CN108135940B - 纯化血小板的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种方法，其是从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法，包括利用150×g～550×g的离心力将上述培养物离心分离的第一离心分离工序以及利用600×g～4000×g的离心力将在第一离心分离工序中回收得到的液体成分离心分离的第二离心分离工序。

Description

纯化血小板的制造方法

技术领域

本发明涉及从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法等。

背景技术

对于随着手术时、受伤时的大量出血、或者表现出抗癌剂治疗后的血小板减少而出血趋势的患者而言，出于治疗和预防其症状的目的，向患者给予血小板制剂。目前，血小板制剂的制造依赖于通过健康志愿者进行的献血。但是，在日本，因人口结构而引起献血者数量减少，推测在2027年，存在大约100万人份的献血缺口。因此，血小板的稳定供给是本技术领域的重要课题。

另外，由于现有的血小板制剂因细菌污染导致的风险高，所以可能在血小板制剂的注入后引起严重感染。因此，在临床实践中，始终寻求更安全的血小板制剂。为了满足这种需求，如今开发了从在体外(in vitro)培养出的巨核细胞中产生血小板的方法。

在输入血小板制剂时，极少数情况下会发生输血副作用(荨麻疹、过敏反应等)。认为其原因之一在于血小板制剂中含有的血浆。因此，为了预防输血副作用，开发了用人工制备出的溶液(洗涤保存液)置换血小板制剂中的血浆的方法。例如，为了洗涤浓缩血小板制剂中的血小板，有使用具备分离转鼓的离心分离装置来洗涤血小板的方法。这里所说的浓缩血小板制剂是通过血液成分采集，除去白细胞的大部分，并将采集到的血小板悬浮在血浆中而得到的。

另一方面，在体外培养巨核细胞而产生血小板的情况下，需要将血小板从巨核细胞分离并浓缩。由于两者的表面标记物相同，所以无法用细胞分选仪分离，为了分离血小板与巨核细胞，使用了利用大小差异而用过滤器和/或中空纤维膜分离的方法、使用离心管进行离心分离的方法。但是，在使用过滤器和/或中空纤维膜的方法中，因为表面蛋白质的损伤等而导致血小板的生理活性丧失，并且回收率低至10％左右。另外，在使用离心分离的方法中，由于采用低的离心速度以使得功能不降低，所以巨核细胞的去除率低，血小板回收率也仅为10％左右，另外，存在一次性能够纯化的量受到离心管的容积限制的问题。

发明内容

技术问题

本发明的课题在于提供以高的回收率且一次性大量地从巨核细胞的培养物中分离纯化血小板来制造高品质的纯化血小板的方法。

技术方案

本发明人等为了解决上述课题反复进行了研究，结果发现，在利用预定的离心力将巨核细胞的培养物离心处理之后，通过利用更高的离心力对在该离心处理中得到的液体成分再一次进行离心处理，从而能够以高回收率从巨核细胞的培养物中纯化出高品质的血小板。

即本发明提供：

〔1〕一种方法，是从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法，包括：

第一离心分离工序，利用150×g～550×g的离心力将上述培养物离心分离；以及

第二离心分离工序，利用600×g～4000×g的离心力将在第一离心分离工序中回收得到的液体成分离心分离；

〔2〕根据〔1〕中记载的方法，上述离心分离工序通过离心分离来实施，上述离心分离装置具备：

能够旋转的分离转鼓，其具备根据离心力使比重大的物质附着的内壁和使分离后的液体成分流出的流出口；以及

回收单元，其对从上述流出口流出的液体成分进行回收。

〔3〕根据〔2〕中记载的方法，上述方法还包括：

洗涤工序，在上述第二离心分离工序之后，向上述分离转鼓加入洗涤液并使其旋转；以及

血小板回收工序，在上述洗涤工序之后，加入回收液并使上述分离转鼓旋转；

〔4〕根据〔2〕或〔3〕中记载的方法，第一离心分离工序通过使上述培养物自然下落而注入到分离转鼓；

〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项记载的方法，上述巨核细胞的培养物是通过如下工序而得到的培养物，上述工序为：

