CN117778354B - 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用 - Google Patents
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39突变体及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。所述昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39突变体在降解昆布多糖中的应用，或在制备昆布寡糖中的应用。本发明在昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39的基础上通过突变改造得到了昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39突变体，与突变前相比，酶活更高，可达6.99 U/mg，且温度稳定性、pH稳定性更佳。本发明对于昆布寡糖的工业化制备具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。
背景技术
褐藻作为地球上最具生产力和环境可持续性的植物之一，含有多种功能活性物质，如ω-3脂肪酸、甘露醇以及海洋多糖等。昆布多糖（laminarin）、褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯是褐藻中最丰富的多糖，占干脱脂藻类生物量的40%～80%。昆布多糖是一种来源于昆布、海带、裙带菜等褐藻的存在于细胞液泡中的水溶性多糖，有抗凝血、抗氧化、调节肠道菌群等多种生理活性功能，在食品、药品、化妆品等领域有应用。
昆布多糖由大约20～25个葡萄糖残基通过β-1,3-糖苷键连接，较高的分子量使其溶解度较低，一定程度上限制了其在食品领域的应用。具有低分子量和较高生物利用度的昆布寡糖（Laminarin oligosaccharides，LOSs）是当前的研究热点，研究者发现寡糖聚合度与功能活性密切相关，比如昆布二糖可以被单子叶植物识别，昆布四糖可以刺激水稻悬浮细胞中的几丁质酶活性，昆布五糖可以增强烟草细胞的免疫反应。因此实现具有特定聚合度的LOSs的高效制备非常重要。
昆布多糖酶能有效催化昆布多糖β-1,3糖苷键的水解，根据CAZy数据库的分类，昆布多糖酶来自12个不同的糖苷水解酶家族，其中GH64家族酶的水解产物以昆布五糖为主，因此该家族又被称为产五糖型昆布多糖酶，其对生产特定聚合度寡糖具有重要意义。但已报道的GH64家族酶的酶活和稳定性都较低，比如中国发明专利申请CN 115927508 A所公开的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39，其比酶活仅为3.64 U/mg，且温度稳定性和pH稳定性均不理想。
发明内容
针对上述现有技术，本发明公开了昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体在降解昆布多糖中的应用，或在制备昆布寡糖中的应用。
进一步地，所述昆布寡糖为昆布五糖。
进一步地，具体应用时，将20μL含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶液加入到100μL昆布多糖溶液中，在35℃下反应15 min；其中，含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶液的浓度为0.5 mg/mL，昆布多糖溶液的浓度为4 mg/mL，昆布多糖溶液的溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液。
本发明在昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的基础上，通过突变改造得到了昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体，与突变前相比，酶活更高，可达6.99 U/mg，且温度稳定性、pH稳定性更佳，在30～40℃下放置48 h，酶活仍可保留80%以上；在pH 5.0～6.0的缓冲液中保留96 h，酶活也能保留80%以上。利用本发明的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体降解昆布多糖，可以得到具有特定聚合度的昆布寡糖——昆布五糖，本发明对于昆布寡糖的工业化制备具有重要意义，对于后续的工业化应用以及研究特定聚合度寡糖的活性也具有重要意义。本发明构建了重组表达载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：各洗脱液的SDS-PAGE电泳图，其中，Marker为标准蛋白；穿透液为粗酶液；10mM、40 mM、80 mM、100 mM、150 mM表示在此浓度的咪唑溶液洗脱下得到的洗脱液。
图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。
图3：pH变化对相对酶活的影响示意图。
图4：在不同温度下孵育不同时间对相对酶活的影响示意图。
图5：在不同pH下孵育不同时间对相对酶活的影响示意图。
图6：降解不同底物时的相对酶活示意图。
图7：昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的降解产物的TLC图，其中，Glu指葡萄糖，Lam2、Lam3、Lam4和Lam5分别指昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖和昆布五糖；底物指昆布多糖，混标指混合标品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的改造
