CN103702556A - 使用唾液酸酶抑制剂改进的血小板保存 - Google Patents

使用唾液酸酶抑制剂改进的血小板保存 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种血小板添加液(PAS)，这种血小板添加液具有一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；以及一种或多种PAS组分，所述组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合。本发明还涉及多种方法、组合物和试剂盒，它们用于通过将分离的血小板与一种或多种唾液酸酶抑制剂一起保存来增加血小板的体内循环时间。另外，本发明涉及多种方法和组合物，它们用于降低在来自一个或多个供体的血小板产品制剂中的唾液酸酶活性并且抑制一种或多种细菌的细菌增殖。

Description

使用唾液酸酶抑制剂改进的血小板保存
相关申请
本申请是2012年5月17日提交的美国申请号13/474,473的一个部分继续申请；2012年5月17日提交的美国申请号13/474,627的一个部分继续申请；以及2012年5月17日提交的美国申请号13/474,679的一个部分继续申请，并且要求以下美国临时申请号的权益：2012年3月21日提交的美国临时申请号61/613,876；2012年3月21日提交的美国临时申请号61/613,837；2011年7月1日提交的美国临时申请号61/503,984；以及2011年5月17日提交的美国临时申请号61/487,077。
以上申请的全部教授内容通过引用结合在此。
政府支持
本发明全部或部分得到美国国家心肺及血液研究所(National Heart，Lung，and Blood Institute)的批准号3RO1HL089224-03S1的支持。该政府部门享有本发明的某些权利。
发明背景
预期用于输注的收集的血小板极易腐坏。血小板是无核骨髓来源的血细胞，它通过粘附至血管损伤位点并通过促进血浆纤维蛋白凝块的形成而保护受伤的哺乳动物免于失血。由于骨髓衰竭而耗尽循环血小板的人遭受威胁生命的自发性出血，并且不太严重的血小板缺乏导致创伤或手术之后的出血并发症。
随着循环血小板计数降低(例如，约70,000个/μL)，患者变得越来越容易皮肤出血。血小板计数少于20,000个/μL的患者极易出现粘膜表面的自发性出血，尤其是在骨髓障碍或衰竭引起血小板减少的时候。与骨髓障碍(如再生障碍性贫血、急性和慢性白血病、转移癌)相关的血小板缺乏以及由癌症治疗(如电离辐射或化学疗法)引起的缺乏都导致了重大公共卫生问题。罹患与大手术、损伤以及败血症相关的血小板减少的患者也需要输注大量的血小板。
半个世纪以前，在医疗护理方面的主要进步是发展血小板输注来矫正这类血小板缺乏，这使得在美国在现有输注率下每年有大约260万血小板输注。然而，收集用来输注的血小板极易腐坏，因为当保存在室温或低于室温下时，它们很快失去体内止血活性。止血活性广义地是指血小板群介导出血停止的能力。
血小板与所有其他可移植的组织不同，它们不能耐受冷藏并且如果经受即使非常短时间的冷冻也会迅速从接受者的循环中消失。重要的是，使血小板存活变短的冷却效应被认为是不可逆的并且冷却的血小板变得不适合用于输注。血小板损伤的第一可见效应之一是从盘状形态向球形形状的不可逆转换，以及由于钙依赖性凝溶胶蛋白活化和磷酸肌醇介导的肌动蛋白聚合所致的血小板表面上的刺状突起外观。当血小板暴露在低于20℃的温度下时，它们在形状上迅速经历这些改变。
在输注之前将血小板保持在室温下的这一需要施加了对血小板保存的独特的一套昂贵且复杂的后勤需要(logistical requirement)。因为血小板在室温下是代谢活跃的，它们需要在气体可渗透的容器中持续搅拌以允许气体交换，从而防止代谢性酸中毒的毒性后果。室温保存条件导致大分子降解和血小板止血功能降低，这一组缺点被称为“保存损害”。此外，在室温下保存促进细菌生长，从而引起更高的细菌感染风险，这有效地将这种保存的持续时间限制为约5天。就此方面，到目前为止血小板的细菌污染是最频繁的血液组分使用的感染性并发症。在目前的比率下，1,000单位之一至2,000单位之一的血小板被细菌充分污染，从而对接受者造成重大风险。
因此，仍然存在着开发出改善或延长人血小板在室温或低于室温下保存时体内止血活性的药剂、溶液和方法的迫切需要。存在着这样做并且抑制细菌增殖的另一种更重要的需要。
发明概述
本发明涉及一种血小板添加液(PAS)，该血小板添加液包含一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；以及一种或多种包含以下各项的PAS组分：盐(例如，钠源、氯化物源、钾源、镁源、钙源以及它们的组合)、柠檬酸盐源(例如，柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、柠檬酸以及它们的组合)和/或碳源(例如，乙酸盐、葡萄糖、蔗糖及其任意组合)。本发明的PAS维持在范围在大约6.4与大约7.6之间的pH下。在一个实施例中，本发明的PAS进一步包括磷酸盐源(例如，单磷酸钠、二磷酸钠、三磷酸钠以及它们的组合)。乙酸盐源可包括例如乙酸钠、乙酸钾、乙酸镁或其组合。在一方面，钠源可以是氯化钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠或其组合。类似地，氯化物源可以是氯化钠、氯化镁、氯化钾或其组合。在一个实例中，钾源可以是氯化钾、柠檬酸钾、乙酸钾、磷酸钾、硫酸钾或其组合。镁源的实例包括氯化镁、柠檬酸镁、硫酸镁以及它们的组合。在一个实施例中，钙源涵盖氯化钙、乙酸钙、柠檬酸钙或其组合。
在一个具体实施例中，本发明的PAS包含一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；在约100mM与约300mM之间的范围内的量的钠源；在约40mM与约110mM之间的范围内的量的氯化物源；在约2mM与约20mM之间的范围内的量的柠檬酸盐源；在约10mM与约50mM之间的范围内的量的乙酸盐源；在约5mM与约50mM之间的范围内的量的磷酸盐源；在约0.5mM与约10mM之间的范围内的量的钾源；在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的镁源；以及在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的钙源；其中该PAS维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下(例如，约7.1至约7.4，或约7.2)。
在又另一个实施例中，本发明是涉及具有分离的血小板的血小板组合物；本发明的PAS；以及血浆，其中该血小板组合物被维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下。在一方面，该血浆以按体积计约1％与约50％之间范围内的量存在(例如，在20％与40％之间的血浆，或30％的血浆)。在又一个实施例中，血小板添加液以按体积计约50％与约99％之间的范围内的量存在。
本发明进一步涉及适合于血小板保存的具有本发明的PAS的袋或容器。该袋或容器可进一步包含分离的血小板并且/或者维持在约6.4与约7.6之间的范围内的pH下。
本发明涉及一种保存血小板的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的。该方法包括使分离的血小板与在此描述的PAS接触的步骤。该唾液酸酶抑制剂可以是例如胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；奥司他韦(Oseltamivir)((3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；扎那米韦(Zanamivir)((2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸)；拉尼娜米韦(Laninamivir)((4S，5R，6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimidamido)-6-[(1R，2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸)；以及帕拉米韦(Peramivir)((1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸)或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。该方法允许分离的血小板保存约1天至约21天的一段时间。该分离的血小板被保存在约1℃与约24℃之间的温度下。在一个实施例中，该方法包括以下步骤：冷却血小板组合物至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后使该血小板组合物复温回至室温。在一方面，在一个时间段内将血小板群用唾液酸酶抑制剂进行处理，其中该时间段是在约1分钟至约8小时之间的范围内。
本发明涉及用于制备血小板以供保存的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的。这些方法包括使分离的血小板与如在此所述的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触。该聚糖修饰剂可以是例如CMP唾液酸、CMP唾液酸前体、UDP半乳糖或其组合。在一方面，还可以将使CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸的酶添加到血小板中。
本发明还涉及制备血小板以供保存的方法。该方法包括以下步骤：从一位或多位个体中分离血小板；并且使所分离的血小板与唾液酸酶抑制剂接触，该唾液酸酶抑制剂的量足以减少唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解。在一方面，出现了血小板受体损失(例如，GPIbα损失、GPV损失或者两者)的减少。
本发明涵盖用于增加分离的血小板的体内循环时间的方法。这些方法包括以下步骤：从一位或多位个体获得分离的血小板；用一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂来处理血小板，从而获得处理的血小板；并且将处理的血小板输注到有需要的个体中，从而获得输注的血小板。与没有经受唾液酸酶抑制剂的血小板相比，这些输注的血小板的循环时间是更长的。在一方面，这些方法包括将该血小板组合物保存在室温下一段时间。在另一方面，这些方法包括冷却该血小板组合物至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后使该血小板组合物复温回至室温。
本发明的又一个实施例包括具有唾液酸酶抑制剂和血小板群的血小板制剂；其中稳定的血小板制剂通过以下方法来制备：从一个供体中获得血小板群；并使用有效量的唾液酸酶抑制剂处理血小板。这种血小板制剂适合于在保存之后给予人体，而与未处理的血小板相比在人体中没有止血功能的显著损失或者没有血小板清除的显著增加。类似地，本发明的血小板制剂还包括从供体中分离的血小板；以及一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
本发明进一步涉及试剂盒和系统。本发明的试剂盒包括能够接收和容纳血小板群的无菌容器，其中该容器是大致上与环境隔离的，以及如在此所述的无菌量的唾液酸酶抑制剂和任选地适合的包装材料和使用说明书。在一个实例中，该容器适合于冷保存血小板。该试剂盒可进一步包含一定量的至少一种聚糖修饰剂，如CMP唾液酸、CMP唾液酸前体、UDP半乳糖或其组合。类似地，本发明包括一种系统，该系统具有适合于血液保存的一个无菌袋或容器；以及一定量的如在此所述的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
本发明涉及用于降低在来自一个或多个供体的血小板产品制剂中的唾液酸酶活性并抑制一种或多种细菌增殖的方法。这些方法包括以下步骤：使该血小板产品制剂与一定量的如在此所述的唾液酸酶抑制剂接触，从而获得唾液酸酶处理的血小板产品制剂；其中与未经受唾液酸酶抑制剂的血小板产品制剂相比，唾液酸酶活性降低并且一种或多种细菌的增殖受到抑制。抑制的细菌的类型包括通常在血小板产品制剂中找到的那些细菌。这类细菌的实例包括：曲霉菌(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus sp)、艾氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、白色念珠菌(Candida albicans)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp)、类白喉菌(Diphtheroid)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogene)、河生肠杆菌(Enterobacteramnigenus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)、毗邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、克雷伯菌属(Klebsiella sp)、(肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)、产酸克雷伯菌(K. oxytoca))、乳酸杆菌属(Lactobacillus sp)、李斯特菌属(Listeria sp)、微球菌属(Micrococcus sp)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、Pseudomys oralis、丙酸杆菌属(Propionibacterium sp)、沙门菌属(Salmonella sp)、沙雷菌属(Serratia sp)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、葡萄球菌属(Staplhylococcus sp)(凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、链球菌属(Streptococcussp)、(解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、牛链球菌(S.bovis)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、草绿色链球菌(S.viridans))、以及小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)。这些方法进一步包括以下步骤：评定唾液酸酶抑制剂处理的血小板产品制剂的细菌增殖以及将该评定与一个对照进行比较。可以将一种或多种聚糖修饰剂添加到血小板中。这类聚糖修饰剂包括例如CMP唾液酸、CMP唾液酸前体、UDP半乳糖或其组合。在一方面，可以将使CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸的酶添加到血小板中。
本发明涵盖用于在保存过程中抑制血小板中的细菌增殖的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的。这些方法包括使分离的血小板与一定量的如在此所述的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触；并且在一个或多个时间点评定在分离的血小板中的细菌增殖；其中分离的血小板中的细菌增殖受到抑制。在一方面，使该血小板制剂与唾液酸酶抑制剂接触，该唾液酸酶抑制剂的量足以减少唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解。在一个实施例中，分离的血小板可以保存约1天至约21天的一段时间。分离的血小板可以例如在约1℃与约24℃之间的温度下保存。在一个实施例中，该方法涉及在室温下保存血小板组合物一段时间。在另一个实施例中，该方法包括冷却该血小板组合物至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后在输注到个体中之前使该血小板组合物复温回至室温。
本发明的又另一个实施例涉及制备供保存的血小板的方法，在此过程中唾液酸酶活性降低并且细菌增殖受到抑制，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的。该方法包括以下步骤：使分离的血小板与一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触；并且评定在分离的血小板中的细菌增殖，其中与对照相比，在分离的血小板中的细菌增殖受到抑制。本发明进一步包括以下方法：通过从一位或多位个体中获得血小板群来增加血小板群的保存时间；并且用有效量的唾液酸酶抑制剂处理血小板，从而获得处理的血小板。在一方面，在一个时间时间范围内使用唾液酸酶抑制剂处理该血小板群，其中该时间时间范围是在约1分钟至约8小时之间的范围内。这些步骤还可以用于通过降低唾液酸酶活性并抑制细菌增殖来增加血小板群的保存时间的方法。
本发明还涵盖输注分离的血小板的方法。这些方法包括以下步骤：从一位或多位个体中获得分离的血小板；使用一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂来处理血小板，从而获得展现出抑制的细菌增殖的处理的血小板；并且将处理的血小板输注到有需要的个体中；其中与未经受唾液酸酶抑制剂的血小板相比，细菌增殖受到抑制。
本发明涉及维持在保存之后被输注到接受者中的血小板的止血活性的方法。此方法通过以下方式来进行：使分离的血小板与一定量的唾液酸酶抑制剂接触从而获得处理的血小板；保存处理的血小板约1天与14天之间的一段时间；将所保存的、处理的血小板输注到有需要的接受者中，从而获得输注的血小板；其中这些输注的血小板与未经受唾液酸酶抑制剂的血小板相比可以活化并形成凝块。
本发明还涵盖血小板制剂。这些血小板制剂包括唾液酸酶抑制剂和血小板群；其中这种稳定的血小板制剂是通过在此所述的方法制备的。另外，本发明的血小板制剂包括从供体中分离的血小板；以及一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；其中这些血小板制剂与未用唾液酸酶抑制剂处理的血小板制剂相比展现出抑制的细菌增殖。
附图简要说明
图1A至图1C是描绘含有细胞内唾液酸酶的唾液酸化血小板和含唾液酸酶的细菌的图示。(A)细菌和血小板来源的唾液酸酶两者都从血小板表面除去了唾液酸，从而导致功能受损的血小板形成(1)。释放的唾液酸支持污染细菌的增殖(短虚线和2)，这导致血小板活化(3)、血小板-细菌聚集体形成(3)以及生物膜形成(长虚线和4)。(B)在输注时，巨噬细胞识别去唾液酸化的血小板并将它们从循环中除去。(C)添加唾液酸酶抑制剂DANA(2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐)抑制了来源于血小板和细菌的唾液酸酶活性、防止了血小板去唾液酸化，使得在输注之后血小板不被巨噬细胞识别。
图2是显示人血小板在4℃下保存过程中损失唾液酸的条形图。在外源性核苷酸糖(a)缺乏、CMP唾液酸(CMP-SA)和UDP半乳糖(UDP-Gal)(b)或单独的UDP半乳糖(c)存在下，在4℃下保存血小板浓缩物(A：供体A和B：供体B)5天。将第0天的血小板的唾液酸含量设为100％。
图3是显示人血小板唾液酸酶表面活性在冷保存之后增加的线形图。(A)描绘了在有或没有透化作用的情况下新鲜血小板的分析。(B)描绘了在pH5和6下新鲜完整的血小板(供体A和B)的分析。(C)描绘了在4℃保存5天之后的完整血小板(供体A和B)的相应分析。
图4示出了固定的、未透化的、静息室温(RT)(左图)和冷藏(右图)的人血小板的免疫荧光显微照片，表明在血小板的表面上存在唾液酸酶Neu3，但是不存在Neu1。血小板冷藏(48h)增加了唾液酸酶(Neu1)表面荧光，即暴露。在上图中使用了抗Neu1抗体。在下图中使用了抗Neu3抗体。
图5显示了在冷保存48h并复温之后小鼠血小板唾液酸酶表面活性增加。在室温下持续0至2.5h以荧光(吸收强度(AI))来测量血小板来源的唾液酸酶活性。将保存在低温(4℃，较暗的圆圈)下的血小板与新鲜血小板(RT，较淡的圆圈)进行比较。作为对照，测量唾液酸酶活性(产气荚膜梭菌(组分H))持续相同的时间段(插图)。
图6显示在血小板保存过程中胎球蛋白竞争唾液酸酶表面活性并因此抑制唾液酸从血小板聚糖上水解。左侧竖条对表示在胎球蛋白缺乏(对照)或存在胎球蛋白(胎球蛋白)下在新鲜血小板(0)上的β-半乳糖暴露。右侧竖条对表示血小板冷藏48h之后在胎球蛋白缺乏(对照)或存在下的β-半乳糖。通过RCA I结合来测量唾液酸损失，即β-半乳糖暴露。
图7显示唾液酸酶抑制剂DANA增加了小鼠血小板的体内寿命。底线表示对照血小板寿命(对照)。顶线表示添加DANA(DANA)后的血小板寿命。
图8(A)表示原始GPIbα结构以及O-连接的聚糖和N-连接的聚糖的图示结构。(B)表示末端Galβ1、4GlcNAc(乳糖胺聚糖/LacNAc)以及核心-1O-聚糖的生物合成修饰。
图9显示经总血小板溶解产物的蛋白质印迹分析人血小板含有唾液酸酶Neu1和Neu3。
图10显示在长期冷藏后人血小板释放Neu1到血浆中，如通过蛋白质印迹所分析的。在第0天和血小板冷藏1天、2天和5天之后分析血小板和它们相应的血浆。
图11(A)描绘了血小板糖基转移酶(GT)的特征。使人总血小板溶解产物经受SDS-PAGE并使用以下单克隆抗体进行免疫印迹：抗-GalNAc转移酶(GalNAc-T1、-T2、-T3)、β4Gal-转移酶1(β4Gal-T1)以及唾液酸转移酶ST3Gal-1(B)血小板分泌GT。静息的血小板在37℃下维持5分钟或者经由凝血酶受体PAR-1与25μM TRAP活化5分钟。1分钟之后观察到最大的释放。在沉淀的血小板部分(P)中或者在其相应沐浴介质(M)中测量每分钟计数(CPM)的酶活性。将该介质在100,000xg下澄清90分钟以在活性测量之前消除微颗粒。
图12描绘了內源性血小板唾液酸转移酶将唾液酸并入血小板表面受体中。(A)活性人血小板表面唾液酸转移酶使FITC-结合的CMP-SA(FITC-SA)并入静息的(虚线)或TRAP-活化的血小板中。将单独的FITC(对照)添加到静息(虚线)或TRAP活化的血小板(实线)中。(B)显示来自静息的(静息)或TRAP-活化的血小板(TRAP)的溶解产物的免疫印迹，所述血小板用FITC(C)或FITC-CMP唾液酸(S)处理或者未用针对FITC、GPIbα、αIIb以及vWf的抗体进行处理(-)。这些显示的印迹表示两个实验。肌动蛋白被显示为加载对照。
图13显示在室温(A)或冷藏(B)下保存的过程中血小板损失了GPIbα和GPV受体。在将血小板保存在冷处之前和之后的指定时间点通过流式细胞术测量小鼠vWf受体复合物组分(GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPV)、GPVI和αIIbβ3的表达。结果表示为平均值±SD，n＝5。将新鲜分离的血小板上的糖蛋白表达设为100％。
图14显示仅抑制金属蛋白酶介导的GPIbα脱落并不改善小鼠血小板的恢复和存活。通过流式细胞术评定(A)GPIbα和(B)GPV的表面表达。在DMSO(对照)或100μM金属蛋白酶抑制剂GM6001(n＝6)存在下，在4℃保存野生型小鼠富含血小板的血浆0h、24h和48h。通过流式细胞术测定在来自TACE+/+和TACE△Zn/△Zn小鼠的新鲜分离的或冷藏24h和48h的富含血小板的血浆上的(C)GPIbα和(D)GPV的表面表达。结果是平均值±平均数标准误差(s.e.m.)。n＝5。(C，插图)在来自保存在冷处3h、24h和48h的TACE+/+和TACE△Zn/△Zn血小板的溶解产物中的GPIbα的免疫印迹。(E)将荧光标记(5-氯甲基荧光素二乙酸酯，CMFDA)的新鲜PRP(RT)或者来自在100μM GM6001缺乏(48h)或存在(48h+GM6001)下保存的富含血小板的血浆的血小板注入到野生型小鼠中(108个血小板/10gm体重)。在指定时间点采集血液并且立即通过流式细胞术分析血小板。结果是平均百分比CMFDA-标记的血小板±平均数标准误差。将输注后5分钟时间的CMFDA阳性新鲜血小板百分比设为100％。n＝5。*P＜0.05。比较冷保存的血小板。(F)将荧光标记(CMFDA)的新鲜血小板(TACE+/+RT和TACE-/-RT)或者来自保存的富含血小板的血浆的血小板(TACE+/+48h和TACE-/-48h)静脉注入到野生型小鼠中(108个血小板/10gm体重)。在指定时间点采集血液并且立即通过流式细胞术分析血小板。结果是平均百分比CMFDA-标记的血小板±平均数标准误差。将输注后5分钟时的CMFDA阳性新鲜TACE+/+血小板百分比设为100％。n＝5。
图15显示唾液酸酶处理的TACE△Zn/△Zn血小板被迅速地从循环中清除。(A)糖蛋白上的β-半乳糖暴露的流式细胞分析，如使用ECL FITC-标记的凝集素所检测的。结合至用或者未用α2-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)处理的TACE+/+(白色条)或TACE△Zn/△Zn(黑色条)血小板的凝集素。显示了结合至未处理的TACE+/+血小板的平均荧光强度的比率。直方图报告了三个单独的实验的平均值±平均数标准误差。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。(B)通过流式细胞术评定GPIbα、GPV和αIIbβ3表面表达。用唾液酸酶(5mU/mL)(黑色条)或者未用唾液酸酶(白色条)处理的TACE+/+(未显示)和TACE△Zn/△Zn血小板。结果相对于在TACE△Zn/△Zn血小板上的GPIbα量来表示(相对于对照的平均值％±平均数标准误差)。n＝3。(C)将用α2-3，6，8，9-唾液酸酶(5mU/mL)(实心符号)处理或者未处理(空心符号)的新鲜、室温和荧光标记的(CMFDA)TACE+/+和TACE△Zn/△Zn血小板静脉注入到TACE+/+小鼠中(108个血小板/10g体重)。在指定时间点采集血液并且立即通过流式细胞术分析血小板。结果表示为平均百分比CMFDA-标记的血小板±平均数标准误差。将输注后5分钟时的CMFDA阳性未处理的TACE+/+血小板百分比设为100％。每点表示4只小鼠。n.s.不显著，***P＜0.0001。比较唾液酸酶处理过的TACE+/+和TACE△Zn/△Zn。
