CN111235132A - 一种β-半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β‑半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用，所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本发明构建的重组大肠杆菌BL21/pET‑28a(+)‑βgal所产的β‑半乳糖苷酶为酶源进行生物催化反应，可将乳糖转化为低聚半乳糖，其中低聚半乳糖粗品中低聚半乳糖质量浓度为40～50％。

Description

一种β-半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶，特别涉及一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca ZJUH1705)菌株的β-半乳糖苷酶基因、酶、重组表达载体、基因工程菌，及其在制备低聚半乳糖中的应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，E.C.3.2.1.23)广泛存在于动物、植物及微生物中。β-半乳糖苷酶可催化转化乳糖为低聚半乳糖，低聚半乳糖是一种功能性低聚糖，广泛应用于婴幼儿配方食品，烘焙食品，动物饲料等领域。

目前已有不同来源的β-半乳糖苷酶基因分别被克隆和测序，并且实现了在不同宿主中的表达。然而野生型β-半乳糖苷酶分离困难，酶活较低，限制了其大规模的制备及应用，因此，构建表达活性高的β-半乳糖苷酶基因工程菌具有实际的应用意义。

发明内容

本发明目的是提供一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca ZJUH1705)菌株的β-半乳糖苷酶、编码基因、重组表达载体、基因工程菌，及其在制备低聚半乳糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ZJUH1705的β-半乳糖苷酶基因，所述基因具有与SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列95％以上同源性，优选所述β-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，所述基因编码酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本发明所述产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ZJUH1705保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017448，保藏日期：2017年8 月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；已在中国发明专利CN107904189A 中公开。

本发明SEQIDNO.1所示序列由如下方法获得：

利用PCR技术，在引物1(CGCGGATCCATGCAACAACACGAC)、引物 2(CCGCTCGAGTTATTGGAAATGAATCGTTAAC)的作用下，以来源于产酸克雷伯菌 (Klebsiellaoxytoca)ZJUH1705菌株的总基因组DNA为模板，克隆得到约3100bp的β-半乳糖苷酶基因片段。将该片段连接到pET-28a(+)载体上获得重组表达质粒pET-28a (+)-βgal。对重组质粒进行测序，利用软件对测序结果进行分析，结果表明该序列含有一个长为3108bp的开放阅读框，该基因核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。

任何对SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有99％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明还涉及一种含有所述β-半乳糖苷酶基因的重组载体及一种由所述重组载体构建的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌构建方法为：将含有目的基因的重组表达载体pET-28a(+)-βgal转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒 pET28a(+)-βgal的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal，即所述重组基因工程菌。

本发明还涉及一种所述β-半乳糖苷酶基因在构建β-半乳糖苷酶中的应用，所述应用为：构建含有所述β-半乳糖苷酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，从培养液中分离得到含有重组β-半乳糖苷酶的菌体细胞。

本发明还提供一种所述β-半乳糖苷酶在制备低聚半乳糖中的应用，所述的应用为：以含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液和底物乳糖构成转化体系，在20～40℃、100～300rpm条件下振荡反应30～60h，反应结束后，煮沸 3min灭活，即得低聚半乳糖粗品。所述酶源的用量以底物质量计为1～4U/g，酶液酶活力为10-15U/mL(优选13.41U/mL)，所述缓冲液体积用量以底物重量计为1-10mL/g (优选1.5-5mL/g)。

