CN103814126A - 多核巨核细胞以及血小板的制造方法 - Google Patents

多核巨核细胞以及血小板的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供促进巨核细胞的多核化、制备更加多核化的多核巨核细胞的方法，进一步地从多核巨核细胞有效地产生血小板的方法等。本发明提供制造多核巨核细胞的方法，包括在多核化前的巨核细胞中使抗细胞凋亡基因强制表达，培养该细胞的工序。

Description

多核巨核细胞以及血小板的制造方法
技术领域
本发明涉及使多核化前的巨核细胞有效地进行多核化的方法、以及从该巨核细胞制造血小板的方法等。
背景技术
在与血液有关的疾病的治疗或外科治疗中，需要较多的血液细胞。在血液细胞中，血小板作为血液凝固以及止血所需的细胞，是尤为重要的血液细胞中的一种。血小板在白血病、骨髓移植、抗癌治疗等治疗中需要的量多，且稳定供给的必要性高。以往，为了确保血小板的供给，除了通过从献血者的血液提取的方法外，采用了给予如TPO样类似物（mimetics）制剂的方法、从脐带血或骨髓细胞分化巨核细胞的方法等。近年来，也已研发出将ES细胞或iPS细胞等多功能干细胞在体外（in vitro）进行分化诱导，制备血小板等血液细胞的技术。
发明者们确立了从人类ES细胞分化诱导巨核细胞以及血小板的技术，揭示了ES细胞作为血小板的来源（source）的有效性（专利文献1以及非专利文献1）。并且，发明者们建立了从iPS细胞制备巨核细胞以及血小板的方法，能够解决在ES细胞来源的血小板的输血中难以避免的白细胞抗原（humanleukocyte antigen，HLA）相容性问题（专利文献2）。
进一步地，发明者们对于从干细胞制备的血小板等细胞的量性问题，通过探索基于干细胞建立永生化的巨核前体细胞株的方法而制备血小板，为了在体外大量制备血小板等细胞而研发出了重要的技术（专利文献3）。
在机体中，巨核细胞形成被称为前血小板(proplatelets)的伪足状（pseudopodial formation），其细胞质裂解（fragmentation）而释放出血小板。被认为巨核细胞释放血小板为止，通过核内有丝分裂（endomitosis）进行多核化。巨核细胞的核内有丝分裂不会伴随分裂沟形成以及纺锤体延伸，是基于异常的核分裂以及细胞质分裂的多极性有丝分裂，其结果，形成含有几个分叶的核的细胞。反复发生这种核内有丝分裂，诱导巨核细胞的多核化。
关于巨核细胞的多核化，迄今为止多次报道过研究结果。Lodier等人（非专利文献1）阐明了在巨核细胞的核内有丝分裂中，虽然形成分裂沟但观察不到局部存在于收缩环中的非肌肉Ⅱ型肌球蛋白，在收缩环形成以及纺锤体延伸中发生缺陷。并且，揭示了这些收缩环、纺锤体延伸的异常，抑制RhoA以及Rock的活性，使得这种异常更加明显（非专利文献2）。RhoA储积于分裂沟，促进包含Rho激酶（Rock）、citron激酶、LIM激酶以及mDia/formins等几个效应子的活化。这些结果给予这样的启示：通过抑制RhoA以及Rock等参与收缩环形成等的因子的活性，促进巨核细胞的核内有丝分裂。并且，还报道有如果位于integrin alpha2/beta1的下流的Rho的信号被增强，则抑制未成熟的未多核化的巨核细胞的前血小板(proplatelet)的形成。
报道有转录因子的全反式维甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）、作为组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase）的抑制剂而得知的丙戊酸，参与巨核细胞的分化。Schweinfurth等人发现用全反式维甲酸或丙戊酸处理未成熟的巨核细胞，则会促进多核化（非专利文献3）。进一步地，还报道有如果敲减癌抑制基因产物的p53，则会促进巨核细胞的多核化（非专利文献4）。
另外，还揭示了以下对于巨核细胞的分化过程的影响，即，在高于通常的培养温度的39℃下培养未成熟的巨核细胞，则会促进多核化的成熟巨核细胞的诱导以及前血小板(proplatelet)的形成（非专利文献5）等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/041370
专利文献2：WO2009/122747
专利文献3：WO2011/034073
非专利文献
非专利文献1：Takayama等,Blood,111：5298-53062008
非专利文献2：Lordier等,Blood,112：3164-31742009
非专利文献3：Schweinfurth等,Platelets,21：648-6572010
非专利文献4：Fuhrken等,J.Biol.Chem.,283：15589-156002008
非专利文献5：Proulx等,Biotechnol.Bioeng.,88：675-6802004
发明内容
技术问题
本发明的发明者们发现能够从没有进行“多核化”的巨核细胞获得功能性血小板（是保持止血作用等机体内活性的血小板，表征为CD42b+）的量，与用于实施临床应用开展所需的量相比非常之少，因此认为为了在体外有效地生成功能性血小板，需要促进巨核细胞的多核化。
因此，本发明的目的在于提供促进巨核细胞的多核化、制备更加多核化的多核巨核细胞的方法，进一步地从多核巨核细胞有效地产生血小板的方法等。
技术方案
鉴于上述目的，本发明的发明者们尝试了促进从多功能干细胞（ES细胞、iPS细胞等）制备的未进行多核化的巨核细胞的多核化。首先，本发明的发明者们利用从自发研制的多功能干细胞制备的永生化巨核前体细胞株（参照专利文献3）而进行了上述的尝试。该永生化巨核前体细胞株，是通过在从多功能干细胞诱导的巨核细胞的前体细胞内使MYC等癌基因以及BMI1等基因表达，由此提高了增殖能力的、株化（永生化）的细胞株。
本发明的发明者们为了利用该永生化巨核前体细胞株而促进多核化，在进行癌基因以及多梳基因的表达抑制时，通过使抗细胞凋亡基因强制表达，由此在有效进行多核化中取得了成功。
并且，确认了在强制表达抗细胞凋亡基因的基础上，通过抑制p53基因产物的表达或功能，会进一步提高多核化的效率。并且，确认出对上述巨核前体细胞株进行ROCK（Rho相关的卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho-associatedcoiled-coil forming kinase）/Rho结合激酶）抑制剂、HDAC抑制剂、39℃下的培养等的处理，也能有效地诱导多核化，进一步发现，如果用肌动球蛋白复合物（肌动蛋白和肌球蛋白的复合物）的功能抑制剂进行处理，则会更加高度促进多核化。
并且，本发明的发明者们发现根据本发明而生成的被促进多核化的巨核细胞，4N或8N以上的巨核细胞的比率与已知的比率相比更高，并且，与机体内生成的成熟巨核细胞相比，其比率也非常高。
进一步地，本发明的发明者们发现对于充分地多核化的成熟巨核细胞，通过抑制上述抗细胞凋亡基因的强制表达，从一个巨核细胞生成的血小板的数量会飞跃性地增加，并且确认通过在培养基中添加ROCK抑制剂进行培养等，可以进一步提高血小板生成率，并且研究培养天数、培养温度等的最适条件，由此完成了本发明。
即，本发明涉及以下〔1〕～〔19〕。
〔1〕一种方法，是制造多核巨核细胞的方法，包括工序：在多核化前的巨核细胞中使抗细胞凋亡基因强制表达，培养该细胞。
〔2〕如〔1〕所述的方法，所述抗细胞凋亡基因为BCL-XL基因。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的方法，在所述的培养工序中，抑制p53基因产物的表达或功能。
〔4〕如〔1〕至〔3〕中任意一项所述的方法，在所述的培养工序中，对多核化前的巨核细胞进行以下（a）至（c）中的至少一个处理：
（a）由肌动球蛋白复合物功能抑制剂的处理；
（b）由ROCK抑制剂的处理；以及
（c）由HDAC抑制剂的处理。
〔5〕如〔4〕所述的方法，所述ROCK抑制剂为Y27632，所述HDAC抑制剂为丙戊酸，所述肌动球蛋白复合物功能抑制剂是Blebbistatin。
〔6〕如〔1〕至〔5〕中任意一项所述的方法，在高于37℃的温度下进行所述的培养工序。
〔7〕如〔1〕至〔6〕中任意一项所述的方法，所述多核化前的巨核细胞是通过以下工序而获得的：在从造血前体细胞到多核化前的巨核细胞的分化阶段的任意阶段，在该细胞中使癌基因与以下（i）至（iii）中的任意基因强制表达，培养该细胞并使其增殖，