图16显示血小板的神经氨酸酶处理增加了β-半乳糖暴露(唾液酸的损失)，如通过ECL荧光凝集素结合所测量的。在血小板糖蛋白上的β-半乳糖或β-GlcNAc暴露的流式细胞分析，如用ECL I(空心条)或s-WGA(实心条)FITC-标记的凝集素所检测的。在来自产脲节杆菌(Neu)的指定浓度的α2-3，6，8，9-唾液酸酶存在和缺乏下的凝集素与新鲜小鼠血小板的结合，n＝5。
图17显示了随着神经氨酸酶浓度增加，血小板GPIbα和GPV受体的剂量依赖性损失。通过流式细胞术评定了在新鲜分离的小鼠血小板上的GPIbα和GPV表面表达。在指定浓度的α2-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)存在和缺乏下的表面受体表达。将0时间的受体表达的平均荧光设为100％。n＝4。
图18显示DANA抑制了由神经氨酸酶处理所致的β-半乳糖暴露。对小鼠血小板糖蛋白上的β-半乳糖或β-GlcNAc暴露的流式细胞分析，如上文在5mUα2-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)和竞争性唾液酸酶抑制剂DANA(Neu+DANA)存在(Neu)和缺乏(对照)下所检测的。n＝4。
图19显示DANA抑制了由神经氨酸酶处理所诱导的血小板GPIbα、GPV、GPIX以及αIIbβ3受体的损失。在5mUα2-3，6，8，9-唾液酸酶存在(灰色条)和缺乏(空心条)下通过流式细胞术测量在小鼠血小板上的表面受体表达(GPIbα、GPV、GPIX和αIIbβ3)。还显示了用唾液酸酶和DANA处理的血小板上的受体表达(黑色条)。将未处理的血小板上的受体表达的平均荧光设为100％。n＝4。
图20描绘了总血小板溶解产物(INPUT)、上清液(SUPERNATANT)和相对应的血小板沉淀(PELLET)的非诱导的免疫印迹法印迹，其显示DANA抑制了由神经氨酸酶(NA)诱导的血小板GPIbα的损失。对照表示未处理的样品。
图21是显示添加DANA完全救助了用神经氨酸酶处理的小鼠血小板的体内恢复和存活的图。对照描绘了未处理的新鲜室温的血小板的存活。
图22是显示在室温下保存的过程中血小板GPIbα和GPV受体损失因为添加DANA而受到抑制的图。
图23是描绘了在100μM金属蛋白酶(MP)抑制剂GM6001存在下神经氨酸酶处理对β-半乳糖暴露的作用的条形图。通过荧光标记的RCA-1凝集素结合来测量β-半乳糖暴露。
图24是描绘了在100μM金属蛋白酶(MP)抑制剂GM6001存在下神经氨酸酶处理对血小板GPIbα和GPV受体表面表达的作用的条形图。将MP抑制剂-神经氨酸酶上的受体表达设为100％。
图25是描绘了重组TACE(ADAM17)(TACE)和重组TACE和DANA(TACE+DANA)对血小板GPIbα和GPV受体表面表达的作用的条形图。唾液酸损失的抑制防止由金属蛋白酶TACE所致的受体裂解这个事实显示唾液酸必须在GPIbα和GPV蛋白水解之前从糖蛋白上水解。用重组TACE进行处理没有影响受体GPIX和αIIbβ3(未显示)。
图26是描绘了对在新鲜的血小板样品和在4℃和RT下保存指定的时间点的样品中的游离唾液酸(FSA)进行定量的条形图。在每个条形图的顶部还显示了FSA浓度。注意，当与在4℃下保存相等时间段的样品比较时，在RT保存的血小板样品中检测的FSA显著更高。
图27是显示检测在唾液酸酶抑制剂DANA存在或缺乏下保存在4℃或RT下的血小板样品(颜色检测时间＝TOCD)中的细菌所需要的时间的照片。在测试样品中的细菌浓度与显色的起始时间成反比，即更短的颜色检测时间＝更高的细菌浓度；更长的颜色检测时间＝更低的细菌浓度。显示了所选择的第9天样品分析的图片(A-C)。使用如在实例6所述的测定技术来检测细菌。D是显示对在唾液酸酶抑制剂DANA存在或缺乏下保存在4℃或RT下的血小板样品中的细菌分析进行定量的条形图。针对血小板样品绘制TOCD(min)。注意的是，在DANA存在下RT保存的样品所需要的时间等于4℃保存的样品，这表明DANA与4℃保存一样有效地抑制细菌生长。
图28是描绘在1mM DANA缺乏(48h)或存在(48h+DANA)下在保存溶液中冷藏保存48h的小鼠血小板的存活的线形图。显示新鲜的、分离的血小板(RT)存活用于比较，对于每个存活图，n＝7。
图29是新鲜血小板(新鲜血小板)大小和密度(A)的流式细胞分析以及DANA、唾液酸乳糖和葡萄糖对稳定的RT保存的小鼠血小板完整性的组合作用，如通过它们的大小(FSC)和密度(SSC)所判断的。在唾液酸乳糖、葡萄糖和DANA缺乏(-防腐剂)(B)和存在(+防腐剂)(C)下在RT保存48h的小鼠血小板的分析。在点图下方显示了相应的血小板数。还显示了防腐剂浓度。
图30是在指定浓度的DANA缺乏(0mM DANA)或存在下在RT保存48h的小鼠血小板的流式细胞术点图分析。注意的是，0.1mM DANA有效地保护了血小板的大小和密度，如通过点图分析(上图)所判断的。还显示了血小板计数和微珠(参照)的相应的流式细胞术直方图(下图)。
图31是描绘了在96孔PVC板(图A)的孔中存在或不存在1mM DANA下在不同介质中生长48h的粘质沙雷菌的细胞密度的条形图。图31在图B中描绘了在96孔PVC板的孔中在存在或不存在1mM DANA下在不同介质中孵育48h的粘质沙雷菌的生物膜形成。在图B中还显示，用结晶紫将在每个孔中的生物膜染色，回收该染料并在595nm下进行测量。在595nm处的吸收(A595nm)与生物膜中的细菌细胞成比例。
图32是显示在从健康受试者中分离的新鲜血小板上的末端β-半乳糖含量的差异的条形图。通过流式细胞术使用β-半乳糖特异性凝集素ECL来测量血小板表面末端半乳糖暴露，如在凝集素与聚糖结构结合的示意图中所描绘的。
图33是在添加剂(InterSol)缺乏、1mM DANA(InterSol+DANA)、10mM葡萄糖(InterSol+Glucose)以及1mM DANA加上10mM葡萄糖(InterSol+DANA+Glucose)存在下在RT保存于按体积计30％血浆和70％PAS(被称为INTERSOLTM溶液)中的小鼠血小板的流式细胞术点图分析和相应的流式细胞术(A)。注意的是，血小板群显得静息，如通过其前向散射和侧向散射特征所判断的。B是显示在具有DANA、葡萄糖或两者的InterSol溶液的门控血小板群中获取的事件的百分比的条形图。
图34是在0.5mM DANA缺乏((-)DANA)或存在((+)DANA)下保存的血小板的代表性流式细胞术点图分析(上图A)。还显示了血小板计数对侧向散射(SSC)的相应直方图(下图B)。该表表示在DANA缺乏或存在下在侧向散射(SSC-H(MFI))中测量的平均荧光强度(MFI)。
图35的图A是如图34中所述在DANA缺乏或存在下在血浆中保存人血小板之后的表面P选择素暴露的代表性流式细胞术直方图分析。使用针对P选择素的单克隆FITC结合抗体(CD62P-FITC)测量P选择素暴露。图35的图B显示了定义为M2的P选择素阳性血小板(如图35图A所示)和相应的MFI的定量。
图36是在0、0.1和0.5mM DANA存在下在30％血浆和70％PAS溶液(按体积计)(PASa，7.15mM Na2HPO4、2.24mM NaH2PO4、10mM柠檬酸钠、30mM乙酸钠、79.2mM NaCl、5.0mM KCl、以及1.5mM MgCl2，pH7.2)中在RT保存7天的人血小板的流式细胞术点图分析。血小板定义为‘G1’，而血小板微颗粒定义为‘G2’。显示每个点图的门统计。
发明详细说明
以下是本发明的优选实施例的说明。
血小板添加液(PAS)
从供体中获得血小板之后，可以将它们悬浮在被称为血小板添加液(PAS)的流体中。基本上，PAS替代了血浆的一部分，其中在血液成分单采(apheresis)过程中放置了分离的血小板。PAS是一种介质，该介质通常是一种生理上相容的水性电解质溶液。除了通常可以如以下所述的不同组合和浓度存在于这些溶液中的某些试剂之外，本发明的PAS溶液包括一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
迄今为止，使用PAS溶液是因为人们相信它们减少了过敏性和发热性输血反应、促进了ABO不相容的血小板输注、使得能够使用病原体灭活技术并且使得更多血浆可用于其他目的(例如，用于分级分离)。
本发明的一个实施例包括具有唾液酸酶抑制剂以及任选地一种聚糖修饰剂的一种PAS溶液。更确切地说，本发明包括具有一种唾液酸酶抑制剂和/或一种聚糖修饰剂的一种PAS组合物以及一种或多种PAS组分(例如，盐类、缓冲液、营养素及其任何组合)。本发明的PAS可以包括多种组分，如一种或多种盐(例如，NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2以及MgSO4)、一种或多种缓冲液(例如，乙酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐或磷酸盐)、以及营养素(例如，乙酸钠、葡萄糖酸钠、葡萄糖、麦芽糖或甘露醇)。
本发明的术语“血小板添加液”或“PAS”是指具有至少一种或多种唾液酸酶抑制剂、一种或多种保存介质组分、以及任选地一种或多种聚糖修饰剂的溶液或介质。“本发明的组合物”包括一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。短语“血小板组合物”或“血小板保存组合物”是指所得的保存组合物(在输注到接受者中之前)，其包含本发明的PAS、血小板以及任选地任何相关血浆和/或抗凝剂。
本发明的PAS的介质包含生理上相容的水性电解质溶液。这类溶液可含有如钠源、钾源、镁源、钙源、氯化物源以及磷酸盐源的溶液中的离子元素。本发明的PAS还可以含有例如可以按柠檬酸或钠盐的形式添加的柠檬酸盐源。本发明的溶液进一步包含例如碳源或营养素源，如乙酸盐、葡萄糖或葡萄糖酸盐，并且可以与一种盐组合而存在。在一个实施例中，可以包含磷酸盐源以帮助维持ATP的产生。这些元素可以按从约5mM至约450mM(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450mM)的范围内的量存在于本发明的溶液中。该溶液维持在从6.4与约7.6(例如，约7.1至约7.4)的范围内的pH下，并且优选维持在约7.2的pH下。
在一个实施例中，钠(Na)源可以按在约100与300mM之间(例如，在约150mM与约250mM之间)的量存在于本发明的PAS中。在一个具体实施例中，钠源以约190mM存在。钠可以作为盐或者组合地作为缓冲液或碳源而存在。例如，钠可以按氯化钠(NaCl)、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠或其组合的形式而存在。其他适合的钠源可以用于本发明的PAS中，包括本领域已知或者后来发现的钠源。
氯(C1)源也可以按在约40mM与约110mM之间(例如，在约60mM与约90mM之间)的量存在于本发明的PAS中。在一个具体方面，氯化物源以约87.2mM存在。氯可以按氯化钠(NaCl)、氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)或其组合的形式而存在。本领域已知或后来发现的任何氯化物源都可以用于本发明，只要其适合与本发明的PAS一起使用。主要处于NaCl形式的Na+和Cl-是张度调节剂，它有助于血小板添加液的等渗性。
在一个实施例中，钾源可存在于本发明的PAS中。它可以按在约0.5mM与约10mM之间并且例如在约3mM与约8mM之间范围内的量存在。在一个具体实施例中，钾以约5mM的量存在。钾源包括氯化钾、柠檬酸钾、乙酸钾、磷酸钾、硫酸钾或其组合。本领域已知或后来发现的其他钾源可以用于本发明。在某些方面，在介质中钾离子的存在可以帮助维持细胞内的镁离子浓度。钾离子还可涉及将丙酮酸盐转运通过线粒体膜以用于柠檬酸循环(TCA循环)中的氧化磷酸化。此外，K+通过有助于脂质和蛋白质的电连续性而在膜稳定性中起重要作用。
镁是可包含在本发明的PAS中的另一种盐。镁源可以按在约0.5mM与约2.5mM之间范围内的量并且具体地说按在约1mM与2mM之间的范围内的量而存在。在一个实施例中，镁以约1.5mM存在于本发明的PAS中。镁源包括氯化镁、柠檬酸镁、硫酸镁以及它们的组合。可以使用本领域已知或后来发现的镁源。在一个实施例中，镁离子可以按接近血浆水平、将为约3mEq/L(1.5mM)的浓度存在于本发明的PAS中。Mg2+可能是维持膜ATP酶活性所必须的。在一方面，介质中的镁离子会维持血小板中的最佳细胞间镁水平并且可以促进血小板中的氧化磷酸化，并且这样做帮助维持介质的pH。而且，Mg2+通过有助于脂质和蛋白质的电连续性而在膜稳定性中起重要作用。
钙也是可包含在本发明的PAS中的另一种盐。钙源可以按在约0.5mM与约2.5mM之间(例如，在约1mM与2mM之间)范围的量而存在。在某个实施例中，钙以约1.5mM存在于本发明的PAS中。钙源包括氯化钙、乙酸钙、柠檬酸钙或其组合。可以使用本领域已知或后来发现的钙源。
柠檬酸盐可用于缓冲该溶液。柠檬酸盐源以在约2mM与约20mM之间范围内的量并且例如以5mM和约15mM的量存在于本发明的PAS中。在一方面，本发明的PAS包含约10mM的柠檬酸盐。可在本发明中使用的柠檬酸盐源的实例包括柠檬酸钠(例如，柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠)、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸镁以及它们的组合。可以使用其他柠檬酸盐源，包括本领域已知或后来发现的柠檬酸盐源，只要它们适合于与本发明的PAS一起使用。柠檬酸盐在本发明的PAS起到多种作用：作为抗凝剂、用于TCA循环的碳源以及缓冲液。
乙酸盐也是本发明的PAS的另一种组分。乙酸盐是用作分离的血小板的营养素的一种碳源。乙酸盐源可以按在约10mM与约50mM之间范围内的量并且例如按在约25mM与约45mM之间范围内的量而存在。本发明的PAS包含约30mM的乙酸盐。乙酸盐源包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸镁或其组合。可以使用其他乙酸盐源，包括本领域已知或后来发现的乙酸盐源，只要它们适合于与本发明的PAS一起使用。乙酸用作碳和缓冲液。
在本发明的PAS中，可以提供一种营养素源。可以单独或者以各种组合来使用乙酸盐和其他碳水化合物如葡萄糖或蔗糖以及柠檬酸盐，以通过作为在柠檬酸循环中产生能量的中间代谢物源而为保存中的血小板提供能源。可以使用碳源的组合。在使用葡萄糖和/或蔗糖的情况下，该浓度可以按从约0.5mM至约25mM(例如，约2mM至约22mM)范围内的量而存在。
其他营养素可以取代本发明的PAS的乙酸盐或与其一起被包含在内。例如，草酰乙酸盐可以存在于本发明的PAS中，或者在已经将本发明的PAS添加到富含血小板的部分中之后，可以将其添加到血小板悬浮液中。草酰乙酸盐是线粒体中发现的四碳分子，它与乙酰CoA缩合而形成TCA循环(柠檬酸循环)的第一个反应。草酰乙酸盐可以直接或者以前体氨基酸如天冬氨酸的形式供应给保存的血小板。在一些实施例中，草酰乙酸盐可以按从约10mM至约45mM存在于本发明的PAS中。更具体地说，草酰乙酸盐可以按从约20mM至约40mM、或者从约24mM至约36mM、或者从约28mM至约33mM存在于本发明的PAS中。
磷酸盐(PO4)是本发明的PAS中可使用的另一种组分。磷酸盐源可以按在约5mM与约50mM之间(例如，在约20mM与40mM之间)范围内的量存在于本发明的PAS中。在一个具体实施例中，磷酸盐源以约28mM存在。磷酸盐的形式包括单磷酸钠、二磷酸钠、三磷酸钠或其组合。可以使用本领域已知的或在未来发现的其他磷酸盐源。
组分如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐可以与一种或多种盐(如钙盐、镁盐、钾盐或钠盐或者这些盐的任意子组合)组合地添加以平衡缓冲溶液的摩尔渗透压浓度。
在一个实施例中，本发明的PAS包含一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂、以及下表1中描述的组分：
表1：
Figure BDA0000415603820000211
Figure BDA0000415603820000221
在一个实施例中，还可以通过氨基酸来缓冲如在此所述的本发明的PAS。这些氨基酸可以用作主要缓冲剂或者可以连同其他缓冲剂如磷酸盐一起使用。在一个实施例中，可以使用氨基酸(组氨酸)来缓冲该保存溶液。因此，该保存溶液可以含有从约1mM至约7mM、或者从约2mM至约5mM的氨基酸。
除了上述事项之外或者作为上述事项的替代物，在此披露的PAS可以进一步包含促进氧化磷酸化的其他组分。可以将抗氧化剂添加到本发明的PAS或者血小板组合物中。抗氧化剂的实例包括谷胱甘肽、硒等。在一些实施例中，抗氧化剂可以按在约0.5μM至约3mM(例如，约1.0μM至约2mM)之间的范围内的量存在于本发明的PAS中。在一些实施例中，谷胱甘肽或其前体N乙酰半胱氨酸和/或硒可以单独地或者组合地以约0.5μM至约3mM(例如，约1.0μM至约2mM)之间的量存在于PAS中。
为了进一步促进氧化磷酸化，本发明的PAS可进一步包含帮助稳定膜的组分。例如，一种磷脂或一种混合物或者多种磷脂可以包含在保存溶液中。在一些实施例中，多种磷脂可以按从约0.1mg/mL至约7.5mg/mL(例如，在约0.25mg/mL至约5mg/mL之间)范围内的量存在于本发明的PAS中。更具体地说，L-α磷脂酰胆碱可以按在约0.1mg/mL至约7.5mg/mL(例如，约0.25mg/mL至约5mg/mL)之间的范围内的量存在于本发明的PAS中。
可以包含在本发明的PAS中的另外的组分是非必需氨基酸。例如，非必需氨基酸可以按从约0.5mM至约14mM范围内的量存在于PAS中(例如，约1.0mM至约10mM)。在一个实施例中，可以包含从约0.5mM至约14mM(例如，约1.0mM至约10mM)范围内的量的L-丙氨酸。
在本发明的PAS中可以进一步包含不饱和游离长链脂肪酸。在此所述的PAS可以含有在约从约0.05mM至约1.5mM(例如，约0.1mM至约1mM)之间的范围内的量的不饱和游离长脂肪酸。在一个实施例中，本发明的PAS可以含有从约0.05mM至约1.5mM或者约0.1mM至约1mM的棕榈酸。
美国药典(USP)注射用水(WFI)可以用作制备用于本发明的PAS的缓冲溶液的溶剂。
短语“血小板组合物”(例如，本发明的PAS和分离的血小板)是指其总体积含有按体积计在约1％至约50％之间的血浆的一种组合物。在一方面，该血小板组合物含有按体积计少于约50％(例如，少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％)的血浆。相反地，本发明的血小板保存组合物具有按体积计在约50％与约99％(例如，约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)之间的本发明的PAS，该PAS含有一种或多种唾液酸酶抑制剂、电解质溶液、磷酸盐和/或多种缓冲化合物、一种或多种碳源以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。在某些实施例中，该血小板保存组合物基本上不含血浆，主要具有本发明的PAS和血小板。在一个实施例中，血小板大体上组成总血小板组合物的按体积计的约1％。
在一个实施例中，一旦将本发明的PAS添加到分离的血小板中，则本发明的PAS构成了分离的血小板溶液的约70％并且血浆构成了分离的血小板溶液的约30％。本发明的PAS的按体积计百分比可以根据其用途，例如用于输注到慢性贫血患者或者急性贫血患者中而变化。血容量过多是一个问题，特别在罹患急性贫血的创伤患者中。因此，可以改变PAS的百分比以最小化或者避免血容量过多。
可以在保存过程中在一个或多个时间点评定本发明的PAS中的血小板组合物。可以进行血小板含量、血小板形态、代谢、细菌增殖、血小板活化程度、细胞溶解程度或其组合的评定。在此进一步描述了血小板、其功能和细菌增殖的评定，以评定血小板在输注之后被移植、在体内存活以及维持止血的能力。与未保存在本发明的PAS中的血小板相比，本发明的PAS允许血小板保存更长时间并且在输注之后具有更长的循环并维持止血。在此还进一步描述了保存时间、循环时间以及止血。
可以通过测量ATP和葡萄糖、乳酸盐以及乳酸脱氢酶(LDH)的水平来评定血小板的代谢。可以使用本领域已知的测定如生物发光测定试剂盒(西格玛(Sigma)，普尔(Poole)，多赛特(Dorset)，英国)进行ATP测量。使用本领域已知的测定如Vitros DT6011化学系统(Shield，金博尔顿(Kimbolton)，剑桥郡(Cambridgeshire)，英国)也可以测量葡萄糖、乳酸盐和LDH。血小板在代谢过程中使用碳源如乙酸盐来维持ATP(一种主要能量载体)。本发明的PAS可以将pH维持在约6.4与约7.6之间、并且优选在约7.1至约7.4之间的范围内。
申请人已经表征了若干基本机制，这些机制解释了输注接受者的血小板对不可逆不耐受性的高度敏感性并且由此引起血小板体内止血活性损失。申请人的发现涉及唾液酸和它在血小板活力中的作用。
出人意料地，申请人已经发现由血小板自身唾液酸酶催化唾液酸残基从血小板表面聚糖上水解通常导致血小板的不可逆不耐受性。申请人已进一步发现內源性唾液酸酶表面活性在血小板保存过程中实际上增加。另一个惊奇的发现是产生唾液酸酶的细菌使得血浆和血小板唾液酸糖结合物(sialioglycoconjugate)去唾液酸化，从而获得营养素，如支持细菌生长和增殖的唾液酸。参见图1A。细菌增殖导致生物膜形成、血小板活化以及聚集。去唾液酸化的血小板增强了细菌-血小板相互作用并且最终经由凝集素介导的机制而从循环中清除(图1B)。因此，唾液酸酶抑制剂的添加防止了唾液酸从血小板表面裂解，从而防止了血小板清除并延长其存活。此外，唾液酸酶抑制剂抑制了血小板制剂中的细菌增殖(图1C)。唾液酸酶抑制剂的这种双功能提供了存活时间更长的优越的血小板制剂并且减少了当在护理点输注到一位接受者中时引起细菌相关性败血症的可能性。
有了当前这些违反直觉的且令人吃惊的结果，申请人已经开发出在血小板从供体中采集之后并且在室温或低于室温下保存之前使用唾液酸酶抑制剂来有效处理血小板的方法。使用唾液酸酶抑制剂进行处理的本发明的血小板组合物与未处理的血小板相比保持更长持续时间的体内止血活性。用唾液酸酶抑制剂处理的这些本发明的血小板组合物与未处理的血小板相比可以在室温或低于室温下保存延长的时间段。根据本发明的方法保存血小板延长了血小板的贮藏寿命并帮助增加保持可用于输注且细菌增殖受抑制的血小板的供应。
正如指出，申请人的发现涉及唾液酸和它在血小板活力中的作用。唾液酸从血小板的外膜上水解被认为导致了血小板的独特且不可逆的不耐受性。研究已报道，血小板在老化和循环过程中从膜糖蛋白上释放了唾液酸，并且体外去唾液酸化的血小板被迅速地清除。唾液酸的损失暴露了基本不成熟的聚糖如β-半乳糖。已知无唾液酸糖蛋白(ASGP)受体介导了携带暴露的β-半乳糖的蛋白质、细胞和粒子的内吞作用。很多细胞，包括肝巨噬细胞和肝细胞表达并呈递(ASGP)受体。因此，人们认为当內源性唾液酸酶从该血小板表面裂解唾液酸残基时，次末端糖(penultimate sugar)如β-半乳糖暴露在血小板表面上并且血小板经历ASGP介导的摄取。
虽然已经将在血小板上的表面受体(例如，GPIb和GPV)的损失与血小板存活关联起来，但是在本发明之前，在血小板上表面唾液酸对于表面受体的作用是未知的。此外，表面唾液酸对于血小板存活的作用是不清楚的。申请人已经使用体外和体内研究来表征表面唾液酸与血小板受体损失之间的关系。因此，申请人的结果已经应用于在此所述的用于延长血小板存活的本发明的方法。表面唾液酸与血小板受体损失之间的这种关系证明是决定血小板存活的一个重要因素。申请人已经发现，抑制表面唾液酸的损失防止在体外保存过程中血小板表面受体GPIb和GPV的损失并且救助了血小板的体内存活。
例如，在室温下保存6h的小鼠血小板损失表面唾液酸，如通过在此提供的流式细胞术数据所证明的。参见例证。这种损失与表面受体GPIb和GPV的30％-60％损失相关联，但是与GPIX和整合素αIIbβ3无关联。此外，使用神经氨酸酶(NA)底物胎球蛋白处理小鼠血小板部分地将GPIb和GPV的损失降低至10％-20％。在体外，通过将α2-3，6，8-神经氨酸酶(NA；霍乱弧菌(Vibriocholerae))或者α2-3，6，-NA(产气荚膜梭菌)添加到小鼠血小板中而使得唾液酸从血小板表面裂解。唾液酸的除去与表面GPIbα和GPV的50％-60％的除去相关联，但是与GPIX和整合素αIIbβ3无关联。添加胎球蛋白或者更特定的唾液酸酶抑制剂2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)的钠盐完全防止了这种损失，如通过流式细胞术和也在此提供的蛋白质印迹分析两者所测定的。
在冷却后血小板的清除加剧。已经发现，人血小板的冷却引起了血小板表面上的冯·维勒布兰德(von Willebrand)因子(vWf)受体复合物α亚基(GPIbα)复合物的成簇。在血小板表面上的(GPIbα)复合物的成簇引出由巨噬细胞补体三型受体(αMβ2，CR3)进行的体外和体内识别。CR3受体识别血小板表面上具有末端β-GlcNAc的N-连接的糖，它们已经形成GPIbα复合物并吞噬了血小板，从而从循环中清除血小板并导致伴随的止血功能损失。尽管通过半乳糖基化对该β-GlcNAc部分进行封端防止了短期冷却的血小板的清除，但是这种策略在延长冷藏(例如，血小板的冷藏长于5天)之后是无效的。延长的冷藏进一步增加了在血小板GPIbα上暴露的半乳糖残基的密度和浓度，使得肝细胞通过Ashwell-Morell受体(ASGP受体或者肝凝集素)结合而变得越来越多地涉及血小板去除。巨噬细胞迅速地除去输注的血小板的大部分，不依赖于它们的保存条件。在延长的血小板冷冻的情况下，肝细胞依赖性清除进一步减少了输注后的血小板恢复和存活。通过β2整合素和Ashwell-Morell受体两者抑制冷冻的血小板清除可以提供一种用于在冷处保存血小板的潜在简单的方法。