在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，使癌基因和多梳基因强制表达的工序；

在上述细胞中使Bcl-xL基因强制表达的工序；以及

将上述强制表达全部解除的工序；

〔6〕一种血液制剂的制造方法，包括将利用〔1〕～〔3〕中任一项记载的方法纯化而成的血小板与其他成分混合的工序。

发明效果

根据本发明的方法，由于能够以高的回收率且一次性大量地从巨核细胞的培养物纯化出高品质的血小板，所以能够大量地生产、供给细菌污染风险低的安全的血小板制剂。

附图说明

图1表示对通过本发明的纯化方法纯化前后的血小板数进行测定而得到的结果。

图2表示对通过本发明的纯化方法纯化后的血小板的生理活性进行测定而得到的结果。

图3表示对通过本发明的纯化方法纯化后的异常血小板的比例进行测定而得到的结果。

图4表示在利用本发明的纯化方法纯化之后6天后，对血小板的生理活性进行测定而得到的结果。

图5表示在利用本发明的纯化方法纯化之后6天后，对异常血小板的比例进行测定而得到的结果。

具体实施方式

本发明的血小板的制造方法包括用不同的离心力对含有巨核细胞的试样进行2次以上的离心分离的工序。例如，第一离心分离工序可以以约150×g～约550×g的离心力实施，第二离心分离工序可以以约600×g～约4000×g的离心力实施。离心分离工序可以通过离心分离来实施，上述离心分离具备：能够旋转的分离转鼓，其具备与离心力对应地使比重大的物质附着的内壁和使分离后的液体成分流出的流出口；以及回收单元，其对从流出口流出的液体成分进行回收。

在该离心分离装置中，使分离转鼓以穿过其底面的中心且与底面垂直的轴为中心旋转，并且如果注入液体混合物，则根据离心力，比重大的成分附着/堆积于分离转鼓的内壁，比重小的成分残留在液体中。

含有比重小的成分的液体通过回收单元回收。回收单元例如由与分离转鼓的流出口连接的导管以及能够更换地与导管连接的回收袋构成。回收袋只要对血小板的品质不造成影响就没有特别限定，可以使用市售的血液、血液成分的保存用袋。

对于该离心分离装置而言，边以预定的速度向分离转鼓注入液体混合物，边进行离心分离，同时能够用回收单元回收所分离出的液体，因此无论分离转鼓的容量如何，均能够连续地分离大量的液体混合物。

作为本发明的纯化血小板制造方法中使用的离心分离装置，例如可以使用日本特开2005-296675号公报中公开的装置、日本特开平7-284529号公报中公开的装置等。另外，还可以使用血液成分的分离中使用的市售的离心分离装置、以往在浓缩血小板制剂的血小板的洗涤中使用的市售的装置。例如，还可以使用HAEMONETICS公司的ACP215、泰尔茂公司的COBE2991。

在特定的方式中，第一离心分离工序可以以约150×g～约550×g的离心力使分离转鼓旋转来进行。离心力优选约160×g～约500×g，更优选约170×g～约400×g，进一步优选约180×g～约300×g。通过将离心力设为该范围来进行离心分离，从而使培养物中的巨核细胞附着/堆积于分离转鼓的内侧。如果使离心力为该范围以上，则由于对血小板施加剪应力，血小板的生理活性展现而导致聚集。

应予说明，由于在离心力(g)、转速(rpm)与旋转半径(cm)之间成立以下的关系，所以所使用的旋转转鼓可以根据大小来决定转速。

离心力(g)＝1119×旋转半径(cm)×(转速(rpm))²×10^-8

在该工序中，可以向巨核细胞的培养物中加入血小板保存液。例如可举出生物学的制剂基准血液保存液A液(Acid-Citrate-Dextrose；ACD-A；枸橼酸-葡萄糖)。ACD-A具有血液/血小板抗凝血作用，还发挥作为血小板的能量源的葡萄糖供给源的功能。

在第一离心分离工序时，将巨核细胞的培养物注入到分离转鼓的方法没有特别限定，可以使用装置所具备的泵，也可以用导管将加入了培养物的容器与分离转鼓连接，将该容器挂在高的位置，使培养物通过导管自然下落到转鼓内。注入速度例如可以设为约50mL/min～约150mL/min、约80mL/min～约130mL/min或者约100mL/min。

第一离心分离工序可以在室温下进行。第一离心分离工序的时间可以是用培养物的体积除以培养物的注入速度而得到的时间，或其以上的时间。

在第一离心分离工序中，血小板残留在溶液中，被回收单元回收。

本发明的血小板的纯化方法的第二离心分离工序是从利用第一离心分离工序回收得到的液体成分中分离血小板的工序。

在第一离心分离工序后，在对分离转鼓进行更换或洗涤之后，一边使分离转鼓旋转，一边注入在第一离心分离工序中回收得到的液体成分。注入可以与第一离心分离工序同样地进行。也可以通过将在第一离心分离工序中使用的回收袋直接挂在高的位置，通过导管自然下落来注入到分离转鼓中。