（i）抑制p16基因或者p19基因表达的基因、
（ii）抑制Ink4a/Arf基因表达的基因、以及
（iii）多梳基因。
〔8〕如〔7〕所述的方法，作为所述癌基因而使用c-MYC基因，作为所述（i）至（iii）的基因而使用BMI1。
〔9〕如〔7〕或〔8〕所述的方法，所述造血前体细胞来源于iPS细胞、ES细胞，以及来源于从由脐带血、骨髓血或末梢血来源的造血干细胞以及造血干细胞构成的组中选择的细胞。
〔10〕包含根据〔1〕至〔9〕中任意一项所述的方法而制造的多核巨核细胞的血液细胞组合物。
〔11〕一种方法，是血小板的制造方法，包括工序：
通过〔1〕至〔9〕中任意一项所述的方法而获得多核巨核细胞，培养该细胞；
从所述多核巨核细胞的培养物回收血小板。
〔12〕如〔11〕所述的方法，所述的培养多核巨核细胞的工序是通过抑制抗细胞凋亡基因的强制表达或者从细胞去除所述抗细胞凋亡基因而进行的。
〔13〕如〔11〕或〔12〕所述的方法，所述的培养多核巨核细胞的工序是在没有血清和/或没有饲养细胞的条件下进行的。
〔14〕如〔11〕至〔13〕中任意一项所述的方法，所述的培养多核巨核细胞的工序进行1到15天。
〔15〕如〔11〕至〔14〕中任意一项所述的方法，所述的培养多核巨核细胞的工序在37℃下进行。
〔16〕如〔11〕至〔15〕中任意一项所述的方法，在所述的培养多核巨核细胞的工序中，在培养基中添加ROCK抑制剂和/或肌动球蛋白复合物功能抑制剂。
〔17〕如〔16〕所述的方法，所述ROCK抑制剂为Y27632，所述肌动球蛋白复合物功能抑制剂是Blebbistatin。
〔18〕根据〔11〕至〔17〕中任意一项所述的方法制造的血小板。
〔19〕包含〔18〕所述的血小板的血液制剂。
有益效果
根据本发明，能够人为地促进巨核细胞的多核化。尤其，本发明对于已知的在体外（in vitro）制备的巨核细胞，也具有促进其多核化的效果，能够获得即使与从机体能获得的巨核细胞相比多核化程度更高的巨核细胞（例如，4N以上的巨核细胞的比率较高的巨核细胞群）。
并且，根据本发明，能够显著增加从每一个多核化的巨核细胞生成的血小板的数量。
从干细胞诱导多核化前的巨核细胞，利用例如专利文献3中所记载的方法使该多核化前的巨核细胞增殖，根据本发明的方法，使该多核化前的巨核细胞进行多核化而生成血小板，由此能够飞跃性地缩短从干细胞制造血小板所需的时间，能够进行大规模制备。进一步地，可获得的血小板呈CD42b阳性，在临床应用中也将会有重大的贡献。
附图说明
图1A表示为了研究iMKPC-型I的增殖的细胞因子依赖性而进行的实验的概要说明。
图1B表示按照图1A所示的实验计划（Schedule），将SCF和TPO（S＋T）、SCF和EPO（S＋E）、SCF（S）、TPO（T）以及EPO（E）加入到培养基而培养iMKPC-型I时的、细胞数的变化。
图1C表示在图1A所示的实验计划的第8天，通过流式细胞仪分析iMKPC-型I的表面标记的表达的结果。
图1D表示在脐带血来源CD34阳性细胞中使c-MYC和BMI1强制表达，促进多核化前的巨核细胞的增殖的结果。
图2A表示调查研究细胞因子对iMKPC-型II的增殖的影响的结果。
图2B表示调查研究在iMKPC-型II中的CD41a和CD42b的表达的结果。
图3表示通过显微镜观察在iMKPC-型II中，进行BCL-XL的强制表达以及p53基因的表达抑制时的多核化、以及向培养基进一步添加Blebbistatin时的多核化的结果。
图4表示调查研究BCL-XL对iMKPC-型II的增殖的影响的结果。
图5表示ROCK抑制剂对巨核细胞多核化的影响。抑制巨核细胞中的MYC/BMI1表达后（在多西环素存在、雌二醇不存在下的培养）、添加ROCK抑制剂（Y27632）（10μM），培养7天，然后调查研究了多核化的程度。A表示将没有添加ROCK抑制剂的细胞（载体对照，vehicle）和添加的细胞（Rocki）用染色核的赫斯特进行染色后，用抗CD41a抗体染色作为巨核细胞的标记的CD41a，通过流式细胞仪进行分析的结果。B为将A结果用图表表示的图。
图6表示调查研究在39℃下培养时的、与巨核细胞的成熟相关的基因的表达量的结果。抑制巨核细胞中的MYC/BMI1的表达后，在39℃下培养5天，然后通过定量PCR（q-PCR）方法研究对巨核细胞的成熟所必需的基因组（GATA1（A）、PF4（B）、NFE2（C）、β-微管蛋白（D））的表达量。表达量表示相对于GAPDH的表达量的比率。
图7表示研究作为抗细胞凋亡基因的一种的BCL-XL对巨核细胞的多核化的影响的结果。抑制巨核细胞中的MYC/BMI1的表达，在ROCL抑制剂（10μM）的存在下，使BCL-XL表达，培养7天后，调查研究了多核化的程度。A表示对MYC/BMI1表达细胞（左图）、抑制了MYC/BMI1的表达并用ROCK抑制剂处理过的细胞（中间图）、经过MYC/BMI1表达抑制以及ROCK抑制剂处理并且使BCL-XL表达的细胞（右图），分别用染色核的赫斯特（Hoechst）进行染色后，用抗CD41a抗体染色作为巨核细胞的标记的CD41a，利用流式细胞仪分析的结果。B是将A结果用图表表示的图。并且，C为核变为2N、4N、8N以及8N以上的细胞的显微照。
图8表示BCL-XL的表达细胞的增殖曲线。根据培养天数，对抑制巨核细胞中的MYC/BMI1的表达，在ROCK抑制剂（10μM）存在下，使BCL-XL表达的细胞（CD41a＋）（■）以及没有使BCL-XL表达的细胞（CD41a＋）（▲）的细胞数的变化，用图表表示的结果。
图9表示p53的敲除对多核化的影响。抑制巨核细胞中的MYC/BMI1的表达，在ROCK抑制剂（10μM）的存在下，使BCL-XL表达，进一步地，敲除p53基因后，39℃下，培养7天，调查研究CD41a＋细胞的多核化程度。A表示将没有敲除p53的对照细胞（对照）和敲除了p53的细胞（SiP53），分别用染色核的赫斯特进行染色后，用抗CD41a抗体染色作为巨核细胞的标记的CD41a，利用流式细胞仪分析的结果。B是将A结果用图表表示的图。
图10表示丙戊酸处理对多核化的影响。抑制巨核细胞中的MYC/BMI1的表达，ROCK抑制剂存在（10μM）下，使BCL-XL表达，敲除p53基因，进一步地，用丙戊酸（0.5mM）处理，在39℃下，培养7天，然后调查研究了CD41a＋细胞的多核化程度。A表示将没有用丙戊酸处理过的细胞（Si P53）与用丙戊酸处理过的细胞（SiP53VLP），分别用染色核的赫斯特进行染色后，用抗CD41a抗体染色作为巨核细胞的标记的CD41a，利用流式细胞仪分析的结果。B是将A结果用图表表示的图。
图11表示用肌球蛋白重链IIA/B ATPase抑制剂（肌动球蛋白复合物功能抑制剂）对巨核细胞的多核化的影响。抑制巨核细胞中的MYC/BMI1的表达后（多西环素存在下，以及多西环素不存在下的培养），添加作为肌球蛋白重链IIA/B ATPase抑制剂的Blebbistatin（10μg/ml），培养7天，然后调查研究了多核化程度。A表示将没有添加Blebbistatin的细胞（－）和添加了Blebbistatin（10μg/ml）的细胞（＋），分别用染色核的赫斯特进行染色后，用抗CD41a抗体染色作为巨核细胞的标记的CD41a，利用流式细胞仪分析的结果。B是将A结果用图表表示的图。
图12表示Blebbistatin处理与其他处理同时进行时对巨核细胞的多核化的影响。抑制巨核细胞中的MYC/BMI1表达，Y27632（10μM）以及丙戊酸（0.5mM）存在下，使BCL-XL表达，敲除p53基因，进一步地，添加Blebbistatin，在39℃下，培养7天，然后调查研究了CD41a＋细胞的多核化程度。A表示将没有用Blebbistatin处理的细胞（－）和用Blebbistatin处理的细胞（＋），分别用染色核的赫斯特进行染色后，用抗CD41a抗体染色作为巨核细胞的标记的CD41a，利用流式细胞仪分析的结果。B是将A结果用图表表示的图。
图13表示Blebbistatin处理与其他处理同时进行的细胞的增殖曲线。根据培养天数，对抑制巨核细胞中的MYC/BMI1表达，Y27632（10μM）以及丙戊酸（0.5mM）存在下，使BCL-XL表达，敲除p53基因，用Blebbistatin处理的细胞（CD41a＋）（▲）和没有用Blebbistatin处理的细胞（CD41a＋）（■）的细胞数的变化，用图表来表示（A）。并且，B表示对这些细胞的显微镜照。