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因，来源于天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor A3(2)（购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号4.7168），序列号为CAC16439.1。该基因片段包含了1197个碱基，如SEQ ID NO.2所示，编码398个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。该酶经过镍柱纯化后的比酶活可达3.64 U/mg，在25～45℃下放置36小时，酶活仍可保留50%以上；在pH 5.0～7.0的缓冲液中保留36小时，酶活也能保留50%以上（该段内容记载在中国发明专利申请CN 115927508 A中）。
为进一步地提高昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶活和稳定性，本发明对该酶进行改造，过程如下：使用Alphafold2对昆布多糖降解酶OUC-ScLam39（去掉前端的由34个氨基酸残基组成的信号肽序列）的结构进行预测，将结构文件和序列信息上传至PROSS平台进行蛋白结构理性设计，输出结果为多个多位点突变体，其中突变数量最少的是一个八位点突变体，命名为昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示。将昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体表达、纯化，并验证其酶活、稳定性、降解产物等，具体见下述实施例。
所述PROSS平台的网址为：https://pross.weizmann.ac.il/step/pross-terms/。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1所示，下划线所示序列为信号肽序列：
MLSRLRHRLLAVAAAAGLTGALLSFGAAPPADAAVPATIPLKITNNSARGDAVHIYNLGTSLTTGQQGWADENGTFHAWPAGGNPPTPAPDASIPGPAAGQTKTIRIPKLSGRIYFSYGQKLDFRLTTGGLVQPAVQNPSDPNRNILFNWSEYTLNDGGLWLNSTQVDMFSAPYTVGVQRADGGVTSAGQLKAGGYRGVFDALRAQPGWGGLIQTRPDGTVLRALAPLYGVETGALPASVMDDYINRVWQKYTTTTLTVTPFGDRPDTKYFGRVSGNVMNFTNTSGAVVTSFQKPDASSVFGCHRLLDAPNDQVRGPISRTLCAGFNRSTLLSNPNQPDPSAANFYRDPVTNHYARIIHERMADGKAYAFAFDDVGNHESLVHDGNPAEARLTLAPLD。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示，如SEQ ID NO.2所示：
GTGCTCTCCCGACTCAGACACCGTCTGCTCGCCGTGGCCGCGGCCGCAGGCCTGACCGGCGCCCTGCTCTCGTTCGGCGCCGCACCGCCCGCGGACGCCGCGGTGCCCGCCACCATCCCCCTGAAGATCACCAACAACTCCGCTCGTGGCGACGCCGTCCACATCTACAACCTGGGCACCTCGCTGACGACCGGTCAGCAGGGCTGGGCGGACGAGAACGGAACCTTCCACGCCTGGCCCGCCGGCGGCAATCCCCCCACTCCCGCACCGGACGCGTCCATCCCTGGACCGGCCGCGGGACAGACCAAGACCATCCGGATCCCGAAGCTGTCGGGACGCATCTACTTCTCCTACGGCCAGAAGCTGGACTTCCGGCTCACCACCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGCCGTGCAGAACCCCAGCGACCCCAACCGCAACATCCTCTTCAACTGGTCCGAGTACACGCTCAACGACGGCGGGCTGTGGCTGAACAGCACCCAGGTCGACATGTTCTCCGCGCCCTACACGGTCGGCGTGCAGCGCGCCGACGGCGGCGTGACCAGCGCCGGACAGCTCAAGGCCGGTGGCTACCGCGGGGTGTTCGACGCGCTGCGGGCCCAGCCGGGCTGGGGCGGGCTGATCCAGACCCGGCCCGACGGCACCGTACTGCGGGCGCTGGCGCCGCTGTACGGGGTGGAGACCGGGGCGCTGCCCGCGTCGGTCATGGACGACTACATCAACCGGGTCTGGCAGAAGTACACGACGACCACGCTCACCGTCACGCCCTTCGGCGACCGTCCGGACACCAAGTACTTCGGACGCGTCTCGGGCAACGTCATGAACTTCACCAACACCTCCGGCGCGGTCGTCACCAGCTTCCAGAAGCCGGACGCCTCCAGCGTCTTCGGCTGCCACCGGCTCCTGGACGCGCCCAACGACCAGGTGCGCGGGCCGATCTCGCGCACGCTGTGCGCCGGCTTCAACCGCTCGACGCTGCTGAGCAACCCCAACCAGCCCGATCCCTCGGCGGCGAACTTCTACCGGGACCCGGTGACCAACCACTACGCCCGGATCATCCACGAGCGCATGGCCGACGGGAAGGCGTACGCGTTCGCCTTCGACGACGTCGGCAACCACGAGTCGCTGGTGCACGACGGCAACCCGGCCGAGGCGAGGCTCACGCTCGCCCCGCTCGACTGA。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.3所示，下划线所示为突变位点：