在特定的方式中，第二离心分离工序可以以约600×g～约4000×g的离心力使分离转鼓旋转来进行。离心力优选约800×g～约3000×g，进一步优选约1000×g～约2000×g。通过将离心力设在该范围来进行离心分离，从而能够在不使血小板丧失其生理活性的情况下使血小板附着/堆积于分离转鼓内壁。

第二离心分离工序可以在室温下进行。第一离心分离工序的时间可以是用在第一离心分离工序中回收得到的液体成分的体积除以该液体的注入速度而得到的时间，或其以上的时间。

将利用第二离心分离工序分离得到的液体成分回收到回收单元，丢弃。

在另一方式中，在第二离心分离工序之后，可以进行洗涤工序。在第二离心分离工序中，培养基和/或添加物也与血小板一起附着/堆积于分离转鼓的内壁。是用于将该培养基除去的洗涤工序。

在洗涤工序中，向分离转鼓内加入洗涤液，以约600×g～约3600×g的离心力使其旋转。作为洗涤液，可以使用碳酸氢钠林格溶液，例如ビカーボン(注册商标)。另外，可以向ビカーボン中加入血小板保存液。血小板保存液可以加入例如ACD液。应予说明，在向分离转鼓加入洗涤液时，以恒定速度注入洗涤液。此时，血小板保持附着于分离转鼓的内壁，含有培养基和/或添加物的洗涤液被回收单元回收。

在另一方式中，在洗涤工序之后可以进行血小板的回收工序。在回收工序中，为了回收附着于分离转鼓的内壁的血小板而加入回收液，以约600×g～约3600×g的离心力使其旋转。由此，血小板从分离转鼓振落，悬浮在回收液中。作为回收液，例如可以使用ビカーボン，将其以恒定速度注入到分离转鼓中。可以向ビカーボン中加入5％的ACD。含有血小板的回收液从分离转鼓的流出口流出，被回收袋等回收单元回收。可以将其作为最终制品。

在本说明书中，“巨核细胞”是在生物体中存在于骨髄中的最大的细胞，其特征是释放出血小板。巨核细胞以细胞表面标记物CD41a、CD42a和CD42b阳性表征，此外，有时也进一步表达选自CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131和CD203c中的标记物。如果巨核细胞多核化(多倍体化)，则具有通常的细胞的16～32倍的基因组。在本说明书中，在简称为“巨核细胞”的情况下，只要具备上述特征，就可以包括多核化而成的巨核细胞和多核化前的巨核细胞这两者。“多核化前的巨核细胞”与“未成熟的巨核细胞”或“增殖期的巨核细胞”同义。

巨核细胞可以通过公知的各种方法获得。作为巨核细胞的制造方法的非限定性的例子，可举出国际公开第2011/034073号中记载的方法。在该方法中，在“与巨核细胞相比分化程度低的细胞(cells less differentiated than megakaryocytes)”中，通过使癌基因与多梳基因强制表达，能够得到无限增殖的永生化巨核细胞株。另外，根据国际公开第2012/157586号中记载的方法，在“与巨核细胞相比分化程度低的细胞”中，通过使细胞凋亡抑制基因强制表达，也能够得到永生化巨核细胞株。这些永生化巨核细胞株通过解除基因的强制表达，进行多核化，释放出血小板。

为了获得巨核细胞，可以组合上述的文献中记载的方法。在这种情况下，癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因的强制表达可以同时进行，也可以按顺序进行。例如，可以使癌基因和多梳基因强制表达，抑制该强制表达，接着使细胞凋亡抑制基因强制表达，抑制该强制表达而得到多核化巨核细胞。另外，也可以使癌基因、多梳基因和细胞凋亡抑制基因同时强制表达，将这些强制表达同时抑制而得到多核化巨核细胞。还可以首先使癌基因和多梳基因强制表达，接下来使细胞凋亡抑制基因强制表达，将这些强制表达同时抑制而得到多核化巨核细胞。

在本说明书中，“与巨核细胞相比分化程度低的细胞”是指具有向巨核细胞分化能力的细胞，表示从造血干细胞系到巨核细胞为止的各种分化阶段的细胞。作为与巨核细胞相比分化程度低的细胞的非限定性例子，可举出造血干细胞、造血前体细胞、CD34阳性细胞、巨核细胞-红细胞系前体细胞(MEP)。这些细胞例如可以从骨髄、脐带血、外周血分离而得到，也可以从作为分化程度更低的细胞的ES细胞、iPS细胞等多能干细胞分化诱导而得到。

