는 방법을 개발하는 것이 요구되고 있다.
본 발명은 종래의 낮은 줄기세포 생산 수율의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 줄기세포의 초기 수율을 높이고, 줄기세포의 줄기세포성 (stemness)을 유지하기 위한 줄기세포 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 줄기세포를 1~8%의 산소 분압을 갖는 저산소 조건 및 1.0~8.0 PSI (Pound per Square Inch)의 압력 조건하에서 초기 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포 배양 방법에 의하면, 기존 배양법 대비 약 3배 정도로 줄기세포의 초기 수율이 증가되고, 기존 배양법 대비 평균 10시간 정도 감소된 Doubling time에 의해 높은 줄기세포 증식율을 달성할 수 있다.
또한, 본 발명의 줄기세포 배양 방법은 줄기세포의 분화를 억제함으로써 줄기세포성 (stemness)을 유지하는 효과를 제공한다.
또한, 본 발명의 줄기세포 배양 방법은 줄기세포의 배양 속도를 단축함으로써, 줄기세포의 대량생산을 가능하게 한다.
도 1은 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 정상 산소 조건 (C), 저산소 조건 (H) 또는 저산소 조건 및 압력 조건 (H+P)에서 초기 배양한 결과이다. 도 1A는 각 조건에서 4일, 7일, 9일 배양 후 줄기세포의 모양을 광학현미경으로 관찰한 결과이고, 도 1B는 각 조건에서 9일 동안 초기 배양했을 때의 세포수율을 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 정상 산소 조건 (C), 저산소 조건 및 2.0 PSI 압력 조건 (C+H+P(2.0)), 또는 저산소 조건 및 2.5 PSI 압력 조건 (C+H+P(2.5))으로 초기 배양한 결과이다. 도 2A는 각 조건에서 3일, 5일, 7일째 되는 날에 각각 광학현미경으로 관찰한 결과이고, 도 2B는 각 조건에서 7일 동안 초기 배양했을 때의 세포수율를 나타낸다.
도 3은 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양 후 중간엽 줄기세포 마커 (도 3A) 및 negative 마커 (도 3B)의 발현 정도를 나타낸다.
도 4는 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 정상 산소 조건 (C), 저산소 조건 (C+H) 또는 저산소 조건 및 압력 조건 (C+H+P)으로 초기 배양 또는 계대 배양한 결과이다. 도 4A는 동일 조건에서 24시간, 48시간, 72시간 초기 배양 후 ATP 생성량이고, 도 4B는 P1, P2 배양시 Doubling time을 나타낸다.
도 5는 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 저산소 조건 및 2.0 PSI 압력 조건으로 초기 배양한 후 지방세포 (adipocyte), 조골세포 (osteoblast), 또는 연골세포 (chondrocyte)로 분화시키는 분화배지를 이용하여 각각 분화시킨 후 분화된 각 세포에 특이적인 염색결과이다.
도 2는 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 정상 산소 조건 (C), 저산소 조건 및 2.0 PSI 압력 조건 (C+H+P(2.0)), 또는 저산소 조건 및 2.5 PSI 압력 조건 (C+H+P(2.5))으로 초기 배양한 결과이다. 도 2A는 각 조건에서 3일, 5일, 7일째 되는 날에 각각 광학현미경으로 관찰한 결과이고, 도 2B는 각 조건에서 7일 동안 초기 배양했을 때의 세포수율를 나타낸다.
도 3은 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양 후 중간엽 줄기세포 마커 (도 3A) 및 negative 마커 (도 3B)의 발현 정도를 나타낸다.
도 4는 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 정상 산소 조건 (C), 저산소 조건 (C+H) 또는 저산소 조건 및 압력 조건 (C+H+P)으로 초기 배양 또는 계대 배양한 결과이다. 도 4A는 동일 조건에서 24시간, 48시간, 72시간 초기 배양 후 ATP 생성량이고, 도 4B는 P1, P2 배양시 Doubling time을 나타낸다.
