CN116286712B - 鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用 - Google Patents

鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用。所述鼠李糖基转移酶突变体的酶活数据Kcat/km是对照菌酶活的136倍，相对于现有技术具有显著进步。将本发明所述鼠李糖基转移酶突变体应用于新橙皮苷的制备，可显著提升反应底物的鼠李糖基修饰效率，进而提升新橙皮苷的生产效率。本发明还提供了用于生产所述鼠李糖基转移酶突变体的重组质粒及工程菌；尤其包括具有稳定遗传的鼠李糖基转移酶突变体与UDP‑鼠李糖合酶基因共表达工程菌株，在只添加底物橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷，不添加UDP‑鼠李糖的前提下，实现了新橙皮苷的高效生产，为新橙皮苷的量产提供了有效策略。

Description

鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物合成技术领域，尤其涉及一种鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用。
背景技术
天然产物糖基化修饰的种类多样，其中，鼠李糖基化修饰是很重要的一种，且取代形式多样。鼠李糖基化修饰能显著提高天然产物的水溶性及稳定性，改善一些其生物活性，增加其生物利用度，增强靶向性作用并减少毒副作用等。因此，结构多样的鼠李糖苷类化合物在调节植物生长和发育方面发挥着不可替代的作用，且是药用活性先导物的重要来源。
鼠李糖基化修饰是由鼠李糖基转移酶催化完成的，鼠李糖基转移酶的活性是制约鼠李糖基化天然产物产量的重要因素。提高鼠李糖基转移酶酶活的蛋白质工程方法有两种，包括体外定向进化和理性设计。其中定向进化可以人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造基因，定向选择出所需性质的突变酶。上海交通大学冯雁课题组通过定向进化糖基转移酶UGT51，使其活性提高了近1500倍。中国科学院天津工业生物技术研究所孙媛霞团队通过定向进化使糖基转移酶UGT74AC1的活性提高了40000多倍。目前对于鼠李糖基转移酶的定向进化还未见报道。
新橙皮苷是具有鼠李糖基修饰的黄酮类化合物，主要从中药枳实中提取，具有抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤等生物活性；同时，新橙皮苷经氢化而得的新橙皮苷二氢查耳酮，甜度是蔗糖的1500-2000倍，且适口性好、热量小、无毒害，被广泛用于果汁、果酒、饮料、糕点及药剂配方的甜味剂（矫味剂），特别适合作为糖尿病患者的食品；因此新橙皮苷的市场需求量巨大。然而，新橙皮苷植物含量低，提取费时费力，由于其结构复杂，化学全合成新橙皮苷还难以实现，因此新橙皮苷的价格昂贵。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用。本发明所述鼠李糖基转移酶突变体的酶活数据Kcat/km是对照菌酶活的136倍，相对于现有技术具有显著进步。
本发明提供了一种鼠李糖基转移酶突变体，所述鼠李糖基转移酶突变体的氨基酸序列包括SEQ ID NO:4。
本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3。
本发明提供了用于获得所述编码基因的定点突变引物对，所述定点突变引物对包括Q49A突变引物对和/或S50A突变引物对；
所述Q49A突变引物对的上游引物序列包括SEQ ID NO:13；
所述Q49A突变引物对的下游引物序列包括SEQ ID NO:14；
所述S50A突变引物对的上游引物序列包括SEQ ID NO:15；
所述S50A突变引物对的下游引物序列包括SEQ ID NO:16。
本发明提供了用于生产所述鼠李糖基转移酶突变体的生物材料，所述生物材料为重组质粒和/或工程菌，所述生物材料包括所述编码基因。
优选的，所述生物材料还包括UDP-鼠李糖合酶基因。
优选的，所述UDP-鼠李糖合酶基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:6。
本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
S1、构建所述生物材料，所述生物材料为工程菌；
S2、培养步骤S1构建得到的工程菌，得到含有鼠李糖基转移酶突变体的培养液，分离培养液成分，得到所述鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白。