正如所指出的，申请人已经发现，唾液酸酶活性是血小板来源的而非血浆来源的，并且唾液酸酶活性在保存血小板过程中显著增加。确切地说，申请人已经发现，人血小板含有唾液酸酶Neu1和Neu3，并且在室温下将Neu1释放到血浆中，并且当保存在冷处时释放更多，这表明释放的Neu1涉及从血小板表面的聚糖上除去表面唾液酸。
本发明提供了用于延长体内止血活性并减少血小板清除的多种血小板组合物和方法，其中血小板是从一个供体中获得的并用一种唾液酸酶抑制剂处理以抵消內源性唾液酸酶活性的作用并抑制细菌增殖。还提供了用于延长有活力的血小板(如哺乳动物血小板、特别是人血小板)的保存的多种组合物和方法。本发明还提供了用于制备改进的血小板组合物的多种方法。
在某些方面，本发明提供了具有增强的循环特性并且保持大致上正常的体内止血活性的多种血小板组合物。在某些实施例中，本发明提供了一种包含一种或多种唾液酸酶抑制剂的新型血小板组合物。正如所指出的，多种唾液酸酶催化末端唾液酸残基从宿主细胞受体上的水解。因此，在本发明的多个方面使用了多种唾液酸酶抑制剂以减小唾液酸酶活性、防止末端唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解、抑制细菌增殖并且延长用于输注的血小板的体内止血活性。
本发明提供了多种血小板组合物和制备、保存并保藏血小板组合物的多种相关方法，这些方法在血小板已经保存在室温或低于室温下之后增强血小板功能和/或允许血小板保持大致上正常的体内止血活性。已经发现某些基本机制并且这些机制导致血小板输注接受者的血小板经历不可逆不耐受性的高度敏感性或血小板体内止血活性损失。唾液酸酶引起的唾液酸残基从血小板表面聚糖上水解导致血小板的不可逆不耐受性。“不可逆不耐受性”是指血小板在经受低于室温的温度后不能保持或者返回正常的血小板功能存活。“血小板活力”被定义为血小板在体内存活的能力。
本发明提供了抑制从供体中分离并保存在室温或低于室温下的血小板中的唾液酸酶活性的多种血小板组合物和方法。因此，在某些方面，本发明提供了具有一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂的多种组合物。在其他方面，本发明提供了用于增加具有一种或多种唾液酸酶抑制剂的多种血小板组合物的循环时间的多种方法。本发明进一步提供了用于降低保存血小板温度(增加了血小板的保存时间)的多种血小板组合物和方法，以及用于减少哺乳动物中的血小板群的清除或者增加血小板群的循环时间的方法。还提供了用于保藏具有保留的止血活性的血小板的多种血小板组合物和方法，以及用于制备血小板组合物及含有血小板组合物的其药用组合物和用于对哺乳动物给予这些药物组合物以介导止血的多种方法。还提供了用于处理一种血小板制剂以供保存的多种试剂盒和用于保存该血小板制剂的多种容器。
血小板及其分离方式
在此使用的术语“分离的”意指从其天然环境中分开。如在此使用的关于血小板群，分离的是指从哺乳动物的血液中移出血小板。
基于标准血液收集方法，通常存在两种类型的捐献的血小板：随机供体血小板和单一供体血小板。随机供体血小板是借助于由本领域技术人员实践的若干标准方法中的任何一种方法而从全血捐献物中分离的血小板，并且两种或更多种随机供体血小板随后在输注到患者中之前以足以构成治疗剂量的量合并。也可以在不合并的情况下将单一随机供体血小板用于小儿科患者。目前的标准方法包括从血沉棕黄层、血小板纽块(platelet button)、富含血小板的血浆等中分离随机供体血小板。单一供体血小板是从一个供体通过在血液成分单采器(apheresis machine)中离心分离中获得的、其量足以构成用于随后输注给一位或多位患者的一个或多个治疗剂量的血小板。目前用于收集单一供体血小板的血液成分单采器是由公司如Terumo BCT(泰尔茂公司(Terumo Corporation))、汾沃公司(Fenwal Inc.)以及血液技术公司(Haemonetics Corporation)制造的。目前的AABB(从前的美国血库协会(American Association of Blood Banks))标准将血小板的治疗剂量定义为大约≥3×1011个血小板。
为了执行在此所述的这些方法，随机供体血小板抑或单一供体血小板借助本领域技术人员已知的标准技术来从供体中分离。用如在此所述的一种或多种唾液酸酶抑制剂和/或聚糖修饰剂处理分离的血小板制剂。
随机供体血小板是从全血捐献物中获得的。全血可以从供体中获得并且可以根据所希望的血液组分的类型通过一种适合的方法来制备。本发明涉及血沉棕黄层、血小板纽块、血小板浓缩物、富含血小板的血浆等形式的分离血小板。
全血由多种组分组成，包括血浆、红细胞、血小板、白细胞及其他组分。因此，除了血小板之外，当从供体中获得血液单位时可以分离并且制备全血的其他组分(例如，红细胞、血浆等)。通常通过静脉穿刺从供体中收集全血。其中存放血液的容器(例如，袋和管)可以含有抗凝剂如柠檬酸盐或基于柠檬酸盐右旋糖的组分，例如柠檬酸盐磷酸盐右旋糖(CPD或者CP2D)、柠檬酸盐磷酸盐右旋糖腺嘌呤1(CPDA-1)。
在常规血液收集过程中，将含有70mL抗凝剂的600mL袋用于收集大约500mL±10％的全血或者将含有63mL抗凝剂的该袋用于收集450mL±10％的全血。全血收集袋常常具有附接至其上以容纳分离的组分的多个卫星袋。在收集全血的时候，还收集供体血液样品管以用于在对每种血液捐献物进行某些需要的测试时使用，测试包括ABO和Rh测定、感染疾病标记等等。
通常通过离心从全血和其他血液组分中分离血小板。离心技术允许通过其不同密度分离各种血液组分。因此，离心的结果是，全血的液体和细胞成分被分成不同的层，其范围是从最密集的红细胞(RBC)至最不密集的血浆。离心的时间根据离心机和由离心机提供的重力(g-force)而变化。可以由本领域技术人员确定离心的时间量。如索福(Sorvall)和贝克曼(Beckman)公司制造了可用于此过程的离心机。
适当离心(例如，轻轻的旋转)使得袋在其远端含有大量的RBC，并在其近端含有大量的富含血小板的血浆(PRP)(血小板和血浆的混合物)，其中在两层之间主要由白细胞形成一个弯月面。通过使用血浆挤压器或提取器(由公司如汾沃公司和泰尔茂公司制造)，将PRP挤压到一个卫星袋中，留下大量RBC在原始全血收集袋中。
再次对含有PRP的卫星袋进行离心(剧烈旋转)以使血浆与血小板分离。在再次离心时，血小板由于它们更大的密度而形成被称为血小板纽块的松散聚集的簇。通过使用血浆挤压器或提取器，然后可以将贫血小板血浆(PPP)挤压到第二个卫星袋中，留下血小板纽块和小体积的血浆(一起被称为血小板浓缩物)在第一个卫星袋中。该血小板浓缩物由大约30至70mL的体积组成并且该PPP由大约180至320mL的流体体积组成。每种分离的血液组分即RBC、PPP以及血小板浓缩物被称为“单位”并且每种单位被分开地输注。
通常，血小板浓缩物袋含有最少5.5×109个血小板。将血小板浓缩物单位在20℃-24℃下保存在机械旋转器上。未用本发明的组合物处理的血小板具有约5天的贮藏寿命。
如通常由本领域技术人员所实践的，合并4至6个血小板浓缩物单位，以获得用于输注给患者的一个单一治疗剂量。合并的血小板浓缩物具有约3.0×1011个或更多个血小板。通过这个过程获得的合并的和未合并的血小板浓缩物包含一种形式的“分离的血小板”，分离的血小板可以在本发明中进行利用或者可以用在此所述的本发明的组合物进行处理。在一个具体实施例中，用于合并该血小板浓缩物的袋可以具有在其中描述的本发明的组合物(例如，唾液酸酶抑制剂和/或聚糖修饰剂)，如在此所进一步描述的。可替代地，可以在合并之前、之后或期间将本发明的组合物添加到血小板浓缩物中。
随机供体血小板还可以通过通常在欧洲和加拿大使用的“血沉棕黄层”方法来分离。如在此所述地获得全血并使全血经历剧烈的旋转离心。该剧烈的旋转使得该袋具有作为顶部部分的血浆、作为底部部分的红细胞以及含有血小板和白细胞的中间层。这个中间层被称为血沉棕黄层。
出于产生血沉棕黄层制备的血小板的目的，通常通过取决于其中收集全血的袋的形式的两种方法之一来分离并合并血沉棕黄层。第一种方法被称为“顶部和底部排出法”，在该方法中其中收集全血的袋具有一个顶部和底部排出管，一个或多个卫星容器附接到每个端部上。一个提取器(例如，来自汾沃的
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提取器)将该袋压平，以使得该血浆层通过顶部排出管排出并且红细胞通过底部排出管排出。该提取器被设计成使得主要含有血小板和白细胞以及小体积的血浆和RBC的血沉棕黄层(共包含大约30至60mL的流体体积)保留在袋内。合并大约4至6个血沉棕黄层单位以制备用于输注给患者的治疗剂量的血小板。在合并时，多个单独的血沉棕黄层单位以通常被称为“链式法”的链形式无菌地连接(例如，袋的底部排出管连接到下一个袋的顶部排出管，以此类推)。血小板添加液或者血浆可以无菌地连接至链上并且用于帮助冲洗多个单独的血沉棕黄层容器，同时血沉棕黄层与血小板添加液或血浆一起转移到底部合并袋中。
用于分离并合并血沉棕黄层制备的血小板的第二种方法是利用如用于与PRP制备的血小板一起使用的相似的全血收集袋。在如先前所述分离全血中的血沉棕黄层之后，通过以下方式使血沉棕黄层从全血中分离：首先将血浆移入到多个附接的卫星容器之一中并将血沉棕黄层转移到第二个附接的卫星容器中，这有时被称为“使血沉棕黄层乳化”，留下RBC在原始容器中。合并大约4至6个血沉棕黄层单位以制备用于输注给患者的治疗剂量的血小板。在合并时，无菌地连接多个单独的血沉棕黄层单位并且将它们与血小板添加液或者血浆一起合并到一个合并容器中。在这个方法中，该合并袋具有多个对接部(dock)(例如，像“蜘蛛”的腿)，多个单独的单位连接到其上。随后使用血小板添加液或血浆作为冲洗剂来将每个血沉棕黄层单位从单独的袋中转移到合并袋中以帮助减少合并中的血小板损失。这种合并方法有时被称为“蜘蛛方法”并且也可以与通过顶部和底部分离而制备的血沉棕黄层一起使用。
无论用于合并多个单独的单位的方法如何，该合并的袋都再次经历离心作用。这种离心作用是长时间的、轻轻的旋转，其中在合并袋的顶部形成含有血小板和血浆/血小板添加液的一部分并且余下的红细胞和白细胞变成底部部分的一部分。使用血浆挤压器或提取器，将血小板和血浆/血小板添加液的顶层转移到另一个袋中，从而得到治疗剂量的血小板。
单一供体血小板是从一个供体通过在自动化血液成分单采器中离心分离获得的、其量足以构成用于随后输注给一位或多位患者的一个或多个治疗剂量的血小板。通过这种方法分离的血小板通常被称为单一供体血小板，因为可以从一位单一供体中收集一个治疗剂量。在这种程序中，供体的血液从静脉穿刺点流动通过无菌离心机，在其中血小板和一定体积的血浆离心地分开并分离，余量的供体血液通过初始静脉穿刺或者第二个静脉穿刺点返回到该供体中。在此所述的抗凝剂组合物可以被添加到血小板中或者存在于其中收集血小板的袋中。各种自动化血液成分单采设备可从如美国血液技术公司(马萨诸塞州布伦特里(Braintree，MA))、泰尔茂BCT(科罗拉多州莱克伍德(Lakewood，CO))、汾沃公司(伊利诺斯州苏黎世湖(Lake Zurich，IL))以及费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi)(德国弗里德堡(Friedberg，Germany))的公司商购。
通过血液成分单采术收集血小板通常产生2个血小板单位，其中每个单位含有大约200至300mL的血浆和大约3.5×1011个血小板。单一供体血小板可以在20℃-24℃下保存约5天。
血液成分单采术收集试剂盒常常包含两个血小板收集袋，因为大部分血液成分单采器收集两个单位的血小板。如在此所述的本发明的组合物可以被包含在血液成分单采器的血小板收集袋中或者可以在使用无菌连接技术收集血小板之前、期间或者之后被添加到该袋中。血小板收集袋可以制造有本发明的组合物并且进一步包含另外的组分，如，如在此所述或者本领域已知的抗凝剂组合物。
在通过血液成分单采术收集血小板之后，血小板可以悬浮在如在此所述的本发明的PAS中。
本发明的这些组合物和方法可以用于通过本领域已知或者未来开发的任何技术来分离的血小板，只要获得治疗浓度的血小板即可。
本发明包括含有如在此所述的唾液酸酶抑制剂和/或聚糖修饰剂组合物或者“本发明的组合物”的多种袋或容器。基于血小板分离过程，本发明的组合物可以被包含在各种血小板收集袋中或者与这些收集袋一起制造。血小板收集袋可以是气体可渗透的或者是由塑性材料如PVC材料制成的。血小板收集袋可以在随机供体收集过程或者在单一供体收集过程中使用。关于随机供体收集过程，可以将本发明的组合物放入到其中合并了多个血小板单位的收集袋中；因此本发明包括具有本发明的组合物的合并收集袋。
类似地，在单一供体收集过程中，本发明的组合物可以被包含在单采血小板收集袋中。与本发明的组合物一起，这些袋包含在血液成分单采过程中使用的其他组分，如多种抗凝剂组合物。
常规血小板袋或包是由这样的材料形成的：它们被设计并由充分可渗透的材料构造成，以最大化到该包的气体运进和运出(运进O2并运出CO2)。本发明允许在低于室温或在室温下保存血小板，如在此进一步所描述的。在此所述的方法减少或降低了在保存过程中血小板所产生的CO2的量。因此，在一个实施例中，本发明进一步提供了对CO2和/或O2基本上不可渗透的血小板容器，这些容器特别适合用于冷保存血小板。在另一个实施例中，这些容器或袋包括气体可渗透的容器。
有了上文所述的任一收集过程，可以使用无菌技术或者连接可替代地将本发明的组合物添加到分离的血小板中。在此情况下，本发明的组合物可以在单独的袋、容器、注射器、管或其他类似血液收集介质中分开地销售。
在一个实施例中，使本发明的具有如在此所进一步描述的唾液酸酶抑制剂和/或聚糖修饰剂的组合物与一个封闭系统(例如，一个无菌的密封血小板包)中的血小板接触，以便避免微生物污染。典型地，在血小板获取或输注过程中静脉穿刺导管是该包上的唯一开口。因此，为了在用本发明的组合物处理血小板的过程中维持一个封闭系统，将这种组合物放在一个相对小的无菌容器中，该容器通过一个无菌连接管附接到该血小板包上(参见，例如美国专利号4,412,835，该专利的内容通过引用结合在此)。该连接管可以是可逆地密封的或者具有一个可破坏的密封，如本领域技术人员将会知道的。在分离血小板之后，打开对包含本发明的组合物的容器的密封并将该组合物引入到该血小板袋中。在一个实施例中，本发明的组合物被包含在一个单独的容器中，该容器具有一个单独可再密封的连接管，以允许将该组合物连续地添加到血小板中。
唾液酸酶抑制剂
一旦获得分离的血小板，用本发明的组合物来处理血小板，该组合物包含一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种保存增强组合物如聚糖修饰剂(例如，单糖类，如阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、核糖、葡萄糖酸、半乳糖胺、葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、胞壁酸、唾液酸(N-乙酰神经氨酸)；和核苷酸糖，如胞嘧啶核苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP唾液酸)、尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖(UDP半乳糖)以及UDP半乳糖前体，如UDP-葡萄糖)。在一些优选实施例中，聚糖修饰剂是UDP半乳糖和/或CMP唾液酸。本发明的组合物包含一种“混合物(cocktail)”，这些成分中的一种以上或者这些成分的一个组合被包含在内。短语“组合物”或“本发明的组合物”是指一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
如在此使用的“唾液酸酶(Sialidase enzyme)”、“唾液酸酶(Sialidase)”也被称为“神经氨酸酶”，它们是裂解神经氨酸的糖苷键的糖苷水解酶。唾液酸酶催化末端唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解。参见图8。因此，在本发明的若干方面使用了多种唾液酸酶抑制剂。唾液酸酶抑制剂降低了唾液酸酶的活性、防止了末端唾液酸残基从血小板表面聚糖上水解、保护了血小板表面聚糖的完整性、并且/或者维持了在输注之前保存的血小板的功能。
唾液酸酶/神经氨酸酶是在一系列生物中发现的一个大家族。神经氨酸酶是裂解神经氨酸的糖苷键的糖苷水解酶(EC3.2.1.18)。广泛已知的神经氨酸酶是一种病毒神经氨酸酶，该病毒神经氨酸酶是防止流感感染的药物靶标。在哺乳动物细胞中发现了其他同系物，并且至少四种哺乳动物唾液酸酶同系物已经描述在人类基因组中[例如，Neu1(Uniprot登录号：Q5JQI0、Q99519)、Neu2(Q9Y3R4)、Neu3(Q9UQ49.1)以及Neu4(A8K056、B3KR54、Q8WWR8)]。
如在此使用的“唾液酸酶抑制剂”或“神经氨酸酶抑制剂”可以是任何化合物、小分子、肽、蛋白质、适体、核酶、RNAi或者反义寡核苷酸等。如在此使用的“抑制”意指干扰酶的结合或活性。抑制可以是部分或者总体的，引起酶的活性降低或调节，如所检测到的。
例如，根据本发明的唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂可以是针对神经氨酸酶蛋白的一种蛋白质，如一种抗体(单克隆的、多克隆的、人源化的，等等)或其结合片段。一种抗体片段可以是除全长形式之外的一种抗体形式，并且除已被工程化的抗体片段之外，包括存在于全长抗体内的部分或组分。抗体片段可包括但不限于：单链Fv(scFv)、双链抗体、Fv以及(Fab’)2、三链抗体、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的多种组合、可变区、四链抗体、双功能杂交抗体、框架区、恒定区，等等(参见梅娜德(Maynard)等，(2000)生物医学工程年评(Ann.Rev.Biomed.Eng.)2：339-76；哈德逊(Hudson)(1998)生物技术新观点(Curr.Opin.Biotechnol.)9：395-402)。抗体可商购获得、定制产生、或者根据本领域建立的多种方法针对感兴趣的抗原来合成(詹恩伟(Janeway)等，(2001)免疫生物学(Immunobiology)，第5版，Garland出版社(GarlandPublishing))。
另外，一种唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂可以是结合一种神经氨酸酶(例如，一种细菌神经氨酸酶)的非抗体肽或多肽。一种肽或多肽可以是除全长形式之外的感兴趣的蛋白质分子的一部分，并且包括是存在于感兴趣的蛋白质分子的全长氨基酸序列内的更小组分的肽。这些肽可以商购获得或者经由多种液相或固相合成方法来合成(艾瑟顿(Atherton)等，(1989)固相肽合成：一种实用方法(Solid Phase Peptide Synthesis：a Practical Approach.)，IRL新闻出版社(IRLPress)，英国牛津)。这些肽或者蛋白质相关唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂可以从天然来源中分离、经基因工程化或化学制备。这些方法在本领域是众所周知的。
一种唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂还可以是结合神经氨酸酶并破坏其功能的一种小分子。小分子是通常具有低分子量的各种各样的合成和天然物质。它们通常从天然来源(例如，植物、真菌、微生物等)中分离、商购获得和/或可用作库或收集、或被合成。候选唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂小分子可经由计算机(in silico)筛查或者高通量(HTP)筛查组合文库来鉴定。大多数常规药物如阿司匹林、青霉素和很多化学治疗药物都是小分子、都可商购获得、都可化学合成或者从如下文所述的随机或组合文库中获得(维尔纳(Werner)等，(2006)功能基因组与蛋白质组学简报(Brief Funct.Genomic Proteomic)5(1)：32-6)。在本发明的一个优选实施例中，一种小分子唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)的钠盐。
根据本发明，该唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂还可以是FDA批准的病毒唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂，如该病毒唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂奥司他韦，也被称为(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸乙酯(达菲(Tamiflu)，基因技术公司(Genentech)，马萨诸塞州坎布里奇(Cambridge，Massachusetts))；扎那米韦，也被称为((2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸)(瑞乐沙(Relenza)；葛兰素史克公司(Glaxo Smith Kline)，北卡罗来纳州三角研究园(Research Triangle Park，N.C.))；以及帕拉米韦((1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸)(BioCryst公司，亚拉巴马州伯明翰(Birmingham，Ala.))或其变体。例如，病毒唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂奥司他韦是乙酯前药，它可以从罗氏研究所(RocheLaboratories)(新泽西州纳特里(Nutley，N.J.))购得。也可以对FDA批准的病毒唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂的氨基酸序列衍生化，例如承受除氨基酸残基的插入、缺失或取代之外的修饰，由此引起原始产物的改变(一种变体)。这些修饰本质上可以是共价的并且包括例如与脂质、其他有机部分、无机部分以及聚合物的化学结合。关于病毒唾液酸酶/神经氨酸酶抑制剂的综述，请参见“对抗流感的战争：唾液酸酶抑制剂的发现和发展(The war against influenza：discoveryand development of sialidase inhibitors)。”自然评论·药物发现(Nature ReviewsDrug Discovery)(2007)6(12)：967-74.柯兰波(Klumpp)等人，(2006)医药化学当前论题(Curr.Top.Med.Chem.)6(5)：423-34；张(Zhang)等人，(2006)医药化学短评(Mini Rev.Med.Chem)6(4)：429-48；杰弗逊(Jefferson)等人，(2006)柳叶刀(Lancet)367(9507)：303-13；阿莱姆瓦(Alymova)等人，(2005)当前药物靶点-传染性病症(Curr Drug Targets Infect.Disord)5(4)：401-9；莫斯卡娜(Moscona)(2005)新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)353(13)：1363-73；德克拉克(De Clercq)(2004)临床病毒学杂志(J.Clin.Virol.)30(2)：115-33；史迪华(Stiver)(2003)加拿大医学协会期刊(CMAJ)168(1)：49-56；牛津(Oxford)等人，(2003)抗感染治疗的名家综述(Expert Rev.Anti.Infect.Ther.)1(2)：337-42；切尔(Cheer)等人，(2002)美国呼吸医学杂志(Am.J.Respir.Med.)1(2)：147-52；西德维尔(Sidewell)等人，(2002)研究用药物的专家意见(ExpertOpin.Investig.Drugs.)11(6)：859-69；多赛特(Doucette)等人，(2001)药理治疗专家意见杂志(Expert Opin.Pharmacother.)2(10)：1671-83；杨(Young)等人，(2001)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.356(1416)：1905-13；卢(Lew)等人，(2000)当今医药化学(Curr.Med.Chem.)7(6)：663-72)；泰勒(Taylor)等人，(1996)现代结构生物学评论(Curr.Opin.Struct.Biol.)19966(6)：830-7；以及公开的美国专利申请号2009/0175805、2006/0057658、2008/0199845和2004/0062801，其中每份文献的全部内容通过引用结合在此。
因此，一种“唾液酸酶抑制剂”包括但不限于以下各项中的一种或多种：胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；奥司他韦((3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；扎那米韦((2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸)；拉尼娜米韦((4S，5R，6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimidamido)-6-[(1R，2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸)；以及帕拉米韦((1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环己烷-1-羧酸)或其药学上可接受的盐。在又另一个优选实施例中，该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐或其组合。用于本发明的多种唾液酸酶抑制剂包括本领域已知的抑制剂或者后来研发的抑制剂。