도 5는 실시예 1의 방법으로 수득된 인간 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 저산소 조건 및 2.0 PSI 압력 조건으로 초기 배양한 후 지방세포 (adipocyte), 조골세포 (osteoblast), 또는 연골세포 (chondrocyte)로 분화시키는 분화배지를 이용하여 각각 분화시킨 후 분화된 각 세포에 특이적인 염색결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 줄기세포를 1~8%의 산소 분압을 갖는 저산소 조건 및 1.0~8.0 PSI (Pound per Square Inch)의 압력 조건하에서 초기 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 배양 방법에 관한 것이다.
국제 줄기세포 위원회 (International Society for Cellular Therapy, ISCT) 에서 정한 중간엽 줄기세포는 배양시 바닥에 부착되어 자라야 하고, 시험관 내에서 조골세포, 지방세포 또는 연골세포로 분화할 수 있어야 하고, 세포 표면 마커로서 CD73, CD90, CD105, CD166 및 CD44을 발현해야 하고, CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 및 HLA-DR은 발현하지 않아야 한다.
본 발명의 줄기세포의 배양 방법은 다양한 기원조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포에 적용될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포의 예로는 제대혈, 태반, 탯줄, 골수, 지방조직 등에서 유래한 중간엽 줄기세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 줄기세포의 배양 방법은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 적용된다.
또한, 본 발명의 중간엽 줄기세포의 배양 방법은 다양한 대상으로부터 수득한 중간엽 줄기세포에 적용될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포의 예로는 인간을 포함한 포유류로부터 수득한 중간엽 줄기세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 구체예에서는 본 발명의 중간엽 줄기세포의 배양 방법은 인간으로부터 수득한 중간엽 줄기세포에 적용되고, 또 다른 구체예에서는 인간 탯줄 중간엽 줄기세포에 적용된다.
성체줄기세포는 유래하는 원천 (source)에 따라 줄기세포성 유지 및 증식에 미치는 인자가 전혀 상이하다. 예를 들어 지방조직 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포를 저산소 조건하에서 배양할 경우, 줄기세포의 종류에 따라 골수 유래 줄기세포는 분화가 유도되고 (J Cell Physiol. 2006 May;207(2):331-9.), 지방조직 유래 줄기세포는 분화가 억제되기도 한다 (J Biol Chem. 2006 Oct 13;281(41):30678-83. Epub 2006 Aug 22).
추가로, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 BMP-2 단백질을 포함하는 배지에서 배양하면서 주기적인 압력 변화를 가하는 경우 심근세포로 분화시킨다는 결과가 보고되었고 (한국 공개특허 10-2008-0026415), 골수 유래 중간엽 줄기세포의 경우 압력을 가하는 경우 골/연골 분화를 유도한다는 것 (Stem Cell Research (2015) 14, 283-296)이 보고되어 있다.
본 발명의 배양 방법은 줄기세포를 저산소 (hypoxia) 조건 하에서 초기 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 저산소 조건은, 대기 중의 산소 농도를 의미하는 정상산소 (normoxia) 조건과 비교하여 줄기세포의 증식을 더욱 촉진한다. 상기 목적을 달성하기 위하여 산소는 1 내지 8%의 농도로, 2 내지 8%의 농도로, 3 내지 8%의 농도로, 4 내지 8%의 농도로, 2 내지 6%의 농도로, 3 내지 6%의 농도로, 4 내지 6%의 농도로, 2 내지 5%의 농도로, 또는 3 내지 5%의 농도로 사용될 수 있다.
또한, 상기 산소의 농도는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% 또는 8%의 농도로 사용될 수 있다.
상기 산소의 농도가 1% 미만이거나 8%를 초과하면 줄기세포의 증식이 현저히 감소되는 문제가 발생한다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 저산소 조건은 5%의 산소 농도이다.