优选的，步骤S1所述工程菌的宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌中的任意一种或者多种。
本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体、所述编码基因、所述引物对、所述生物材料、所述制备方法制备得到的鼠李糖基转移酶突变体在生产新橙皮苷中的应用，所述应用包括鼠李糖基转移酶突变体在体外催化体系中催化合成新橙皮苷的步骤；所述体外催化体系包括鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白、UDP-鼠李糖和橙皮素-7-O-葡萄糖苷。
优选的，所述催化合成的反应pH值为7.5-8.5，反应温度为36.5-37.5℃。
本发明还提供了所述生物材料在生产新橙皮苷中的应用，所述生物材料为工程菌；所述应用包括工程菌发酵的步骤；所述工程菌发酵的底物包括橙皮素-7-O-葡萄糖苷；所述工程菌发酵的温度为25~35℃；所述工程菌发酵的时间为3-15天。
有益效果
本发明提供了一种鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用。所述鼠李糖基转移酶突变体的酶活数据Kcat/km是对照菌酶活的136倍，相对于现有技术具有显著进步。将本发明所述鼠李糖基转移酶突变体应用于新橙皮苷的制备，可显著提升反应底物的鼠李糖基修饰效率，进而提升新橙皮苷的生产效率。
本发明还提供了用于生产所述鼠李糖基转移酶突变体的重组质粒及工程菌；尤其包括具有稳定遗传的鼠李糖基转移酶突变体与UDP-鼠李糖合酶基因共表达工程菌株，在只添加底物橙皮素-7-O-葡萄糖苷，不添加UDP-鼠李糖的前提下，实现了新橙皮苷的高效生产，为新橙皮苷的量产提供了有效策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1是实施例1中利用AlphaFold 2构建的柚鼠李糖基转移酶蛋白结构模型图；
图2是实施例1中鼠李糖基转移酶突变体Q49A/S50A的SDS-PAGE分析图；
图3是实施例2中鼠李糖基转移酶催化橙皮素-7-O-葡萄糖苷生成新橙皮苷液相色谱质谱检测图；
图4是实施例3中基因工程大肠菌株pETDuet-1-Cm1,2RhT-CsRHM全细胞催化产新橙皮苷图；
图5是实施例6中基因工程大肠菌株pESC-Leu-Cm1,2RhT-CsRHM发酵产新橙皮苷图。
具体实施方式
本发明提供了一种鼠李糖基转移酶突变体，所述鼠李糖基转移酶突变体的氨基酸序列包括SEQ ID NO:4。
本发明基于丙氨酸扫描的定向进化技术，通过设计引物，采用特殊设计的引物和高保真酶进行PCR反应，在DNA片段的特定位点引入碱基改变，将亲本鼠李糖基转移酶的第49位谷氨酸突变成丙氨酸，以及第50位丝氨酸突变成丙氨酸后，得到所述鼠李糖基转移酶突变体。
具体的，本发明以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的鼠李糖基转移酶为亲本。首先将鼠李糖转移酶基因连接到相应载体上，获得鼠李糖转移酶基因重组质粒；然后以鼠李糖转移酶基因重组质粒为模板，49A突变引物对为引物，高保真酶进行PCR后，将PCR产物直接转化大肠杆菌，以获得49A突变体菌株；再以49A突变菌株为模板，50A突变引物为引物，保真酶进行PCR后，将PCR产物直接转化大肠杆菌，以获得49A/50A突变体菌株。
本发明提供的鼠李糖基转移酶突变体（49A/50A）的酶活水平Kcat/Km是对照的136倍，相对于现有技术具有显著进步。同时，本发明为鼠李糖基转移酶的高效表达及产酶研究提供了一种有效的策略。
本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体的编码基因、获得所述编码基因的定点突变引物对以及用于生产所述鼠李糖基转移酶突变体的生物材料。
在本发明中，所述编码基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3；所述定点突变引物对包括Q49A突变引物对和/或S50A突变引物对，更优选包括Q49A突变引物对和S50A突变引物对；所述Q49A突变引物对的上游引物序列优选包括SEQ ID NO:13；所述Q49A突变引物对的下游引物序列优选包括SEQ ID NO:14；所述S50A突变引物对的上游引物序列优选包括SEQID NO:15；所述S50A突变引物对的下游引物序列优选包括SEQ ID NO:16。利用本发明提供的定点突变引物对，以SEQ ID NO:1为模板，可在鼠李糖基转移酶氨基酸的第49位和50位定向引入丙氨酸突变，进而得到本发明所述鼠李糖基转移酶突变体。