图14表示在血小板释放期，抑制了BCL-XL的表达时和没有抑制时，巨核细胞和血小板的CD41a和CD42b的表达的调查研究结果。
图15表示基于与图14相同的结果，计数了BCL-XL表达的ON/OFF时的细胞数的结果。A表示CD42b阳性血小板数，B表示CD41a阳性/CD42b阳性巨核细胞数，C表示CD41a阳性巨核细胞数。
图16表示在血小板释放期，抑制了BCL-XL的表达时和没有抑制时，培养温度设定为35℃、37℃、39℃，对血小板的影响的调查研究结果。
图17表示血清、饲养细胞、Blebbistatin的有无，对血小板数的影响的调查研究结果。
图18表示血清、饲养细胞、Blebbistatin的有无，对CD42b血小板的比率的影响的调查研究结果。
图19表示巨核细胞的多核化工序（MCB expansion）和血小板释放期（Platelet production）的适宜的培养条件的一种示例。
图20表示通过抑制BCL-XL的表达而提高CD42b血小板的比率，通过从培养基去除血清以及饲养细胞，加入Blebbistatin而进一步提高CD42b血小板的比率。
图21表示对于CD42b的功能抑制性载体HIP1对末梢血血小板的瑞斯托菌素凝集效果的影响的调查研究结果。
图22表示对于CD42b的功能抑制性载体HIP1对体内的血栓形成的影响的调查研究结果。
图23表示将通过加入ADAM17抑制剂KP-457（S-45457）而产生的、提高了GPIba（CD42b）的表达量的iPS细胞来源血小板、以及没有加入ADAM17抑制剂而产生的iPS细胞来源血小板，分别输血于NOG小鼠，测定参与血栓形成的血小板的数的结果。
图24表示将在KP-457存在下加入血小板损伤剂CCCP100μM而使人类末梢血血小板假劣化的血小板、在KP-457不存在下加入CCCP的血小板、新鲜血小板，分别进行输血，测定参与血栓形成的血小板的数的结果。
具体实施方式
（多核巨核细胞的制造方法）
本发明提供通过促进巨核细胞的多核化，制备多核化的巨核细胞的方法。
本发明所涉及的多核巨核细胞（polynucleated megakaryocytic cell）的制造方法的一种方式，包括在多核化前的巨核细胞中使抗细胞凋亡基因强制表达，培养该细胞的工序。
在本发明中对于“多核化前的巨核细胞”没有特别限制，可以是从脐带血或骨髓细胞获得的尚未进行多核化的巨核细胞，并且，也可以是从来源于ES细胞、iPS细胞；脐带血、骨髓血或外周血的、造血干细胞以及前体细胞等细胞分化诱导的尚未进行多核化的巨核细胞。
并且，本发明的“多核化前的巨核细胞”还包括例如表征为CD41a阳性/CD42a阳性/CD42b阳性的细胞。
“多核巨核细胞”或“多核化的巨核细胞”，是指与“多核化前的巨核细胞”相比，核的数量相对增加的细胞或细胞组。例如，适用本发明的方法的巨核细胞的核为2N时，4N以上的细胞成为“多核巨核细胞”或“多核化的巨核细胞”。即使是多核化前的巨核细胞，核的数量也不限于一个。并且，细胞组中，经过一定天数后，在整个该细胞组中的核的数量有意（significantly）增加时，有时将经过该天数之前的细胞组称为多核化前的巨核细胞，有时还将经过该天数后的细胞组称为多核化的巨核细胞。
本发明也可以适用于从来源于多功能干细胞（ES细胞、iPS细胞等）；脐带血、骨髓血或末梢血的造血干细胞以及前体细胞等细胞分化诱导的多核化前的巨核细胞。例如，优选从ES细胞或iPS细胞制备的网状结构物（又称为ES-sac或iPS-sac）获得的巨核细胞。在此，从ES细胞或iPS细胞制备的“网状结构物”，是指来源于ES细胞或iPS细胞的立体囊状（伴随内部空间）结构物，由内皮细胞群等形成，内部包含造血前体细胞（参照专利文献1、专利文献2以及非专利文献2）。
对于本发明中所使用的ES细胞，没有特别限制，一般可以使用将囊胚期的受精卵与饲养细胞一起培养，分开增殖的内细胞团来源的细胞，进一步地反复进行继代培养操作，最终作为ES细胞株建立细胞。
并且，使用的iPS细胞时，只要是通过向体细胞（例如，纤维母细胞或血液细胞等）导入赋予分化多功能性的多种转录因子（以下，在此称为“分化多功能因子”）基因而获得了与ES细胞同样的分化多功能性的细胞，则可以是任何来源的细胞。作为分化多功能因子，已经报道有多种因子，在使用上没有限制，但是例如可以举出：Oct家族（例如，Oct3/4）、SOX家族（例如，SOX2、SOX1、SOX3、SOX15以及SOX17等）、Klf家族（例如，Klf4、Klf2等）、MYC家族（例如，c-MYC、N-MYC、L-MYC等）、NANOG、LIN28等。
本发明的发明者们报道过关于在从多功能干细胞诱导的多核化前的巨核细胞（包括在专利文献3中记载为“巨核前体细胞”的细胞）中使MYC等癌基因和BMI1等基因等强制表达，增加该巨核细胞的增殖能力（专利文献3，JEM,207:2817-28302010）。
根据该方法制备的多核化前的巨核细胞可以适用于本发明的方法。
因此，在本发明所涉及的多核巨核细胞的制造方法中，将通过以下工序获得的细胞可以作为多核化前的巨核细胞使用：在从造血前体细胞到多核化前的巨核细胞的任意分化阶段，在该细胞中使癌基因与以下（i）至（iii）中的任意基因强制表达，培养该细胞并使其增殖，
（i）抑制p16基因或者p19基因表达的基因；
（ii）抑制Ink4a/Arf基因表达的基因；以及
（iii）多梳基因。
作为癌基因，例如可以举出MYC家族基因、Src家族基因、Ras家族基因、Raf家族基因、c-Kit或PDGFR、Abl等蛋白激酶家族基因等。并且，作为（i）至（iii）基因，例如可以举出BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3b等，但是特别优选BMI1基因。癌基因以及细胞凋亡基因的表达调控可以根据本领域技术人员的通常的方法而进行，例如可以使用专利文献3等中详细记载的方法。癌基因以及（i）至（iii）基因在从造血前体细胞向多核化前的巨核细胞分化的任意阶段导入到细胞即可。无论使用哪一种方法，只要在本发明所使用的多核化前的巨核细胞中能够使这些基因的表达被诱导即可。
本发明中所使用的癌基因以及（i）至（iii）基因（例如，BMI1基因）不言而喻包括其cDNA序列已经被公开的基因，而且还包含基于这些公知的cDNA序列的同源性而根据现有技术鉴定的同源物（homolog）。
例如，在MYC家族基因中c-MYC基因是指例如由序列标识符1表示的核酸序列构成的基因。并且，c-MYC基因的同源物，是指其cDNA序列例如由与序列标识符1表示的核酸序列实质上相同的序列构成的基因。由与序列标识符1表示的核酸序列实质上相同的序列构成的cDNA，是指与由序列标识符1表示的序列构成的DNA具有约60%以上，优选约70%以上，更优选约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最为优选约99%的一致性的序列构成的DNA，或者是可以在严格条件下与由与序列标识符1表示的核酸序列互补的序列构成的DNA杂交的DNA，由这些DNA编码的蛋白质是对多核化前的巨核细胞等分化阶段的细胞的扩增起作用的物质。
BMI1基因是指例如由序列标识符2表示的核酸序列构成的基因。并且，BMI1基因的同源物，是指其cDNA序列例如由与序列标识符2表示的核酸序列实质上相同的序列构成的基因。由与序列标识符2表示的核酸序列实质上相同的序列构成的cDNA，是指与由序列标识符2表示的序列构成的DNA具有约60%以上，优选约70%以上，更优选约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最为优选约99%的一致性的序列构成的DNA，或者是可以在严格条件下与由与序列标识符2表示的核酸序列互补的序列构成的DNA杂交的DNA，由其DNA编码的蛋白质是抑制在表达MYC家族基因等癌基因的细胞内出现的癌基因诱导性细胞衰老，促进该细胞的扩增的物质。
虽然上述癌基因以及（i）至（iii）基因是在细胞增殖中所必需的，但是因为会抑制多核化的促进以及血小板的释放等，所以也可以在进入多核化工序之前将这些基因的表达进行抑制。通过抑制细胞内的这些基因的表达，使功能性血小板更加容易释放（专利文献3）。
在本说明书中，“抗细胞凋亡基因”是指只要是抑制细胞凋亡的基因，没有特别限制，例如可以举出BCL2基因、BCL-XL基因、Survivin、MCL1等。