상기 저산소 조건은 세포 배양기 내 산소 농도를 조절함으로써 이루어진다. 예를 들어 정상 산소 조건을 갖는 배양기 내에 질소 가스 (100%) 또는 질소/이산화탄소 (95%/5%) 혼합가스를 공급하여 배양기 내 공기를 대체함으로써 저산소 조건을 달성할 수 있다. 상기 산소 농도는 배양기에 장착된 산소 센서를 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 배양 방법은 줄기세포를 압력 조건하에서 초기 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 압력 조건은 대기압 조건과 비교하여 줄기세포의 증식을 더욱 촉진한다. 상기 목적을 달성하기 위하여 압력 조건은 1.0 내지 8.0 PSI (Pressure per Square Inch), 2.0 내지 8.0 PSI, 3.0 내지 8.0 PSI, 4.0 내지 8.0 PSI, 5.0 내지 8.0 PSI, 6.0 내지 8.0 PSI, 1.0 내지 6.0 PSI, 2.0 내지 6.0 PSI, 3.0 내지 6.0 PSI, 4.0 내지 6.0 PSI, 1.0 내지 4.0 PSI, 2.0 내지 4.0 PSI, 3.0 내지 4.0 PSI, 또는 1.0 내지 4.0 PSI가 사용될 수 있다.
또한, 압력조건은 1 PSI, 2 PSI, 3 PSI, 4 PSI, 5 PSI, 6 PSI, 7 PSI 또는 8 PSI가 사용될 수 있다.
상기 압력이 1.0 PSI 미만이거나, 8.0 PSI를 초과하면 줄기세포의 증식이 현저히 감소되는 문제가 발생한다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 압력 조건은 2.0 PSI, 또는 2.5 PSI이다.
또한, 본 발명의 배양 방법은 줄기세포를 산소 농도 2~5%의 저산소 조건 및 1.0 내지 8.0 PSI의 압력 조건에서 초기 배양하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 구체예는, 산소 농도 5%의 저산소 조건 및 2.0 PSI의 압력 조건이다. 본 발명의 또다른 일 구체예는 산소 농도 5%의 저산소 조건 및 2.5 PSI의 압력 조건이다.
전술한 조건 외에 중간엽 줄기세포의 배양은 통상적으로 사용되는 세포배양기에서 흡기 및 호기 밸브를 통하여 세포배양장치 내의 공기와 압력변화장치 내의 공기의 교환을 통해 산소 농도 및 압력을 조절하는 방법에 의해 이루어진다. 상기 세포배양기의 예는 배양기 내의 산소 농도 및 압력을 동시에 조절할 수 있는 AvatarTM Cell Control System (xcellbio)이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
"초기 배양 (Primary Culture)"은 조직에서 세포를 분리하여 최초로 배양하는 것이다. 중간엽 줄기세포는 접착 배양계 세포이므로, 필요한 경우 영양배지는 교환할 수 있지만, 배양용기는 교환하지 않는다. 본 발명에서는 탯줄에서 분리된 중간엽 줄기세포를 최초로 배양기에서 배양하는 것이다.
"초기 수율"은 초기 배양에 의해 증식되는 세포의 수이다. 본 발명에서는 초기 배양된 탯줄에서 분리된 중간엽 줄기세포를 초기 배양하였을 때의 세포 수이다.
"계대 배양 (subculture)"은 기존의 배양되던 세포를 새로운 배양용기로 바꾸어 증식 및 유지하는 것이다. 본 발명의 세포인 탯줄에서 분리된 중간엽 줄기세포는 접착 배양계 세포이므로, 트립신 등의 효소를 처리하여 배양용기에서 떼어낸 후 새로운 배양용기에 옮겨 계대 배양한다.