在本说明书中，“癌基因”是指在生物体中诱导细胞的癌化的基因，例如可举出MYC家族基因(例如c-MYC、N-MYC、L-MYC)、SRC家族基因、RAS家族基因、RAF家族基因、c-Kit、PDGFR、Abl等蛋白激酶家族基因。

在本说明书中，已知“多梳基因”是对CDKN2a(INK4a/ARF)基因进行负调控，为了避免细胞老化而发挥功能的基因(小仓等,再生医疗vol.6,No.4,pp26-32；Jseus等,Jseus等,Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7,pp667-677,2006；Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.100,pp211-216,2003)。作为多梳基因的非限定性例子，可举出BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3b。

在本说明书中，“细胞凋亡抑制基因”是指细胞的具有抑制细胞凋亡的功能的基因，例如可举出BCL2基因、BCL-xL基因、生存素(Survivin)基因、MCL1基因等。

基因的强制表达和强制表达的解除可以通过国际公开第2011/034073号、国际公开第2012/157586号、国际公开第2014/123242或Nakamura S等,Cell Stem Cell.14,535-548,2014中记载的方法、其他公知的方法或以此为基准的方法来进行。

在本说明书中，“血小板”是的血液中的细胞成分之一，以CD41a阳性和CD42b阳性表征。血小板在血栓形成和止血中起到重要的作用，并且与损伤后的组织再生、炎症的病理生理也有关系。如果血小板因出血等被激活，则在其膜上表达整合素(Integrin)αIIBβ3(糖蛋白IIb/IIIa；CD41a和CD61的复合体)等细胞粘附因子的受体。其结果，血小板彼此聚集，利用从血小板释放出的各种凝血因子而使纤维蛋白(Fibrin)凝固，从而形成血栓，进行止血。

利用本发明的方法纯化而成的血小板是高品质的。在本说明书中，高品质的纯化血小板是指实质上除去了巨核细胞，结果较高地维持每一组分的生理活性，异常血小板足够少的血小板。

血小板的生理活性可以通过公知的方法测定和评价。例如，可以使用对于与经激活的血小板膜上的整合素αIIBβ3特异性结合的PAC-1的抗体，测定经激活的血小板量。另外，同样地可以用抗体检测作为血小板的激活标记物的CD62p(P-选择素)来测定经激活的血小板量。例如，可以通过如下方式来进行：使用流式细胞术，用针对激活非依赖性的血小板标记物CD61或CD41的抗体进行分选(gating)，其后，检测抗PAC-1抗体和/或抗CD62p抗体的结合。这些工序可以在二磷酸腺苷(ADP)存在下进行。

另外，血小板的功能的评价也可以通过观察在ADP存在下是否与纤维蛋白原结合来进行。通过血小板与纤维蛋白原结合，从而发生在血栓形成的初期所必需的整联蛋白(整合素)的激活。

此外，血小板的功能的评价还可以如国际公开第2011/034073号的图6所示，通过可视化地观察在体内(in vivo)的血栓形成能力的方法来进行。

另一方面，在血小板的CD42b的表达率低的情况下，或者膜联蛋白V阳性率低的情况下，评价为血小板恶化或异常。这些血小板不足以具有血栓形成、止血功能，在临床上没有用。

在本说明书中，“血小板的恶化”是指血小板表面的CD42b(GPIbα)减少的情况。因此，恶化的血小板包括CD42b的表达降低的血小板、因脱落(shedding)反应而导致CD42b的细胞外区域被切断的血小板。如果血小板表面的CD42b消失，则无法进行与冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor：VWF)的缔合，结果丧失血小板的凝血功能。血小板的恶化可以以血小板组分中的CD42b阴性率(或CD42b阴性粒子数)相对于CD42b阳性率(或CD42b阳性粒子数)的情况为指标来评价。CD42b阴性率相对于CD42b阳性率越高，或者CD42b阴性粒子数相对于CD42b阳性粒子数越多，则血小板越恶化。CD42b阳性率是指血小板组分所含的血小板中的能够与抗CD42b抗体结合的血小板的比例，CD42b阴性率是指血小板组分所含的血小板中的不与抗CD42b抗体结合的血小板的比例。