如在此使用的“聚糖”或“聚糖残基”是血小板的表面上的多糖部分，例如GPIbα多糖。一个“末端”聚糖残基是在多糖链的末端处的单糖/糖残基，该多糖链典型地附接到血小板表面上的多肽上。聚糖修饰剂包括修饰血小板上的聚糖残基的一种试剂。该聚糖修饰剂修复了发生在聚糖残基上的裂解。在一个实施例中，该聚糖修饰剂改变了血小板表面上的GPIbα多糖链的糖残基。
唾液酸酶抑制剂用于保护聚糖结构并且确切地说聚糖末端的完整性，而聚糖修饰剂用于通过将单糖添加到该聚糖上来修饰或修复聚糖。因此，唾液酸酶抑制剂和聚糖修饰剂具有多种不同且互补的功能。
如在此使用的“聚糖修饰剂”包括单糖，如阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、核糖、葡萄糖酸、半乳糖胺、葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、胞壁酸、唾液酸(N-乙酰神经氨酸)；和核苷酸糖，如胞嘧啶核苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP唾液酸)、尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖(UDP半乳糖)以及UDP半乳糖前体，如UDP-葡萄糖。聚糖修饰剂包括CMP唾液酸或UDP半乳糖的前体。在一些优选实施例中，聚糖修饰剂是UDP半乳糖或CMP唾液酸。
UDP半乳糖是半乳糖代谢中的中间体，它通过酶UDP-葡萄糖-α-D-半乳糖-1-磷酸尿甙基转化酶形成的，该酶催化葡萄糖-1-磷酸从UDP-葡萄糖中释放并交换半乳糖-1-磷酸从而产生UDP半乳糖。UDP半乳糖和唾液酸可从若干商业供应者如西格玛(Sigma)购得。此外，用于合成和生产UDP半乳糖的方法在本领域已知并且描述在文献中(参见，例如刘(Liu)等人，化学生物化学(ChemBioChem)3,348-355,2002；海德拉斯(Heidlas)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)57,152-157；博特勒(Butler)等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)8,281-284,2000；小泉(Koizumi)等人，碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)316,179-183,1999；远藤(Endo)等人，应用微生物学和生物技术(Appl.Microbiol.，Biotechnol.)53,257-261,2000)。UDP半乳糖前体是可以转化(例如，酶促地或生物化学地)为UDP半乳糖的分子、化合物或中间体化合物。UDP半乳糖前体的一个非限制性实例是UDP-葡萄糖。在某些实施例中，将使UDP半乳糖前体转化为UDP半乳糖的一种酶添加到反应混合物中(例如，在一个血小板容器中)。
在某些实施例中，聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。在另外的实施例中，包含CMP唾液酸前体的血小板组合物进一步包含使CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸的一种酶。在某些实施例中，该聚糖修饰剂是CMP唾液酸。在某些实施例中，该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。在某些实施例中，这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
在某些实施例中，唾液酸酶抑制剂是一种蛋白质。在另外的实施例中，唾液酸酶抑制剂是针对一种神经氨酸酶蛋白的一种抗体，其中该抗体是单克隆的、多克隆的、人源化的，或是其结合片段。在某些实施例中，包含是一种蛋白质或一种抗体的一种唾液酸酶抑制剂的这些方法进一步包含有效量的至少一种聚糖修饰剂。在某些实施例中，该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。在某些实施例中，该CMP唾液酸前体进一步包含使CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸的一种酶。在某些实施例中，该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。在某些实施例中，这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
处理血小板
通过本发明的组合物来处理分离的血小板。简而言之，总过程描述如下。在被分离的一段时间内，使本发明的组合物与分离的血小板接触，从而获得一种处理的血小板组合物(例如，在此被称为一种“血小板组合物”)。该血小板组合物可以保存在室温或低温下并且随后被加温。将该血小板组合物输注到需要血小板的个体中，用本发明的组合物进行处理的结果是，这些输注的血小板与未处理的血小板相比，展现出减少的细菌增殖并且在体内保持更长时间的循环并且维持更长时间的止血。
在一个实施例中，该血小板组合物包含如在此所述的这些唾液酸酶抑制剂中的一种或多种。在某个实施例中，DANA被用作唾液酸酶抑制剂。在其中使用了本发明的组合物的一种混合物的一个实施例中，除该唾液酸酶抑制剂之外，可以添加聚糖修饰剂如UDP半乳糖和/或CMP唾液酸。
在如在此所述地或者使用本领域已知的其他方法分离血小板之后，用本发明的组合物处理血小板。使本发明的组合物与分离的血小板接触，血小板的量为降低唾液酸酶活性、抑制细菌增殖、允许血小板维持止血、并且/或者允许血小板保持活化和形成凝块的能力的量。在一个实施例中，一种唾液酸酶抑制剂或与一种或多种聚糖修饰剂组合的一种唾液酸酶抑制剂的一个有效量是该唾液酸酶抑制剂或与保护或改变血小板表面上的聚糖残基的足够数量的一种或多种聚糖修饰剂组合的唾液酸酶抑制剂的使得当引入血小板群时能降低唾液酸酶活性、抑制细菌增殖、并且/或者在将血小板输注到哺乳动物中之后增加血小板的循环时间或者减少血小板群清除的量。
例如，与分离的血小板接触的一种唾液酸酶抑制剂和/或一种聚糖修饰剂的一个“有效量”的范围是从约1微摩尔至约2,000微摩尔、并且最优选是约200微摩尔至约1.2毫摩尔(例如，在约1与10微摩尔、约1与约100微摩尔、约100与约500微摩尔、约500微摩尔与约1.0毫摩尔、约1.0与约1.5毫摩尔、以及约1.0与约2.0毫摩尔之间)。在另一方面，是在约10微摩尔至约1000微摩尔之间、在约100微摩尔至约150微摩尔之间、或者在约200微摩尔至约1200微摩尔之间的范围内。
当使用本发明的混合物时，可以如下用一种唾液酸酶抑制剂或与一种或多种聚糖修饰剂组合的一种唾液酸酶抑制剂来对血小板进行修饰。使血小板群与所选择的唾液酸酶抑制剂或和一种或多种聚糖修饰剂组合的唾液酸酶抑制剂接触。可以同时或按顺序地使用多种唾液酸酶抑制剂和/或聚糖修饰剂(例如，两种、三种、四种或更多种)。如果按时间顺序使用，则在时间上足够近地提供这些唾液酸酶抑制剂和/或聚糖修饰剂以获得所希望的效果。在一些实施例中，将0.1-500mU/mL半乳糖转移酶或唾液酸转移酶添加到血小板群中。使用凝集素如FITC-ECL或sWGA结合可以在功能上监测半乳糖转移。聚糖修饰反应的目标是将sWGA结合降低到静息室温sWGA结合水平。可以使用14C-UDP半乳糖对半乳糖转移进行定量。使UDP半乳糖与14C-UDP半乳糖混合以获得适当的半乳糖转移。彻底地洗涤血小板并且使用一个γ-计数器来测量掺入的放射性。所测量的cpm(每分钟计数)允许计算掺入的半乳糖。相似的凝集素结合技术可适用于监测唾液酸转移。
在出现显著的唾液酸水解之前的一个时间段内，可以用该血小板组合物来处理分离的血小板。可以在分离过程中、分离过程后不久或者在另一个时间段内将该组合物添加到血小板中。
当通过如在此所述的血液成分单采术来从供体循环中移出单一供体血小板时，可以按无菌方式添加本发明的组合物。例如，在通过血液成分单采器离心血液并且使血小板与余下的血液组分分开之后，可以将本发明的组合物添加到含有血小板的袋中。在另一个实施例中，在离心之后存放血小板的采集袋可以已经含有本发明的组合物。在另一个实施例，可以将本发明的组合物添加到其中在收集血小板的同时收集血小板的袋中。一旦血小板与本发明的组合物接触，可以混合或搅拌(例如，将袋朝下和朝上翻转)这些组分，以确保血小板与本发明的组合物接触。在这个实例中，在收集血小板与用本发明的组合物进行处理之间有很少或没有时间间隔。因此，在血小板捐献过程中或者血小板分离后不久(例如，在血小板分离内的1分钟与约120分钟之间)可以使本发明的组合物与分离的血小板接触。
在一个实施例，在捐献之后“立即”、在捐献之后的一定时间段内或者在捐献过程的“同时”可以将本发明的组合物添加到分离的血小板中。在一个实施例中，在约1分钟与6小时之间的范围内(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分钟、11/2h、2h、21/2h、3h、31/2h、4h、41/2h、5h、51/2h、6h)使本发明的组合物与血小板接触。
当随机供体血小板从多个供体中分离时，可以在从全血中分离血小板之后添加本发明的组合物。在一个实施例中，当合并来自这些供体的血小板时，可以将本发明的组合物添加到血小板中。通常容纳约6个单位的随机供体血小板的合并袋可以包含本发明的组合物，使得当将血小板添加到该合并袋中时，分离的血小板与该组合物接触。可替代地，在合并血小板的过程中或者之后，该组合物可以无菌地连接至该合并袋并且被引入到该合并袋中。不管怎样，本发明的这些方法包括在约1小时至约8小时内(例如，在1小时与约3小时之间)接触分离的血小板。在一个实施例中，使本发明的组合物与分离的血小板接触应当在冷藏血小板之前进行。
仍然根据本发明的又另一个方面，提供了一种用于收集和处理血小板的装置。该装置具有用于收集血小板的一个容器或袋，其中该容器或袋包含本发明的组合物。在另一个实施例中，该装置包括含有分离的血小板的一个容器或袋以及至少一个卫星容器或袋，其中该卫星容器包含本发明的组合物。含有血小板的袋和含有本发明的组合物的袋可以彼此处于无菌连通。
血小板在与本发明的组合物接触之后可以被保存在室温下或者被冷藏。在某些方面，冷藏血小板使得能够保存更长的时间段。然而，如在此所进一步描述的，唾液酸酶抑制剂抑制了细菌增殖并允许血小板保存在室温下。
在某些实施例中，本发明的血小板组合物包含有效量的一种唾液酸酶抑制剂，该唾液酸酶抑制剂在已经从一个供体中获得血小板之后被添加到血小板群中。在另一个实施例中，新型血小板组合物包含有效量的一种唾液酸酶抑制剂，该唾液酸酶抑制剂在已经从一个供体中获得血小板之后被添加到血小板群中，并且将所得的血小板组合物在室温下保存一段时间而没有体内止血活性和抑制细菌增殖的实质性损失。在另一个优选的实施例中，新型血小板组合物包含有效量的一种唾液酸酶抑制剂，该唾液酸酶抑制剂在已经从一个供体中获得血小板之后被添加到血小板群中；冷却所得的血小板组合物至低于室温的温度；在低于室温的温度下保存一段时间并且复温回至室温而没有体内止血活性的实质性损失。
可互换的术语“冷却”、“低温”、“低于室温的温度”以及“低于环境温度的温度”是指在28℃与-100℃之间的任何温度。在此所述的本发明的任何实施例中，该温度可替代地选自以下温度组，该组由以下各项组成：27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃以及-10℃。在一些实施例中，该血小板制剂保存在小于15℃、优选小于10℃、并且更优选小于5℃的温度下。在一些其他的实施例中，该血小板制剂保存在室温下。在其他实施例中，血小板被冷冻，例如0℃、-20℃或-80℃或更冷。
如在此处本发明的所有方面和实施例中使用的术语“时间段”是指在其中在任何给定的温度下保存血小板或血小板组合物的一段持续时间。术语“时间段”的范围可以是从几秒到几分钟到几小时到几天到几周。在多个优选实施例中，术语“时间段”是指包括约3小时至约120小时的若干小时，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119以及120小时。在某些实施例中，处理的血小板可以保存的时间段包括约1天与约30天(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29以及30天)。
在一个实施例中，处理的血小板可以在室温下保存约1天至约14天(例如，约7天)。在一方面，在7天之后，可以如在此所述冷藏血小板。
在各种其他实施例中，处理的血小板可以保存在室温下。当在处理之后一段时间与未处理的血小板样品比较时，用一种或多种唾液酸酶抑制剂、任选地一种或多种聚糖修饰剂处理保护/修饰了血小板群，即，保护或改进了血小板群在输注到哺乳动物中之后的止血功能，并且降低了在室温保存的血小板中的保存损害的发生率。因此，保存在室温或低于室温下的处理的血小板样品适合于在以下延长的保存时间段之后自体或异源地输注，在一个实施例中，这些延长的保存时间段为至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约21天或者至少约28天。
如在此处本发明的所有方面和实施例中使用的术语“缓慢加温”是指加温的一个渐增率(例如，每小时或每天0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃)。如在此所述的，本发明的任何方面或实施例进一步包括以下一个步骤：加温处理的血小板制剂至室温以上，例如通过加温血小板至37℃。加温可以逐渐地或者通过逐步增加温度来实现。优选的是，通过缓慢加热并同时连续轻轻搅拌(如在复温血液产品中常用的)来加温室温保存的或冷保存且处理的血小板群。一种血液加温装置被披露在WO/2004/098675中并且适合于复温来自冷保存条件的一种处理的血小板群。
对细菌增殖和病原体诱导的血小板降解的抑制
本发明提供了一种通过抑制病原体唾液酸酶来减少病原体诱导的血小板降解并抑制病原体生长/繁殖的新颖方法。多种唾液酸酶抑制剂展现出防止病原体增殖的抗微生物特性。
如在此使用的术语“病原体”是指引起感染的一种或多种微生物或类似物，如在(多德R·Y(Dodd R.Y.)，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)327：419-421(1992)；瑟兰德E·M(Soland，E.M.)等，美国医学会志(J.Am.Med.Assoc.)274：1368-1373(1995)以及施赖勃G·B(Schreiber，G B.)等，新英格兰医学杂志334：1685-1690(1996))中所描述的。示例性病原体包括但不限于病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌。病毒的实例包括但不限于单纯疱疹病毒、HIV、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、呼吸道合体病毒、蓝舌病毒以及牛腹泻病毒。病毒还包括巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、I型和II型单纯疱疹病毒以及在血液中自由循环的其他病毒，还有以细胞相关病毒。真菌包括但不限于例如曲霉菌。并且典型的寄生虫包括但不限于例如：阿米巴(Ameoba)、疟原虫(Plasmodiunm)、利什曼原虫(Leishmania)、Mycosusprofundus、锥虫(Trypanosoma)、螺旋菌(Spirochete)以及虫媒病毒(Arbovius)。
关于通常与血小板相关并且其增殖被一种唾液酸酶抑制剂抑制的细菌包括但不限于：曲霉菌属、芽孢杆菌属、艾氏拟杆菌、白色念珠菌、柠檬酸杆菌属、产气荚膜梭菌、棒状杆菌属、类白喉菌、产气肠杆菌、河生肠杆菌、阴沟肠杆菌、鸟肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、梭杆菌属、毗邻颗粒链菌、幽门螺杆菌、克雷伯菌属、(肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌)、乳酸杆菌属、李斯特菌属、微球菌属、消化链球菌属、普通变形杆菌、假单胞菌属、Pseudomys oralis、丙酸杆菌属、沙门菌属、沙雷菌属、葡萄球菌属(凝固酶阴性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌)、链球菌属(解没食子酸链球菌、牛链球菌、酿脓链球菌、草绿色链球菌)、粘质沙雷菌以及小肠结肠炎耶尔森菌。
如在此使用的术语“病原体诱导的血小板降解”是指由一种或多种病原体引起的任何程度的血小板降解、止血活性的降低、或血小板清除率的增加。
如在此使用的术语“有害作用”可以指由一种或多种病原体引起的对血小板活力的有害作用(例如，血小板降解增加、止血活性降低、或血小板清除率增加)。如在此使用的术语“有害作用”还可以指由一种或多种病原体引起的对患者的有害作用(例如，其自身感染的结果)如败血症。
如在此使用的术语“细菌污染”是指由任何上文所述的细菌病原体或者由能够产生细菌来源的唾液酸酶的非病原体细菌引起的污染。“抑制细菌增殖”是指降低和/或抑制血小板制剂中的细菌生长。
如在此使用的术语“细菌来源的唾液酸酶”是指由细菌产生的唾液酸酶。如在此使用的“细菌来源的唾液酸酶”的抑制除抑制细菌来源的唾液酸酶外，还可以任选地抑制血小板来源的唾液酸酶和/或患者来源的唾液酸酶。
在其他方面，本发明提供了一种通过从供体中获得一个血小板群并使血小板与有效量的本发明的组合物(例如，一种唾液酸酶抑制剂)接触来抑制血小板制剂中的细菌增殖的新颖方法。在一个优选实施例中，本发明的方法进一步包括在室温下保存该处理的血小板组合物一段时间而没有体内止血活性的实质性损失。可替代地，如在此所述，可以冷却处理的血小板使得所得的血小板组合物至低于室温的温度；在低于室温的温度下保存一段时间并且复温回至室温而没有体内止血活性的实质性损失。
如在此所述的本发明的减少血小板制剂中的病原体生长的方法的优选实施例包括使血小板与有效量的如在此所述的一种唾液酸酶抑制剂和任选地与有效量的如在此所述的至少一种聚糖修饰剂接触。
唾液酸酶抑制剂对细菌的抗增殖性抑制允许血小板保存更长时间同时细菌污染的风险降低，并且当然允许保存在此所述的时间段。
血小板的细菌污染是一个问题，因为它在接受它们的患者中引起败血症。细菌污染可以是从供体中获得血液和/或血小板或在捐献之后不良处理血小板的非无菌技术所导致的结果。甚至尽管在获得捐献的血液或血小板中使用良好的无菌技术，但是细菌仍可存在于血小板制剂中。例如，即使技术员使用一种抗菌剂来清洁捐献位点处的皮肤，但是细菌可以嵌入在多个皮肤层中。因此在用针插入皮肤时，可以发生血小板捐献物的细菌污染。作为结果，在护理时(例如，在该接受者接受血小板时)进行细菌测试以降低败血症风险。
另外，细菌污染可以导致在血液容器/袋的内部表面上形成生物膜。这种生物膜形成是附着在该袋的内部表面并使用该表面作为一个载体来增殖的细菌所导致的结果。随着细菌增殖增加，这种生物膜形成也增加。
因此，使该血小板制剂与多种唾液酸酶抑制剂接触提供了意想不到的细菌抗增殖性抑制和在血小板袋内部表面上的生物膜形成的减少。使用在此所述的这些方法，使该血小板制剂与有效量的一种或多种唾液酸酶抑制剂接触，该唾液酸酶抑制剂不仅抑制了内源性血小板唾液酸酶而且抑制了细菌唾液酸酶。对血小板的这种处理使得血小板的保存时间延长同时细菌生长/增殖减少，这使得血小板在输注到接受者中之后存活和体内止血提升。
本发明的方法中涵盖在一个或多个时间点测试细菌增殖以确定在输注到接受者中之前细菌增殖实际受到抑制。细菌测试可以发生在一个单一的时间点(例如，在护理时)，并且可以将这些结果与一个标准进行比较以确定在有待转移的处理的血小板中是否已经发生细菌增殖。另外，可以在一个以上的时间点对处理的血小板的进行细菌测试以评定这些特定样品是否已经展现出细菌增殖的抑制。细菌增殖的增加或者细菌增殖的存在表明处理的血小板受到污染并且不能用于输注。细菌增殖的缺乏表明处理的血小板可以用于输注。本发明的唾液酸酶抑制剂引起适合于输注的处理的血小板。
存在着多种测试来确定在处理的血小板制剂中存在细菌污染。细菌可以通过对细菌常见但不能在血小板中找到的多肽或蛋白质的存在、通过培养技术、革兰氏染色法、扫描技术、在细菌、扫描中保守的核酸的存在等等来测试。
在确定血小板制剂的细菌污染中常用的测试是Pan Genera Detection(PDG)(Verax生物医学公司，马萨诸塞州伍斯特)。该PGD测试可以检测血液组分中的一批细菌。这种广泛检测是基于两大类细菌的细胞壁所常见的共有或保守的抗原(在革兰氏阳性菌上的脂磷壁酸和革兰氏阴性菌上的脂多糖)的存在。该测试靶向这些保守的革兰氏阳性和革兰氏阴性抗原，以通过使用直接结合这些靶标的结合剂来测试生物样品的范围广泛的细菌污染物。尽管通过这个测试不能确定特定细菌的水平或存在，但是该测试确定了在血小板制剂中的许多细菌的存在。
可以采用多种培养方法来确定细菌污染和/或细菌增殖的存在或不存在。一种可商购的测试是指BacT/ALERT测试(生物梅里埃公司(bioMérieux，Inc.)，北卡罗来纳州达拉谟(Durham，NC))。细菌检测是基于增殖细菌释放二氧化碳。在培养瓶底部的一种二氧化碳敏感的液乳胶传感器改变颜色并通过反射在该传感器上的光的改变来检测。BacT/ALERT测试检测了许多细菌、真菌和酵母的存在。
用于细菌检测的另一种方法涉及测量在一个血小板制剂样品中的氧含量。一个实例是Pall eBDS测试(颇尔公司(Pall Corporation)，纽约华盛顿港(PortWashington，NY))。检测方法测量了样品小袋内的空气的氧含量，以作为细菌的替代指标。使用一种氧分析仪来测量在具有血小板的小袋或袋的顶部空间气体中的氧百分比。如果在所收集的血小板样品中存在细菌，则在孵育过程中通过该样品中的细菌代谢活动和增殖而消耗了增加量的氧，从而引起血浆以及样品小袋内的空气中的氧含量的可测量的减少。
用于确定在一个血小板制剂中存在细菌增殖的更多常规方法是革兰氏染色法。革兰氏染色法允许人们将细菌种类分成多种类别(革兰氏阴性或革兰氏阳性)，以试图开始鉴定微生物。该测试检测了肽聚糖，该肽聚糖是细菌的细胞壁中的一种聚糖。
可以获得来自处理的血小板制剂的一种样品并对该样品进行培养以确定是否存在任何细菌。用该样品对生长介质进行接种或铺板并使该生长介质处于适合于细菌生长的受控制的条件下。细菌可以生长并且被鉴定。
可以使用本领域已知或未来发展的其他方法来确定在本发明的处理的血小板制剂中的细菌增殖。
本发明的这些方法涉及通过使该血小板制剂与有效量的一种或多种唾液酸酶抑制剂接触来减少细菌增殖和/或生物膜形成。与一个标准或与在一个不同时间点进行的另一个评定相比，细菌增殖有所减少。在此所述的这些方法使得细菌增殖和/或生物膜形成减少了至少5％(例如，减少了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一个实施例中，与在用该唾液酸酶抑制剂处理该血小板制剂时进行的方法相比，本发明的这些方法完全抑制了细菌增殖和/或生物膜形成。
血小板的保存：
本发明包括一种用于增加血小板的保存时间的方法。在用在此描述的唾液酸酶抑制剂进行保存期间，血小板可以被保存，具有降低的唾液酸酶活性、抑制的细菌增殖并且没有血小板功能或止血活性的实质性损失如循环的能力的损失或没有血小板清除率的增加。
血小板是通过本领域普通技术人员已知的标准技术如在此所述从血液中收集的。该保存组合物包括足以降低血小板清除的量的至少一种唾液酸酶抑制剂和任选地至少一种聚糖修饰剂。在一些实施例中，该保存组合物进一步包含一种酶，该酶催化血小板上的一个聚糖部分的修饰。
在某些方面，本发明提供了一种保存血小板组合物的新颖方法，其中这些步骤包括从供体获得一个血小板群并且用有效量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂来处理血小板。在一个实施例中，用于保存血小板组合物的该新颖方法涉及从供体获得一个血小板群；添加有效量的唾液酸酶抑制剂到该血小板群中并且在室温下保存所得的血小板组合物持续一段时间而没有体内止血活性的实质性损失。在另一个实施例中，用于保存血小板组合物的该新颖方法包括从供体获得一个血小板群；添加有效量的唾液酸酶抑制剂到该血小板群中；冷却所得的血小板组合物至低于室温的温度；在低于室温的温度下保存该血小板组合物持续一段时间并且将该血小板组合物复温回到室温而没有体内止血活性的实质性损失。在另外的实施例中，该血小板组合物缓慢地复温。在某些实施例中，该血小板组合物当在保存之后输注到哺乳动物中时保持基本上正常的止血活性。在另外的实施例中，该血小板组合物在保存之后输注到哺乳动物中时具有约5％或大于未处理的血小板的循环半衰期的循环半衰期。在某些优选的实施例中，该血小板组合物适合用于在保存之后输注到人类中。
根据本发明，在用唾液酸酶抑制剂处理之后，处理过的血小板群可以在室温下保存或冷冻而没有在未处理的血小板冷冻之后所经历的有害作用(冷诱导的血小板活化)。聚糖部分的保护和/或选择性修饰减少清除，因此允许比目前可能的更长期的保存。在一方面，一种或多种唾液酸酶抑制剂被添加到保持在大约室温(在约20℃与25℃之间)与37℃之间的血小板群中。如在此所用，冷冻是指将血小板群的温度降低至小于约25℃的温度。在一些实施例中，血小板被冷冻至小于约15℃的温度。在一些优选的实施例中，血小板被冷冻至在从约0℃至约4℃之间的温度。冷冻还包括冰冻血小板制剂，即，至小于0℃、-20℃、-50℃、以及-80℃或更冷的温度。用于细胞的深低温保藏的工艺是本领域中熟知的。
在一些实施例中，血小板群是在室温下保存至少3天。例如，处理过的血小板群在室温下保存至少4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、以及28天或更长时间。
此外，在某些方面，处理过的血小板群可以冷冻保存至少3天。处理过的血小板群冷冻保存例如至少4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、以及28天或更长时间。
向哺乳动物(例如，人类)输注血小板
在保存之后，在一些方面，本发明提供了一种用处理过的血小板组合物输注患者的方法，该血小板组合物具有一种或多种唾液酸酶抑制剂，其中该血小板组合物是根据在此所述的方法制备的。类似地，使用这些步骤，本发明提供了一种用于在哺乳动物中介导止血的新颖方法。