본 발명의 배양 방법은 줄기세포 초기 배양 또는 계대 배양시에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 줄기세포를 초기 배양하는 경우 줄기세포의 증식이 촉진되므로, 적은 횟수의 계대 배양으로도 많은 수의 줄기세포를 얻을 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 배양 방법을 통해 얻은 중간엽 줄기세포는 면역원성이 없고 면역반응을 유발하지 않으므로, 인간을 대상으로 한 세포치료제로 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 배양 방법에 의해 수득된 증식력, 생존도, 회수율 등이 개선된 중간엽 줄기세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 배양 방법에 의해 수득된 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다. 본 발명의 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 간세포, 췌도베타세포, 혈관세포 또는 폐세포 등의 재생 또는 보호에 이용될 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1: 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 분리
인간 탯줄 조직은 삼성의료원의 IRB (Institutional Review Board of Samsung Medical Center) 승인을 받은 후 산모의 동의를 받아 채취하였다.
채취한 탯줄은 이전에 보고된 Peng J 등의 방법 (Brain Research Bulletin, 84(2011) 235-234)을 일부 변경하여 처리하는데, PBS (Phosphate Buffered Saline)로 탯줄을 수 차례 세척한 후 3~4 cm 길이로 자르고, 혈관 및 양막을 제거한 후 가위를 이용하여 잘게 분쇄하였다. 분쇄된 조직은 37oC의 온도에서 2 mg/ml의 콜라게나제 (Collagenase)를 60분 동안 처리하여 세포를 분리하였다. 분리된 세포 분획에 우태아 혈청 (Fetal Bovine Serum)을 처리하여 효소 반응을 멈춘 후, 효소 반응액을 1,000g에서 10분 동안 상온에서 원심분리하여 세포를 수득하였다.
수득된 세포는 무혈청의 aMEM (a-modified Minimum Essential Media) 배지로 세척한 후, 상기 세포는 15% 우태아 혈청 및 0.5% 젠타마이신 (gentamicin) (10 mg/ml)이 포함된 aMEM 배지를 첨가하여 cm2당 50,000 내지 100,000 세포로 계수하여 초기 배양 (P0)을 수행하였다.
초기배양 4일 후에 첫 배지교체를 진행하며, 세포의 밀집도가 70~80% 되었을 때 0.25% 트립신 (Trypsin)을 이용하여 부착된 세포를 부유 시켜준다. 부유시켜 수득된 세포를 무혈청의 aMEM 배지로 세척한 후, 상기 세포는 10% 우태아 혈청 및 0.5 % 젠타마이신 (10 mg/ml)이 포함된 aMEM 배지를 첨가하여 cm2당 3,000 내지 5,000 세포로 계수하여 계대 배양 (P1)을 수행하였다.
계대 배양을 P2까지 진행하여 수득한 세포의 표면 마커를 분석한 결과 중간엽 줄기세포의 마커 (CD90, CD105, CD73, CD166 및 CD44)의 발현을 보이고, 중간엽 줄기세포의 negative marker (CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 및 HLA-DR)는 발현하지 않았다 (도면 생략).
실시예 2 : 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의
Ex vivo
배양 (초기 수율 분석)
실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양 (P0)시 배양 조건에 따른 초기 수율을 분석하기 위한 실험을 실시하였다.
구체적인 실험 방법은 실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 실시예 1에서 사용한 동일한 배지로 정상 산소 조건 (Control), 저산소 조건 (5% O2 Hypoxia), 및 압력 조건 (2.0 PSI 압력)을 단독 또는 조합으로 초기 배양 (P0)하였다.
배양 시작한지 4일, 7일 및 9일째 되는 날에 각각 광학현미경으로 관찰한 결과는 도 1A와 같다. 도 1A의 결과로부터, 정상 조건 (C), 저산소 조건 (C+H), 저산소 조건+압력 조건 (C+H+P)에서 배양된 세포 모두 중간엽 줄기세포의 형태를 유지하며 배양된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 동일한 조건에서의 9일 배양에 의한 세포 수율(%)을 "(초기 배양을 통해 수득한 세포수/탯줄 조직에서 분리한 세포수) X 100"의 식에 의해 확인하였고 그 결과는 도 1B와 같다.
도 1B의 결과로부터 실시예 1의 방법으로 수득된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 9일 배양시 5%의 초기 수율 (정상산소 조건; C)이 저산소 단독 조건 (C+H)에서는 12.5%, 저산소 조건 및 압력 조건 조합 (C+H+P)의 경우 16%까지 증가한 것을 확인할 수 있다.