在本发明中，用于生产所述鼠李糖基转移酶突变体的生物材料为重组质粒和/或工程菌；所述生物材料优选包括所述编码基因。更优选的，所述生物材料还包括UDP-鼠李糖合酶基因；所述UDP-鼠李糖合酶基因的核苷酸序列优选包括SEQ ID NO:6；所述UDP-鼠李糖合酶基因表达后的氨基酸序列优选包括SEQ ID NO:5。
在更具体的实施方式中，本发明提供了一株具有稳定遗传的鼠李糖基转移酶突变体与UDP-鼠李糖合酶基因共表达工程菌株，该菌株的构建方法优选包括以下步骤：将鼠李糖转移酶突变体基因和UDP-鼠李糖合酶基因分别连接到载体中，得到鼠李糖转移酶突变体基因载体和UDP-鼠李糖合酶基因载体；分别以鼠李糖转移酶突变体基因载体和UDP-鼠李糖合酶基因载体为模板，采用引物进行PCR扩增，获得鼠李糖转移酶突变体基因片段和UDP-鼠李糖合酶基因片段；将鼠李糖转移酶突变体基因片段和UDP-鼠李糖合酶基因片段与载体进行重组连接，得到重组载体；将重组载体转化至宿主细胞中，筛选得到稳定遗传高产新橙皮苷的基因工程菌株。
本发明提供的重组质粒和/或工程菌可通过鼠李糖基转移酶催化UDP-鼠李糖和橙皮素-7-O-葡萄糖苷，用于新橙皮苷的高效生产。由于底物UDP-鼠李糖原料比较昂贵，本发明提供的所述具有稳定遗传的鼠李糖基转移酶突变体与UDP-鼠李糖合酶基因共表达工程菌株，能利用UDP-鼠李糖合酶催化UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖，通过自主合成UDP-鼠李糖合酶，再连接高活性鼠李糖基转移酶突变体，构建这两种酶的共表达系统，进而利用廉价底物，实现新橙皮苷的高产。本发明提供的具有稳定遗传的鼠李糖基转移酶突变体与UDP-鼠李糖合酶基因共表达工程菌株在只添加底物橙皮素-7-O-葡萄糖苷，不添加UDP-鼠李糖的前提下，在大肠杆菌和酿酒酵母中分别实现了新橙皮苷1.64g/L和2.14g/L的高效生产，为新橙皮苷的量产提供了有效策略。
本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体、所述编码基因、所述引物对、所述生物材料、所述制备方法制备得到的鼠李糖基转移酶突变体在生产新橙皮苷中的应用，所述应用包括鼠李糖基转移酶突变体在体外催化体系中催化合成新橙皮苷的步骤；所述体外催化体系包括鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白、UDP-鼠李糖和橙皮素-7-O-葡萄糖苷；所述催化合成的反应pH值为7.5-8.5，优选为8.0；反应温度为36.5-37.5℃，优选为37℃。
本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
S1、构建所述生物材料；所述生物材料为工程菌；
S2、培养步骤S1构建得到的工程菌，得到含有鼠李糖基转移酶突变体的培养液，分离培养液成分，得到所述鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白。
在本发明更具体的实施方式中，本发明先将重组质粒转化宿主菌以获得重组菌株，然后将诱导后的重组菌离心，收集菌体，超声破碎离心，获得粗酶液后，再经亲和层析柱Ni柱和阴离子交换柱Q柱，获得纯化的鼠李糖基转移酶突变体蛋白。在本发明中，所述宿主菌优选包括大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌中的任意一种或者多种；更优选包括大肠杆菌和/或酿酒酵母菌。本发明提供的制备方法能对少量可溶性蛋白进行高效纯化。
本发明还提供了所述生物材料在生产新橙皮苷中的应用，所述生物材料为工程菌；所述应用包括工程菌发酵的步骤；所述工程菌发酵的底物包括橙皮素-7-O-葡萄糖苷；所述工程菌发酵的温度为25~35℃，优选为30℃；所述工程菌发酵的时间为3-15天，优选为6-8天，更优选为7天。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
在本发明的各实施例中，所用引物、质粒及测序均由华大基因完成；所用PCR体系试剂盒及连接试剂盒均购于北京全式金生物技术有限公司；所用高效液相色谱质谱联用仪为沃特世品牌Xevo G2-XS型号。
实施例1 基于丙氨酸扫描技术定向进化鼠李糖基转移酶获得鼠李糖基转移酶突变体
1、丙氨酸扫描技术定向进化鼠李糖基转移酶