本发明的发明者们发现如果抑制上述癌基因以及（i）至（iii）基因的强制表达，则会诱导被增殖的多核化前的巨核细胞的细胞死亡。如后述的实施例所示，对多核化前的巨核细胞中的癌基因以及（i）至（iii）基因的表达进行抑制，同时使抗细胞凋亡基因在该细胞中强制表达，由此促进该巨核细胞的多核化，其结果，能够从多核化前的巨核细胞有效地生成血小板。
如后述的实施例所示，通过使抗细胞凋亡基因强制表达，从而巨核细胞长期继续增殖。
本发明中所使用的BCL-XL基因、BCL2基因等抑制细胞凋亡的基因不言而喻包括其cDNA序列已经被公开的基因，而且还包含基于这些公知的cDNA序列的同源性而根据现有技术鉴定的同源物。例如，作为抑制细胞凋亡的一种基因的BCL-XL基因，是指由序列标识符3表示的核酸序列构成的基因。并且，BCL-XL基因的同源物，是指其cDNA序列例如由与序列标识符3表示的核酸序列实质上相同的序列构成的基因。由与序列标识符3表示的核酸序列实质上相同的序列构成的cDNA，是指与由序列标识符3表示的序列构成的DNA具有约60%以上，优选约70%以上，更优选约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最为优选约99%的一致性的序列构成的DNA，或者是可以在严格条件下与由与序列标识符3表示的核酸序列互补的序列构成的DNA杂交的DNA，由其DNA编码的蛋白质是具有抑制细胞凋亡效果的物质。
在此，严格条件是指本领域技术人员容易决定的杂交条件，一般是基于探针长度、洗脱温度以及盐浓度的经验实验条件。一般，如果探针长，则适宜的退火温度会上升；如果探针短，则温度会降低。杂交物的形成一般依赖于互补链在略低于其熔点的环境中的再退火能力。
例如作为低严格条件，可以举出在杂交后的过滤器的洗脱阶段，在37℃～42℃的温度条件下，于0.1×SSC、0.1%SDS溶液中洗脱等。并且，作为高严格条件，例如可以举出在洗脱阶段，在65℃温度下，于5×SSC以及0.1%SDS中洗脱等。通过进一步提高严格条件，能够得到同源性高的多核苷酸。
在使癌基因、（i）至（iii）基因、抗细胞凋亡基因等基因在细胞内强制表达时，虽然可以根据本领域技术人员所公知的任何方法实施，但是例如可以利用介由慢病毒或逆转录病毒等的基因导入系统将基因导入到细胞内，使其表达。当介由病毒基因导入载体进行基因表达时，可以在适宜的启动子的下游可发挥作用地连接该基因，将其插入到基因导入载体，然后导入到细胞内，使目的基因表达。在此，“可发挥作用”地连接，是指将启动子和目的基因连接，以根据该启动子而顺式调控目的基因而实现目的基因的期望的表达。在本发明的实施中，例如可以使用CMV启动子、EF1启动子等而组成性表达目的基因，或者还可以在由四环素等药物响应因素等反式因子而活性被调控的因素的作用下，设置适宜的启动子（诱导型启动子），例如通过药物添加等调控而诱导性表达目的基因。对于这种基于药物的基因表达系统而言，为了实现癌基因或（i）至（iii）基因的期望的表达调控，本领域技术人员可以容易地选择合适的系统。为了进行这种表达，还可以使用市场上销售的试剂盒等。并且，可以将作为表达调控的目的基因的癌基因和（i）至（iii）基因分别插入到不同的载体，也可以插入到同一个的载体。
并且，巨核细胞内的癌基因或（i）至（iii）基因的表达的抑制，例如，可以通过以下的方法实现：通过去除药物等而解除诱导，由此抑制由前述的诱导性表达系统诱导的表达。或者，还可以通过使用Cre/Lox系统等而去除导入的癌基因或（i）至（iii）基因，抑制性调控这些基因的表达。为了抑制性调控癌基因或者（i）至（iii）基因的表达，也可以使用适宜的市场上销售的试剂盒等。
本发明所涉及的多核巨核细胞的制造方法的一种方式，包括在使抗细胞凋亡基因强制表达的细胞中，同时进行抑制p53基因产物的表达或功能的工序。在此，表达是指以包含转录以及翻译的概念使用，称为抑制表达时，可以包含转录水平上的抑制，也可以包含翻译水平上的抑制。
p53基因产物作为癌抑制基因而被广为人知，各种动物种的基因序列等也已是公知的。
抑制巨核细胞内的p53基因产物的功能的方法可以根据本领域的普通技术而实现。作为该方法，例如可以举出：通过在p53基因中导入突变（取代、添加或缺失，或者改变或修饰），抑制该基因产物的生成的方法；直接抑制该基因产物的功能的方法等。作为在基因中导入突变（取代、添加或缺失，或者改变或修饰）的方法，可以举出：利用适宜的基因打靶载体而将整个p53基因通过同源重组进行破坏的方法；利用Cre/lox等系统而向对于该基因产物的活性重要的区域导入突变的方法。
并且，作为抑制p53基因产物的功能的方法还可以使用显性负性突变技术。显性负性突变技术，是指导入突变而使降低或丧失了活性的p53蛋白在细胞内大量表达，使细胞内不活性的p53蛋白的比率压倒性地高于正常的p53蛋白，其结果，获得表现为不能得到p53蛋白的功能的行为的细胞的方法。
作为抑制p53基因产物的表达的方法，可以使用反义技术、核酶技术、RNAi技术等。
反义技术，是利用具有与靶基因（基本上是转录产物的mRNA）相互补的碱基序列，一般长度为10个碱基～100个碱基、优选为15个碱基～30个碱基的单链核酸，抑制基因表达的方法。通过将反义核酸导入到细胞内，与靶标基因杂交，由此使基因表达得到抑制。对于反义核酸而言，只要能获得对靶基因的表达抑制效果，可以是不完全与靶基因互补的核酸。对于反义核酸而言，本领域技术人员可以利用公知的软件等而适宜设计。反义核酸可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体中的任意个，并且也可以被修饰。
核酶是将靶标RNA进行催化水解的核酸分子，由具有与靶标RNA相互补的序列的反义区域以及承担切割反应的催化中心区域构成。对于核酶而言，本领域的技术人员可以根据公知的方法而适宜设计。核酶一般是RNA分子，但是也可以使用DNA-RNA嵌合分子。
RNAi技术，是由双链核酸诱导的序列特异性基因表达抑制机制。因为是目标特异性非常高，且利用原本在机体内存在的基因表达抑制机制的方法，因此安全性高。
作为具有RNAi效应的双链核酸，例如可以举出siRNA。siRNA是当用在哺乳动物细胞时，通常为19～30个碱基左右、优选为21～25个碱基左右的双链RNA。具有RNAi效应的双链核酸一般在其一侧具有与部分目标核酸互补的碱基序列，另一侧具有与其互补的序列。
具有RNAi效应的双链核酸可以基于靶基因的碱基序列，根据公知的方法而设计。并且，具有RNAi效应的双链核酸可以是双链RNA，可以是DNA-RNA嵌合双链核酸，也可以是人工核酸或者经过各种修饰的核酸。
siRNA、反义核酸、核酶可以通过将分别编码这些核酸的载体（例如，慢病毒载体）导入到细胞内，使其在细胞内表达。siRNA可以使用分别编码双链的DNA，也可以使用编码通过环介导而连接形成双链核酸的单链核酸的DNA。如果是后者，通过在细胞内转录而获得的单链RNA其互补的部分在分子内杂交，呈发夹（Hairpin）结构。该RNA称为shRNA（shorthairpin RNA：短发夹RNA）。shRNA如果转移到细胞质，则环部分因酶（Dicer）而被切割，成为双链RNA，引起RNAi效应。
除此以外，作为抑制巨核细胞内的p53基因产物的功能的方法，还可以是直接或间接地抑制p53基因产物的功能的方法、通过抑制p53的磷酸化而间接地抑制p53的活化的方法等。
如后述的实施例所示，虽然对抗细胞凋亡基因的强制表达、以及p53基因产物的表达或功能进行抑制之前的巨核细胞可以继续增殖，但是细胞因子依赖性（cytokine dependency）为SCF，释放出的血小板中还存在非CD42b阳性的血小板。如果对抗细胞凋亡基因的强制表达、以及p53基因产物的表达或功能进行抑制，则巨核细胞此后会仍然增殖的同时一部分进行多核化，会大量释放出CD42b阳性的血小板。在该阶段，巨核细胞的细胞因子依赖性从SCF变为TPO，增殖与成熟并行。
本发明所涉及的多核巨核细胞的制造方法的一种方式，包括对使抗细胞凋亡基因强制表达而在培养的细胞，进行处理的以下工序中的至少一个工序：（a）用肌动球蛋白复合物功能抑制剂进行处理；（b）用ROCK抑制剂进行处理；（c）用HDAC抑制剂进行处理。通过这些处理，会更加稳定地进行增殖以及多核化。