VPATIPLKITNNSGRGDAVHIYNLGTDLTTGQQGWADENGTFHAWPAGGNPPTPAPDASIPGPAAGQTKTIRIPKMSGRIYFSYGQKLDFRLTTGGLVQPAVQNPSDPNRNILFNWSEYTLNDGGLWLNSTQVDMFSAPYTVGVQRADGGVTSTGQLKPGGYRGVFDALRAQPGWGGLIQTRPDGTVLRALAPLYGVETGALPASYMDDYINRVWQKYTTTTLTVTPFGDRPDTKYFGRVSGNVMNFTNTSGAVVTSFQKPDASSVFGCHGLLDAPNDQVRGPIARTLCAGFNRSTLLSNPNQPDPSAANFYRDPVTNHYARIIHERMADGKAYAFAFDDVGNHESLVHDGNPAEARLTLAPLD。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的编码基因的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示，如SEQ ID NO.4所示：
GTGCCCGCCACCATCCCCCTGAAGATCACCAACAACTCCGGCCGTGGCGACGCCGTCCACATCTACAACCTGGGCACCGACCTGACGACCGGTCAGCAGGGCTGGGCGGACGAGAACGGAACCTTCCACGCCTGGCCCGCCGGCGGCAATCCCCCCACTCCCGCACCGGACGCGTCCATCCCTGGACCGGCCGCGGGACAGACCAAGACCATCCGGATCCCGAAGATGTCGGGACGCATCTACTTCTCCTACGGCCAGAAGCTGGACTTCCGGCTCACCACCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGCCGTGCAGAACCCCAGCGACCCCAACCGCAACATCCTCTTCAACTGGTCCGAGTACACGCTCAACGACGGCGGGCTGTGGCTGAACAGCACCCAGGTCGACATGTTCTCCGCGCCCTACACGGTCGGCGTGCAGCGCGCCGACGGCGGCGTGACCAGCACGGGACAGCTCAAGCCGGGTGGCTACCGCGGGGTGTTCGACGCGCTGCGGGCCCAGCCGGGCTGGGGCGGGCTGATCCAGACCCGGCCCGACGGCACCGTACTGCGGGCGCTGGCGCCGCTGTACGGGGTGGAGACCGGGGCGCTGCCCGCGTCGTACATGGACGACTACATCAACCGGGTCTGGCAGAAGTACACGACGACCACGCTCACCGTCACGCCCTTCGGCGACCGTCCGGACACCAAGTACTTCGGACGCGTCTCGGGCAACGTCATGAACTTCACCAACACCTCCGGCGCGGTCGTCACCAGCTTCCAGAAGCCGGACGCCTCCAGCGTCTTCGGCTGCCACGGCCTCCTGGACGCGCCCAACGACCAGGTGCGCGGGCCGATCGCGCGCACGCTGTGCGCCGGCTTCAACCGCTCGACGCTGCTGAGCAACCCCAACCAGCCCGATCCCTCGGCGGCGAACTTCTACCGGGACCCGGTGACCAACCACTACGCCCGGATCATCCACGAGCGCATGGCCGACGGGAAGGCGTACGCGTTCGCCTTCGACGACGTCGGCAACCACGAGTCGCTGGTGCACGACGGCAACCCGGCCGAGGCGAGGCTCACGCTCGCCCCGCTCGAC。
实施例2 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的编码基因的获得
以昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增7次，每次扩增所采用的引物的核苷酸序列如表1所示（如SEQ ID NO.5～18所示），表1中各序列下划线所示部分为目的片段与载体的同源序列。最后一次扩增后，得到核苷酸序列如SEQID NO.4所示的基因片段。
表1 引物的核苷酸序列
PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTPs 7μl，引物各1.5μl，模板2μl，KOD Fx酶1μl，无菌水2μl，PCR Enhancer 10μl，总体系50μl。
PCR反应条件为：95℃预变性5 min，98℃变性20 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，反应30个循环，68℃后延伸10 min。
最后一次PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳后回收1092 bp的PCR产物片段。
实施例3 重组表达载体、重组质粒及工程菌的构建
将实施例2中最后一次扩增得到的PCR原液转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体抗性平板上，37℃培养箱中培养16小时；挑取单克隆至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220 rpm摇床培养12小时。进行阳性克隆验证。将条带大小正确的单克隆送至测序公司测序。序列比对完全正确后将验证成功的重组质粒提取出来并命名为pET28a-OUC-ScLam39-突变体，将其保存在-20℃备用。
测序所用引物的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示：
正向引物：TAATACGACTCACTATAGG，如SEQ ID NO.19所示。
反向引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGG，如SEQ ID NO.20所示。
将上述抽提的重组表达载体pET28a-OUC-ScLam39-突变体转化至宿主大肠杆菌BL21感受态细胞中,构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出，得到重组表达菌株。将重组表达菌株于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养12小时。保藏菌液置于10%甘油中，保存在-80℃备用。