使用WebLogo 3在线软件对鼠李糖基转移酶氨基酸序列（SEQ ID NO:2）进行保守分析，其中用于保守分析的同源序列数据集由Consensus Finder软件输出。鼠李糖基转移酶的三维模型由AlphaFold 2建立（图1），并使用ProSA、PROCHECK等软件评估构建的模型质量。进一步，将鼠李糖基转移酶模型与橙皮素-7-O-葡萄糖苷进行分子对接计算。从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）库中获取橙皮素-7-O-葡萄糖苷的三维结构，将鼠李糖基转移酶中的His21周围6Å范围定义对接口袋，利用AutoDockTools 1.5.7进行底物和酶的半柔性对接计算。结果显示，鼠李糖基转移酶中的Trp16、His21、His19、Gln49、Ser50、Lys85和Gln332与橙皮素-7-O-葡萄糖苷具有相互作用，主要为氢键或疏水相互作用，因此确定以上7个位点为突变的热点残基。
2、引物设计
以鼠李糖基转移酶亲本基因序列SEQ ID NO:1为模板，设计用于定点突变的引物序列（W16A、H19A、H21A、Q49A、S50A、K85A、Q332A），具体引物序列如表1所示：
表1 鼠李糖基转移酶定点突变引物对
3、鼠李糖基转移酶突变体质粒构建
以鼠李糖基转移酶亲本基因序列（SEQ ID NO:1，合成基因梁平柚cDNA）或空载（Novagen公司）为模板进行PCR。PCR扩增反应体系（50µL）包括：10µM上下游引物各1.5µL（表2），KOD one Mix 25µL，模板1µL，PCR级别水21µL。DNA聚合酶选用东洋纺生物技术有限公司的高保真的KOD one聚合酶。PCR扩增程序为：95℃预变形5min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸5s（载体25s），共10个循环；98℃变性10s，60℃退火5s，68℃延伸5s（载体25s），共30个循环；68℃终延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，采用EasyPure® QuickGel Extraction Kit（北京全式金生物技术有限公司）从琼脂糖凝胶中回收DNA。回收后的PCR产物利用pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit（北京全式金生物技术有限公司）将基因与载体连接，用含抗性的培养基筛选出阳性转化子，所获得的重组载体命名为pET28a-Cm1,2RhT。
表2 带同源臂的PCR引物
随后利用定点突变技术获得突变体核苷酸序列，通过PCR扩增的方式在鼠李糖基转移酶上引入突变位点。PCR扩增反应体系（50µL）包括：10µM上下游引物各1.5µL，KOD oneMix 25µL，模板1µL，PCR级别水21µL。以重组载体pET28a-Cm1,2RhT为模板，使用表1中定点变位引物，高保真酶KOD one进行PCR扩增突变体DNA片段。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，98℃变性10s，60℃退火5s，68℃延伸35s，共35个循环，然后68℃终延伸5min。PCR产物经EasyPure® PCR Purification Kit（北京全式金生物技术有限公司）纯化后转化DH5α感受态，用含卡那霉素抗性的培养基筛选出阳性转化子，即可获得相应的鼠李糖基转移酶突变体质粒。双突突变体获得方法同上，只是PCR的模板换成相应的单突突变体质粒即可。
4、鼠李糖基转移酶突变体的表达和纯化
将上述得到质粒转化进大肠杆菌BL21（DE3），阳性菌接入含卡那霉素的LB培养基中，于250rpm、37℃条件下培养至OD到0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，随后在160rpm，16℃条件下培养20h；然后离心收集菌体并用去离子水清洗2遍，超声破碎菌体，高速离心后获得粗酶液。粗酶液先经亲和层析柱Ni柱纯化，以50mM Tris-Hcl（pH8.0）含30mM咪唑为wash buffer，以50mM Tris-Hcl（pH8.0）含300mM咪唑为elution buffer。收集His柱洗脱液，上阴离子交换柱Q柱，QA（25mM Tris、10mM NaCl、2mM DTT，pH8.0）和QB（25mM Tris、1MNaCl、2mM DTT，pH8.0）为流动相，线性洗脱以获得纯化的鼠李糖基转移酶突变体蛋白（W16A、H21A、H19A、Q49A、S50A、K85A、Q332A、Q49A/S50A）。其中，纯化的鼠李糖基转移酶突变体蛋白Q49A、S50A和Q49A/S50A的SDS-PAGE胶图如图2所示。
实施例2 鼠李糖基转移酶突变体酶活研究