此外，本发明涉及用于增加血小板的循环时间或减少血小板的清除的方法。血小板群的循环时间被定义为在输注到哺乳动物中之后那个群中的一半血小板不再在那个哺乳动物中循环的时间。
如在此所用，“清除”意指处理过的血小板从哺乳动物的血循环中的去除(如但不限于通过巨噬细胞吞噬作用)。更确切地说，血小板群的清除是指血小板群每单位时间从单位体积的血液或血清中的去除。减少血小板群的清除是指防止、延迟、或降低血小板群的清除或血小板清除的速率。
需要血小板输注的患者包括那些具有例如，贫血、血小板减少症、功能障碍性血小板异常、活动性血小板相关出血、或严重的出血风险(例如，预防性用途)的患者。有时具有以下医学病症的患者需要血小板输注：白血病、脊髓发育不良、再生障碍性贫血、实体瘤、先天性或获得性血小板功能障碍、中枢神经系统创伤。正在经历体外膜式氧合或心肺转流术的患者也接受血小板输注。
在本发明的一方面，用于增加分离的血小板群的循环时间的方法涉及使分离的血小板群与至少一种唾液酸酶抑制剂接触，该唾液酸酶抑制剂处于有效减少血小板群的清除的量。如在此所用，血小板群是指具有一个或多个血小板的样品。
减少血小板的清除包括减少在血小板在室温下或低于室温下保存之后的血小板的清除。减少血小板的清除可以由减少在室温下或低于室温下获得的保存损伤或减少在血小板的冷保存之后发生的“冷诱导的血小板活化”造成。冷诱导的血小板活化是对于本领域的普通技术人员来说具有特殊含义的一个术语。冷诱导的血小板活化可以通过血小板形态的改变来证明，其中一些变化与血小板活化之后发生的变化相似。表明室温诱导的或冷诱导的血小板活化的结构变化是使用如光或电子显微镜的技术而最容易地鉴定的。在分子水平上，血小板活化造成肌动蛋白束形成并且随后细胞内钙的浓度增加。肌动蛋白束形成是使用例如电子显微镜来检测的。细胞内钙浓度的增加是例如通过采用荧光细胞内钙螯合剂来测定的。用于抑制肌动蛋白丝切断的许多上述螯合剂对于测定细胞内钙的浓度也是有用的(钱永健(Tsien，R.)，1980，上述)因此，不同的技术可供用于确定血小板是否已经历室温诱导的或冷诱导的活化。
添加唾液酸酶抑制剂到血小板中防止唾液酸残基从聚糖的末端水解并且保护血小板上聚糖部分的结构，从而导致处理的血小板的减少的清除。这个效应可以例如使用一种体外系统来测量，该系统采用分化的THP-1细胞或小鼠巨噬细胞，这些细胞是在巯基乙酸盐注射刺激之后从腹腔中分离的。可以测定与未处理的血小板相比的处理过的血小板的清除率。为了测试清除率，将处理过的血小板送入巨噬细胞并且监测巨噬细胞对血小板的摄取。与未处理的血小板相比，减少处理过的血小板的摄取(1.2倍或更大)表明出于在此所述的目的的聚糖部分的成功修饰。
此外，添加唾液酸酶抑制剂到血小板中抑制了细菌增殖，这进而减少了血小板清除并且防止败血症。在此描述了细菌增殖的评定。
在本发明的某些实施例中，血小板群的循环时间增加了至少约10％、20％、25％、30％、或40％。在另一些实施例中，血小板群的循环时间增加了至少约50％至约100％。仍然在另外的其他实施例中，血小板群的循环时间增加了约150％或更高。
血小板组合物：
在经受了如在此所述的唾液酸酶抑制剂之后，血小板被处理并且在此被称为“血小板组合物”或“处理过的血小板”。本发明包括一种新颖的血小板组合物，其包含一种或多种如在此所述的唾液酸酶抑制剂。在另一个实施例中，新颖的血小板组合物进一步包含有效量的至少一种聚糖修饰剂。处理过的血小板在血小板的表面上具有多个完整的聚糖分子，否则在没有唾液酸酶抑制剂处理的情况下这些分子将已经被裂解。本发明的血小板组合物的聚糖分子包括其中唾液酸裂解已呈现并且聚糖分子保持完整的那些。如果唾液酸被裂解，那么聚糖修饰剂(例如，CMP唾液酸、或UDP半乳糖，或这两者)允许唾液酸添加到末端糖残基上，或末端糖残基的半乳糖基化，或末端糖残基的唾液酸化和半乳糖基化两者。在一些实施例中，修饰的聚糖部分是GPIbα分子。本发明还包括在一种保存介质中的血小板组合物。在一些实施例中，该保存介质可以是一种药学上可接受的载体。
在一些实施例中，如此修饰的末端聚糖分子是GPIbα分子。处理过的血小板包括具有末端GPIbα分子的聚糖结构，在处理之后，末端半乳糖或唾液酸将附接到GPIbα分子上。在另一方面，本发明提供了包含多个处理过的血小板的血小板组合物。在一些实施例中，该血小板组合物进一步包含一种保存介质。在一些实施例中，该血小板组合物进一步包含一种药学上可接受的载体。
在一些实施例中，根据在此所述的本发明方法处理的血小板群显示出抑制的细菌增殖和基本上正常的止血活性，优选地在输注到哺乳动物中之后。在一些实施例中，相对于类似地保存但未处理的血小板群，根据在此所述的本发明方法处理的血小板群显示出减少的细菌增殖和改善的止血活性。
在一个另外优选的实施例中，如上所述的新颖血小板组合物提供一种稳定的血小板制剂。在某些实施例中，本发明的稳定的血小板制剂能够保存至少24-360小时，并且该血小板制剂适合用于在保存之后给予/输注到人体中而与未处理的血小板相比在人体中没有止血功能的显著损失或没有血小板清除的显著增加。在某些优选的实施例中，稳定的血小板制剂能够冷保存。在某些其他优选的实施例中，血小板能够在室温下保存而与未处理的血小板相比没有生物活性的实质性降低。
在其他方面，本发明提供了组合物，这些组合物包含如在此所述的新颖的血小板组合物，并且进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。如在此所用的“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、固体粘合剂、润滑剂，等等，如适合于所希望的具体剂型。雷氏药学大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版，E.W.马丁(E.W.Martin)(宾夕法尼亚州伊斯顿市的马克出版有限公司(Mack Publishing Co.，Easton，PA)，1980)披露了在配制药用组合物时使用的不同的赋形剂以及用于其制备的已知技术。除非任何常规的赋形剂介质与本发明的化合物不相容，如通过产生任何所不希望的生物效应或另外以有害的方式与该药用组合物的任何其他组分相互作用，它的用途将涵盖在本发明的范围内。
在某些实施例中，该血小板组合物适合用于输注到患有出血障碍或贫血的人类患者中。在优选的实施例中，该血小板组合物可以在给予人类之前在抑制的细菌增殖下保存至少5天，并且其中该组合物可以在保存之后输注到人体中而与未处理的血小板相比在人体中没有止血功能的显著损失或没有血小板清除的显著增加。
术语“药学上可接受的”意指不干扰血小板的生物活性的有效性的无毒材料以及与生物系统如细胞、细胞培养物、组织、或有机体相容的无毒材料。药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、以及本领域中熟知的其他材料，例如，将血小板制剂稳定至7.3-7.4(血液的生理pH)的pH的缓冲剂是适合用于在本发明中使用的药学上可接受的组合物。
本发明进一步包括用于制备供给予哺乳动物的药用组合物方法。在一个优选的实施例中，包含血小板的新颖的药用组合物进一步包含有效量的唾液酸酶抑制剂，在血小板已从供体获得之后将该唾液酸酶抑制剂添加到一个血小板群中并且将所得的血小板组合物在室温下保存一段时间而没有体内止血活性的实质性损失。在另一个优选的实施例中，包含血小板的新颖的药用组合物进一步包含有效量的唾液酸酶抑制剂，在血小板已从供体获得之后将该唾液酸酶抑制剂添加到一个血小板群中；将所得的血小板组合物冷却至低于室温的温度；在低于室温的温度下保存一段时间并且复温回到室温而没有体内止血活性的实质性损失。在一些实施例中，用于制备包含血小板的新颖的药用组合物的方法包括中和、去除或稀释唾液酸酶抑制剂和/或一种或多种聚糖修饰剂和/或保护和/或催化聚糖部分的修饰的一种或多种酶，并且将处理过的血小板制剂放置在药学上可接受的载体中。在一个优选的实施例中，在中和或稀释之前和期间，将血小板在室温下(约22℃)保存。在另一个优选的实施例中，在中和或稀释之前，将血小板冷冻、保存，并且然后加温至室温(约22℃)。在一些实施例中，在与唾液酸酶抑制剂和/或一种或多种聚糖修饰剂和/或保护和/或催化聚糖部分的修饰的一种或多种酶接触之前将血小板包含在药学上可接受的载体中并且不需要在中和或稀释之后将血小板制剂置于药学上可接受的载体中。
如在此所用，术语“中和”或“中和作用”是指致使唾液酸酶抑制剂和/或一种或多种聚糖修饰剂和/或保护和/或催化聚糖部分的修饰的一种或多种酶基本上不能在血小板上进行聚糖残基的聚糖修饰的过程，或它们在血小板溶液中的浓度被降低至对哺乳动物无害的水平，例如，小于50微摩尔的聚糖修饰剂。在一些实施例中，冷冻的血小板是通过例如用红细胞的悬浮液进行稀释来中和的。可替代地，处理过的血小板可以输注到接受者中，这等同于稀释至红细胞悬浮液中。这个中和方法有利地保持封闭系统并且使得对血小板的损害最小。在一个优选的实施例中，不需要中和作用。
降低毒性的一种替代方法是通过将过滤剂插入输液线中，该过滤剂含有例如活性炭或固定抗体，以便除去唾液酸酶抑制剂和/或一种或多种聚糖修饰剂和/或保护和/或催化聚糖部分的修饰的一种或多种酶。
唾液酸酶抑制剂和/或一种或多种聚糖修饰剂和/或保护和/或催化聚糖部分的修饰的一种或多种酶中的任一者或全部也可以被去除或大体上通过根据标准的临床细胞洗涤技术对处理过的血小板进行洗涤而被稀释。
本发明进一步提供一种用于在哺乳动物中介导止血的方法。该方法包括给予上述处理过的血小板或处理过的血小板或药用组合物的上述输注可以根据本领域中已知的标准方法来进行。根据一个实施例，在给予处理过的血小板之前、之后或期间向人类患者输注红细胞。红细胞输注用来稀释所给予的处理过的血小板，由此中和唾液酸酶抑制剂和/或一种或多种聚糖修饰剂和/或保护和/或催化聚糖部分的修饰的一种或多种酶。
使用处理过的血小板来介导止血的给药方案是根据多种因素来选择的，这些因素包括受试者的类型、年龄、体重、性别和医学病症、疾病的严重性、给药的途径和频率。本领域的普通的内科医师或临床医师可以容易地确定和开出介导止血所需要的有效量的处理过的血小板。
给药方案可以例如根据在临床体征和实验室检查方面对处理的反应来确定。此类临床体征和实验室检查的实例在本领域中是熟知的并且参见哈里森内科学(HARRISON’SPRINCIPLESOFINTERNALMEDICINE)，第15版，福西AS(FauciAS)等人编著，纽约的麦格劳希尔出版社(McGraw-Hill,New York),2001来描述。
例如，为了确定用于通过用一种或多种唾液酸酶抑制剂和任选地聚糖修饰剂处理血小板来防止血小板的室温诱导的活化或冷诱导的活化的最佳浓度和条件，在室温下保存血小板和/或将血小板暴露于冷冻温度之前，使增加量的这些试剂与血小板接触。防止唾液酸裂解和/或催化聚糖部分的修饰的唾液酸酶抑制剂和/或一种或多种聚糖修饰剂的最佳浓度是最低有效浓度，这个浓度保护了完整的血小板功能，如体外测试(例如，观察对玻璃、凝血酶、深低温保藏温度作出反应的形态变化；ADP-诱导的聚集)所确定，接着是显示止血功能的体内测试(例如，在血小板减少动物中出血时间的恢复、存活和缩短或在人类受试者中51Cr标记的血小板的恢复和存活)。
制备血小板组合物的方法：
在其他方面，本发明提供一种制备血小板组合物的新颖方法，该方法涉及从供体获得一个分离的血小板群并且在在此所述的一段时间内用有效量的唾液酸酶抑制剂处理血小板。在一个优选的实施例中，用于制备血小板组合物的该新颖方法包括从供体获得一个血小板群；添加有效量的唾液酸酶抑制剂到该血小板群中并且在室温下保存所得的血小板组合物持续一段时间而没有体内止血活性的实质性损失。在另一个优选的实施例中，用于制备血小板组合物的该新颖方法包括从供体获得一个血小板群；添加有效量的唾液酸酶抑制剂到该血小板群中；冷却所得的血小板组合物至低于室温的温度；在低于室温的温度下保存该血小板组合物持续一段时间并且将该血小板组合物复温回到室温而没有体内止血活性的实质性损失。在另外的实施例中，该血小板组合物缓慢地复温。在某些实施例中，该血小板群当输注到哺乳动物中时保持基本上正常的止血活性。在另外的实施例中，该血小板群当输注到哺乳动物中时具有约5％或大于(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或150％)未处理的血小板的循环半衰期的循环半衰期。在某些优选的实施例中，该处理过的血小板群适合用于输注到人类中。
如在此所述的用于制备血小板组合物的本发明方法的多个优选实施例包括如在此所述用有效量的唾液酸酶抑制剂处理该血小板群。
如在此所述的用于制备血小板组合物的本发明方法的另外优选的实施例涉及用有效量的唾液酸酶抑制剂处理一个血小板群，并且进一步用有效量的至少一种聚糖修饰剂处理该血小板群，如在此所述。
在一些实施例中，本发明提供在此所述的处理血小板的方法与一种或多种本领域中已知的其他血小板保藏方法的组合。例如，本发明中提供的血小板修饰方法在与例如但不限于以下专利公开号中所述的方法组合时是有用的：20090053198A1，和美国专利：7,030,110；7,029,654；7,005,253；6,900,231；6,866,992；6,730,783；6,706,765；6,706,021；6,693,115；6,638,931；6,635,637；6,566,379；6,521,663；6,518,310；6,514,978；6,497,823；6,476,016；6,472,399；6,420,397；6,417,161；6,350,764；6,344,486；6,344,466；6,326,492；6,277,556；6,245,763；6,235,778；6,221,669；6,204,263；6,037,356；5,919,614；5,763,156；5,753,428；5,660,825；5,622,867；5,582,821；5,571,686；及5,569,579；5,550,108；5,529,821；5,474,891；5,466,573；5,399,268；5,376,524；5,344,752；5,269,946；5,256,559；5,236,716；5,234,808；以及5,198,357。
试剂盒
本发明还提供了用于血小板收集、处理和保存的试剂盒，这些试剂盒进一步包括适合的包装材料和用于使用这些试剂盒内容物的说明书。优选的是，试剂盒中的所有试剂和辅助材料根据标准的医疗实践都是无菌的，这些医疗实践涉及血液和血液产品的处理和保存。为这些试剂盒内容物进行灭菌的方法是本领域中已知的，例如，环氧乙烷气体、γ辐照等。在某些实施例中，该试剂盒可以包括静脉穿刺辅助材料和/或血液收集辅助材料，例如一个针套件、用于为血小板供体的皮肤进行灭菌的溶液、以及血液收集袋或容器。优选地，该容器是“封闭的”，即基本上与环境隔离的。此类封闭的血液收集容器是本领域中熟知的，并且提供了防止其中所容纳的血小板制剂的微生物污染的手段。其他实施例包括含有用于血液收集和血小板单采的辅助材料的试剂盒。这些试剂盒可以进一步包括一种或多种唾液酸酶抑制剂，有或没有聚糖修饰剂，该抑制剂的量足以修改该容器中所收集和保存的血小板的体积。在其他实施例中，该试剂盒包括一种血液收集系统，该系统具有一个血液保存容器，其中唾液酸酶抑制剂以足以处理该容器中所保留的血液或血小板的体积的量而被提供在该容器内。唾液酸酶抑制剂单独或唾液酸酶抑制剂与聚糖修饰剂一起的量将部分地取决于该容器的容量。优选的是，唾液酸酶抑制剂单独或唾液酸酶抑制剂与聚糖修饰剂一起作为一种无菌的非致热的(non-pyogenic)溶液而被提供，但它还可以作为一种冻干粉来供应。例如，血袋被提供具有250mL的容量。血袋中容纳的是一定量的唾液酸酶抑制剂，以使得当添加250mL的血液时，唾液酸酶抑制剂的最终浓度是大约1200微摩尔。其他实施例含有不同浓度的单独的唾液酸酶抑制剂或与聚糖修饰剂一起的唾液酸酶抑制剂，例如但不限于产生10微摩尔至10毫摩尔，并且优选地100微摩尔至1.2毫摩尔的单独的唾液酸酶抑制剂或与聚糖修饰剂一起的唾液酸酶抑制剂的最终浓度的多个量。其他实施例使用唾液酸酶抑制剂或唾液酸酶抑制剂与聚糖修饰剂一起的各种组合，例如以便实现引入该容器中的血液产品上的聚糖的唾液酸化或半乳糖基化。
处理过的血小板的血小板功能和评定
在血小板的处理之后，血小板功能可以用不同的体外方法来评定。可以对处理过的血小板的恢复和存活进行进一步评估，该评估通常是在健康志愿者中用放射性标记的血小板来进行的。
如在此所述的“止血活性”是指血小板群介导出血停止(例如，形成凝块)的能力。正常的止血活性是指在处理过的血小板中所见的止血活性的程度，它在功能上等效于或实质上类似于在健康的(非血小板减少的或非血小板病的哺乳动物中的)体内未处理的血小板的止血活性或在功能上等效于或实质上类似于体外新近分离的血小板群的止血活性。
在血小板的处理之后，可以对血小板进行评定以确定血小板是否维持其功能，例如，其活化和形成凝块的能力。不同的测定可供用于确定血小板止血活性(班尼特·J.S.(Bennett，J.S.)和沙蒂尔·S.J.(Shattil，S.J.)，1990，“血小板功能(Platelet function)，”《血液学(Hematology)》，威廉姆斯·W.J.(Williams，W.J.)等人编著，麦格劳希尔出版社，第1233-12250页)。在一个实施例中，“止血”或“止血活性”的证明还可以包括以下证明：注入到血小板减少的或血小板病的(即，非功能性血小板)动物或人类中的血小板循环并且终止天然或实验诱导的出血。为了测定血小板的止血活性，实验室使用体外测试。这些测试包括聚集、分泌、血小板形态和代谢变化的测定，它们测量对于活化的血小板功能反应。这些体外测试测定了体内血小板止血功能。
在一个实施例中，用本发明的组合物(例如，唾液酸酶抑制剂)处理的血小板呈现出与未处理的但新近获得/分离的血小板类似的血小板功能水平。
测量血小板凝结能力的测试是一种聚集测定。该血小板聚集测试使用凝集计来测量血浆的浑浊度或浊度。促进凝固的激动剂被用于聚集测定中。激动剂的实例包括腺苷二磷酸(ADP)、肾上腺素(epinephrine/adrenaline)、凝血酶、胶原蛋白、TXA2、以及瑞斯托菌素。由于为了进行测试将激动剂添加到样品中，所以如果样品的供体正在服用抗凝剂，那么结果将受到影响。添加激动剂到血浆样品中造成血小板成簇在一起，使得流体更加透明。然后凝集计测量穿过标本的光透射以便确定血小板响应于激动剂而凝固的程度。当添加激动剂时，血小板聚集并且吸收较少的光且因此透射增加并且这是通过凝集计中的光电池来检测的。血小板聚集的正常时间取决于实验室、温度、进行测试的小瓶的形状、以及患者对不同激动剂的反应而稍微有所不同。建立正常的凝固时间和用于聚集测定的激动剂的量可以由本领域普通技术人员来确定。激动剂的示例性量如下：在1μM至10μM之间的ADP、在1与4μg/mL之间的胶原蛋白、在0.5mg/mL与1.5，5mg/mL之间的瑞斯托菌素、在5与10μM之间的肾上腺素、约500μg/mL的花生四烯酸(TXA2的前体)、以及在50nmol/L与100nmol/L之间的凝血酶。例如，应该注意对瑞斯托菌素与对其他产品的反应之间的差异，因为瑞斯托菌素通过与其他激动剂不同的机制触发聚集。响应于腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸、胶原蛋白、凝血酶、TXA2、肾上腺素和/或瑞斯托菌素而具有约65％或更高的血小板聚集的血小板被视为具有正常凝固功能的血小板。因此，用本发明的唾液酸酶抑制剂处理的并且在聚集测定中呈现约65％或更高的(例如，约65％至约100％)血小板聚集的血小板被视为呈现出止血活性(homeostaticactivity)。
另一种测量凝固的测试是血栓弹力描记术。血栓弹力描记术是从例如血液技术公司(Haemonetics Corporation)(马萨诸塞州布伦特里(Braintree，MA))以商品名TEG可获得的。在血栓弹力描记术中，将一小份血小板样品(典型地0.36mL)置于轻轻地围绕4°45′旋转(周期时间6/分钟)的比色皿(杯)中以模拟缓慢的静脉流并且激活凝固。当将一个传感器轴插入样品中时，在该杯与传感器之间形成凝块。凝块形成的速度和强度是以不同的方式来测量的，并且取决于血浆凝固系统的活性、血小板功能、纤维蛋白溶解以及可能受到疾病、环境和药物处理的影响的其他因素。一般来说，表示凝块形成的四个值是通过以下这个测试来测定的：R值(或反应时间)、K值、角度以及MA(最大振幅)。R值表示直到检测到凝块的第一证据的时间。K值是从R结束直到凝块达到20mm的时间并且它表示凝块形成的速度。角度是当达到K时所作出的曲线的切线并且提供与K相似的信息。MA是凝块强度的反映。由制造厂商所确定的数学公式可以用于确定凝血指数(CI)，该指数将这4个值的每一个的相对贡献考虑在1个方程中。本发明的处理过的血小板能够形成凝块，并且保持止血。
血小板标记/功能的免疫学评定
可以评定包括在用该组合物处理之前和/或之后并且还在输注到个体中之后活化的能力的血小板功能。血小板活化标记的实例包括P选择素、PAC-1、GPIIb、GPIIIa、GPIb以及GPIIIa。可以评定可溶的和膜结合的标记以便确定血小板活化的状态并且评定处理过的血小板制剂的止血(homeostasis)。测量可溶的和膜结合的血小板标记的方法包括若干适合的测定。适合的测定包括免疫学方法，如流式细胞术、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、以及用体积毛细管血细胞计数系统进行评定。现在已知的或后来开发的任何方法都可以用于测量此类标记。
本发明方法利用与血小板标记或其部分反应的抗体。在一个优选的实施例中，这些抗体与膜结合的和/或可溶的血小板标记或其部分特异性结合。当抗体结合时，它们抑制与其结合的蛋白质或标记的功能。这些抗体可以是多克隆的或单克隆的，并且术语抗体旨在包括多克隆的和单克隆的抗体，以及其功能片段。术语多克隆和单克隆是指一种抗体制剂的同质性的程度，并且不旨在限于特定的产生方法。
在若干优选的实施例中，免疫技术借助于一种抗血小板标记抗体(即，一种或多种抗体)来检测血小板标记水平。抗血小板标记抗体包括单克隆的和/或多克隆的抗体、及其混合物。用针对表面膜糖蛋白的抗体标记血小板并且接着通过流式细胞术来分析结合是一种用于评定止血(homeostasis)的快速且灵敏的技术。例如，可以分别使用抗体CD41、CD61、CD42b以及CD61来评定GPIIb、GPIIIa、GPIb以及GPIIIa。升高水平的膜结合的或可溶的P选择素可以表明血小板活化的程度并且可以使用单克隆抗体S12或W40来进行检测。用于检测此类标记的抗体可以商购获得或使用本领域中已知的方法来建立一种适当的免疫原。
现在已知的或后来开发的任何方法都可以用于测量膜结合的血小板标记。本发明利用的用于评定膜结合的血小板标记水平的一种方法是流式细胞术。用于测量血小板或膜结合的标记的流式细胞术的方法是本领域中熟知的。(沙蒂尔·桑福德J(Shattil，Sanford J)等人的“使用活化依赖性的单克隆抗体和流式细胞术检测全血中活化的血小板(Detection of Activated Platelets in Whole Bloodusing Activation-Dependant Monoclonal Antibodies and Flow Cytometry)，”《血液学(Blood)》，第70卷，第1期(7月)，1987年：第307-315页；沙尔夫·罗迪格E.(Scharf,Rudiger E.)等人的“在血液灌注的血管成形术-损伤的冠状动脉中血小板的活化，流式细胞术检测(Activation of Platelets in Blood PerfusingAngioplasty-damaged Coronary Arteries，Flow Cytometric Detection)，”《动脉硬化和血栓形成(Arteriosclerosis and Thrombosis)》，第12卷，第12期(12月)，1992年：第1475-1487页，它们的传授内容通过引用以其全文结合在此)。例如，包含血小板的样品可以与对标记具有特异性的抗体在适合用于在抗体与血小板上表达的标记之间形成复合物的条件下接触，并且检测或测量(直接或间接地)复合物的形成。在一个实例中，膜结合的标记的水平可以通过流式细胞术通过以下手段来评定：获得包含血小板的第一样品和第二样品，将用作对照的所述第一样品与血小板活化激动剂(如乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、ADP(腺苷二磷酸)、凝血酶、胶原蛋白、和/或TRAP(凝血酶受体活化肽))在适合用于活化所述第一样品中的血小板的条件下接触、优选地持续有效最大地活化所述血小板的一段时间，并且优选地，同时在适合用于维持内源性血小板活化水平的条件下维持该第二样品。该方法然后涉及用包含具有荧光标记的抗血小板标记抗体的组合物接触或染色该样品，优选地以超过结合血小板上表达的标记所需要的量，在适合用于在所述抗体与活化的血小板之间形成标记的复合物的条件下。然后测定(检测或测量)在所述样品中复合物的形成，其中所检测的复合物的量表明在所述第二样品中血小板活化的程度。在一个实施例中，在用本发明的组合物处理并且保存的分离的血小板中血小板活化的量类似于从供体新近获得的血小板中血小板活化的量。
除了使用流式细胞术来测量膜结合的血小板标记之外，还可以采用放射免疫测定。使用放射免疫测定，内源性血小板活化可以通过免疫结合测定通过以下手段来评定：获得包含血小板的第一样品和第二样品，其中每个样品含有预选数目的血小板；将所述第一样品与血小板活化激动剂(如乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、ADP(腺苷二磷酸)、凝血酶、胶原蛋白、和/或TRAP(凝血酶受体活化肽))在适合用于活化所述第一样品中的血小板的条件下接触、优选地持续有效最大地活化所述血小板的一段时间，并且优选地，同时在适合用于维持内源性血小板活化水平的条件下维持该第二样品。然后将这些样品与对正在被评定的标记有特异性的抗体组合物接触。该抗体可以具有一个放射性标记；或具有放射性标记的针对第二抗体的一个结合位点。检测这些样品中的复合物的形成，其中在所述第二样品中所检测的复合物与在所述第一样品中所检测的相比的量表明在所述第二样品中的血小板活化的程度。
用于检测可溶性血小板标记的测定