在本说明书中，“异常的血小板”是指作为阴性电荷磷脂质的磷脂酰丝氨酸从脂质双分子层的内侧向外侧露出的血小板。在生物体中，已知磷脂酰丝氨酸随着血小板的激活而在表面露出，在此结合了大量的凝血因子，由此凝血级联反应扩大。另一方面，在异常的血小板中，大量的磷脂酰丝氨酸始终在表面露出，如果向患者给予该血小板，则可能引起过度的血液凝固反应，导致弥散性血管内凝血综合征等严重的疾病。由于膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸结合，所以血小板表面上的磷脂酰丝氨酸可以通过以荧光标记的膜联蛋白V的结合量为指标，使用流式细胞仪来检测。因此，异常的血小板的量可以用血小板组分中的膜联蛋白V阳性率，即膜联蛋白结合的血小板的比例或数目来评价。膜联蛋白V阳性率越高，或膜联蛋白V粒子数越多，异常的血小板越多。

本发明中的巨核细胞的培养条件可以采用通常的条件。例如，温度可以设为约35℃～约42℃、约36℃～约40℃或约37℃～约39℃，可以为5～15％的CO₂和/或20％的O₂。

培养巨核细胞时的培养基没有特别限定，可以适当使用从巨核细胞产生血小板所适宜的公知的培养基和/或以此为基准的培养基。例如，可以将动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基，例如可举出IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔氏基本成分培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM)培养基、αMEM培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal培养基(LifeTechnologies公司)和它们的混合培养基。

培养基中可以含有血清或血浆，或者可以没有血清。根据需要，培养基例如可以含有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油(thiolglycerol)、单硫代甘油(MTG)、脂质、氨基酸(例如L-谷氨酰胺)、抗坏血酸、肝素、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等中的1种以上的物质。细胞因子是指促进血细胞类分化的蛋白质，例如例示有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板生成素(TPO)、各种TPO类活性物质、干细胞因子(SCF：StemCell Factor)、ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)添加剂、ADAM抑制剂等。在本发明中优选的培养基是含有血清、胰岛素、转铁蛋白、丝氨酸、硫代甘油、抗坏血酸、TPO的IMDM培养基。此外，可以含有SCF，还可以含有肝素。各自的浓度也没有特别限定，但例如，TPO可以为约10ng/mL～约200ng/mL或约50ng/mL～约100ng/mL，SCF可以为约10ng/mL～约200ng/mL或约50ng/mL，肝素可以为约10U/mL～约100U/mL，或约25U/mL。可以加入佛波酯(例如，佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯；PMA)。

在使用血清的情况下优选人血清。另外，可以使用人血浆等代替血清。根据本发明的方法，即使使用这些成分，也能够得到与使用血清时同等的血小板。

为了进行基因的强制表达及其解除，可以使用Tet-on(注册商标)或Tet-off(注册商标)系统那样的药剂反应性的基因表达诱导系统。在这种情况下，在强制表达的工序中，可以在培养基中含有对应的药剂，例如四环素或多西环素，通过从培养基中除去它们而抑制强制表达。

本发明中的巨核细胞的培养工序可以通过悬浮培养来进行，因此可以在无饲养细胞的情况下实施。

本发明的“巨核细胞的培养物”是在上述的培养工序中得到的培养物，包括含有巨核细胞和各种添加物的培养液。

本发明还包括用本发明的方法纯化而成的血小板。

本发明的血液制剂的制造方法包括利用本发明的方法制造血小板制剂的工序以及将该血小板制剂与其他成分混合的工序。作为其他成分，例如可举出红细胞。

本发明还包括通过该方法纯化而成的血液制剂。

除此之外，在血小板制剂和血液制剂中还可以加入有助于细胞稳定化的其他成分。

在本说明书中，所引用的所有专利文献和非专利文献的公开内容可以作为整体通过参照援引到本说明书中。

实施例

以下，基于实施例具体地说明本发明，但本发明不受其任何限定。本领域技术人员可以在不脱离本发明的主旨的情况下将本发明改变为各种方式，该改变也包括在本发明的范围内。

1.永生化巨核细胞的制作

1-1.从iPS细胞制备造血前体细胞

根据Takayama N.,等J Exp Med.2817-2830(2010)中记载的方法，实施从人iPS细胞(TKDN SeV2：使用仙台病毒建立的来自于人胎儿皮肤纤维芽细胞的iPS细胞)向血球细胞的分化培养。即，在20ng/mL的VEGF(R&D SYSTEMS)存在下，将人ES/iPS细胞集落与C3H10T1/2饲养细胞共培养14天来制作造血前体细胞(Hematopoietic Progenitor Cells；HPC)。在培养条件为20％的O₂、5％的CO₂的条件下实施(只要没有特别记载，以下就为相同条件)。