실시예 3 : 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의
Ex vivo
배양 (압력 조건 최적화)
실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양 (P0)시 압력 조건을 최적화하기 위한 실험을 실시하였다.
구체적인 실험 방법은 실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 실시예 1에서 사용한 동일한 배지로 정상 산소 조건 (Control), 저산소 조건 및 2.0 PSI 압력 조건 (5% O2 Hypoxia + 2.0 PSI), 또는 저산소 조건 및 2.5 PSI 압력 조건 (5% O2 Hypoxia + 2.5 PSI)으로 초기 배양하였다.
배양 시작한지 3일, 5일, 7일째 되는 날에 각각 광학현미경으로 관찰한 결과는 도 2A와 같다. 도 2A의 결과로부터, 정상 조건 (Control), 저산소 조건 및 압력 조건 (5% O2 Hypoxia + 2.0 PSI, 5% O2 Hypoxia + 2.5 PSI)에서 배양된 세포 모두 중간엽 줄기세포의 형태를 유지하며 배양된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 동일한 조건에서의 7일 배양에 의한 세포 수율을 실시예 2와 동일한 방법으로 확인하였고 그 결과는 도 2B와 같다. 도 2B의 결과로부터 실시예 1의 방법으로 수득된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 7일 배양시 8%의 초기 수율 (정상산소 조건; C) 대비 저산소 및 2.0 PSI (5% Hypoxia + 2.0 PSI; C+H+P(2)) 배양시 초기수율이 24% 증가하고, 저산소 및 2.5 PSI (5% Hypoxia + 2.5 PSI; C+H+P(2.5)) 배양시 초기수율이 13% 증가한 것을 확인할 수 있다.
따라서 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양시 최적의 압력 조건을 2.0 PSI로 선택하였다.
실시예 4: 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양 및 계대 배양 후 세포 표면 마커 분석
실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양 후 중간엽 줄기세포의 성질이 유지되는지 확인하기 위해 세포표면 마커 분석을 실시하였다.
구체적인 실험 방법은 실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 실시예 1에서 사용한 동일한 배지로 저산소 조건 및 압력 조건 (5% hypoxia + 2.0 PSI)에서 7일 동안 초기 배양하여 얻은 세포를 정상 산소 및 압력 조건에서 계대 배양을 P2까지 진행하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 ISCT (International Society for Cellular Therapy)의 요건에 따라 중간엽 줄기세포 특이 세포표면 마커 (CD90, CD105, CD73, CD166 및 CD44)의 발현 양상을 분석하였고, 순도 분석을 위해 중간엽 줄기세포의 negative marker (CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 및 HLA-DR)을 발현하는 세포를 유세포분석기로 분석하였다.
그 결과 저산소 조건 및 압력 조건에서 초기 배양 후 계대 배양된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포는 여전히 99% 이상의 중간엽 줄기세포 특이 세포표면 마커를 발현하였고 (도 3A), negative marker는 발현하지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 3B).
실시예 5: 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양시 증식능 분석
실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양 (P0)시 배양 조건에 따른 증식능을 분석하기 위한 실험을 실시하였다.
구체적인 실험 방법은 실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 실시예 1에서 사용한 동일한 배지로 정상 산소 조건 (C), 저산소 조건 (5% O2 Hypoxia; C+H), 및 저산소 조건 및 압력 조건 (2.0 PSI 압력; C+H+P)으로 초기 배양 (P0)하였다.
배양 시작 후 24시간, 48시간 및 72시간에 되는 때에 각각 세포를 모아 세포 내 ATP 생성량을 분석하였다. ATP 분석은 promega사의 CellTiter-Glo® kit을 설명서에 따라 수행했고, 그 결과는 도 4A과 같다.