现在已知的或后来开发的任何方法都可以用于测量可溶性血小板标记。在一个优选的实施例中，可溶性血小板标记是使用ELISA测定或夹心ELISA测定来确定的。为了检测适合的样品中的可溶性血小板标记，收集一个样品(例如，血液)，并且优选地将血小板从该样品中去除(部分地或全部)，例如通过血清或血浆(例如，贫血小板血浆的分离)的制备。优选地对样品进行处理以在适于降低可溶性血小板标记中的人工增加的时间内去除血小板，如由于来自血小板的分泌或蛋白水解所造成的那些增加。可以在适当时对样品进行进一步处理(例如，通过用测定缓冲剂(例如，ELISA稀释剂)进行稀释)。此外，技术员可以添加稳定并防止体外血小板活化的试剂。这些稳定试剂的实例是腺苷三磷酸双磷酸酶和前列腺素E1(PGE1)。
为了在适合的样品如血清、贫血小板血浆(PPP)中使用ELISA测定确定可溶性血小板标记的测量，该方法涉及将适合的样品与组合物进行组合，该组合物包括抗血小板抗体作为检测剂，如生物素化的抗血小板MAb和HRP-链霉亲和素、或HRP-结合的抗血小板Mab，以及固体载体，如微量滴定板，在其上结合有(直接地或间接地)抗血小板标记捕获抗体。在适合用于在所述抗血小板标记抗体与可溶性血小板标记之间形成复合物的条件下，检测剂抗体结合到由捕获抗体识别的不同的表位上。该方法涉及确定样品中复合物的形成。
固相载体，如微量滴定板、浸渍片、珠粒、或其他适合的载体，可以用抗血小板标记抗体直接或间接地包被。例如，抗血小板标记抗体可以包被微量滴定孔，或可以将生物素化的抗血小板标记Mab添加到链霉亲和素包被的载体上。可以使用多种固定或包被方法以及许多固体载体，并且可以根据所希望的格式进行选择。
在一个特别优选的实施例中，将该样品(或标准品)与固体载体组合，同时与检测剂抗体组合，并且任选地与一种或多种通过其来监测检测的试剂组合。
已知量的可溶性血小板标记标准品可以如上针对适合的样品所述地进行制备和处理。这个标准品帮助量化对通过相对于标准品中的水平来比较样品中血小板标记的水平所检测的标记的量。内科医师、技术员、设备或有资格的人员可以将所检测的复合物的量与适合的对照进行比较以便确定水平是否升高。
用于血小板标记的典型测定是顺序测定，其中将一块板用第一抗体包被，添加血浆，洗涤该板，添加第二标记抗体，并且洗涤该板并且量化结合的第二抗体。然而，结合动力学揭示在一个同步格式中，第二抗体的解离率是降低的并且该测定更加灵敏。因此，同步格式(其中固体载体被用捕获抗体包被，并且同时添加血浆和检测剂抗体)可以实现提高的灵敏度并且是优选的。
技术员、内科医师、有资格的人员或设备可以将这些结果与适合的对照如标准、在正常个体中一种或多种血小板标记的水平、以及在来自同一供体的样品中血小板标记的基线水平进行比较。例如，该测定可以使用已知量的血小板标记标准代替样品来进行，并且建立标准曲线。可以将已知量的血小板标记标准与形成的或检测的复合物的量进行相对地比较。
可以对保存损伤进行评定以便确定血小板的健康以及其活化并形成凝块的能力。保存损伤包括在室温下或低于室温下保存之后血小板的形态和分子变化。血小板损伤的第一可见效应之一是盘状形态向球形的不可逆损失，以及由于钙依赖性的凝溶胶蛋白活化和磷酸肌醇介导的肌动蛋白聚合所致的在表面上的刺状突起外观。在血小板中诱导的某些形态变化可以在显微镜下容易地观察到。形状的损失在低温下是加速的并且特别是当血小板暴露于低于20℃的温度下时。除了在形状上增加的改变之外，还在细胞内钙水平和肌动蛋白聚合程度方面出现显著增加。而且，保存的血小板分泌α颗粒和溶酶体内容物，这可以如在此所述用免疫学方法来评定，并且经由解聚过程重新组织在质膜下溶解的微管线圈。因此，在室温下或低于室温下发生的保存损伤可以通过本领域中已知的和在此所述的方法容易地测量以便量化本发明血小板组合物及相关方法的有效性。该标准用于比较本发明的血小板保存溶液的质量与没有唾液酸酶抑制剂的血小板保存溶液的质量。因此，用本发明的组合物处理的血小板维持与未在本发明的PAS中保存的(例如，在已知的血小板保存溶液如InterSol(芬沃公司(Fenwal))和SSP+(MacoPharma)中保存的)血小板至少相似或更佳的形状和功能。
例证
实例1：人类血小板：在室温下和低于室温下的延长的保存导致人类血小板的唾液酸损失和增加的唾液酸酶(神经氨酸酶)活性在冷藏下的延长的保存期间血小板唾液酸的损失
将血小板在1.2mM核苷酸糖的不存在或存在下在4℃下保存并且量化总唾液酸。将血小板离心、充分洗涤、并且再悬浮于140mM NaCl、3mM KCl、0.5mM MgCl2、5mM NaHCO3、10mM葡萄糖以及10mM HEPES中，pH为7.4。将再悬浮的血小板的等分部分用RIPA缓冲剂(细胞信号技术有限公司(CellSignaling Technology))溶解以便使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质量化，或进行处理以便使用QuantiChromTM唾液酸测定试剂盒根据制造厂商的说明书(博世生物技术有限公司(BioAssays Systems))对血小板唾液酸进行量化。该测定试剂盒使用一种改进的Warren法，其中唾液酸被氧化成甲酰丙酮酸，该甲酰丙酮酸与硫代巴比妥酸反应形成粉红色产物。在549nm下的吸光度与唾液酸浓度成正比，在测试样品中的唾液酸浓度可以从根据制造厂商的说明书由唾液酸标准品获得的一个线性标准曲线来计算。新鲜的血小板含有约10μg的唾液酸/mg血小板蛋白质。与新鲜的血小板(第5_a天)相比，在冷藏下的延长的保存导致血小板唾液酸的严重损失(第5_b天，供体A，约35％；供体B，约25％)，归一化至100％。然而，唾液酸的损失由于在保存的血小板中存在CMP唾液酸和UDP-Gal(B_第5_b天)而在供体B血小板中被减慢，供体糖是再唾液酸化所需要的(图2)。UDP-Gal单独不具有作用(第5_c天)。应当注意的是，具有较少唾液酸损失的来自供体B的血小板与来自供体A的血小板相比具有较低的初始唾液酸酶表面活性(参见下文，图3B)。
在血小板保存期间的唾液酸酶活性。
人类血小板表达表面暴露的唾液酸酶。唾液酸酶活性是一个特别关注点，因为它大概是造成保存期间的血小板唾液酸损失的原因。因此，除了唾液酸含量的直接分析之外，在保存期间的总血小板唾液酸酶活性和表面唾液酸酶活性的量化对于了解唾液酸损失的机制是关键的。此外，唾液酸酶活性可能成为一种试图的再唾液酸化方法的阻碍。在新鲜的和保存的血小板中的唾液酸酶的性质的确定是重要的。在此示出了用于血小板唾液酸酶活性的一种可靠且灵敏的荧光测定方法，该方法使用4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸(4-MU-NeuAc)作为底物。在用Na2CO3终止之后，通过唾液酸酶来裂解底物释放出唾液酸和甲基伞形酮(MU)，其中后者是在λex/em＝355/460nm下读取的。测量了在非透化的或透化的血小板中的唾液酸酶活性。图3A示出了完整的新鲜血小板不含显著的表面唾液酸酶活性。相比之下，丰富的唾液酸酶活性(包括表面和细胞内唾液酸酶活性两者)在透化的新鲜血小板中测量到。进一步的分析指出新鲜血小板的表面唾液酸酶活性在供体之间是不同的(图3A，供体A和B)，但在冷保存之后的增加的血小板唾液酸酶活性在所有的情况中(包括供体A和B(图3C))都观察到了。
冷藏之后的增加的血小板唾液酸酶活性的检测以及该情况在保存介质(未示出)中的不存在表明低温可以增加唾液酸酶的表面暴露。为了测试这个假设，血小板上的唾液酸酶暴露是通过免疫荧光来检查的。已经鉴定了4种人类唾液酸酶：Neu1、Neu2、Neu3及Neu4。Neu1是一种溶酶体酶；Neu2是一种胞质溶胶唾液酸酶；Neu3是一种质膜唾液酸酶，其中它的活性对神经节苷脂有特异性；并且Neu4是一种新颖的人类细胞腔的(1uminal)溶酶体酶。Neu1、Neu2、Neu3及Neu4共享高的相似度以及高度保守的残基的氨基酸嵌段。然而，这些唾液酸酶在亚细胞定位、体外底物优先选择、以及组织分布方面彼此不同。Neu1是一种溶酶体唾液酸酶，据推测它具有窄的底物特异性。这种酶的天然底物是未知的并且活性因此仅在如4-MU-NeuAc和硝基-苯基-NeuAc的人工底物上有报道，但在神经节苷脂酶(gangliosidase)、胎球蛋白、或唾液乳糖上没有。Neu2是一种具有宽的底物特异性的胞质溶胶酶。Neu3是一种质膜结合的唾液酸酶，最初被描述为神经节苷脂唾液酸酶。Neu3优先水解神经节苷脂，虽然也水解糖蛋白、4-MU-NeuAc、唾液乳糖等。溶酶体Neu1和表面结合的Neu3(抗体是可商购的)是当前研究的焦点。如在图4中所示，Neu3可以容易地在新鲜血小板的表面上可视化并且它的表达不受冷藏的影响。相比之下，Neu1在新鲜血小板上仅显示弱的表面暴露，这与它在细胞内溶酶体颗粒中的亚细胞定位一致。然而，在冷藏48h之后，它的表面暴露极大地增加。数据显示Neu1至少部分地造成冷藏期间血小板表面唾液酸酶活性的增加。
总体来说，在冷藏下的血小板保存促进血小板表面唾液酸的损失并且增加血小板表面唾液酸酶的表达。类似的结果也在RT保存的血小板中(未示出)见到。
实例2：小鼠血小板：在小鼠血小板的冷保存期间唾液酸酶活性增加并且唾液酸酶抑制剂DANA增加体内小鼠血小板的存活。
在48h的冷保存之后小鼠血小板唾液酸酶活性增加。
我们已经使用Amplex红神经氨酸酶(唾液酸酶)测定试剂盒(美国俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular probes，Eugene，OR，USA))测定在分离的、完整的、新鲜的小鼠血小板中并且在冷却和复温之后的唾液酸酶表面活性。将保持在室温下或冷藏48h的小鼠血小板(2×109个)分离并悬浮在所提供的反应缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH7.2和1mM CaCl2)中。源自血小板的唾液酸酶活性是在室温下在2.5h上测量。图5示出了唾液酸酶活性在血小板在低温(4℃)下保存之后与新鲜的室温血小板(RT)相比实质性地有所提高。关键的是，唾液酸酶活性不是来源于血浆，因为血小板在唾液酸酶活性测定之前被广泛地洗涤。作为对照，在相同的时间段上测量唾液酸酶活性(产气荚膜梭菌(组分H))(插图)。如通过流式细胞术使用抗Neu1特异性抗体所测定在保存的血小板上的Neu1表面表达增加了3.5倍(未示出)。
胎球蛋白作为血小板保存期间的一种竞争性唾液酸酶底物。
胎球蛋白(1mg/mL)被添加到在冷保存之前的小鼠富血小板血浆中或被添加到在室温下的新鲜的血小板中并且通过流式细胞术使用FITC结合的RCA-1-凝集素来测量β-半乳糖暴露，该凝集素是一种对暴露的β-半乳糖有特异性的凝集素。添加胎球蛋白极大地抑制了血小板保存期间的唾液酸水解，从而防止了RCA-1结合。胎球蛋白添加对RCA-1结合到新鲜的血小板上没有影响(图6)。这些结果表明在血小板冷保存期间唾液酸酶活性增加，大概由此介导了唾液酸水解。
唾液酸酶抑制剂DANA增加体内血小板的存活期。
使用一种唾液酸量化试剂盒(美国圣路易斯MI的西格玛公司(Sigma，St.Louis MI，USA))来测定新近分离的血小板和长期保存的血小板中的唾液酸的量化。唾液酸定量试剂盒测定在使用α2-3，6，8，9-神经氨酸酶(以便裂解所有的唾液酸键，包括支链唾液酸)从糖缀合物释放之后的总N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。结果显示2×109个新近分离的小鼠血小板(～2.5mg蛋白质)含有约3μmol唾液酸。在长期保存之后，血小板损失＞50％的其唾液酸含量(未示出)。
先前已经假设唾液酸正常地覆盖β-半乳糖残基并且允许血小板存活。这些结果显示正常的血小板存活是由肝细胞ASGP受体来调节的，不依赖于巨噬细胞。表面唾液酸一般是通过唾液酸酶来水解的。这些研究然后着手解决体内唾液酸酶活性的抑制是否对血小板存活具有影响。小鼠血小板在用特异性的唾液酸酶抑制剂2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐(DANA)注射小鼠之后具有延长的存活。在体内血小板生物素化之后，用100mM DANA或PBS(磷酸盐缓冲盐水)注射小鼠作为对照。与对照小鼠中的生物素化的血小板存活(对照)相比，用DANA抑制唾液酸酶活性增加了生物素化的血小板(DANA)的存活(图7)。这些结果指出体内神经氨酸酶活性的抑制延长了血小板存活。然而，该效应可能不是血小板特异性的。如所示，新鲜的血小板的恢复和存活在Asgr-1或Asgr-2缺乏的小鼠中显著提高(索伦森
Figure BDA0000415603820000741
等人，血液学，2009年，第114卷，第1645-1654页)，揭示了肝细胞Ashwell-Morell受体常规地监视(survey)血小板表面的β-半乳糖暴露。总之，这些数据指示血小板在循环时损失唾液酸，可能是由于唾液酸酶的活性所致，这代表了衰老的血小板的一个新的清除机制。
实例3：唾液酸化/去唾液酸化在限定血小板的循环寿命中的作用。
人类血小板产生Neu1和Neu3并且将Neu1释放到血浆中。
在此的研究提出了两种新颖的机制，这些机制促成了在保存之后发生的血小板清除的增加。第一血小板清除机制是通过在血浆不存在下的冷藏被快速诱导的，该机制是在当GPIbα的N-连接的聚糖上的GlcNAc残基变得暴露并且由肝脏吞噬细胞上的αMβ2受体的凝集素域识别时被介导的。第二清除机制是通过在低温下在血浆中长期的血小板保存所诱导的，该机制缓慢开始并且在当GPIbα被去唾液酸化并且由肝脏的肝细胞和巨噬细胞两者上的ASGP受体识别时发生。近来的数据揭示了内源性唾液酸酶和糖基转移酶(GT)在调整正常血小板的循环寿命中的意外的作用。此外，如在此所证明，血小板在其表面上表达GT和唾液酸酶并且分泌这两者。这两种机理途径的交叉强烈地提示血小板具有通过更新其表面糖蛋白的聚糖来自我调节在血液中的存活的一种固有能力并且血小板的寿命可以分别在正方向抑或负方向上通过碳水化合物添加或去除机构来调整。促进血小板循环或清除的聚糖结构因子理想地适合于由唾液酸酶或GT活性进行的治疗操作(参见图8)。
使人类血小板的溶解产物经受SDS-PAGE并且使用对Neu1和Neu3有特异性的抗体(由马里兰大学(Univ.ofMaryland)的N.斯塔玛托斯(N.Stamatos)博士提供)进行蛋白质印迹法。图9示出了人类血小板含有Neu1和Neu3两者。图10示出了人类血小板在低温下保存24小时之后将Neu1释放到血浆中，这表明了释放的Neu1可以介导表面唾液酸从血小板GPIbα中的去除。如从图10和图4所预测，与血小板表面结合的唾液酸酶活性随着冷却时间而提高。
人类血小板表达糖基转移酶并且在活化后将它们释放到血浆中。
糖基转移酶(GT)在血小板上表达并且在内部被包装到一个分泌室中。血小板具有表面结合的β4gal-T(β4Gal-T1)，该物质催化在β1-4键中的Gal与GPIbα的N-连接的聚糖上暴露的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的联接，从而改善了短期冷却的小鼠血小板循环(霍夫迈斯特KM(Hoffmeister KM)、约瑟夫森EC(Josefsson EC)、艾萨克NA(Isaac NA)、克劳森H(Clausen H)、哈特维希JH(Hartwig JH)、斯多塞尔TP(Stossel TP)，糖基化恢复冷冻的血液血小板的存活(Glycosylation restores survival of chilled blood platelets)，科学(Science)，2003年9月12；301(5639)：1531-4)。这个糖基化机构的性质由在此所提供的数据而变得越来越明显。例如，血小板上镶嵌有抗体以确定表达了哪种酶。人类血小板溶解产物是通过SDS-PAGE来显示的并且进行针对识别GT的抗体的蛋白质印迹。存在针对3种GalNAc-T、一种Gal-T、以及一种Sial-T的交叉反应性蛋白质(图11A)。
内部GT储备的存在提示血小板可能在活化之后将GT移到它们的表面。评定了与静息血小板抑或活化血小板相关的各GT亚型的量，还评定了释放到相应介质中的量。静息血小板被维持在37℃下或用25μM TRAP处理5分钟。1分钟之后观察到最大的释放。将维持在800xg沉淀的血小板(P)中的酶活性释放到介质(M)中。在活性测量之前该介质在100,000xg下澄清持续90分钟。图11B示出了约93％的与静息血小板相关联的总GT活性，如通过离心(P)所收集，虽然小部分的活性被释放到沐浴介质(M)中。然后，在用25μM的凝血酶受体活化肽(TRAP)活化血小板5min之后，细胞相关的活性的量下降并且约50％的总GalNAc-、Gal-、以及Sial-T活性被释放到该介质中。超速离心并未从上清液中除去酶活性，这排除了分泌的活性驻留在血小板微颗粒中的可能性。因此，GT被包装在分泌室中的血小板内。也解决了这个内部GT室的性质。用针对某些选定的GT的抗体或充分表征的高尔基基质蛋白GM130来免疫荧光标记固定的和透化的血小板揭示了每个血小板2-5个颗粒状结构的染色(未示出)。由此可见，血小板含有丰富数量的GT和唾液酸酶并且血小板进行循环的能力取决于具有在最大唾液酸化状态下的GPIbα。
内源性活化血小板唾液酸转移酶将唾液酸并入GPIbα中。
内源性去唾液酸化是通过追踪静脉内注射的荧光-CMP唾液酸(FITC-SA)在小鼠血小板中的结局来研究的。注射之后，对血小板进行分离并且通过流式细胞术(图12)和通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析来测定荧光标记合并到小鼠(未示出)和人类GPIbα(图12)中的程度来分析荧光的合并。使用14C CMP唾液酸获得类似的结果，如图12中所示。将FITC标记的CMP-SA(FITC-SA)或FITC单独(FITC)注射到野生型小鼠中。1小时之后，使小鼠出血并且通过流式细胞术来测定FITC向血小板中的掺入。将分离的人类血小板用FITC(F)、FITC-SA来孵育或未进行处理(-)。使静息的(静息)和TRAP(TRAP)活化的血小板经受使用抗-FITC(FITC)、-GPIbα、-αIIb或-冯·维勒布兰德因子(vonWillebrand factor)(vWf)抗体进行的蛋白质印迹法。肌动蛋白被显示为一种加载对照。
由金属蛋白酶TACE(ADAM17)对GPIbα和GPV进行的蛋白水解不是引发去唾液酸化之后的血小板清除所需要的。
在室温血小板保存或冷藏下的血小板保存期间，观察到GPIbα和GPV的损失。与其他血小板受体如相比，如GPIX、GPIbβ、GPVI或β3在血小板保存之后保持不变，与保存温度无关(图13)。TACE介导血小板冷藏期间的GPIbα和GPV的蛋白水解，如由使用金属蛋白酶抑制剂GM6001进行的TACE的抑制或血小板缺乏TACE所示(图14)。意外的是，在血小板冷藏期间受体损失的保护并不防止冷藏的血小板清除(图14)。唾液酸从TACE缺乏的血小板中的去除缩短了血小板的循环寿命(图15C)。这表明GPIbα或GPV的蛋白水解不是引发去唾液酸化之后的血小板清除所需要的。血小板是从TACE活性缺乏的小鼠中分离的并且用唾液酸酶在37℃下处理15min或未进行处理(-Neu)。将荧光(CMFDA)标记的血小板(2×108个)注射到野生型小鼠中并且测定它们的循环时间。重要的是，在唾液酸酶(Neu)处理过的和未处理的TACE-/-血小板中当通过流式细胞术来测量时没有观察到表面vWf受体表达的差异(图15B)。相比之下，在唾液酸酶处理之后，β-半乳糖暴露增加了约5倍，如使用RCA I和ECL凝集素所测定(图15A)。
实例4：表面唾液酸防止了在血小板保存期间GPIbα和GPV的损失并且挽救小鼠血小板的体内存活。
血小板的处理和保存与血小板损伤(例如，形状变化、活化、释放反应、以及细胞凋亡)相关联，这部分地是由于表面受体的损失。表面唾液酸被视为是循环的血细胞和糖蛋白的存活的一个关键因素。然而，它在血小板受体损失和血小板存活中的作用还不清楚。在这项研究中，对表面唾液酸与血小板受体损失之间的关系进行体外和体内调研。
唾液酸从血小板vWf受体中的除去刺激GPIbα和GPV脱落。
用增加浓度的广谱产脲节杆菌α2-3，6，8-唾液酸酶孵育小鼠血小板增加了表面β-半乳糖暴露，但β-GlcNAc却没有，如通过在流式细胞仪中的凝集素结合测定所检测(图16)。图17展示了表面GPIbα和GPV的渐进性表面损失连同唾液酸含量的减少(p＜0.05)。GPIbα受体表达之后是多重抗-GPIbα抗体以便排除去唾液酸化更改结合到GPIbα上的抗体的可能性。我们检测到在用5mU唾液酸酶处理之后末端β-半乳糖的约6倍增加，但β-GlcNAc却没有。B-半乳糖暴露受到竞争性唾液酸酶抑制剂DANA的完全抑制(图18)。唾液酸酶处理不会影响表面GPIX-受体或整联蛋白αIIbβ3的表达(p＞0.05)(图19)。关键性地，添加竞争性唾液酸酶抑制剂DANA防止了所有GPIbα和GPV脱落(图19)，这与唾液酸损失引发GPIbα和GPV用于金属蛋白酶介导的脱落做的假说一致。图20通过使用总血小板溶解产物、血小板上清液以及相应的血小板沉淀在添加或不添加神经氨酸酶和DANA下的免疫印迹分析来证实图19中所示的流式细胞术数据。为了支持这个看法，图21示出了用唾液酸酶处理的新鲜的血小板在通过将DANA添加到保存缓冲液中来避免的方法中从循环中快速地被清除。重要的是，DANA的添加保护了室温保存的小鼠血小板的受体表达(图22)和血小板存活(未示出)。
去唾液酸化是TACE-介导的GPIbα和GPV脱落所需要的。
为了证实去唾液酸化的GPIbα和GPV是比唾液酸化形式更佳的TACE底物，将血小板用重组的TACE(rTACE)在DANA的存在或不存在下进行处理。用rTACE处理的血小板释放出分别为47％±6和18％±12的它们的GPIbα和GPV(p＜0.05)(图25)，但是可忽略不计的量的它们的GPIX和αIIbβ3(p＞0.05)(未示出)。由rTACE而非rTACE活性(未示出)所致的受体脱落被DANA完全避免(图25)。将MMP抑制剂GM6001添加到唾液酸酶处理过的血小板中并不能防止β-半乳糖暴露，例如唾液酸的损失(图23)，但抑制由rTACE所致的受体脱落(图24)(p＜0.05)。由唾液酸酶诱导的β-半乳糖暴露在GM6001和rTACE的存在下增加了7倍(图23)，这表明GM6001对唾液酸酶活性没有影响，但是完全抑制了rTACE和内源性金属蛋白酶功能。因此，这些数据显示GPIbα和GPV的去唾液酸化可能是在低温下TACE-介导的受体脱落的前提，并且支持以下观念：GPIbα的TACE裂解取决于先前的唾液酸酶活化。
实例5：血小板浓缩物中的细菌污染/增殖导致过多自由的唾液酸在保存介质中的形成。
在医院和血液中心，血小板是在室温下保存的。为了降低细菌生长和输注之后的医源性感染的风险，在美国，血小板的保质期被限于5天。血小板不可以在冷藏下在细菌生长和输注相关感染的较低风险下以与红细胞(RBC)相似的方式保存。冷藏的血小板快速地从接受者的循环中清除，尽管有改善的体外功能。血小板的冷藏使血小板糖蛋白Ibα(GPIbα)复合物不可逆地成簇，导致当经由凝集素介导的途径注入时快速的血小板清除。
用于输注的血小板在室温下的保存促进受细菌污染(非无菌)的血小板中的细菌生长。许多细菌能够与血小板相互作用并且通过细菌表面蛋白与血小板受体的直接相互作用或其中血浆蛋白结合到细菌表面且随后结合到血小板受体上的间接相互作用诱导血小板聚集。参见图1A-C。细菌分泌多种生物活性物质到它们的局部环境中。分泌的蛋白质在细菌致病机制中特别重要。这些蛋白质具有从宿主细胞毒性到宿主细胞为了侵入者的利益而发生的更精细改变的范围内的生物功能。在受细菌污染的血小板产品中，源于细菌的产物可能能够触发血小板活化或引起对血小板的损害。许多细菌分泌的水解酶如蛋白酶和糖苷酶(即，分泌的酶)促成细菌毒力或被视为在作为营养素促进细菌生长中发挥作用。在血小板产品中，由污染的细菌分泌的酶可以截断血小板聚糖和/或促进血小板受体脱落。血小板尤其易受唾液酸酶活性(唾液酸水解)的影响，因为它们被唾液酸末端的聚糖大量地修饰。唾液酸残基的唾液酸酶介导的损失将在输注之后通过肝细胞的无唾液酸糖蛋白受体(ASGR)造成去唾液酸化血小板的清除。产唾液酸酶细菌在血小板产品中的存在将对血小板特别有害。另外，在唾液酸损失之后，无唾液酸糖缀合物可能变成另外的细菌糖苷酶的底物。基础聚糖的随后释放将生成营养素，这些营养素将增加细菌增殖并且产生用于细菌-血小板相互作用的配位体。
尽管众所周知血小板产品中的细菌污染可能导致输注相关败血症以及经由细菌-血小板相互作用发生的血小板活化，但是产唾液酸酶细菌在血小板产品中的存在以及它们对血小板质量的潜在影响还尚未被认识或研究。预期产唾液酸酶细菌在血小板产品中的存在去唾液酸化血小板上和血浆中的唾液酸糖蛋白并且增加保存介质中的游离唾液酸浓度。
材料与方法：将一袋血小板浓缩物(马萨诸塞州波士顿市的研究血液组分公司(Research Blood Components，Boston，MA))无菌地分到两个50-mL离心管中。添加前列腺素E1(PGE1，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))至1μg/mL并且在200xg下离心样品20min以使受污染的红细胞沉积。将上清液(纯化的血小板浓缩物，PC)从污染的RBC中除去并且汇集在新的50mL离心管中。然后将纯化的PC分开，提供相同的产品以供分别在4℃和室温(RT)下保存。所有步骤都是在无菌条件下进行。在保存的第0天、第8天和第13天，将来自每种保存条件的等分部分去除并且在取样之时目视检查由细菌生长所引起的颜色变化。将样品在1000xg下离心10min。将所得的上清液(贫血小板血浆，PPP)进一步在10,000xg、4℃下离心10min。使用QuantiChrom唾液酸测定试剂盒(加利福尼亚州海沃德市的博世生物技术有限公司(BioAssaySystems，Hayward，CA))根据制造厂商的说明书分析来自第二离心(不含血小板的血浆，PFP)的上清液的游离唾液酸。
结果：在第8天和第13天，容易地可见在室温下保存的PC样品中的颜色变化，提示了在这些条件下的“天然”(与掺加相反)存在的细菌的增殖。在4℃保存的样品中没有看到可见的颜色变化。
对新鲜的PRP和PFP中的游离唾液酸(FSA)以及从保存样品中回收的PFP进行测量并且结果示于图26中。虽然人类血浆含有高浓度的总唾液酸(1-2mM)，但在新鲜的PC或PFP中的FSA的量仅为约4μM，占小于总唾液酸的0.5％。FSA水平在4℃下的8天保存期间保持不变并且在4℃保存的第二周(第13天)期间增加了1.4倍(虚线)。这一数据显示了在细菌生长受阻的条件下，由于内源性血小板唾液酸酶所致的血小板唾液酸损失是最低的。相比之下，在RT下保存期间，FSA在第8天增加了约3倍且在第13天增加了约9倍。在RT保存的样品中FSA的快速增加不可以仅归因于内源性血小板唾液酸酶的作用。这可能是由污染的细菌释放的内源性唾液酸酶的结果。这一数据还表明污染的细菌是产唾液酸酶细菌。