1-2.基因导入系统

基因导入系统利用了慢病毒载体系统。慢病毒载体是四环素控制性的Tet-on(注册商标)基因表达诱导系统载体。是通过将LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(Kobayashi,T.,等Cell 142,787-799(2010))的mOKS盒改组为c-MYC、BMI1、BCL-xL而制作的。分别为LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G和LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G。

病毒粒子是通过利用上述慢病毒载体向293T细胞进行基因导入而制作的。

通过使上述病毒粒子感染目的细胞，从而将BMI1、MYC和BCL-xL的基因导入到目的细胞的基因组序列。稳定地导入到基因组序列的这些基因可以通过向培养基加入多西环素(clontech#631311)来强制表达。

1-3.c-MYC和BMI1病毒向造血前体细胞的感染

在预先接种了C3H10T1/2饲养细胞的6孔板上，以5×10⁴个细胞/孔的方式分别接种按照上述方法得到的HPC，通过慢病毒法使c-MYC和BMI1强制表达。此时，对每1种细胞株各使用6个孔。即，以分别成为MOI 20的方式在培养基中添加病毒粒子，通过自旋感染(32℃、900rpm，离心60分钟)进行感染。本操作每12小时实施2次。

使用如下的培养基：向基本培养基(含有15％的胎牛血清(GIBCO)、1％的青霉素-链霉素-谷氨酰胺(GIBCO)、1％的胰岛素、转铁蛋白、硒溶液(ITS-G)(GIBCO)、0.45mM的1-硫代甘油(Sigma-Aldrich)、50μg/mL的L-抗坏血酸(Sigma-Aldrich)的IMDM(Iscove'sModified Dulbecco's Medium：伊思考夫改良的杜尔贝科培养基)(Sigma-Aldrich))中加入50ng/mL的人血小板生成素(TPO)(R&D SYSTEMS)、50ng/mL的人干细胞因子(SCF)(R&DSYSTEMS)和2μg/mL的多西环素(Dox)，向所得到的培养基(以下，称为分化培养基)中进一步加入鱼精蛋白，以使得最终浓度成为10μg/mL。

1-4.巨核细胞自体增殖株的制作和维持培养

将通过上述方法实施了cMYC和BMI1病毒感染的日期作为感染第0天，如下，通过培养cMYC和BMI1基因导入型巨核细胞，来分别制作巨核细胞自体增殖株。BMI1基因、c-MYC基因的强制表达通过向培养基中加入1μg/mL的多西环素(clontech#631311)来进行。

·感染第2天～感染第11天

利用移液器回收通过上述方法得到的病毒感染完毕的血球细胞，进行1200rpm、5分钟离心操作而除去上清液之后，在新的分化培养基悬浮地接种于新的C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。通过在感染第9天进行同样的操作来实施传代。在测量细胞数之后，以1×10⁵个细胞/2mL/孔接种在C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。

·感染第12天～感染第13天

实施与感染第2天同样的操作。在测量细胞数之后，以3×10⁵个细胞/10mL/100mm培养皿的条件接种在C3H10T1/2饲养细胞上(100mm培养皿)。

·感染第14天

回收病毒感染完毕的血球细胞，针对每1.0×10⁵个细胞，使用抗人CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人CD42b-PE抗体(eBioscience)、抗人CD235ab-pacific blue(BioLegend)抗体分别为2μL、1μL、1μL进行抗体反应。在反应后，使用FACS Verse(BD)进行解析。在感染第14天，将CD41a阳性率为50％以上的细胞作为巨核细胞自体增殖株。

1-4.BCL-xL病毒向巨核细胞自体增殖株的感染

通过慢病毒法向上述感染第14天的巨核细胞自体增殖株进行BCL-xL的基因导入。以成为MOI 10的方式向培养基中添加病毒粒子，通过自旋感染(32℃、900rpm，离心60分钟)进行感染。BCL-xL基因的强制表达通过向培养基中加入1μg/mL的多西环素(clontech#631311)来进行。

1-5.巨核细胞永生化株的制作和维持培养

·感染第14天～感染第18天

回收通过上述方法得到的进行了BCL-xL的基因导入的巨核细胞自体增殖株，进行1200rpm、5分钟离心操作。离心后，在用新的分化培养基将沉淀的细胞悬浮之后，以2×10⁵个细胞/2mL/孔的条件接种在新的C3H10T1/2饲养细胞上(6孔板)。