进一步，优选反应条件为40℃、200rpm反应48h。优选缓冲液为pH 7.0、0.05M 磷酸缓冲液。

进一步，所述酶源按如下方法制备：(1)湿菌体的制备：将含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，20～37℃、100～200rpm 振荡培养6～12h(优选37℃、200rpm振荡培养12h)，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的OD₆₀₀达到0.6～0.9时，向培养液中加入终浓度为0.1～1mM(优选1mM)的IPTG， 20～37℃、200rpm继续诱导培养6～12h(优选28℃、200rpm诱导培养12h)，将所得培养液离心，收集湿菌体；(2)酶液的制备：将步骤(1)湿菌体加50mM、pH 7.5的磷酸缓冲液中进行超声波破碎，超声处理条件为：超声功率200W、超声处理1s后，间歇2s，反复处理共30min，破碎后样品经10000rpm、4℃离心10min，所得上清液即为粗酶液；将粗酶液上样于用结合缓冲液平衡好的Ni柱，再次平衡后以洗脱缓冲液洗脱，收集含有酶活的洗脱液，所得洗脱液经透析袋透析后取截留液即为所述酶源；所述结合缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，溶剂为水，优选 20mM磷酸钠，0.5MNaCl，40mM咪唑，溶剂为水；所述洗脱缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，300-500mM咪唑，溶剂为水，优选20mM磷酸钠，0.5M NaCl， 0.5M咪唑，溶剂为水。所述上样和洗脱流速均为1mL/min。所述透析袋截留分子量 10KDa。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明提供了一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca ZJUH1705)菌株的β-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列，并将该基因与表达载体连接，构建得到含该基因的表达重组质粒pET-28a(+)-βgal，转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒 pET-28a(+)-βgal的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal；利用所述发酵的重组质粒 pET-28a(+)-βgal的重组大肠杆菌细胞，经过简单的超声破碎，离心，Ni柱纯化步骤即可获得纯化的β-半乳糖苷酶酶源，可应用本发明构建的重组大肠杆菌 BL21/pET-28a(+)-βgal所产的β-半乳糖苷酶为酶源进行生物催化反应，可将乳糖转化为低聚半乳糖，其中低聚半乳糖粗品中低聚半乳糖质量浓度为40～50％。

相较于已报道的中国专利(CN 106479925B)，本发明使用了不同种的菌体(Klebsiella oxytoca ZJUH1705 vs.Klebsiella michiganensis)，实现了该酶的异源表达。相较于日本专利(JP3556704B2)，本发明克隆表达的β-半乳糖苷酶与其分离得到的酶不同，表现为酶源获得方法不同(本发明，克隆表达；日本专利，粗酶液中分离纯化)，且两酶分子量不同(本发明118KDa vs.日本专利320KDa)。此外，上述中国专利与日本专利均仅说明了其半乳糖苷酶有转糖基作用，但并未对转化率、转化产物进一步描述。

附图说明

图1为pET-28a(+)-βgal重组质粒图谱。

图2为β-半乳糖苷酶基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。

图3为含有表达重组质粒pET-28a(+)-βgal的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal 的菌落PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。

图4为底物乳糖的HPLC图。

图5为β-半乳糖苷酶转化乳糖产物HPLC图。

图6为HPLC图中相关特征峰的质谱图，A为葡萄糖/半乳糖(8.0min)，B为 乳糖(10.6min)，C为转移二糖(11.6min)，D，E为三糖(14.3min,15.0min)， F为四糖(18.5min)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)CCTCC NO：M 2017448的β-半乳糖苷酶、编码基因，载体及重组基因工程菌。

产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ZJUH1705保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017448，保藏日期：2017年8月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，已在中国发明专利CN107904189A中公开。

用基因组提取试剂盒(上海生工)提取产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)CCTCCNO：M 2017448菌株的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1(CGCGGATCCATGCAACAACACGAC)、引物2 (CCGCTCGAGTTATTGGAAATGAATCGTTAAC)的作用下进行PCR扩增。