实施例4 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的制备
重组表达菌株在5 mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中活化12 h，按1%的接种量接入含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养4 h。按1‰的比例加入100 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），20℃、200 rpm摇床培养18 h，诱导表达昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体。
发酵结束后，菌液于8000 g、4℃条件下离心10 min，收集菌体，细胞重悬于50 mM、pH 7.0的Tirs-HCl缓冲液中，并且用相同缓冲液进行三次置换，然后将菌体置于冰水浴中超声破碎30 min（40%功率，3 s开，3 s关），然后在8000 g、4℃条件下再次离心10 min，收集上清液，即为粗酶液。
粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，首先使用平衡缓冲溶液（500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）平衡柱子，然后用10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）洗脱结合力较差的杂蛋白，再分别用40 mM、80 mM、100 mM、150 mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，收集得到4种洗脱液，进行SDS-PAGE检测以验证条带是否单一，大小是否准确，结果如图 1所示，结果显示，目的蛋白在40 mM溶液和80 mM咪唑溶液下被洗脱，重组蛋白分子量大小约为35～48 kDa，与突变前基本一致。取80 mM咪唑溶液洗脱后的洗脱液，使用10 kDa超滤离心管在4000 rpm下低温离心20 min以去除咪唑，得到纯酶液，经检测，蛋白含量为7.9mg/mL，用纯水稀释至0.05 mg/mL，作为酶液用于下述实施例5～7的研究。
实施例5 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的比酶活测定
标准测定方法为：120μL的反应体系中，包含20μL酶液，以及100μL浓度为4 mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液），在35℃下反应15 min，沸水浴10 min对酶灭活，冷却后加入180μL的DNS试剂，并在沸水浴中煮沸5 min进行显色。12000 rpm离心1min，在540 nm处测定吸光值。
酶活力定义为：在标准条件下每分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量。
所用昆布多糖，购自北京索莱宝科技有限公司，商品货号L8030，CAS：9008-22-4。
经测定，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶活力为6.99 U/mg。相比而言，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶活为3.64 U/mg（记载在CN 115927508 A的说明书第0045段），可见，本发明的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶活明显更高。在同等的酶解效率下，本发明的酶解速度更快，所需时间更短。
实施例6 最适反应条件和稳定性的测定
最适温度的测定：选取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的反应温度，按照实施例5的测定方法测定酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图2所示，最适温度为35℃，在20℃～50℃范围内酶活均比较高，相对酶活高于80%。
最适pH的测定：选用pH为3.0～9.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，按照实施例5的测定方法测定酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图3所示，最适pH为5.0。
温度稳定性的测定：分别在4℃、30℃、35℃、40℃的温度条件下对酶液进行孵育，孵育时间分别为12 h、24 h、36 h、48 h、60 h，按照实施例5的测定方法测定孵育不同时间后的残留酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图4所示，在4℃孵育12～60h，残留酶活仍然很高，在90%以上，说明昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体在4℃条件短期储存不会造成酶活大幅度降低。在30～40℃孵育48 h，残留酶活仍然很高，在90%以上，在40℃孵育60 h，残留酶活约68%，说明昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的耐热性能优异。而昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的耐热性能一般，在30～40℃孵育36 h，残留酶活就降低至50%～60%。