在此，肌动球蛋白复合物是指肌动蛋白与肌球蛋白II的复合物，例如构成细胞质分裂时出现的收缩环等。在肌动球蛋白复合物中，肌球蛋白II与肌动蛋白相作用的同时，还起马达蛋白的作用，参与收缩环的收缩运动等。本发明的“肌动球蛋白复合物功能抑制剂”可以是通过任何机制抑制其功能的物质，例如包括：通过抑制肌动球蛋白复合物的形成而抑制肌动球蛋白复合物的功能的物质、伴随肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MHC）IIA/B ATPase的抑制而抑制肌动球蛋白复合物的功能的物质、伴随肌球蛋白轻链激酶抑制剂（Myosin light chain kinase，MLCK）的抑制而抑制肌动球蛋白复合物的功能的物质等。肌球蛋白重链IIA/B ATPase是在细胞质分裂时对收缩环的收缩运动起着重要的作用的分子，而肌球蛋白轻链激酶使肌球蛋白轻链中的L2磷酸化而诱导肌动蛋白与肌球蛋白间的滑动。
迄今为止，报道有ROCK抑制剂抑制巨核细胞的核内分裂，促进多核化，但是，对于调控肌动球蛋白复合物的形成或功能的肌球蛋白重链IIA/B ATPase或肌球蛋白轻链激酶而言，在ROCK信号下游起作用，通过调节肌动球蛋白复合物的形成或功能，更加直接地调控收缩环的收缩运动。因此，认为肌动球蛋白复合物功能抑制剂，是相比于ROCK抑制剂，更加有效地抑制巨核细胞的核内分裂，更进一步促进多核化的物质。
本发明中可使用的肌动球蛋白复合物功能抑制剂，可以举出作为肌球蛋白重链IIA/B ATPase抑制剂的、布雷他汀（Blebbistatin；科学杂志（Science）,299:1743-17472003）。并且，可以举出作为肌球蛋白轻链激酶抑制剂的、ML7等。另外，作为肌球蛋白重链IIA/B ATPase抑制剂或肌球蛋白轻链激酶抑制剂，还可以使用抑制肌球蛋白重链IIA/B ATPase或肌球蛋白轻链激酶的活性的核酸（例如，shRNA等）或抗体等。
另外，在本说明书中，“处理”是指进行操作以在对象细胞中使抑制剂等发挥效果，例如在细胞的培养液中添加适量的抑制剂等，放置在如吸收进到细胞内的状态。根据情况，也可以同时进行如促进向细胞的吸收的操作。
本发明所涉及的巨核细胞的制造方法的一种方式，包括工序：对使抗细胞凋亡基因强制表达而在培养的细胞，用Rock抑制剂进行处理。
作为ROCK（Rho相关的卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho-associatedcoiled-coil forming kinase）/Rho结合激酶）抑制剂，例如可以举出反式-4-[(R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐（(R)-(+)-trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide·2HCl·H2O）（Y27632）等。根据情况如抑制Rho激酶活性的抗体或者核酸（例如，shRNA等）也可以作为ROCK抑制剂使用。
本发明所涉及的巨核细胞的制造方法的一种方式，包括工序：对使抗细胞凋亡基因强制表达而在培养的细胞，用HDAC抑制剂进行处理。
HDAC抑制剂具有抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）活性的作用。至今已经得知有多种HDAC抑制剂，例如可以举出丙戊酸、曲古抑菌素A（Trichostatin A）、SAHA（辛二酰苯胺异羟肟酸（Suberoylanilidehydroxamic acid））、APHA（芳酰基吡咯基羟基酰胺（Aroyl pyrrolyl hydroxyamide））等，尤其可以适合使用丙戊酸、曲古抑菌素A。如果使用药物具有盐形式，也可以以盐形式使用。
对于用肌动球蛋白复合物功能抑制剂、ROCK抑制剂、HDAC抑制剂等处理细胞时的最适浓度等而言，只要是本领域技术人员，能够通过预实验而事先决定。并且，对于处理的天数或方法等，本领域技术人员也能够适宜选择。例如，用肌球蛋白重链II ATPase抑制剂的、Blebbistatin进行处理时，向培养液中添加2～15μg/ml、或者5～10μg/ml左右，作为培养天数例如为5～10天左右，尤其优选为6～7天左右。并且，对于作为ROCK抑制剂的Y27632而言，可以使用5～15μM、或者8～12μM、优选10μM左右；而作为HDAC抑制剂的丙戊酸而言，可以使用0.1～1mM、或者0.2～0.7mM、优选0.5mM左右。作为Y27632、丙戊酸的处理时间，可以为10～21天，优选为14天左右。
本发明所涉及的多核巨核细胞的制造方法的一种方式，包括将使抗细胞凋亡基因强制表达而在培养的细胞放置于37℃以上的温度。
并且，确认出通过在通常的37℃以上的温度下培养巨核细胞，促进多核化的巨核细胞的分化。在此，37℃以上的温度，是指不损伤细胞的程度的温度为适宜，因此例如约37℃～约42℃左右、优选约37℃～约39℃左右。并且，对于37℃以上的温度下的培养天数而言，实时观察多核化的巨核细胞的数量等而适宜决定，例如10天～28天，优选14天～21天左右。
对于在多核化前的巨核细胞中使抗细胞凋亡基因强制表达而进行培养的工序的其他培养条件等，只要适宜获得本发明的效果，没有特别限制，可以使用公知的培养条件或依照该条件的条件。例如，TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3配体、肝素（Heparin）等的任意个或者也可以从中组合两个以上而添加到培养基。
并且，也可以使用适宜的饲养细胞而进行培养。
通过上述的方法获得的多核化的巨核细胞有效地产生CD42b阳性的功能性血小板。如实施例所示，CD42b阳性的血小板在体内（in vivo）以及体外（in vitro），具有高的血栓形成能力。并且，多核化的巨核细胞即使冷冻保存后解冻，也能产生功能性血小板。
本发明还提供多核巨核细胞的含有率高的血液细胞组合物。在此，“血液细胞组合物”中除了包括通过本发明的方法而被促进了多核化的“多核巨核细胞”以外，还可以包括通过其他方法制备的巨核细胞、或者其他血液细胞。
根据本发明的方法而处理多核化前的巨核细胞，则能够促进向4N以上的多核巨核细胞的分化。为此，例如通过对从多功能干细胞等分化的巨核细胞群，适用本发明的方法，能够获得4N以上的多核巨核细胞的含有率高的血液细胞组合物。如果用本发明的方法处理巨核细胞群，则能够将4N以上的多核巨核细胞的含有率增加到至少20%以上、30%以上，优选40%以上、50%以上，更为优选80%以上（例如，参照图11B）。因此，根据本发明的方法，可以制备多核巨核细胞的存在比率高的巨核细胞群或者血液细胞群。
这种血液细胞组合物也能够冷冻保存。因此，也可以以冷冻保存的状态流通，由使用者进行后述的血小板的制造方法。
对于采用本发明的方法处理而被促进了多核化的巨核细胞等而言，通过适宜的方法移植到机体内，在机体内产生功能性血小板，也是有效的。
目前，作为造血干细胞的移植方法，采用骨髓移植、脐带血移植等，尤其脐带血移植而言，可以减轻骨髓移植中存在的捐赠者的人数不足、捐赠者的负担大的问题，因此近年来脐带血移植的机会逐渐地增加。然而，通过脐带血移植而机体内产生的巨核细胞，多核化程度低，在机体内产生充足的血小板为止需要时间，当急需提高血小板的产生能力时，如果只采用脐带血移植，则会处于难以充分地满足所需的量的状况。
根据本发明而获得的多核巨核细胞等的移植能够解决在骨髓移植中存在的捐赠者的人数不足以及捐赠者的负担的问题、在脐带血移植中存在的机体内的血小板产生能力的问题，因此可以说是与现有的移植方法比非常优异的方法。
（血小板的制造方法）
另一方面，本发明所涉及的血小板的制造方法，是在机体外（in vitro）从通过本发明的方法获得的多核巨核细胞等产生血小板的方法。
本发明所涉及的血小板的制造方法包括工序：培养通过上述的方法而获得的多核化的巨核细胞，从培养物回收血小板。
对于培养条件不做限定，但是例如可以在TPO（10～200ng/mL、优选50～100ng/mL左右）的存在下；或者，TPO（10～200ng/mL、优选50～100ng/mL左右）、SCF（10～200ng/mL、优选50ng/mL左右）以及肝素（Heparin）（10～100U/mL、优选25U/ml左右）的存在下，培养7～15天左右。
本发明所涉及的血小板的制造方法的一种方式，在多核巨核细胞的培养工序中，抑制上述细胞凋亡基因的强制表达，或者从多核巨核细胞去除上述抗细胞凋亡基因。