PCR反应体系各组分加入量(总体积100μL)：DNA聚合酶预混液(Prime STAR Max)50μL，引物1、引物2各2.5μL(100μM)，基因组DNA 5μL，无核酸水40μL。采用博日PCR仪扩增，PCR反应条件为：预变性98℃3min，然后进行温度循环98℃ 10s，55℃15s，72℃40s，共35个循环，终止反应温度为4℃。取5μL用1％琼脂糖凝胶电泳检测其条带纯度(见图2所示)，纯化或切胶回收该PCR产物。回收的PCR 产物用限制性核酸内切酶BamH I，Xho I进行处理，并利用T4 DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的表达载体pET-28a(+)进行连接，构建表达载体 pET-28a(+)-βgal，pET-28a(+)-βgal重组质粒图谱见图1所示。将构建的表达载体 pET-28a(+)-βgal化转至大肠杆菌BL21中，涂平板(LB培养基)37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR扩增鉴定(见图3所示)，获得阳性克隆后测序。利用软件分析结果。结果表明：利用引物1、引物2扩增得到一段3108bp的开放阅读框序列，核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示，即该阳性的菌体为重组工程菌BL21/pET-28a(+)-βgal。

LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为水， pH7.4。

实施例2：重组β-半乳糖苷酶的表达及分离纯化

将实施例1验证后的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的 OD₆₀₀达到0.7时，向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，28℃、200rpm诱导培养 8h，将所得培养液10000rpm、4℃离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体。

将获得的湿菌体1g加入50mM、pH 7.5的磷酸缓冲液20ml中重悬，并进行超声波破碎，超声处理条件为：超声功率200W、超声处理1s后，间歇2s，反复处理共 30min，破碎后样品经10000rpm、4℃离心10min，所得上清液即为粗酶液，粗酶液酶活力为108.1U/mL(即酶液中酶蛋白浓度为3.4mg/mL)，酶液比活力为31.8U/mg。

将粗酶液上样(流速1mL/min)于用结合缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl， 40mM咪唑，溶剂为水)平衡好的Ni柱，再次平衡，以洗脱缓冲液(20mM磷酸钠， 0.5M NaCl，0.5M咪唑，溶剂为水)洗脱(流速1mL/min)，收集含有酶活力的洗脱液，所得洗脱液经透析袋(截留分子量10KDa)透析后，取截留液为纯化β-半乳糖苷酶酶液，该酶液经SDS-PAGE检测呈现单一条带，见图2所示，酶液酶活力为 13.41U/mL(即酶液中酶蛋白浓度为0.232mg/mL)，酶液比活力为57.8U/mg。

酶活力测定方法为：准确称量一定质量的邻硝基苯酚(oNP)，用100mM、pH7.0 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配置成浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0μmoL/mL的 oNP溶液，420nm测定吸光度，以OD值为纵坐标，以oNP浓度为横坐标绘制oNP 标准曲线，其曲线方程为：

y＝1.7289x+0.0114，R²＝0.9987，y：吸光度OD_420nm；x：oNP浓度，μmoL/mL。

准确称量邻硝基苯酚半乳糖苷(oNPG)，用100mM、pH7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液溶解使其终浓度为1mg/mL的oNPG溶液。取1mg/mL的oNPG溶液480μL 于ep管中，40℃保温10min，然后加入20μL适当稀释酶液，震荡均匀后40℃下反应10min，然后加入500μL0.15M Na₂CO₃水溶液终止反应，波长420nm下测定样品吸光度。同样条件下，对照管先加500μL 0.15M Na₂CO₃水溶液，再加20μL酶液。根据标准曲线计算酶活力。

酶活力单位(U)定义：上述条件下，酶催化oNPG反应1mim生成1μmoL的oNP 所需酶量定义为1个酶活力单位U。

实施例3：诱导时间对比酶活的影响

将实施例1验证后的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1％接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600为0.6时，向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，28℃、200rpm 分别诱导培养6h、8h、10h、12h，将所得培养液10000rpm、4℃离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体。将获得的不同诱导时间的湿菌体各 1g分别加入50mM、pH 7.5的磷酸缓冲液20ml中重悬，超声波破碎，超声处理条件为：200W超声处理1s后，间歇2s，反复处理共30min，破碎后样品经10000rpm、 4℃离心10min，测定所得上清液的酶活力，结果见表1所示。优选的诱导时间为8h。