结论：产唾液酸酶细菌潜在地存在于所有的血小板产品中。细菌的唾液酸酶可以去唾液酸化血小板，损害了它们的生物功能。
实例6：在血小板产品中的细菌增殖可以受到唾液酸酶抑制剂的抑制
唾液酸酶在产唾液酸酶细菌的致病性和营养中发挥重要作用。唾液酸占据许多脊椎动物细胞的表面上的聚糖分子内的末端位置，其中它在不同的细胞过程如细胞间粘附和细胞信号传导中起作用。致病菌已经进化成以如下至少两种不同的方式有利地使用这种分子：1)它们可以以唾液酸自身包被，从而提供对宿主的先天免疫应答的组分的抗性，2)或它们可以将这种分子用作营养素。唾液酸自身是由这些细菌从头合成的或从宿主中被直接清除。我们对于产唾液酸酶细菌在血小板产品中作为污染物而存在的发现提示了通过用唾液酸酶抑制剂来抑制唾液酸酶活性而在血小板产品中抑制细菌生长的一种新颖途径。
唾液酸酶抑制剂对于制药工业来说并不陌生。流感病毒药物达菲和瑞乐沙抑制流感病毒的唾液酸酶，该酶是从受感染的细胞传播病毒所需要的。然而，它们不曾被用在血小板产品中。
常规地，将血小板悬浮于100％血浆中。尽管血浆(更确切的说全血)是血小板体内的天然介质，但它可能对保存期间的血小板具有有害作用，因为血浆酶如蛋白酶可能损害血小板膜。同样可以维持血小板功能或比血浆更佳的保存溶液是令人希望的，部分是为了使血浆可供用于其他目的，但尤其是减轻输注相关的不良反应如TRALI。因此，一直致力于关注具有满意的血小板保藏能力的血小板添加液，该溶液具有少的残余血浆。
血小板添加液(PAS)最早是在1980年代开发的，并且不断地被改进至今。对于血小板浓缩物的质量和患者两者来说，使用PAS代替血浆具有许多益处。已经对在保存在比率为35％：65％的血浆与INTERSOLTM(30mM磷酸钠、10mM柠檬酸钠、30mM乙酸钠以及70mM氯化钠，pH7.4)中的血小板中的模型细菌的生长动力学进行了研究，其中初始细菌浓度是0.5至1.6CFUs/mL。PAS保存环境内的细菌的对数期生长的更快速引发导致在24小时在PAS单位中的细菌浓度比血浆单位中高出4个log。这可以呈现PAS保存的血小板的早期细菌检测优势。
为了增加浮游细菌的形成从而改进细菌检测的灵敏度，在PAS(InterS0l)与血浆的一种混合物(80：20)中进行血小板保存研究。许多细菌检测方法可供使用。我们使用了SLP成套试剂(297-51501，美国和光化学公司(WakoChemicals USA))，该成套试剂含有桑蚕幼虫血浆(SLP)和3，4-二羟苯丙氨酸(DOPA)，根据制造厂商的说明书进行复原并且作为100μL等分部分保存在-80℃下。当将样品与SLP试剂混合时，来源于样品中的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞壁的肽聚糖引发一系列反应，包括多重丝氨酸蛋白酶的活化，被称为酚氧化酶原(proPO)级联。在这些级联反应中产生的酚氧化酶(PO)氧化SLP试剂中的底物3，4-二羟苯丙氨酸(DOPA)，从而形成黑素(深蓝)。在测试样品中的细菌浓度与显色的起始时间成反比：更短时间＝更高的细菌浓度；更长时间＝更低的细菌浓度。
材料与方法：将一袋血小板浓缩物分到两个50mL离心管中，添加PGE1。在900xg下离心10min之后，将80％的上清液(PPP)(相对于总体积)除去，并且用相等体积的血小板添加液进行替换。将血小板充分再悬浮。汇集血小板悬浮液并且分成在15mL离心管中的4个等分部分。将在PBS中的DANA(1mM)添加到两个管中同时仅将PBS添加到其他管中。将一对样品在有和没有DANA的情况下在4℃下保存。将第二对保持在RT(22℃-24℃)下。在第0天和第9天除去1.0mL的等分部分，并且立即沉淀(5min,15,800xg)。丢弃上清液，并且将含有血小板和细菌的沉淀保存在-80℃下直至使用。所有实验步骤都是在无菌条件下进行。
将从在不同的时点采集的1mL等分部分中回收的含有血小板和细菌两者的沉淀再悬浮于100μL的0.1M NaOH中，并且在70℃下加热10min。在短暂的冷却之后，将溶液用135μL的80mM MES中和。将反应混合物通过离心(5min，在15,800xg下)来澄清。将上清液的10μL等分部分与相等体积的SLP试剂混合，该SLP试剂是根据制造厂商的说明书从SLP试剂盒中的组分复原。将样品留在实验台上，并且监测显色。记录颜色检测的时间(TOCD)。
结果：结果示出于图27中。选出的在第9天的样品分析期间拍摄的照片显示于图27、的图A-C中。淡的、但是可见的显色在15分钟后在没有DANA的RT保存的样品中观察到，表明在这个样品中有最高的细菌浓度。TOCD在DANA的存在下延长至约34min(#3，图27，图B)。并不奇怪的是，细菌生长在低的保存温度下受到极大地抑制，在4℃保存的样品中的TOCD(图27，图C)(＜45min)与在DANA不存在或存在下在RT保存的样品中的TOCD相比是增加的。其在4℃下的TOCD在DANA的存在下进一步延长(约50min，图27图C)。量化数据显示在图27图D中。
结论：唾液酸酶抑制剂DANA可以有效地抑制血小板保存期间的细菌生长。虽然细菌的性质是未知的，但它们可能是产唾液酸酶的细菌。另外，观察到污染的细菌在4℃下不是完全休眠的。
实例7：DANA抑制保存的小鼠血小板中的细菌增殖并且改善体内小鼠血小板的存活和恢复。
小鼠血小板具有约4-5天的寿命，这大大短于人类血小板(8-10天)。当在室温或4℃下保存时它们还比人类血小板不稳定得多。小鼠血小板体外快速变质的机制还未被充分了解，然而，小鼠血小板保存可能由于缺乏无菌血小板采购方案而受到细菌污染的影响，这与人类血小板的收集形成对照。至今尚不清楚潜在的细菌污染是否促使小鼠血小板的快速变质。
材料与方法：小鼠血液是使用3.75mg/g的阿佛丁(德国斯坦海姆市的佛卢卡化学公司(Fluka Chemie，Steinheim，Germany))通过眶后眼球放血(retro-orbital eye bleeding)至0.1体积Aster-Jandl抗凝剂中而从麻醉的小鼠中获得的并在300xg下在RT下离心8min以获得富血小板血浆(PRP)。将血小板通过在1200x g下离心5min从血浆中分离并且在140mM NaCl、5mM KCl、12mM柠檬酸三钠、10mM葡萄糖、以及12.5mM蔗糖、1μg/mLPGEl、pH6.0(血小板洗涤缓冲液)中通过离心洗涤2次。将洗涤的血小板以1×109个/mL的浓度再悬浮于140mM NaCl、3mM KCl、0.5mM MgCl2、5mM NaHCO3、10mM葡萄糖以及10mM HEPES、pH7.4(血小板再悬浮缓冲液)中，用5μM5-氯甲基荧光素二乙酸酯(CMFDA)在37℃下标记15min。未掺入的染料是通过离心去除并且将血小板悬浮于血浆中。分别从其相应的PBS储备溶液中添加DANA、唾液乳糖以及葡萄糖(作为营养素)至0.5、0.5以及8mM的最终浓度。仅添加PBS作为对照。将血小板悬浮液在4℃或RT下保存48h。在48h之后，将保存的血小板通过眶后注射200μL的3×108个血小板而输注。输注之后，通过在5min、2以及24h的时点下进行眶后放血来收集血液。在PRP中的CMFDA阳性血小板的百分比是通过流式细胞术测定的。
结果：目视检查所有样品的细菌污染的证据。在DANA不存在下在室温保存的血小板中观察到严重的血浆颜色漂白，提示了细菌生长。在所有其他的条件下没有看到可见的变化。在血小板防腐剂存在下在RT保存48h的小鼠血小板的恢复和存活与缺乏防腐剂保存的血小板相比大大改善(图28)。小鼠血小板在RT保存时快速地变质，这清楚地显示在图29中。重要的是，与对照样品相比，在保存介质中存在DANA、唾液乳糖和葡萄糖下，约5倍多的血小板被恢复(图29)。
结论：唾液酸酶抑制剂DANA能够有效地保护小鼠血小板免于在保存期间变质并且大大改善了输注的血小板的恢复和存活。
实例8：在不同浓度的DANA存在下的小鼠血小板的保藏
DANA是针对病毒、细菌和哺乳动物的唾液酸酶的一种有效的、广谱的唾液酸酶抑制剂，其中Ki是在低的μM范围中。它在所有我们的研究中常规地在1mM下使用。预期的是其浓度可以急剧降低，同时维持它的针对细菌引起的保存的小鼠血小板变质的功效。
材料与方法：将小鼠血小板如实例3中所述来分离，再悬浮于血小板再悬浮缓冲液中并且分成4个等分部分。将葡萄糖以8mM添加到所有样品中，并且分别添加DANA至0、0.1、1.0以及10mM的最终浓度，两者都来自100mM含储备溶液的PBS。将样品在37℃下孵育30min，离心并且除去上清液。将血小板再悬浮于血浆中。将DANA和葡萄糖恢复至其初始浓度。血小板悬浮液保存在RT下。在48h之后，将在每种保存条件下的血小板通过流式细胞术来计数。
结果：小鼠血小板在RT下保存时快速地消亡，这清楚地显示在图30A中。然而，在仅0.1mM DANA在保存介质中存在下，约5倍多的血小板被恢复(图30B)。
结论：唾液酸酶抑制剂DANA能够有效地保护小鼠血小板免于变质，这极大地改善了输注的血小板的恢复和存活。
实例9：通过唾液酸酶抑制剂DANA抑制粘质沙雷菌的增殖和生物膜形成
血液产品的细菌污染是目前最显著的输注相关感染风险。血小板浓缩物(PC)是最可能因其保存条件(22℃伴随搅拌、中性pH、以及高葡萄糖含量)而被污染的产品，这些条件特别适合于细菌生长。虽然革兰氏阳性菌最常从被污染的PC中回收，但是革兰氏阴性菌更多地与严重疾病和死亡相关联。革兰氏阴性粘质沙雷菌是重要的人类机会致病菌，它已经涉及到牵涉被污染的PC的许多不良输注反应(ATR)。这个物种在不利的环境条件下存活、抵抗消毒以及形成微生物的表面相关群落(生物膜)的能力带来了关于其在临床环境中的消除的挑战。最近，已经示出了近缘物种液化沙雷菌在血小板保存条件下形成生物膜，这与通过菌落计数进行的检测降低有关。
为了在血小板产品中进行增殖，受污染的细菌可能具有一种获得和/或利用唾液酸的机构。粘质沙雷菌是一种革兰氏阴性菌，它已经涉及到与被污染的血小板浓缩物相关联的不良输注反应。它产生一系列的毒性极强的产物，包括蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、甲壳酶以及溶血素；然而，可分泌的唾液酸酶的存在尚未被描述。基于由粘质沙雷菌分泌的产物的毒性特征，唾液酸酶的存在是高度可信的(highly plausible)。因此，这个菌株被选用来测试我们的抑制细菌生长的唾液酸酶抑制策略。粘质沙雷菌菌株(ATCC#43862)先前已经用于涉及在血液产品中的细菌检测和生长的研究中。
材料与方法：细菌菌株和生长条件。粘质沙雷菌菌株(ATCC#43862)是从美国典型培养物保藏中心(维吉尼亚州马纳萨斯市(Manassas，VA))购买的。使细胞在脑心浸液肉汤(ATCC培养基3)中在37℃和250rpm下生长。将冷冻储备物从过夜培养物来制备并在-80℃下保存在含有按体积计15％甘油的脑心浸液肉汤中。
生物膜形成：为了制备种子培养物，将粘质沙雷菌的深冷储备物用棉签接种至3mL的脑心浸液肉汤中并且在37℃下、在250rpm下伴随搅拌孵育6h。将细胞密度在双波长分光仪上在600nm下测定并且用无菌PBS稀释至0.5麦氏比浊标准(McFarland Standard)(1.5×108个细胞/mL)。将10μL稀释的培养物接种至140μL的含30％血浆的PAS、按体积计含30％PC的PAS或100％血浆中，补充有或没有1mM DANA，在96孔PVC板(康宁生物科学(ComingBiosciences))的孔中。对于每种培养基，进行六次重复。将10μL的PBS接种至对照孔中。然后将微量滴定板用无菌多孔膜(VWR)密封并且置于平台振荡器上。将培养物在轻微振荡(约100rpm)下孵育48h。将培养物轻轻地混合并转移到聚苯乙烯板上以用于在OD595nm下测定浮游细胞密度。将原始微量滴定板上的孔用3×200μL的PBS洗涤，晾干，用0.1％(wt/vol)结晶紫的水溶液染色15min，用水冲洗，并且晾干1小时。将由生物膜保留的结晶紫用200μL的二甲亚砜(DMSO)或30％乙酸洗脱，并且在595nm下读取。
结果：在微量滴定板上的次最优的生长条件(缺乏充分的搅拌和通气、以及低温)下，粘质沙雷菌在纯血浆中生长良好(图31A)。细胞生长在30％血浆或含30％PC的PAS中显著受阻。值得注意的是，在生长介质中包含1mM DANA抑制了在所有条件下的细菌生长。与观察到细菌生长的趋势同时，生物膜的形成与浮游细胞密度充分相关并且受到在生长介质中存在DANA的负面影响(图31B)。由于信号溢出，在血浆中生长的细菌的生物膜形成的A595nm的测量不能被准确地解释，提示在纯血浆中比在基于PAS的介质中的更强的生物膜形成。
结论：当用96孔PVC板进行分析时，唾液酸酶抑制剂DANA能够抑制粘质沙雷菌的增殖和生物膜形成。这些数据还显示粘质沙雷菌含有一种先前未报道的机构来获得和/或利用唾液酸进行增殖和/或形成生物膜。
实例10：血小板表面聚糖在健康志愿者之间的变化
血小板具有所有主要的血液组分中最短的保质期并且是最难保存的；这些限制使血小板输注实践复杂化。史利希特博士(Dr.Slichter)和同事们(华盛顿州西雅图市的普吉特海湾血液中心(Puget Sound Blood Center，Seattle，WA))已经鉴定了输注的新鲜的放射性标记的自体血小板的恢复和存活在健康受试者之间的显著差异。仍然不清楚血小板恢复和存活的个体间差异的原因我们证明了唾液酸从冷保存的和输注的血小板的表面的损失促进其由肝脏去唾液酸糖蛋白受体(Ashwell-Morell受体)的清除。血小板表面唾液酸的损失与血小板保存期间表面唾液酸酶活性的增加相关。在这里，我们研究了来自单独供体的新鲜血小板是否在表面聚糖暴露上呈现出差异，这可能影响输注后血小板恢复和存活。
材料与方法：静脉血是通过静脉穿刺至0.1体积的Aster Jandl柠檬酸基抗凝剂中而从志愿者中获得的。抽血的批准是从布莱根妇女医院的机构审查委员会(Institutional Review Board of Brigham and Women’s Hospital)获得，并且知情后同意是根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)批准的。富血小板血浆(PRP)是通过在125xg下离心20min来制备的并且将血小板通过经由小型琼脂糖2B柱的凝胶过滤而从血浆蛋白中分离。将分离的血小板在室温下用10μg/mL的β-半乳糖特异性FITC-结合的鸡冠刺桐(E.cristagalli)凝集素(ECL)孵育20min。将样品用200μL的PBS稀释并且立即在FACSCalibur流式细胞仪(碧顿迪肯森(Beckton Dickenson))上通过流式细胞术进行分析。平均荧光强度是在门控的血小板群中测定。
结果：末端半乳糖在新近分离的血小板的表面糖蛋白(即缺乏SA的聚糖)上的存在在健康的受试者之间差异很大(五名个体中的三名具有低水平的暴露的半乳糖(15.3±4.1，MFI)，如所预期的。然而，两名受试者呈现出显著更高(2-7.5倍)水平的半乳糖暴露。这些结果是使用第二半乳糖特异性凝集素RCAI并且通过在两个不同的时点重复测量同一个体来证实。类似地，对血小板浓缩物的初步研究证明了在血小板表面唾液酸酶活性上的显著变化(图32)，这与血小板保存期间并且可能是在血小板体内循环期间的唾液酸损失率相关。我们的结果显示了来自健康个体的新鲜血小板在表面唾液酸酶活性和唾液酸含量上是不同的。
这些结果表明表面唾液酸可以代表影响输注的新鲜血小板的恢复和存活的一个因素。
实例11：用于制备含有唾液酸酶抑制剂的血小板添加液的一般程序
本发明的PAS可以如下来制作。袋的总体积是500mL。
为了制备一种血小板添加液，获得以下USP级别的组分：
1)电解质，如Na、Cl、K、Ca、以及Mg。
2)一种能量来源，如葡萄糖或柠檬酸盐，以便维持有氧代谢。
3)一种缓冲剂如磷酸盐。
4)注射用水(WFI)。
5)一种唾液酸酶抑制剂。
表2提供了制备1000mL的血小板添加液所必需的包括能量来源、缓冲剂以及电解质的组分的浓度和量(克)。水是以1000mL的量来添加并且对溶液进行缓冲以维持pH7.2的pH。
唾液酸酶抑制剂如DANA可以从无菌的0.1-1000mM储备水溶液来添加至所希望的浓度。
表2
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实例12：在含有唾液酸酶抑制剂的PAS中保藏小鼠血小板。
小鼠血小板具有约4-5天的寿命，这大大短于人类血小板(8-10天)。当在室温或4℃下保存时它们还比人类血小板不稳定得多。然而，小鼠血小板的这些缺点可以被利用来评定血小板添加液对于血小板保藏的效力。
材料与方法：小鼠血液是使用3.75mg/g的阿佛丁(德国斯坦海姆市的佛卢卡化学公司)通过眶后放血至0.1体积的Aster-Jandl抗凝剂中而从麻醉的小鼠中获得的并在200xg下在RT下离心8min。将含有富血小板血浆、血沉棕黄层、以及一些RBC的上清液除去并且在300xg下离心6min以获得富血小板血浆(PRP)。将PRP的4份150μL等分部分转移到4×1.5mL微量离心管(Eppendorftubes)中，并且在1000x g下离心5min。将约70％的上清液(105μL)从每个管中除去，并且用相等体积的InterSol替换。从100mM含储备溶液的PBS中添加DANA和/或葡萄糖(作为营养素)分别至1.0和10mM的最终浓度。使在缺乏一种或两种添加剂的管中的体积与PBS均等。将血小板悬浮液在RT下在振荡器上保存48h并且通过流式细胞术来分析。
结果：并不奇怪的是，小鼠血小板当在RT下保存时在InterSol中快速地变质(图33，图Aa)。仅57％的血小板是门控的(图33，图Ba)。引人注目的是，在用1mM唾液酸酶抑制剂DANA保存时超过80％的原始血小板事件被计数在血小板门内(图33，图Ab和Bb)。添加10mM葡萄糖导致保存之后甚至更高的血小板计数恢复(图33，图Ac和Bc)。DANA和葡萄糖两者的一个组合保护了所有血小板(93％门控的，图33，图Ad和Bd)。DANA单独或与葡萄糖的一个组合与单独的葡萄糖相比导致更多的静息血小板群，如通过它们的前向和侧向散射特征所判断(该群是“较小拉长的”，即形成较少的血小板聚集物)(图33，图Ab和Ad，与图33，图Ac相比)。这一数据提示在保藏呈静息状态的血小板和保护血小板保存之后的血小板数量方面DANA比葡萄糖更有效。
结论：总之，这些数据表明在血小板保存期间DANA的存在改善了在含至少30％血浆的血小板添加剂INTERSOLTM溶液中保存的血小板的质量。
实例13：在唾液酸酶抑制剂DANA的存在下在血浆中保存的人类血小板的改进的体外质量。
“健康的”血小板的状态部分地是由其形状和大小来定义。血小板形状变化和聚集是血小板活化的标志。一旦活化，血小板改变形状并且分泌它们的颗粒内容物。血小板的保存伴随血小板活化，即血小板形状改变和颗粒释放。人类血小板在保存期间还增加表面唾液酸酶表达并且损失表面唾液酸。大概，唾液酸酶是保存在颗粒中并且在保存期间释放到血小板表面。来自实例12的结果提示小鼠血小板还可能在保存期间损失唾液酸并且这个过程可以有效地通过在保存中存在唾液酸酶抑制剂DANA来抑制，从而极大地改善了血小板的输注后恢复和存活。数据进一步表明保存的人类血小板的质量可以通过在保存介质中包括一种唾液酸酶抑制剂而改善。
静息的血小板具有圆盘形状并且在流式细胞仪中产生不同的侧向散射(SSC)信号，这取决于它们同激光束的相对取向。静息的血小板群在SSC/FSC信号中具有宽的(例如“圆形”)分布。一旦刺激，血小板形成伪足并且变成球形(形状改变)，从而产生一个特征性的SSC信号，不论它们对激光束的相对取向如何。因此，活化的血小板群在FCS/SSC图上显得更加“密集”。
基于这些考虑，我们研究了DANA是否在血浆中保存期间影响人类血小板活化(即，形状变化和颗粒释放)。
材料与方法：静脉血是通过静脉穿刺至0.1体积的Aster Jandl柠檬酸基抗凝剂中而从志愿者中获得的。抽血的批准是从布莱根妇女医院的机构审查委员会获得，并且知情后同意是根据赫尔辛基宣言批准的。富血小板血浆(PRP)是通过在125xg下离心20min来制备并且将血小板通过在850xg下离心5min从添加了PGE1(1μg/mL)之后的PRP中分离。保留上清液(贫血小板血浆，PPP)。将血小板沉淀再悬浮于PPP、1/2体积的原始PRP中，并且分成等分部分。将DANA从100mM含储备物的PBS中添加到一半的等分部分中至1.0mM，仅添加PBS至对照中。将样品保存在室温下的96孔微量滴定板的孔中，在振荡器上伴随搅拌，用可透气性的膜覆盖该滴定板。血小板的大小和密度是通过前向(FSC)和侧向散射(SSC)在FACSCalibur流式细胞仪(BD)上测量的。血小板是通过它们的前向和侧向散射特征来门控的。对于分析血小板脱粒(即，α-颗粒释放)来说，通过在50μL的PBS中用0.1μg/mL的FTIC小鼠抗人类CD62P(BD Pharmingen)抗体在RT下孵育30min来对保存的血小板的P选择素表面表达进行分析。然后将混合物用200μL的PBS稀释并且立即通过流式细胞术进行分析。P选择素(FITC)阳性细胞的百分比是在门控的血小板群中进行测定。
结果：在血浆中在RT下保存72h之后，人类血小板与新鲜的RT血小板(未示出)相比呈现出在侧向和前向散射特征上的降低(图34，图A，左侧)。在侧向和前向散射特征上的降低是血小板活化的特征。相比之下，在血小板保存期间添加0.5mM DANA造成了血小板形状的可见的改善(图34，图B，右侧)。血小板计数/SSC的直方图的比较显示，用DANA保存的血小板具有增加的平均荧光强度(MFI)，(图34，图B，左侧，注意到曲线稍微向右侧迁移)，提示在DANA存在下保存的血小板具有更高的颗粒性或内部复杂性并且更少被活化。类似地，血小板计数的直方图/FSC直方图显示，用DANA保存的血小板具有更高的侧向散射平均荧光强度(图34，图B，右侧，注意到曲线稍微向右侧迁移)。这些结果显示在DANA存在下保存的血小板更大并且保持盘状、静息形状。
这些结果是通过用FTIC小鼠抗人类CD62P(P选择素)抗体分析保存的血小板的P选择素暴露来证实的(图35)。在保存期间DANA的纳入显著防止了P选择素的暴露，并且抑制了α-颗粒释放。
总之，这些数据表明在血小板保存期间DANA的存在改善了100％血浆中保存的血小板的质量。
实例14：在含有唾液酸酶抑制剂DANA的PAS中保存的人类血小板的改善的体外质量。
实例12中所述的数据表明唾液酸酶抑制剂DANA可以有效地保护在30％血浆血小板添加液(被称为INTERSOL溶液)中保存的小鼠血小板的质量。实例13中所述的数据清楚地显示DANA还能有效地保护在100％血浆中的人类血小板的质量。在这个实例中，研究延伸至在比率为30：70的血浆/PAS中在DANA不存在或存在下保存的人类血小板。
材料与方法：人类血小板是如实例13中所述获得的。将血小板沉淀再悬浮于PPP、1/5体积的PRP中，并且等分至96孔微量滴定板的孔中(60μL/孔)。将含有7.15mM Na2HPO4、2.24mM NaH2PO4、10mM柠檬酸钠、30mM乙酸钠、79.2mM NaCl、5.0mM KCl、以及1.5mM MgCl2的PAS(被指定为PASa)以140μL/孔添加至相应孔中，从10或100mM含储备物的PBS添加DANA至适当的孔中直至0、0.1以及0.5mM。用PBS使孔中的样品体积相等。然后将该板用可透气性膜覆盖并且置于振荡器上。血小板的大小和密度是在第7天通过前向(FSC)和侧向散射(SSC)在FACSCalibur流式细胞仪(BD)上测量，并且在第9天检查pH。
结果：所有保存样品在第9天后都维持在pH6.8下，表明这个PAS配制品对于将血小板保存至少9天具有足够的缓冲容量。相比之下，在100％血浆中的类似的保存条件下，保存的血小板样品的pH下降至低于pH6.5。在30％血浆和70％PAS溶液中保存时在RT下保存7天之后注意到人类血小板的显著变质。如在图36、图A中所示，仅55％的总获取事件在限定新鲜血小板的门(G1)中被门控，而超过40％的总获取事件是在G2中限定的血小板微粒(血小板微粒被视为血小板变质的体现)。相比之下，当血小板在0.1mM DANA的存在下保存时，超过70％的总获取事件被门控作为血小板(图36，图B、G1)。因此，观察到微粒形成从41.5％(图36，图A、G2)大幅减少至23.95％(图36，图B、G2)。DANA浓度在保存介质中增加至0.5mM进一步降低了血小板计数(81.6％门控的，图36，图C、G1)并且减少了微粒的形成(13.52％，G2)。特别要注意的是血小板群在添加DANA到保存溶液中之后呈现出“静息”，如通过它们的侧向和前向散射特征所判断的。
结论：与实例12和13中所述的结果一致，DANA可以在含30％血浆的血小板添加液中有效地保护人类血小板的质量，即，减少血小板活化和微粒形成，由此显示唾液酸酶抑制剂如DANA可以用作PAS配制品中的重要组分用于血小板保存。
在此引用的所有参考文献、专利和/或专利申请的相关传授内容都通过引用以其全部内容结合在此。
虽然已经参考其优选的实施方案对本发明具体地进行了展示和说明，但本领域普通技术人员应当理解的是，可以在形式和细节上做出不同的改变而不背离由所附的权利要求书所涵盖的本发明的范围。

Claims (96)

1.一种血小板添加液(PAS)，包含：
a)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；以及
b)一种或多种PAS组分，所述PAS组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合。
2.如权利要求1所述的PAS，其中该PAS被维持在范围在约6.4与约7.6之间的pH下。
3.如权利要求1所述的PAS，进一步包含一种磷酸盐源。
4.如权利要求3所述的PAS，其中该磷酸盐源选自下组，该组由以下各项组成：单磷酸钠、二磷酸钠、三磷酸钠、以及它们的组合。
5.如权利要求1所述的PAS，其中该柠檬酸盐源选自下组，该组由以下各项组成：柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、柠檬酸、以及它们的组合。
6.如权利要求1所述的PAS，其中该碳源选自下组，该组由以下各项组成：乙酸盐、葡萄糖以及蔗糖。
7.如权利要求6所述的PAS，其中该乙酸盐选自下组，该组由以下各项组成：乙酸钠、乙酸钾、乙酸镁、以及它们的组合。
8.如权利要求1所述的PAS，其中该盐选自下组，该组由以下各项组成：一种钠源、氯化物源、钾源、镁源、钙源、以及它们的组合。