抗细胞凋亡基因的表达的抑制，例如，可以通过去除药物等而解除由前述的诱导性表达系统诱导的表达，由此达到抑制表达的目的。或者，还可以通过使用Cre/Lox系统等而去除导入的抗细胞凋亡基因，抑制性调控这些基因的表达。为了抑制性调节抗细胞凋亡基因的表达，也可以使用适宜的市场上销售的试剂盒等。
如后述的实施例所示，如果抑制为了促进多核化而强制表达的抗细胞凋亡基因的表达，则CD41a阳性／CD42b阳性的功能性血小板的产生效率就会提高。
抗细胞凋亡基因的表达抑制或去除，从血小板回收前的15天前、优选10天前、更优选3天～7天前、进一步优选约3天前开始进行。
更加具体而言，在该工序中，不仅抑制外源性的抗细胞凋亡基因，而且还可以抑制内源性的抗细胞凋亡基因的表达。并且，在本工序中，还可以继续进行对p53基因产物的表达或功能的抑制。
对于培养温度而言，只要获得本发明的效果，则没有特别限制，虽然可以在35℃～40℃下进行，但是如实施例所示，37℃～39℃为适宜。
本发明所涉及的制造方法中，也可以在无血清和/或无饲养细胞的条件下，进行多核巨核细胞的培养工序。如实施例所示，本发明所涉及的方法中，将小牛血清添加到培养基时、以及采用无血清培养基进行培养时，虽然没有观察到血小板的产生量之间存在大的差异，但是采用无血清培养基或无饲养细胞培养基进行培养时，CD42b阳性血小板的比率更高。如果能在无血清且无饲养细胞下进行血小板产生工序，则当获得的血小板用于临床时，不容易发生免疫原性问题。
并且，如果不使用饲养细胞而能产生血小板，则没有必要粘附饲养细胞，因此可以用烧瓶等进行悬浮培养，从而能够抑制制造成本，同时适合大规模生产。另外，不使用饲养细胞时，可以使用条件培养基（conditioned medium）。对于条件培养基（conditioned medium）不做特别限定，本领域技术人员可以根据公知的方法等而进行制备，但是可以通过适宜培养饲养细胞，采用过滤器从培养物去除饲养细胞而获得。
本发明所涉及的血小板的制造方法的一种方式，向培养基加入ROCK抑制剂和/或肌动球蛋白复合物功能抑制剂。作为ROCK抑制剂以及肌动球蛋白复合物功能抑制剂，可以使用与上述的多核巨核细胞的制造方法中所使用的抑制剂相同的物质。作为ROCK抑制剂，例如可以举出Y27632。作为肌动球蛋白复合物功能抑制剂，可以举出作为肌球蛋白重链II ATPase抑制剂的、Blebbistatin。可以单独加入ROCK抑制剂，也可以单独加入ROCK抑制剂以及肌动球蛋白复合物功能抑制剂，还可以组合加入这些抑制剂。
ROCK抑制剂和/或肌动球蛋白复合物功能抑制剂优选加入0.1μM～30μM，例如也可以是0.5μM～25μM、5μM～20μM等。
从加入ROCK抑制剂和/或肌动球蛋白复合物功能抑制剂后的培养天数可以是1天～15天，也可以是3天、5天、7天等。通过加入ROCK抑制剂和/或肌动球蛋白复合物功能抑制剂，能够进一步增加CD42b阳性血小板的比率。
本发明的实施方式中，包括用于促进巨核细胞的多核化，制造成熟巨核细胞和/或血小板的试剂盒。该试剂盒中除了包含癌基因、上述（i）～（iii）基因、BCL-XL基因等细胞内表达所需的表达载体等以及试剂等以外，还包含用于细胞培养的培养基、血清、增殖因子等添加因子（supplement，例如，TPO、EPO、SCF、肝素、IL-6、IL-11等）、抗菌剂等。另外，例如使用ES细胞或iPS细胞来源的细胞时，还包含用于鉴定从这些细胞制备的网状结构物的标记确认用的抗体（例如，针对Flk1、CD31、CD34、UEA-凝集素等的抗体）。试剂盒中所包含的试剂、抗体等可以装在如使组成成分长期有效地维持活性，不会根据容器的材料而吸附，不会发生变质的、任意种类的容器中。
进一步地，本发明的试剂盒中也可以包含有使癌基因以及上述（i）～（iii）基因强制表达的多核化前的巨核细胞。
本说明书中所记载的“细胞”的来源，是人类以及非人类动物（例如，小鼠、大鼠、牛、马、猪、绵羊、猴、狗、猫、鸡等），没有特别限制。但是，尤其优选人类来源的细胞。
以下，举出实施例，进行更加详细的说明，但是本发明不受实施例的任何限制。
实施例
1.多核化前的巨核细胞的制备
1-1.从ES细胞制备多核化前的巨核细胞
为了研究巨核细胞的多核化，从ES细胞制备了进行多核化前的巨核细胞（详细内容参照专利文献3。）。
将人类ES细胞株〔KhES-3〕在20ng/ml的VEGF存在下培养14天，制备网状结构物，回收从该网状结构物取出的造血前体细胞，在10T1/2细胞上种植以达到细胞数1×105/孔。
向如此制备的造血前体细胞以MOI＝10（通过Jurkat细胞确认）每隔12小时感染三次整合了c-MYC-2A-BMI1的pMx tet off c-MYC2A BMI1逆转录病毒载体，进行c-MYC和BMI1表达的诱导（专利文献3）。pMx tet off c-MYC2A BMI1载体在雌二醇存在下，使c-MYC基因以及BMI1基因表达，而在多西环素（Dox）存在且雌二醇不存在下，则抑制c-MYC基因以及BMI1基因的表达。
与第一次感染同时添加2mM雌二醇，并且，从最后一次感染12小时后去除病毒。在该时期，即使关闭(off)c-MYC基因或BMI1基因的表达，CD42b阳性血小板释放得少，认为是未成熟的巨核细胞。下面有时将该细胞称为“iMKPC-型I”。
为了调查研究iMKPC-型I的细胞因子依赖性，在10T1/2饲养细胞上接种2x105个iMKPC-型I，在2uMβ-雌二醇（β-estradiol）存在下，在37℃，使用SCF(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)、EPO(6U/ml)的细胞因子，在图1A示出的条件下培养14天。在第4天、第11天，对被确认出增殖的组测定细胞数，以2×105个进行再接种，除此以外更换培养基。在第8天、第14天，测定细胞数，以2×105个进行再接种，同时在第8天，将部分细胞使用CD41抗体、CD42b抗体以及GPA抗体进行染色，利用流式细胞仪进行分析。
结果示出在图1B以及C。如图1B所示，iMKPC-型I的增殖高度依赖于SCF。并且，如图1C所示，虽然所有的组几乎为CD41阳性，但去除了SCF的组中，CD41+/CD42b-组的增殖极其低下。CD41+/CD42b-组在iMKPC-型I中也是增殖良好的群体。
iMKPC-型I为SCF依赖性，从这一点也暗示着iMKPC-型I是未成熟的巨核细胞。
1-2.从脐带血来源CD34阳性细胞制备多核前的巨核细胞
确认出也能从脐带血来源CD34阳性细胞通过与ES细胞或iPS细胞同样的方法制备多核化前的巨核细胞。
具体而言，向脐带血来源CD34阳性细胞以MOI10感染三次pMx-c-MYC和DNsam BMI1病毒（均为逆转录病毒载体），然后对第14天以及第21天的细胞利用FACS计数了CD41a（巨核细胞标记）阳性细胞。作为对照，使用了Mock（空白载体（Empty vector））。
结果示出在图1D。与Mock对比，使c-MYC以及BMI1强制表达的组中，观察到CD41阳性巨核细胞的增殖，确认出也能从脐带血来源细胞通过与1-1.同样的方法获得多核化前的巨核细胞。
2.从多核化前的巨核细胞制备多核巨核细胞
2-1.BCL-XL表达对多核化的影响
在1-1.中，整合了c-MYC-2A-BMI1的pMx tet off c-MYC2A BMI1逆转录病毒载体感染后第23天，以MOI10感染一次多西环素诱导性的Lv-BCL-XL-GFP（慢病毒载体）。该载体是如下制备的：向用EcoRI、BamHI处理过的Ai-Lv tet on载体（clontech公司），利用In-Fusion advance PCR cloningkit（clontech公司），导入通过PCR扩增的BCL-XL的cDNA，由此进行制备。从感染24小时后，去除病毒。去除雌二醇，加入多西环素，抑制c-MYC和BMI1的表达，同时开始BCL-XL的表达。
2-2.p53基因的敲除对多核化的影响
使多西环素诱导性的Lv-BCL-XL-GFP慢病毒载体感染外，又使FG12-shp53慢病毒载体感染，敲除p52基因。下面有时将该细胞称为“iMKPC-型II”。
2-3.iMKPC-型II的细胞因子依赖性
在10T1/2饲养细胞接种2×105个iMKPC-型II，在Dox0.5μg/ml存在下，在39℃，SCF(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)、EPO(6U/ml)的细胞因子条件下，培养21天。结果示出在图2A。确认出iMKPC-型II株虽然在细胞因子不存在下也进行增殖，但因TPO的添加而增殖被进一步促进。iMKPC-型I是SCF依赖性，TPO与增殖无关，但是型II在TPO存在下增殖被促进，SCF与增殖无关。