表1诱导时间对比酶活的影响

实施例4：诱导温度对比酶活的影响

将实施例1验证后的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1％接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600为0.6时，向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，分别在25℃、 28℃、30℃、33℃、37℃，200rpm条件下诱导培养8h，将所得培养液10000rpm、 4℃离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集不同温度下的湿菌体。将获得的不同温度下的湿菌体各1g分别加入50mM、pH 7.5的磷酸缓冲液20ml中重悬，超声波破碎，超声处理条件为：200W超声处理1s后，间歇2s，反复处理共30min，破碎后样品经10000rpm、4℃离心10min，测定所得上清液的酶活力，结果见表2 所示。优选的诱导温度为28℃。

表2诱导温度对比酶活的影响

实施例5：电泳纯β-半乳糖苷酶底物谱考察

以实施例2中获得纯化β-半乳糖苷酶酶液为转化用酶源，分别以乳糖、乳果糖、麦芽糖、蜜二糖、纤维二糖为底物进行反应，转化体系及反应条件如下：在2mL ep 管中加入50mM、pH7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液500μL、100mg底物(底物先用缓冲液溶解后再加入酶液)，20μL(13.41U/mL)酶液构成转化体系，在40℃、pH 7.0、200rpm条件下反应1h，沸水浴3min灭活后得到反应产物。反应产物用高效液相色谱检测反应产物各组分，高效液相色谱检测条件同实施例6，结果见表3，该β-半乳糖苷酶对乳糖和乳果糖有水解和转糖基活性。

表3电泳纯β-半乳糖苷酶底物谱考察

注：+，有活性；-，无活性。

实施例6：转化乳糖制备低聚半乳糖

以实施例2中所获得纯化β-半乳糖苷酶酶液为转化用酶源，以乳糖为底物制备低聚半乳糖，转化体系及转化操作条件如下：在50mL摇瓶中加入pH 7.0、0.05M磷酸缓冲液6mL，乳糖4g(底物先用缓冲液溶解后再加入酶液)，1mL(13.41U/mL) 酶液，40℃、200rpm条件下转化48h，沸水浴3min灭活后得到转化产物。转化产物用高效液相色谱及质谱法(安捷伦飞行时间质谱仪，进样量10μL，流速1mL/min，流动相为乙腈：水70:30)检测混合物各组分。

HPLC法检测产物的条件为：安捷伦1260高效液相色谱仪，色谱柱为ShodexAsahipak NH2P-50 4E(4.6×250mm)，柱温30℃，进样量10μL，流速1mL/min，流动相为乙腈：水70:30，检测器为蒸发光散射检测器ELSD。

底物乳糖HPLC图见图4，转化产物HPLC图见图5。

低聚半乳糖的产率由下述公式计算获得：

式中C代表质量浓度。

转化产物中各组分质谱图见图6，经检测，转化产物中主要含单糖(葡萄糖和半乳糖)，未反应乳糖及低聚半乳糖，低聚半乳糖主要为转移二糖，三糖及少量四糖，低聚半乳糖产率为45％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种β-半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3108

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca )

<400> 1

atgcaacaac acgacactca ttccgccgca ggagcaacgt tccatcagat tctcgcccgc 60

gaagactggc agaaccagac cattacccat ctcaaccgtt taccggccca cccgactttc 120

gccagctggc gcgataccga cgcggcgcga aaaaaccagc cctcggcgtt ccgccgccgg 180

cttgacggcc agtggcagtt ctcctgggcc cgcagcccgt ttgacgtgga tgcccgctgg 240

ctggaagacg atctgccgga cagccgcagt acgccggtgc cgtcaaactg gcaaatggaa 300

ggctacgacg ctccgatcta taccaacgtc cgctacccga tcgacactac gccgccgcgc 360

gtacctgagg agaatccgac cggctgctac tcgctgacgt tcagcgtcga tgagagctgg 420

cgagccgacg gccagacgca gattatcttc gacggcgtta attcggcttt tcatctgtgg 480

tgcaacggcg aatgggtcgg ttattcgcag gacagtcgcc tgcccgcggc cttcgatctc 540

tcgccctacc ttcagccggg cgataaccgc atctgcgtga tggtgatgcg ctggagcgcg 600

ggtacctggc ttgaagacca ggatatgtgg cgcatgagcg gcatcttccg ttcggtctgg 660

ctgctgaaca aaccgaccct gcacctctgc gacgttcagc tcacgccgca gctcgatgcg 720

ctctatcggg atgccgagct gctggtgaac ttaagcgtcg ccgcgccggt cgcgctgctg 780

gaggcgctga cggtgaagat cgaactgtgg gatgacgatc gtctggtcgc cagccaccag 840

cagtcgccgg gttcgccgat tatcgatgag cgcggaagct atgccgaacg cgcggcgatt 900

cgtctgccgg tagagcgacc ggcgctgtgg agcgcggaaa cgccaaactg ctatcgggcg 960

gtggtgtccc tgtgccgcgg cgatgaaacg atcgaggctg aagcctggga tatcggcttt 1020

cgccgggttg aaatcaaaaa tggcctgctg ctgttaaacg gcaaaccgct gctgatccgc 1080

ggcgtcaacc gtcacgagca ccatcaccag cgcggccagg tggtgaccga agaggatatg 1140

gtgcaggaca tcctgctgat gaagcagaac aactttaacg ccgtgcgctg ctcgcattat 1200

ccaaacaccc cgcgctggta tgagctgtgc aatcgctatg gcctgtacgt cgttgacgaa 1260

gccaatattg aaacccacgg catggtgccg atgaatcgtc tttccgacga tccggcctgg 1320

ctgccggcct tcagcgcccg cgtcagccgg atgttgcaaa gcaatcgcaa ccacccgtcg 1380

attattatct ggtcgctggg gaacgaatcc ggcggcggcg gcaaccatga agcgatgtat 1440

cactggctga agcgcaacga tccctcccgc ccggggcagt acgagggtgg aggcgccgac 1500

agcaccacca ccgatattat ctgcccgatg tacgcccgcg ttgagcgcga tcagcggatt 1560

ccgacggtgc cgaaatgggg gatcaaaaag tggatcagtc tgccgggcga gcagcgcccg 1620

ctgatcctct gcgaatacgc ccacgcgatg ggcaacagcc tcggcaactt tgctgattac 1680

tggcaggcct tccgcgacta tccgcgcctg cagggcgggt ttatctggga ctgggccgat 1740

caggccatca gcaaaacctt cgacgacggc agcgtcggct gggcctacgg cggtgatttt 1800

ggcgatacgc cgaacgatcg ccagttctgt atgaacggcc tggtcttccc cgaccgccgc 1860

ccgcaccctt cattaattga agcgaaacac gcgcagcagt acttccagtt taccctgctt 1920

gcgcaatccc cgctgcgtat cagcatcagc agcgaatatc tgttccgcgc caccgataac 1980

gaagcgctgc gctggcaggt ccaggccgcc ggagaaacct ttgccgaggg tcaagtgaag 2040

cttgagctga gccctgaagg ccagagcgag ctgacgctgt gcgatgcgct gacgctgccc 2100

gtgggcgccg aagcggtgtg gctgacgctg gaggttgtcc agccgcaggc caccgcctgg 2160

tccgacgccg ggcatcgcgt cgcctggcag cagttcccgc tcgccgcccc gctggcgctg 2220

cgcctgcctt ctcccgtcgg cacggcgcca gcgctggaga gcagcgacgc ggcctggacc 2280

gtacgcagcg gctcgcagca atggactatc gaccgggaga gcggcctgct gacccactgg 2340

caggtagagg gtgtggaaca gctgctgacg ccgctgcgcg accagtttgt gcgcgccccg 2400

ctggataacg atatcggcgt cagcgaagtg gagcgcatcg accccaacgc ctgggttgaa 2460

cgctggaaga gcgccgggct ctacggcctc agcgcccgct gcgtacagtg cgacgcccag 2520

cgcctggccc atgaagtggt tatcgatagc cgctggcact atctgcgcgg cgacgaagtg 2580

gtgattgtca gccactggcg gatgacgttt gatggcgaag gcaagctgca tttggcggtc 2640

aatggcgaac gcgccggcac cctgccgccg ctgcagcgca tcgggctgaa tttccaggtt 2700

ccggaccagc atcaaccggt ttcctggctc ggttacggcc cgcatgaaaa ctatccggac 2760

cgccgcacca gcgcctgttt ctcccgttgg cagctgccgc tggaagagat gaccacaccg 2820

tacattttcc cgacggaaaa cggcctgcgc tgcgataaca aagcgctgga ctgggggcgc 2880

aggcacgtcg cgggcgattt ccacttgtcc gtccagccct acagcaccgc gcagttaatg 2940

gagaccgatc actggcacag gatgaagccg gaaaacggcg tgtggatcac gttcgatgct 3000

caacacatgg gcatcggcgg cgatgactcc tggacaccca gcgtactaca gcaatggctg 3060

ctgcttgaga cacaatggca atatcagtta acgattcatt tccaataa 3108

<210> 2

<211> 1035

<212> PRT

<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca )

<400> 2

Met Gln Gln His Asp Thr His Ser Ala Ala Gly Ala Thr Phe His Gln

1 5 10 15

Ile Leu Ala Arg Glu Asp Trp Gln Asn Gln Thr Ile Thr His Leu Asn

20 25 30

Arg Leu Pro Ala His Pro Thr Phe Ala Ser Trp Arg Asp Thr Asp Ala

35 40 45

Ala Arg Lys Asn Gln Pro Ser Ala Phe Arg Arg Arg Leu Asp Gly Gln

50 55 60

Trp Gln Phe Ser Trp Ala Arg Ser Pro Phe Asp Val Asp Ala Arg Trp

65 70 75 80

Leu Glu Asp Asp Leu Pro Asp Ser Arg Ser Thr Pro Val Pro Ser Asn

85 90 95

Trp Gln Met Glu Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Arg Tyr

100 105 110

Pro Ile Asp Thr Thr Pro Pro Arg Val Pro Glu Glu Asn Pro Thr Gly

115 120 125

Cys Tyr Ser Leu Thr Phe Ser Val Asp Glu Ser Trp Arg Ala Asp Gly

130 135 140

Gln Thr Gln Ile Ile Phe Asp Gly Val Asn Ser Ala Phe His Leu Trp

145 150 155 160

Cys Asn Gly Glu Trp Val Gly Tyr Ser Gln Asp Ser Arg Leu Pro Ala

165 170 175

Ala Phe Asp Leu Ser Pro Tyr Leu Gln Pro Gly Asp Asn Arg Ile Cys

180 185 190

Val Met Val Met Arg Trp Ser Ala Gly Thr Trp Leu Glu Asp Gln Asp

195 200 205

Met Trp Arg Met Ser Gly Ile Phe Arg Ser Val Trp Leu Leu Asn Lys

210 215 220

Pro Thr Leu His Leu Cys Asp Val Gln Leu Thr Pro Gln Leu Asp Ala

225 230 235 240

Leu Tyr Arg Asp Ala Glu Leu Leu Val Asn Leu Ser Val Ala Ala Pro

245 250 255

Val Ala Leu Leu Glu Ala Leu Thr Val Lys Ile Glu Leu Trp Asp Asp

260 265 270

Asp Arg Leu Val Ala Ser His Gln Gln Ser Pro Gly Ser Pro Ile Ile

275 280 285

Asp Glu Arg Gly Ser Tyr Ala Glu Arg Ala Ala Ile Arg Leu Pro Val

290 295 300

Glu Arg Pro Ala Leu Trp Ser Ala Glu Thr Pro Asn Cys Tyr Arg Ala

305 310 315 320

Val Val Ser Leu Cys Arg Gly Asp Glu Thr Ile Glu Ala Glu Ala Trp

325 330 335

Asp Ile Gly Phe Arg Arg Val Glu Ile Lys Asn Gly Leu Leu Leu Leu

340 345 350

Asn Gly Lys Pro Leu Leu Ile Arg Gly Val Asn Arg His Glu His His

355 360 365

His Gln Arg Gly Gln Val Val Thr Glu Glu Asp Met Val Gln Asp Ile

370 375 380