酶活Kcat/km的测定：200μL 50mM Tric-Hcl（pH8.0）反应体系包括10μg纯化蛋白（突变体蛋白和/或对照菌蛋白）、10mM UDP-鼠李糖、不同浓度的橙皮素-7-O-葡萄糖苷底物（2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 100 μM），37℃反应20min后，加入等体积的冰甲醇终止反应，12,000 rpm离心20 min，收集上清进行高效液相色谱及质谱检测产物新橙皮苷的含量。利用米氏方程计算出酶活数据。酶活反应体系液相色谱及质谱检测结果如图3所示。根据图3可以看出：在UDP-鼠李糖的存在下，鼠李糖基转移酶能够催化橙皮素-7-O-葡萄糖苷生成新橙皮苷。鼠李糖基转移酶突变体及对照菌酶活数据如表3所示。根据表3可以看出：鼠李糖基转移酶突变体的Kcat/Km为29.92 mM-1·s-1，是对照菌酶活0.22 mM-1·s-1的136倍。
表3 鼠李糖基转移酶突变体酶活
实施例3 高产新橙皮苷的基因工程大肠菌株的构建
以合成的甜橙UDP-鼠李糖合酶RHM基因（SEQ ID NO:6）或空载为模板进行PCR（RHM能够催化UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖）。PCR扩增反应体系（50µL）包括：10µM上下游引物各1.5µL（表4），KOD one Mix 25µL，模板1µL，PCR级别水21µL。DNA聚合酶选用东洋纺生物技术有限公司的高保真的KOD one聚合酶。PCR扩增程序为：95℃预变形5min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s（载体25s），共10个循环；98℃变性10s，60℃退火5s，68℃延伸10s（载体30s），共30个循环；68℃终延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，采用EasyPure® Quick Gel Extraction Kit（北京全式金生物技术有限公司）从琼脂糖凝胶中回收DNA。回收后的PCR产物利用pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit（北京全式金生物技术有限公司）将基因与载体连接，用含抗性的培养基筛选出阳性转化子，所获得的重组载体命名为pETDuet-1-CsRHM。
表4 带同源臂的PCR引物
以质粒pETDuet-1-CsRHM和pET28a-Cm1,2RhT为模板，设计引物（表4）将Cm1,2RhT与pETDuet-1-CsRHM相连接，连接体系10µL，包括100ng的Cm1,2RhT和130ng的pETDuet-1-CsRHM，50℃反应30min。所获得的重组载体命名为pETDuet-1-CsRHM-Cm1,2RhT。
将pETDuet-1-CsRHM-Cm1,2RhT质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）以获得pETDuet-1-CsRHM-Cm1,2RhT基因工程大肠菌株。
实施例4 pETDuet-1-CsRHM-Cm1,2RhT基因工程大肠菌株在产新橙皮苷上的应用
将上述得到的pETDuet-1-CsRHM-Cm1,2RhT基因工程阳性菌株接入带氨苄青霉素抗性的LB培养基中，于250rpm、37℃条件下培养至OD到0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，随后在160rpm，16℃条件下培养20h；然后离心收集菌体，将菌体重悬于含有10mM橙皮素-7-O-葡萄糖底物的M9培养基中，200rpm，30℃培养12h。收集不同时间段培养基，超声破碎后，加入等体积冰甲醇，高速离心后，用高效液相色谱质谱检测新橙皮苷的产量，结果如图4所示。根据图4可以看出：随着时间的增加，菌液的OD600缓慢上升，新橙皮苷的产量也在增加，发酵12h，新橙皮苷的产量达到了1.64g/L。
实施例5 高产新橙皮苷的基因工程酵母菌株的构建
以合成的甜橙RHM基因或空载为模板进行PCR。PCR扩增反应体系（50µL）包括：10µM上下游引物各1.5µL（表5），KOD one Mix 25µL，模板1µL，PCR级别水21µL。DNA聚合酶选用东洋纺生物技术有限公司的高保真的KOD one聚合酶。PCR扩增程序为：95℃预变形5min；98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸10s（载体25s），共10个循环；98℃变性10s，60℃退火5s，68℃延伸10s（载体40s），共30个循环；68℃终延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，采用EasyPure® Quick Gel Extraction Kit（北京全式金生物技术有限公司）从琼脂糖凝胶中回收DNA。回收后的PCR产物利用pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit（北京全式金生物技术有限公司）将基因与载体连接，用含抗性的培养基筛选出阳性转化子，所获得的重组载体命名为pESC-Leu-CsRHM。