·感染第18天：传代

在测量细胞数之后，以3×10⁵个细胞/10mL/100mm培养皿的条件进行接种。

·感染第24天：传代

在测量细胞数之后，以1×10⁵个细胞/10mL/100mm培养皿的条件进行接种。之后，每4-7天进行传代，进行维持培养。

在感染第24天回收进行了BCL-xL的基因导入的巨核细胞自体增殖株，针对每1.0×10⁵个细胞，使用抗人CD41a-APC抗体(BioLegend)、抗人CD42b-PE抗体(eBioscience)、抗人CD235ab-Pacific Blue(Anti-CD235ab-PB；BioLegend)抗体分别为2μL、1μL、1μL进行免疫染色之后，使用FACS Verse(BD)进行解析，在感染第24天，将CD41a阳性率为50％以上的株作为永生化巨核细胞株。将在感染后24天以上增殖完成之后的这些细胞作为永生化巨核细胞株SeV2-MKCL。

将得到的SeV2-MKCL在10cm培养皿(10mL/dish)中静置培养。培养基以IMDM作为基本培养基，并加入了以下的成分(浓度为最终浓度)。

培养条件为37℃、5％的CO₂。

2.血小板的生产

接下来，通过用不含有多西环素的培养基进行培养，从而解除强制表达。具体而言，用PBS(-)对利用1.的方法得到的永生化巨核细胞株(SeV2-MKCL)进行2次洗涤，悬浮于下述的用于生产血小板的培养基中。细胞的接种密度为1.0×10⁵个细胞/mL。

在血小板生产培养基中培养6天，产生血小板。

用于生产血小板的培养基(血小板生产培养基)以IMDM作为基本培养基，并加入了以下的成分(浓度为最终浓度)。

3.血小板的纯化

3-1.巨核细胞除去

首先，使用无菌接合装置，将ACP215一次性组件的废液袋替换为回收用袋。回收用袋使用ハイカリック(注册商标)IVH袋((泰尔茂HC-B3006A)。

接下来，制备含有在血小板的生产工序中得到的巨核细胞和产生血小板的培养液2.4L。对于上述培养液量2.4L，添加10％量的ACD-A液。其后，将添加有ACD-A液的培养液注入到细胞袋。细胞袋使用ハイカリック(注册商标)IVH袋(泰尔茂HC-B3006A)。

接下来，使用无菌接合装置，将含有培养液的细胞袋接合到ACP215一次性组件。

将ACP215在服务模式下启动，将离心速度设定为2000rpm(223.8×g)。

在ACP215设置ACP215一次性组件，将盛有培养基的细胞袋设置于支架。

使ACP215启动，以约100mL/min的条件将细胞袋中的培养液注入到分离转鼓中。将从转鼓溶出的溶出液回收到回收袋中。

在将细胞袋中的所有培养液添加到分离转鼓之后，再追加500mL的洗涤液。

在将洗涤液注入到分离转鼓之后，停止离心，使用导管密封器将含有回收液(含有血小板)的回收袋分开。

3-2.浓缩、洗涤、制剂化

(1)浓缩工序

使用无菌接合装置，将含有回收液(含有血小板)的回收袋接合到新的ACP215一次性组件。

将ACP215在通常模式下启动。程序设定选择WPC，根据设备的指示，设置接合了上述回收袋的ACP215一次性组件。另外，将含有回收液的回收袋设置于支架。

接下来，将ACP215的离心速度变更为5000rpm(1398.8×g)，开始离心。

在开始向分离转鼓注入回收液时，从自动注入变更为手动注入。具体而言，以约100mL/min的条件使回收液注入到分离转鼓。将所有的回收液添加到分离转鼓之后，再追加500mL的洗涤液。

(2)洗涤工序

洗涤根据ACP215的程序，用2000mL的洗涤液进行洗涤。

(3)制剂化

根据ACP215的程序，将200mL的洗涤完毕的血小板回收到血小板制剂袋。

4.巨核细胞数、血小板数、血小板的生理活性、异常血小板的测定

4-1.测定方法

使用流式细胞仪对经纯化的血小板制剂中的巨核细胞数、血小板数、血小板的生理活性、异常血小板等进行测定。

在巨核细胞数、血小板数、血小板的生理活性的测定中，向1.5mL微管添加稀释液900μL，添加巨核细胞的培养物或血小板纯化后的回收物100μL，进行混合。将得到的溶液200μL分注到FACS导管中，添加标记抗体进行染色。

在异常血小板的测定中，将巨核细胞的培养物或血小板纯化后的回收物100μL分注到FACS导管，添加标记抗体和蛋白质进行染色，在即将进行流式细胞仪分析之前用膜联蛋白V结合缓冲液(binding buffer，BD)稀释5倍，进行分析。