9.如权利要求8所述的PAS，其中该钠源选自下组，该组由以下各项组成：氯化钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、以及它们的组合。
10.如权利要求8所述的PAS，其中该氯化物源选自下组，该组由以下各项组成：氯化钠、氯化镁、氯化钾、以及它们的组合。
11.如权利要求8所述的PAS，其中该钾源选自下组，该组由以下各项组成：氯化钾、柠檬酸钾、乙酸钾、磷酸钾、硫酸钾、以及它们的组合。
12.如权利要求8所述的PAS，其中该镁源选自下组，该组由以下各项组成：氯化镁、柠檬酸镁、硫酸镁、以及它们的组合。
13.如权利要求8所述的PAS，其中该钙源选自下组，该组由以下各项组成：氯化钙、乙酸钙、柠檬酸钙、以及它们的组合。
14.如权利要求1所述的PAS，其中一种或多种PAS组分包含：
a)在约100mM与约300mM之间的范围内的量的一种钠源；
b)在约40mM与约110mM之间的范围内的量的一种氯化物源；
c)在约2mM与约20mM之间的范围内的量的一种柠檬酸盐源；
d)在约10mM与约50mM之间的范围内的量的一种乙酸盐源；
e)在约5mM与约50mM之间的范围内的量的一种磷酸盐源；
f)在约0.5mM与约10mM之间的范围内的量的一种钾源；
g)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种镁源；以及
h)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种钙源。
15.一种血小板组合物，包含：
a)分离的血小板；
b)一种PAS，该PAS包含：
i)一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；和
ii)一种或多种PAS组分，该PAS组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合；以及
c)血浆；
其中该血小板组合物被维持在范围在约6.4与约7.6之间的pH下。
16.如权利要求15所述的血小板组合物，其中该血浆以按体积计在约1％与约50％之间范围内的量存在。
17.如权利要求15所述的血小板组合物，其中该血小板添加液以按体积计在约50％与约99％之间范围内的量存在。
18.如权利要求15所述的血小板组合物，其中该一种或多种PAS组分包含：
i)在约100mM与约300mM之间的范围内的量的一种钠源；
ii)在约40mM与约110mM之间的范围内的量的一种氯化物源；
iii)在约2mM与约20mM之间的范围内的量的一种柠檬酸盐源；
iv)在约10mM与约50mM之间的范围内的量的一种乙酸盐源；
v)在约5mM与约50mM之间的范围内的量的一种磷酸盐源；
vi)在约0.5mM与约10mM之间的范围内的量的一种钾源；
vii)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种镁源；
viii)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种钙源；
其中该血小板组合物被维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下。
19.一种袋或容器，包括：
a)适合用于血小板保存的一个袋或容器；以及
b)一种PAS，该PAS包含：
i)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；和
ii)一种或多种PAS组分，该PAS组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合。
20.如权利要求19所述的袋或容器，进一步包含分离的血小板。
21.如权利要求19所述的袋或容器，其中该PAS被维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下。
22.如权利要求19所述的袋或容器，其中一种或多种PAS组分
i)在约100mM与约300mM之间的范围内的量的一种钠源；
ii)在约40mM与约110mM之间的范围内的量的一种氯化物源；
iii)在约2mM与约20mM之间的范围内的量的一种柠檬酸盐源；
iv)在约10mM与约50mM之间的范围内的量的一种乙酸盐源；
v)在约5mM与约50mM之间的范围内的量的一种磷酸盐源；
vi)在约0.5mM与约10mM之间的范围内的量的一种钾源；
vii)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种镁源；
viii)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种钙源；
其中该血小板组合物被维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下。
23.如权利要求19所述的袋或容器，进一步包含分离的血小板。
24.一种保存血小板的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体获得的，该方法包括：
a)使分离的血小板与一种PAS接触，这种PAS包含：
i)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；和
ii)一种或多种PAS组分，该PAS组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；(2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimidamido)-6-[(1R，2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸；以及(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
26.如权利要求25所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
27.如权利要求24所述的方法，其中分离的血小板被保存约1天至约21天的一段时间。
28.如权利要求24所述的方法，其中分离的血小板在约2℃与约25℃之间的温度下保存。
29.如权利要求24所述的方法，进一步包括将该血小板组合物冷却至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后将该血小板组合物复温回至室温。
30.如权利要求24所述的方法，进一步包括在一段时间内用该唾液酸酶抑制剂处理该血小板群，其中该时间段是在约1分钟至约8小时之间的范围内。
31.一种制备血小板以供保存的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体获得的，该方法包括：
使分离的血小板与一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触。
32.如权利要求31所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；(2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimidamido)-6-[(1R，2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸；以及(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
33.如权利要求32所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
34.如权利要求31所述的方法，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
35.如权利要求34所述的方法，进一步包含一种酶，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
36.如权利要求31所述的方法，其中该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。
37.如权利要求31所述的方法，其中这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
38.一种制备血小板以供保存的方法，该方法包括：
a)从一位或多位个体分离出血小板；
b)使分离的血小板与一种唾液酸酶抑制剂接触，该抑制剂处于足以减少唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解的量。
39.如权利要求38所述的方法，其中血小板受体损失发生降低。
40.如权利要求39所述的方法，其中该血小板受体损失的降低包括GPIbα损失、GPV损失或这两者的降低。
41.一种增加分离的血小板的体内循环时间的方法，该方法包括：
a)从一位或多位个体获得分离的血小板；
b)用一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂处理血小板，以便由此获得处理过的血小板；
c)将处理的血小板输注到有此需要的个体的体内，以便由此获得输注的血小板；
其中与未经受步骤a)的血小板相比，所输注的血小板的循环时间更长。
42.如权利要求41所述的方法，进一步包括在室温下保存该血小板组合物一段时间。
43.如权利要求41所述的方法，进一步包括将该血小板组合物冷却至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后将该血小板组合物复温回至室温。
44.一种血小板制剂，包含一种唾液酸酶抑制剂和一个血小板群；其中该稳定的血小板制剂是通过以下方法制备的：
a)从一个供体获得一个血小板群；并且
b)用有效量的一种唾液酸酶抑制剂处理血小板；并且
其中该血小板制剂适合用于在保存之后给予人体而与未处理的血小板相比在人体中没有止血功能的显著损失或没有血小板清除的显著增加。
45.一种血小板制剂，包含：
i)从一个供体中分离的血小板；和
ii)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
46.一种试剂盒，包括：能够接收和容纳一个血小板群的一个无菌容器，该容器是基本上与环境隔离的；以及一定无菌量的一种唾液酸酶抑制剂。
47.如权利要求46所述的试剂盒，其中该容器适合用于血小板的冷保存。
48.如权利要求46所述的试剂盒，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；(2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimidamido)-6-[(1R，2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸；以及(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
49.如权利要求48所述的试剂盒，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
50.如权利要求46所述的试剂盒，进一步包含有效量的至少一种聚糖修饰剂。
51.如权利要求50所述的试剂盒，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
52.如权利要求16所述的试剂盒，进一步包含一种酶，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
53.如权利要求50所述的试剂盒，其中该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。
54.如权利要求50所述的试剂盒，其中这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
55.一种无菌袋或容器，包括：
a)适合用于血液保存的一个无菌袋或容器；以及
b)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
56.一种用于在来自一个或多个供体的血小板产品制剂中降低唾液酸酶活性并且抑制一种或多种细菌的增殖的方法，该方法包括以下步骤：
a)使该血小板产品制剂与一定量的一种唾液酸酶抑制剂接触，以便由此获得一种唾液酸酶处理过的血小板产品制剂；
其中与未经受步骤a)的血小板产品制剂相比，该唾液酸酶活性被降低并且一种或多种细菌的增殖被抑制。
57.如权利要求56所述的方法，其中该被抑制的细菌包括在血小板产品制剂中发现的细菌。
58.如权利要求56所述的方法，其中该被抑制的细菌选自下组，该组由以下各项组成：曲霉菌属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus sp)、艾氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、白色念珠菌(Candida albicans)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp)、类白喉菌(Diphtheroid)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogene)、河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)、毗邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、克雷伯菌属(Klebsiella sp)、(肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)、产酸克雷伯菌(K.oxytoca))、乳酸杆菌属(Lactobacillus sp)、李斯特菌属(Listeria sp)、微球菌属(Micrococcus sp)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、Pseudomys oralis、丙酸杆菌属(Propionibacterium sp)、沙门菌属(Salmonella sp)、沙雷菌属(Serratiasp)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、葡萄球菌属(Staplhylococcus sp)(凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、链球菌属(Streptococcus sp)、(解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、牛链球菌(S.bovis)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、草绿色链球菌(S.viridans))、以及小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。
59.如权利要求56所述的方法，进一步包括以下步骤：评定该唾液酸酶抑制剂处理过的血小板产品制剂的细菌增殖，并且将该评定与一个对照进行比较。
60.如权利要求56所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；(2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimidamido)-6-[(1R，2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸；以及(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
61.如权利要求60所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
62.如权利要求56所述的方法，进一步包括使该血小板产品制剂与一种或多种聚糖修饰剂接触，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
63.如权利要求62所述的方法，进一步包括将该血小板产品制剂与一种酶接触，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
64.如权利要求56所述的方法，进一步包括使该血小板产品制剂与一种或多种聚糖修饰剂接触，其中该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。
65.如权利要求56所述的方法，进一步包括使该血小板产品制剂与两种聚糖修饰剂接触，其中这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
66.一种降低在来自个体的血小板制剂或血小板样品中的唾液酸酶活性并且抑制细菌增殖的方法，其中该细菌选自下组，该组由以下各项组成：曲霉菌属、芽孢杆菌属、艾氏拟杆菌、白色念珠菌、柠檬酸杆菌属、产气荚膜梭菌、棒状杆菌属、类白喉菌、产气肠杆菌、河生肠杆菌、阴沟肠杆菌、鸟肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、梭形杆菌属、毗邻颗粒链菌、幽门螺杆菌、克雷伯菌属、(肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌)、乳酸杆菌属、李斯特菌属、微球菌属、消化链球菌、普通变形杆菌、假单胞菌属、Pseudomys oralis、丙酸杆菌属、沙门菌属、沙雷菌属、粘质沙雷菌、葡萄球菌属(凝固酶阴性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌)、链球菌属、(解没食子酸链球菌、牛链球菌、酿脓链球菌、草绿色链球菌)、以及小肠结肠炎耶尔森菌；该方法包括以下步骤：
a)使至少一种唾液酸酶抑制剂与该制剂接触；
其中与未经受步骤a)的制剂相比，该唾液酸酶活性被降低并且一种或多种细菌的增殖是被抑制。
67.一种抑制在保存期间血小板中的细菌增殖的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的，该方法包括：
a)使分离的血小板与一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触；并且
b)在一个或多个时点评定分离的血小板中的细菌增殖；
其中在分离的血小板中的细菌增殖被抑制。
68.如权利要求67所述的方法，其中使该血小板制剂与该唾液酸酶抑制剂接触，该抑制剂处于足以减少唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解的量。
69.如权利要求67所述的方法，其中分离的血小板被保存约1天至约21天的一段时间。
70.如权利要求67所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；(2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimidamido)-6-[(1R，2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸；以及(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
71.如权利要求70所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
72.如权利要求67所述的方法，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
73.如权利要求67所述的方法，进一步包含一种酶，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
74.如权利要求67所述的方法，其中该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。
75.如权利要求67所述的方法，其中分离的血小板在约1℃与约24℃之间的温度下保存。
76.如权利要求75所述的方法，进一步包括在室温下保存该血小板组合物一段时间。
77.如权利要求75所述的方法，进一步包括将该血小板组合物冷却至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后将该血小板组合物复温回至室温。
78.一种制备血小板以供保存的方法，在保存期间唾液酸酶活性被降低并且细菌增殖被抑制，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的，该方法包括：
a)使分离的血小板与一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触；并且
b)评定分离的血小板中的细菌增殖，其中与一个对照相比，在分离的血小板中的细菌增殖被抑制。
79.一种增加血小板群的保存时间的方法，该方法包括：
a)从一位或多位个体中获得一个血小板群；并且
b)用有效量的一种唾液酸酶抑制剂处理血小板，从而获得处理过的血小板。
80.如权利要求79所述的方法，进一步包括在一段时间范围内用该唾液酸酶抑制剂处理该血小板群，其中该时间范围是在约1分钟至约8小时之间的范围内。
81.如权利要求79所述的方法，进一步包括在室温下保存该血小板组合物一段时间。
82.如权利要求81所述的方法，进一步包括将该血小板组合物冷却至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后将该血小板组合物复温回至室温。
83.一种通过降低唾液酸酶活性和抑制细菌增殖来增加血小板群的保存时间的方法，该方法包括：
a)从一位或多位个体中获得一个血小板群；并且
b)用有效量的一种唾液酸酶抑制剂处理血小板，从而获得处理过的血小板，
其中与未经受唾液酸酶抑制剂的血小板相比，该细菌增殖被抑制。
84.一种用于输注分离的血小板的方法，该方法包括：
a)从一位或多位个体中获得分离的血小板；
b)用一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂处理血小板，从而获得展现出抑制的细菌增殖的处理过的血小板；并且
c)将处理过的血小板输注到有此需要的个体中；
其中与未经受步骤b)的血小板相比，该细菌增殖被抑制。
85.一种用于维持在保存之后输注到一个接受者中的血小板的止血活性的方法，其中血小板是从一个供体中获得和分离的，从而获得分离的血小板，该方法包括：
a)使分离的血小板与一定量的一种唾液酸酶抑制剂接触，从而获得处理过的血小板；
b)将处理过的血小板保存约1天与14天之间的一段时间；
c)将这些保存的、处理过的血小板输注到有此需要的接受者中，从而获得输注的血小板；
其中与未经受步骤a)的血小板相比，输注的血小板可以活化并形成凝块。
86.一种血小板制剂，包含一种唾液酸酶抑制剂和一个血小板群；其中该稳定的血小板制剂是通过以下方法制备的：
a)从一个供体中获得一个血小板群；并且
b)用有效量的一种唾液酸酶抑制剂处理血小板；并且
其中该血小板制剂适合用于在保存之后给予人体而与未处理的血小板相比在人体中没有止血功能的显著损失或没有血小板清除的显著增加；并且
其中该血小板制剂展现出抑制的细菌增殖，如与未用唾液酸酶抑制剂处理的一种血小板制剂相比。
87.如权利要求86所述的血小板制剂，其中，在处理血小板之后，该制备进一步包括以下另外的步骤：
a)在室温下保存该血小板制剂一段时间。
88.如权利要求86所述的血小板制剂，其中，在处理血小板之后，该制备进一步包括以下另外的步骤：
a)将该稳定的血小板制剂冷却至低于室温的温度；
b)保存该血小板制剂一段时间；
c)将该血小板制剂复温回至室温；并且
d)评定该血小板制剂的细菌增殖。
89.如权利要求86所述的血小板制剂，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；(2R，3R，4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R，2R)-1，2，3-三羟基丙基)-3，4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimidamido)-6-[(1R，2R)-3-羟基-2-甲氧基丙基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸；以及(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-(二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
90.如权利要求89所述的血小板制剂，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
91.如权利要求89所述的血小板制剂，进一步包含有效量的至少一种聚糖修饰剂。
92.如权利要求91所述的血小板制剂，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
93.如权利要求89所述的血小板制剂，进一步包含一种酶，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
94.如权利要求91所述的血小板制剂，其中该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。
95.如权利要求91所述的血小板制剂，其中这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
96.一种血小板制剂，包含：
i)从一个供体分离的血小板；以及
ii)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；
其中该血小板制剂展现出抑制的细菌增殖，如与未用唾液酸酶抑制剂处理的一种血小板制剂相比。
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