表5 带同源臂的PCR引物
以质粒pESC-Leu-CsRHM和pET28a-Cm1,2RhT为模板，设计引物（表5）将Cm1,2RhT与pESC-Leu-CsRHM相连接，连接体系10µL，包括100ng的Cm1,2RhT和150ng的pESC-Leu-CsRHM，50℃反应30min。所获得的重组载体命名为pESC-Leu-CsRHM-Cm1,2RhT。
将pESC-Leu-CsRHM-Cm1,2RhT质粒转入酿酒酵母BY4742以获得pESC-Leu-CsRHM-Cm1,2RhT基因工程酵母菌株。
实施例6 基因工程酵母菌株在产新橙皮苷上的应用
将得到的pESC-Leu-CsRHM-Cm1,2RhT基因工程酵母菌株阳性菌株接入SC-Leu-Trap葡萄糖培养基中。200rpm、30℃条件下培养24h后，收集菌体，并将菌体重悬于等体积含有10mM橙皮素-7-O-葡萄糖底物的SC-Leu-Trap半乳糖培养基中，200rpm、30℃条件下发酵168h。
收集不同时间段培养基，玻璃珠破碎后，加入等体积冰甲醇，高速离心后，用高效液相色谱质谱检测新橙皮苷的产量，结果如图5所示。根据图5可以看出：随着发酵时间的增加，新橙皮苷的产量在不断增加，发酵24h到达2.14g/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.鼠李糖基转移酶突变体，其特征在于，所述鼠李糖基转移酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
2.权利要求1所述鼠李糖基转移酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
3.用于获得权利要求2所述编码基因的定点突变引物对，其特征在于，所述定点突变引物对为Q49A突变引物对和S50A突变引物对；
所述Q49A突变引物对的上游引物序列为SEQ ID NO:13；
所述Q49A突变引物对的下游引物序列为SEQ ID NO:14；
所述S50A突变引物对的上游引物序列为SEQ ID NO:15；
所述S50A突变引物对的下游引物序列为SEQ ID NO:16;
所述定点突变引物对以鼠李糖基转移酶亲本基因序列SEQ ID NO:1为扩增模板。
4.用于生产权利要求1所述鼠李糖基转移酶突变体的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组质粒和/或工程菌，所述生物材料包括权利要求2所述编码基因。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料还包括UDP-鼠李糖合酶基因。
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述UDP-鼠李糖合酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
7.权利要求1所述鼠李糖基转移酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建权利要求4-6任意一项所述的生物材料，所述生物材料为工程菌；
S2、培养步骤S1构建得到的工程菌，得到含有鼠李糖基转移酶突变体的培养液，分离培养液成分，得到所述鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白。
8.权利要求1所述鼠李糖基转移酶突变体、权利要求2所述编码基因、权利要求4-6任意一项所述生物材料或者权利要求7所述制备方法制备得到的鼠李糖基转移酶突变体在生产新橙皮苷中的应用，其特征在于，所述应用包括鼠李糖基转移酶突变体在体外催化体系中催化合成新橙皮苷的步骤；所述体外催化体系包括鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白、UDP-鼠李糖和橙皮素-7-O-葡萄糖苷。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述催化合成的反应pH值为7.5-8.5，反应温度为36.5-37.5℃。
10.权利要求5或者权利要求6所述生物材料在生产新橙皮苷中的应用，其特征在于，所述生物材料为工程菌；所述应用包括工程菌发酵的步骤；所述工程菌发酵的底物包括橙皮素-7-O-葡萄糖苷；所述工程菌发酵的温度为25~35℃；所述工程菌发酵的时间为3-15天。
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