2-4.iMKPC-型II的表面标记的分析
添加细胞因子后第21天，将细胞使用CD41抗体、CD42b抗体以及GPA抗体进行染色，用流式细胞仪进行分析。结果示出在图2B。添加了TPO的组与其他组相比，CD41a以及CD42b的表达更高。被认为是更加定向（commit）于巨核细胞的群体。
2-5.形态学变化以及Blebbistatin的影响
将通过显微镜观察iMKPC-型I以及型II的结果示出在图3。通过关闭(off)c-MYC和BMI1的表达，使BCL-XL强制表达的同时敲除p53，由此能够观察到向多核化发展。并且，确认出如果添加Blebbistatin（5μg/ml），则会进一步向多核化发展。
如2-3.～2-5.所示，在iMKPC-型II阶段，巨核细胞增殖的同时，释放的血小板中CD42b阳性的比率变高，一部分向多核化发展而细胞因子依赖性变为TPO，因此被认为增殖与成熟在并行。
2-6.BCL-XL表达抑制的影响
在10T1/2饲养细胞接种2×105个iMKPC-型II，在Dox0.5μg/ml存在下（BCL-XL ON）或不存在下（BCL-XL OFF），在39℃下，长期培养。2天～5天一次测定细胞数，再接种2×105个。
结果示出在图4。如果通过Dox OFF抑制BCL-XL的表达，则iMKPC-型II的增殖速度变得低下，经过长时间后（100天以后，）失去了增殖能力。得知BCL-XL对iMKPC-型II的长期增殖是必需的。
2-7.其他处理对多核化的影响的研究
2-7-1.ROCK抑制剂的影响
导入MYC以及BMI1基因后，在多西环素不存在以及雌二醇存在下，培养条件37℃、5％CO2存在下，将巨核细胞（105左右）培养30天左右，增殖达到1011个左右。为了抑制增殖的巨核细胞株中的MYC基因以及BMI1基因的表达，将条件改为多西环素存在，而雌二醇不存在，为了观察ROCK抑制剂（Y27632；和光纯药）对多核化的影响，向培养液添加Y27632达到10μM，进一步继续培养。从添加Y27632而培养第7天时，利用FACS调查研究了多核化程度（图5）。添加了ROCK抑制剂的细胞（图5的上图（Rocki）、下图中白色）与没有添加的细胞（图5的上图（载体对照，vehicle）、下图中黑色）比较，增加了4N以上的细胞数。从这一点明确了ROCK抑制剂对从ES细胞诱导、且通过c-MYC基因以及BMI1基因的表达而获得了增殖能力的多核化前的巨核细胞，促进多核化。
2-7-2.ROCK抑制剂+高温条件下的培养的影响
迄今为止，报道有如果将未成熟巨核细胞在比通常的培养温度高的温度如39℃下培养，则多核化、前血小板（proplatelet）形成等巨核细胞的成熟会得到促进（非专利文献5）。为了在从ES细胞诱导的多核化前的巨核细胞中确认这一点，通过定量PCT，研究了被认为是随巨核细胞的成熟而表达量上升的基因（GATA1、PF4、NFE2以及β-微管蛋白）的表达量。
促进了多核化前的巨核细胞的增殖。为了抑制获得的多核化前的巨核细胞中的MYC基因以及BMI1基因的表达，将条件改为多西环素存在，而雌二醇不存在，培养温度为39℃，培养5天后，通过定量PCR法，测定各种基因的表达量（图6）。其结果得知，与在37℃下培养时相比，在39℃下培养时成为巨核细胞的成熟的指标的基因的表达更加上升。
2-7-3.ROCK抑制剂+BCL-XL基因强制表达的影响
抑制多核化前的巨核细胞中的MYC/BMI1的表达的同时在多西环素存在下向细胞内导入了与2-1.相同地使BCL-XL表达的逆转录病毒载体。
调查研究了BCL-XL基因的表达与否对由ROCK抑制剂诱导的巨核前体细胞的多核化引起什么样的影响（图7）。
在10μM的Y27632存在下，抑制MYC／BMI1的表达，且使BCL-XL表达，培养7天后，研究了多核化的程度（倍体检测，ploidy assay）。能够确认BCL-XL表达细胞株（图7B，斜线柱）与未表达BCL-XL的细胞株（图7B，白色柱）相比，8N以上的多核化细胞优势地增长。并且，观察到未表达BCL-XL的细胞的细胞数逐渐减少（图8中▲），与此相比，表达BCL-XL的细胞的细胞数平稳地逐渐增殖（图8中■）。
以上的实验结果，揭示因癌基因的强制表达而获得高增殖能力的多核化前的巨核细胞中，为了避免癌基因依赖性，BCL-XL基因等抑制细胞凋亡的基因是有效的。
2-7-4.ROCK抑制剂+BCL-XL基因强制表达+p53基因抑制的影响
研究了在多核化前的巨核细胞中，p53的表达抑制是否促进多核化。
p53基因的表达抑制，与2-2.同样地，通过利用导入了H1启动子、shp53的慢病毒FG12载体以MOI10进行了慢病毒感染。
抑制MYC/BMI1的表达，使BCL-XL强制表达，在Y27632的存在下，进行了p53的表达抑制，在39℃下，培养了7天。培养后，调查研究了多核化的程度，其结果，与没有敲除p53的对照细胞（图9B，黑色柱）相比，敲除了p53的细胞（图9B，白色柱）中，8N以上的细胞数增加，多核化得到了促进。
2-7-5.ROCK抑制剂+BCL-XL基因强制表达+p53基因抑制+丙戊酸的影 响
进行上述2-7-4.的处理，再进一步地对细胞进行丙戊酸处理，研究了对多核化的影响。抑制MYC/BMI1的表达，进行BCL-XL的强制表达、ROCK抑制剂处理（10μM）、p53表达抑制，进一步地向培养基中添加丙戊酸（终浓度0.5mM），在39℃下，培养了7天，其结果，与没有用丙戊酸处理过的对照细胞（图10B，黑色柱）相比，用丙戊酸处理过的细胞（图10B，白色柱），多核化得到了促进。
2-7-6.BCL-XL基因强制表达+肌球蛋白重链IIA/B ATPase抑制剂的影响 以及ROCK抑制剂+BCL-XL基因强制表达+p53基因抑制+丙戊酸+肌球蛋白 重链IIA/B ATPase抑制剂的影响
研究了对没有进行多核化的巨核细胞，用肌球蛋白重链IIA/B ATPase抑制剂的Blebbistatin进行处理时，是否对多核化程度产生影响。抑制MYC/BMI1的表达、进行BCL-XL强制表达、Blebbistatin（10μg/ml）处理，在39℃下，培养了7天。与没有用Blebbistatin处理的对照细胞（图11B，黑色柱）比较，用Blebbistatin处理的细胞（图11，白色柱）中，8N以上的细胞数增加，多核化得到了促进。
接着，研究了其他处理与Blebbistatin处理组合进行时的多核化程度。在上述2-7-5.处理上，再进一步对细胞进行了Blebbistatin处理，研究了对多核化的影响。进行抑制MYC/BMI1的表达、BCL-XL强制表达、ROCK抑制剂（10μM）处理、p53表达抑制、丙戊酸（0.5mM）处理的基础上，还进行了Blebbistatin（10μg/ml）处理，在39℃下，培养了7天。与没有用Blebbistatin处理的对照细胞（图12B，黑色柱）比较，用Blebbistatin处理的细胞（图12，白色柱）中，8N以上的细胞数增加，多核化得到了促进。并且，培养7天后，用Blebbistatin处理的细胞，增殖能力逐渐低下（图13，上部图），而观察到细胞质增生，确认了向成熟巨核细胞的诱导（图13，下部图）。
3.从多核巨核细胞的血小板的产生
3-1.BCL-XL表达抑制对血小板产生的影响（1）
在10T1/2饲养细胞上，接种从2-2.获得的2×105个iMKPC-型II，在Dox0.5μg/ml存在下（BCL-XL ON），或者从培养液中去除Dox（BCL-XL OFF），在39℃下培养。第3-4天，用CD41抗体以及CD42b抗体染色巨核细胞以及培养液中的血小板，通过流式细胞仪进行分析。
将结果示出在图14。与在Dox ON下表达BCL-XL的巨核细胞（A）比较，由于Dox OFF而BCL-XL表达被抑制的组中，表达CD42b的成熟的巨核细胞成为主体（B）。并且，从该巨核细胞释放的血小板与从BCL-XL ON的巨核细胞释放的血小板（C）比较，表达功能表达所需的CD42b的血小板的比例也增加了（D）。
3-2.BCL-XL表达抑制对血小板产生的影响（2）
基于与3-1.相同的结果，将计数了在BCL-XL表达ON/OFF时的细胞数的结果示出在图15。抑制了BCL-XL表达的组中，血小板数显著地增加。