pH稳定性的测定：酶液分别与不同pH的缓冲液（pH 3.0～10.0）混合，并于35℃中孵育，孵育时间分别为24 h、48 h、72 h、96 h，按照实施例5的测定方法测定孵育不同时间后的残留酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图5所示，在pH 5.0～6.0的缓冲液中孵育96 h，残留酶活也能保留80%以上，说明昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的pH稳定性较好。而昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的pH稳定性一般，在pH 5.0～6.0的缓冲液中孵育36 h，残留酶活就降低至50%～60%。
实施例7 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的底物选择性
用pH 5.0的柠檬酸缓冲液配制浓度均为4 mg/mL的凝胶多糖溶液、香菇多糖溶液、酵母聚糖溶液、茯苓多糖溶液、昆布多糖溶液共5种溶液。各溶液各取100μL，加入20μL的酶液，混合均匀，按照实施例5的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图6所示，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体对昆布多糖的催化活性最强，对香菇多糖、酵母聚糖、茯苓多糖的催化活性一般，对凝胶多糖几乎无活性，说明昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的底物特异性良好。
实施例8 TLC法鉴定昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的降解产物
（1）分别以昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体、昆布多糖降解酶OUC-ScLam39降解昆布多糖，共设置4组，如下：
实验组1：将实施例4的纯酶液用纯水稀释至0.5 mg/mL，取20μL，与100μL浓度为4mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液）混合，在35℃下反应15 min，得降解产物。
对照组1：将实施例4的纯酶液用纯水稀释至0.5 mg/mL，取20μL，进行灭酶处理（沸水浴10 min），然后与100μL浓度为4 mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液）混合，在35℃下反应15 min。
实验组2：取20μL含昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶液（浓度0.5 mg/mL），与100μL浓度为4 mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 6.0的磷酸盐缓冲液）混合，在35℃下反应15min，得降解产物。
对照组2：取20μL含昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶液（浓度0.5 mg/mL），进行灭酶处理（沸水浴10 min），与100μL浓度为4 mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 6.0的磷酸盐缓冲液）混合，在35℃下反应15 min。
（2）采用聚丙烯酰胺凝胶柱层析进行分离和制备，流动相为超纯水，通过TLC检测产物，具体方法如下：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液，正丁醇、乙酸和水的体积比为3:2:2；显色剂为3,5-二羟基甲苯、浓硫酸（质量分数98%）和乙醇的混合溶液，3,5-二羟基甲苯的浓度为2 mg/mL，浓硫酸的浓度为10%（体积百分比）；于90℃条件下加热3 min。以昆布多糖底物、混合标品（混合标品中含有葡萄糖、昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖和昆布五糖）和昆布五糖标品作为参照，对上述4组的降解产物进行TLC分析。
结果如图7所示，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的降解产物中含有昆布五糖，不含昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖，与昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的降解产物一致。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (5)
1.一种昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的编码基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体在降解昆布多糖中的应用，或在制备昆布寡糖中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述昆布寡糖为昆布五糖。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：具体应用时，将20μL含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶液加入到100μL昆布多糖溶液中，在35℃下反应15 min；其中，含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶液的浓度为0.5 mg/mL，昆布多糖溶液的浓度为4 mg/mL，昆布多糖溶液的溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液。
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| GR01 | Patent grant | ||
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