抗体使用以下抗体。

(1)巨核细胞数、血小板数的测定

1.0μL的抗CD41a抗体APC标记(Bio Legend 303710)

1.0μL的抗CD42a抗体PB标记(eBioscience 48-0428-42)

1.0μL的抗CD42b抗体PE标记(Bio Legend 303906)

(2)血小板的生理活性的测定

0.5μL的抗CD42a抗体PB标记(eBioscience 48-0428-42)

0.5μL的抗CD42b抗体PE标记(Bio Legend 303906)

0.5μL的抗CD62p抗体APC标记(Bio Legend 304910)

10μL的抗PAC-1抗体FITC标记(BD 303704)

(3)异常血小板数的测定

1.0μL的抗CD41a抗体APC标记(Bio Legend 303710)

1.0μL的抗CD42b抗体PE标记(Bio Legend 303906)

5μL的膜联蛋白V FITC标记(BD 556419)

4-2.巨核细胞数、血小板数的测定结果

将CD41a阳性CD42b阳性的粒子数作为血小板数，将阳性的粒子数作为巨核细胞数。分别对纯化前的培养物(使用Versus培养6天而得到的培养物)和纯化后的回收物中所含的血小板数和巨核细胞数进行测定。

将结果示于下表和图1。

[表1]

纯化前

(2600mL)

纯化后

(200mL)

收率(％)

血小板

2.40×10¹⁰

7.41×10⁹

30.8

巨核细胞数

6.91×10⁸

1.60×10⁷

3.3

从表1可知，血小板回收率为30.8％。另外，巨核细胞数减少到纯化前的2.3％(巨核细胞去除率97.7％)。与现有的方法(使用过滤器的方法、使用离心管的离心分离法)相比，血小板回收率上升到3倍。

4-3.血小板的生理活性的测定结果

在室温下，利用PMA 0.2μM(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯,sigma#P1585-1MG)或ADP 100μM(sigma #A2754)和凝血酶0.5U/mL(sigma)进行血小板的刺激。在从刺激开始起算30分钟后，利用BD公司FACSverce实施测定。

CD42a阳性的血小板组分中的刺激前后的PAC-1阳性率和CD62p(p-选择素)

测定阳性率，比较评价生理活性。

将结果示于图2。确认了在刺激后PAC-1阳性和CD62p(p-选择素)阳性细胞增加，纯化血小板维持高的生理活性。

4-4.异常血小板的测定结果

将膜联蛋白V阳性的粒子数作为异常血小板数。将结果示于图3。

膜联蛋白V阳性率低至14.5％，血小板的异常得到充分抑制。

4-5.纯化6天后的血小板的生理活性和异常的测定结果

利用与上述3-2.和3-3同样的方法，对纯化6天后的血小板的生理活性和异常进行测定。

将结果示于图4和图5。

即使在纯化6天后，血小板的生理活性也维持得高，异常血小板足够少。

Claims (7)

1.一种方法，其特征在于，是从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法，包括：

第一离心分离工序，在能够旋转的分离转鼓中，利用150×g～550×g的离心力将所述培养物离心分离，由此从所述培养物除去巨核细胞，回收含有所述培养物分离的血小板的液体成分；以及

第二离心分离工序，在能够旋转的分离转鼓中，利用600×g～4000×g的离心力将在第一离心分离工序中回收得到的液体成分离心分离，由此纯化所述液体成分中的血小板。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心分离工序通过所述能够旋转的分离转鼓和回收单元来实施，

所述能够旋转的分离转鼓具备根据离心力使比重大的物质附着的内壁和使分离后的液体成分流出的流出口，并且

所述回收单元对从所述流出口流出的液体成分进行回收。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

洗涤工序，在第二离心分离工序之后，向所述分离转鼓加入洗涤液并使所述分离转鼓旋转；以及

血小板回收工序，在所述洗涤工序之后，向所述分离转鼓加入回收液并使所述分离转鼓旋转。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第一离心分离工序通过使所述培养物自然下落而注入到分离转鼓。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，第一离心分离工序通过使所述培养物自然下落而注入到分离转鼓。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述巨核细胞的培养物是通过如下工序而得到的培养物，所述工序为：

在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，使癌基因和多梳基因强制表达的工序；

在所述细胞中使Bcl-xL基因强制表达的工序；以及

将所述强制表达全部解除的工序。

7.一种血液制剂的制造方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1～6中任一项所述的方法制造纯化血小板的工序；以及

将所述纯化血小板与其他成分混合的工序。

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