A表示CD42b阳性血小板数，B表示CD41a阳性/CD42b阳性巨核细胞数，C表示CD41a阳性巨核细胞数。
对于表达CD41的巨核细胞的数而言，虽然没有观察到因Bcl-xL的表达的影响（C），但是CD41+中的CD42b的表达比率因Bcl-xL表达抑制而增加，可以说更加成熟的巨核细胞增加了。
3-3.培养温度对血小板产生的影响
在10T1/2饲养细胞上，接种2～3×105个iMKPC-型II，在添加或不添加Dox0.5μg/ml的条件下，在35、37、39℃的培养温度下，培养3天。用CD41抗体以及CD42b抗体染色包含于上清中的血小板，通过流式细胞仪进行分析。将以37℃Dox+作为1，各组的CD41+CD42b+血小板数的平均值以及标准偏差示出在图16。
了解到培养温度为37℃或39℃，是适宜的。以后的实验中，培养温度设定为37℃。
3-4.饲养细胞、培养基中的血清以及Blebbistatin的有无对血小板产生的 影响
如图17所示，将使用/不使用饲养细胞、使用/不使用条件培养基（Conditioned Medium）、使用血清培养基/使用无血清培养基、加入/不加入Blebbistatin的条件进行组合，测定了血小板产生效率。
对于条件培养基（Conditioned Medium）而言，明胶涂层（Gelatin coating）的10cm的培养皿（dish）中接种用MMC处理的10T1/2细胞8×105，第二天（细胞粘附后），更换为含SCF(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)的含15％血清的分化培养基（EBM）或者没有血清的分化培养基10ml，24小时后回收培养基，添加10ml的新培养基（含SCF、TPO），将3日份的条件培养基（ConditionedMedium）合并(pool)，使用0.22μm的过滤器去除10T1/2，由此进行配制。用于试验时，重新添加SCF、TPO。
对于饲养细胞使用组而言，在10T1/2饲养细胞上接种2～3×105个iMKPC-型II，而对于非使用组而言，涂覆明胶的培养皿（dish）中同样地接种细胞。对于血清培养基使用组而言，使用含15%血清的分化培养基或条件培养基（Conditioned Medium），对于Blebbistatin添加组而言，在培养基中添加5μM的Blebbistatin。在37℃下，培养3天。
用CD41抗体以及CD42b抗体染色包含于培养上清中的血小板，通过流式细胞仪进行分析。将在饲养细胞上未添加Blebbistatin、添加15%血清而培养的组作为标准状态（normal condition），将各组的CD41+CD42b+血小板数相对于标准状态的比率的平均值以及标准偏差以柱状图示出在图17。血小板产生量在所有的组中均没有出现较大的差异。
并且，将各组的CD41阳性血小板中的CD42b表达量（各组的平均荧光强度相对于标准状态的平均荧光强度的比率）的比较示出在图18。没有血清、没有饲养细胞的条件下，产生了CD42b的表达最高的血小板。没有观察到Blebbistatin的影响。
将最适宜的条件的一种例示出在图19。并且，将该条件下培养时的CD41阳性、CD42b（还称为GPIba）阳性血小板的比率示出在图20。
如图20所示，从根据本发明获得的多核巨核细胞得到的血小板约20%呈CD41阳性CD42b阳性，通过抑制BCL-XL的表达，其比率上升到55%，进一步地，通过去除饲养细胞和血清而进行培养，能够上升到81%。
4.CD42b表达对血小板功能的重要性（参考）
利用人类末梢血血小板，测定对于瑞斯托菌素（ristocetin）凝集反应（介由vWF和血小板上的受体（由GPIba、GPIX等构成的异源五聚体）的凝集反应）的HIP1抗体的抑制效果。HIP1抗体是GPIba的功能抑制性抗体。
将1×108个血小板悬浮于50%血浆中，添加HIP1抗体，在37℃下前培养3分钟，抑制GPIba效果，然后添加瑞斯托菌素（终浓度为2mg/ml），引起凝集反应，实时观察7分钟光透射率。将表示各组的最大光透射率（表示凝集的强度）的柱状图示出在图21。HPI1抗体在10μg/ml以上的浓度下完全抑制由GPIb/alpha-von Willebrand factor(vWF，血浆血管性血友病因子)缔合的凝集。
接着，向NOG小鼠体内给予100ug的HIP1抗体或对照IgG，输血用TAMRA（红色色素）染色的血小板。用激光照射血管内皮使其损伤，引起血栓的形成，计数参与血栓形成的人类血小板（红色）数。
用单位血管长度校正血栓中的人类血小板数，将校正值的平均值以及标准误差以柱状图表示（图22）。给予HIP1抗体的组中，抑制了人类血小板参与血栓形成。
从以上试验，得知GPIba（CD42b）是在体内（in vivo）以及体外（in vitro）对血栓形成起重要的作用的分子。
产业上的可利用性
本发明提供促进巨核前体细胞的多核化，进一步地，有效地使血小板释放的方法。尤其，本发明的方法在从各种干细胞在体外制备巨核细胞或血小板时非常有效，会对医疗领域中的治疗方法或血液制剂的研发做出较大贡献。
Figure IDA0000414295200000011
Figure IDA0000414295200000021

Claims (19)

1.一种方法，是制造多核巨核细胞的方法，包括工序：在多核化前的巨核细胞中使抗细胞凋亡基因强制表达，培养该细胞。
2.如权利要求1所述的方法，所述抗细胞凋亡基因为BCL-XL基因。
3.如权利要求1或2所述的方法，在所述的培养工序中，抑制p53基因产物的表达或功能。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，在所述的培养工序中，对多核化前的巨核细胞进行以下（a）至（c）中的至少一个处理：
（a）由肌动球蛋白复合物功能抑制剂的处理；
（b）由ROCK抑制剂的处理；以及
（c）由HDAC抑制剂的处理。
5.如权利要求4所述的方法，所述ROCK抑制剂为Y27632，所述HDAC抑制剂为丙戊酸，所述肌动球蛋白复合物功能抑制剂是Blebbistatin。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，在高于37℃的温度下进行所述的培养工序。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的方法，所述多核化前的巨核细胞是通过以下工序而获得的：在从造血前体细胞到多核化前的巨核细胞的分化阶段的任意阶段，在该细胞中使癌基因与以下（i）至（iii）中的任意基因强制表达，培养该细胞并使其增殖，
（i）抑制p16基因或者p19基因表达的基因、
（ii）抑制Ink4a/Arf基因表达的基因、以及
（iii）多梳基因。
8.如权利要求7所述的方法，作为所述癌基因而使用c-MYC基因，作为所述（i）至（iii）的基因而使用BMI1。
9.如权利要求7或8所述的方法，所述造血前体细胞来源于iPS细胞、ES细胞，以及来源于从由脐带血、骨髓血或末梢血来源的造血干细胞和造血干细胞构成的组中选择的细胞。
10.包含根据权利要求1至9中任意一项所述的方法而制造的多核巨核细胞的血液细胞组合物。
11.一种方法，是血小板的制造方法，包括工序：
通过权利要求1至9中任意一项所述的方法而获得多核巨核细胞，培养该细胞；
从所述多核巨核细胞的培养物回收血小板。
12.如权利要求11所述的方法，所述的培养多核巨核细胞的工序是通过抑制抗细胞凋亡基因的强制表达或者从细胞去除所述抗细胞凋亡基因而进行的。
13.如权利要求11或12所述的方法，所述的培养多核巨核细胞的工序是在没有血清和/或没有饲养细胞的条件下进行的。
14.如权利要求11至13中任意一项所述的方法，所述的培养多核巨核细胞的工序进行1到15天。
15.如权利要求11至14中任意一项所述的方法，所述的培养多核巨核细胞的工序在37℃下进行。
16.如权利要求11至15中任意一项所述的方法，在所述的培养多核巨核细胞的工序中，在培养基中添加ROCK抑制剂和/或肌动球蛋白复合物功能抑制剂。
17.如权利要求16所述的方法，所述ROCK抑制剂为Y27632，所述肌动球蛋白复合物功能抑制剂是Blebbistatin。
18.根据权利要求11至17中任意一项所述的方法制造的血小板。
19.包含权利要求18所述的血小板的血液制剂。
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