도 4A의 결과로부터 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포는 각 시간대 별로 저산소 조건 및 압력 조건 (C+H+P)에서의 ATP 생성량이 정상 산소 조건 (C) 및 저산소 조건 (C+H)에 비해 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있다.
또한, 실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 계대 배양시 배양 조건에 따른 Doubleing time을 분석하기 위한 실험을 실시하였다.
구체적인 실험 방법은 실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 실시예 1에서 사용한 동일한 배지로 정상 산소 조건 (C), 저산소 조건 (5% O2 Hypoxia; C+H), 또는 저산소 조건 및 압력 조건 (2.0 PSI 압력; C+H+P)으로 초기 배양 (P0)을 진행하고 정상 산소 및 압력 조건에서 계대 배양하였다 (P1, P2).
도 4B의 결과로부터 초기 배양 (P0) 후에 저산소 조건 (C+H) 혹은 저산소 조건 및 압력 조건 (C+H+P)에서 배양한 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포는 정상 산소 및 압력 조건에서 P1, P2 배양시에도 Doubling time이 기존 조건 대비 각각 3시간, 9시간 단축된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의
Ex vivo
배양 후 분화능 측정
실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포의 초기 배양 후 대표적인 중간엽세포인 지방세포 (adipocyte), 조골세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte)로 분화시키는 분화배지를 이용하여 각각 분화시켰다.
구체적인 실험 방법은 실시예 1에서 분리된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포를 실시예 1에서 사용한 동일한 배지로 저산소 조건 (5% O2) 및 2.0 PSI의 압력 조건으로, 7일 동안 초기 배양 (P0)하여 얻은 세포를 정상 산소 및 압력 조건에서 계대 배양을 P2 까지 진행하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 조골세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte) 또는 지방세포 (adipocyte)로 분화시키는 분화배지로 10~30일 동안 배양 후 각 세포로 분화되었는지 확인하였다.
지방세포 분화를 위해 StemPro Adipogenesis Differentiation Kit을 사용하였고, 조골세포 분화를 위해 StemPro Osteogenesis Differentiation Kit을 사용하였고, 연골 세포 분화를 위해 DMEM 배지에 BMP-6, TGFβ3, ITS (Insulin-transferrin-selenium), dexamethasone, ascorbic acid, L-proline, sodium pyruvate를 포함한 배지를 사용하였다.
지방세포는 oil-red O로, 조골 세포는 Alizarin red S로, 연골세포는 Safranin-O로 염색하였고 그 결과는 도 5와 같다.
도 5의 결과로부터 저산소 조건 및 압력 조건에서 초기 배양된 탯줄 조직 유래 중간엽 줄기세포는 적합한 분화배지 하에서 중간엽 세포인 지방세포, 조골세포 또는 연골세포로 분화되는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
Claims (10)
- 골수의 기질, 지방조직, 연골, 또는 탯줄 유래인 중간엽 줄기세포를 1~8%의 산소 분압을 갖는 저산소 조건 및 1.0~8.0 PSI (Pound per Square Inch)의 압력 조건하에서, 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum) 및 항생제가 포함된 aMEM (a-modified Minimum Essential Media) 배지에서 초기 배양하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 배양 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 산소 분압은 5%인, 중간엽 줄기세포의 배양 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압력 조건은 2.0 PSI인, 중간엽 줄기세포의 배양 방법. - 제1항에 있어서,
상기 압력 조건은 2.5 PSI인, 중간엽 줄기세포의 배양 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 탯줄 유래인, 중간엽 줄기세포의 배양 방법. - 제1항 내지 제4항, 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 초기 배양은 5일 내지 15일 동안 초기 배양되는, 중간엽 줄기세포의 배양 방법. - 제7항에 있어서,
상기 초기 배양은 4일 내지 9일 동안 초기 배양되는, 중간엽 줄기세포의 배양 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 배양은 15%의 소태아혈청 및 0.5%의 젠타마이신이 포함된 aMEM (a-modified Minimum Essential Media) 배지에서 수행되는, 중간엽 줄기세포의 배양 방법.
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