Leu Leu Met Lys Gln Asn Asn Phe Asn Ala Val Arg Cys Ser His Tyr

385 390 395 400

Pro Asn Thr Pro Arg Trp Tyr Glu Leu Cys Asn Arg Tyr Gly Leu Tyr

405 410 415

Val Val Asp Glu Ala Asn Ile Glu Thr His Gly Met Val Pro Met Asn

420 425 430

Arg Leu Ser Asp Asp Pro Ala Trp Leu Pro Ala Phe Ser Ala Arg Val

435 440 445

Ser Arg Met Leu Gln Ser Asn Arg Asn His Pro Ser Ile Ile Ile Trp

450 455 460

Ser Leu Gly Asn Glu Ser Gly Gly Gly Gly Asn His Glu Ala Met Tyr

465 470 475 480

His Trp Leu Lys Arg Asn Asp Pro Ser Arg Pro Gly Gln Tyr Glu Gly

485 490 495

Gly Gly Ala Asp Ser Thr Thr Thr Asp Ile Ile Cys Pro Met Tyr Ala

500 505 510

Arg Val Glu Arg Asp Gln Arg Ile Pro Thr Val Pro Lys Trp Gly Ile

515 520 525

Lys Lys Trp Ile Ser Leu Pro Gly Glu Gln Arg Pro Leu Ile Leu Cys

530 535 540

Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Leu Gly Asn Phe Ala Asp Tyr

545 550 555 560

Trp Gln Ala Phe Arg Asp Tyr Pro Arg Leu Gln Gly Gly Phe Ile Trp

565 570 575

Asp Trp Ala Asp Gln Ala Ile Ser Lys Thr Phe Asp Asp Gly Ser Val

580 585 590

Gly Trp Ala Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp Thr Pro Asn Asp Arg Gln

595 600 605

Phe Cys Met Asn Gly Leu Val Phe Pro Asp Arg Arg Pro His Pro Ser

610 615 620

Leu Ile Glu Ala Lys His Ala Gln Gln Tyr Phe Gln Phe Thr Leu Leu

625 630 635 640

Ala Gln Ser Pro Leu Arg Ile Ser Ile Ser Ser Glu Tyr Leu Phe Arg

645 650 655

Ala Thr Asp Asn Glu Ala Leu Arg Trp Gln Val Gln Ala Ala Gly Glu

660 665 670

Thr Phe Ala Glu Gly Gln Val Lys Leu Glu Leu Ser Pro Glu Gly Gln

675 680 685

Ser Glu Leu Thr Leu Cys Asp Ala Leu Thr Leu Pro Val Gly Ala Glu

690 695 700

Ala Val Trp Leu Thr Leu Glu Val Val Gln Pro Gln Ala Thr Ala Trp

705 710 715 720

Ser Asp Ala Gly His Arg Val Ala Trp Gln Gln Phe Pro Leu Ala Ala

725 730 735

Pro Leu Ala Leu Arg Leu Pro Ser Pro Val Gly Thr Ala Pro Ala Leu

740 745 750

Glu Ser Ser Asp Ala Ala Trp Thr Val Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp

755 760 765

Thr Ile Asp Arg Glu Ser Gly Leu Leu Thr His Trp Gln Val Glu Gly

770 775 780

Val Glu Gln Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asp Gln Phe Val Arg Ala Pro

785 790 795 800

Leu Asp Asn Asp Ile Gly Val Ser Glu Val Glu Arg Ile Asp Pro Asn

805 810 815

Ala Trp Val Glu Arg Trp Lys Ser Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Ser Ala

820 825 830

Arg Cys Val Gln Cys Asp Ala Gln Arg Leu Ala His Glu Val Val Ile

835 840 845

Asp Ser Arg Trp His Tyr Leu Arg Gly Asp Glu Val Val Ile Val Ser

850 855 860

His Trp Arg Met Thr Phe Asp Gly Glu Gly Lys Leu His Leu Ala Val

865 870 875 880

Asn Gly Glu Arg Ala Gly Thr Leu Pro Pro Leu Gln Arg Ile Gly Leu

885 890 895

Asn Phe Gln Val Pro Asp Gln His Gln Pro Val Ser Trp Leu Gly Tyr

900 905 910

Gly Pro His Glu Asn Tyr Pro Asp Arg Arg Thr Ser Ala Cys Phe Ser

915 920 925

Arg Trp Gln Leu Pro Leu Glu Glu Met Thr Thr Pro Tyr Ile Phe Pro

930 935 940

Thr Glu Asn Gly Leu Arg Cys Asp Asn Lys Ala Leu Asp Trp Gly Arg

945 950 955 960

Arg His Val Ala Gly Asp Phe His Leu Ser Val Gln Pro Tyr Ser Thr

965 970 975

Ala Gln Leu Met Glu Thr Asp His Trp His Arg Met Lys Pro Glu Asn

980 985 990

Gly Val Trp Ile Thr Phe Asp Ala Gln His Met Gly Ile Gly Gly Asp

995 1000 1005

Asp Ser Trp Thr Pro Ser Val Leu Gln Gln Trp Leu Leu Leu Glu Thr

1010 1015 1020

Gln Trp Gln Tyr Gln Leu Thr Ile His Phe Gln

1025 1030 1035

Claims (10)

1.一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ZJUH1705的β-半乳糖苷酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。

2.一种权利要求1所述β-半乳糖苷酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

3.一种权利要求1所述β-半乳糖苷酶在催化乳糖制备低聚半乳糖中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液和乳糖构成转化体系，在20～40℃、100～300rpm条件下振荡反应30～60h，反应结束后，即得低聚半乳糖粗品。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酶源的用量以底物质量计为1～4U/g，所述缓冲液体积加入量以乳糖重量计为1-10mL/g。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于反应条件为40℃、200rpm反应48h。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH 7.0、0.05M磷酸缓冲液。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：(1)湿菌体的制备：将含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，20～37℃、100～200rpm振荡培养6～12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的OD₆₀₀达到0.6～0.9时，向培养液中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG，20～37℃、200rpm继续诱导培养6～12h，将所得培养液离心，收集湿菌体；(2)酶液的制备：将步骤(1)湿菌体加50mM、pH 7.5的磷酸缓冲液中进行超声波破碎，超声处理条件为：超声功率200W、超声处理1s后，间歇2s，反复处理共30min，破碎后样品经10000rpm、4℃离心10min，所得上清液即为粗酶液；将粗酶液上样于用结合缓冲液平衡好的Ni柱，再次平衡后以洗脱缓冲液洗脱，收集含有酶活的洗脱液，所得洗脱液经透析袋透析后即为所述酶源；所述结合缓冲液组成为：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，溶剂为水；所述洗脱缓冲液组成为：20mM磷酸钠，0.5M NaCl，300-500mM咪唑，溶剂为水。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述结合缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5MNaCl，40mM咪唑，溶剂为水；所述洗脱缓冲液组成20mM磷酸钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，溶剂为水。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述上样和洗脱流速均为1mL/min。

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