CN117778354A - 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用 - Google Patents
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117778354A CN117778354A CN202410199315.7A CN202410199315A CN117778354A CN 117778354 A CN117778354 A CN 117778354A CN 202410199315 A CN202410199315 A CN 202410199315A CN 117778354 A CN117778354 A CN 117778354A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- laminarin
- ouc
- sclam39
- mutant
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 132
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 132
- 239000005717 Laminarin Substances 0.000 title claims abstract description 109
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 title claims abstract description 109
- DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N 0.000 title claims abstract description 99
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 39
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- -1 laminarin oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 45
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 4
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 241001466453 Laminaria Species 0.000 abstract 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 6
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920002558 Curdlan Polymers 0.000 description 2
- 239000001879 Curdlan Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000019316 curdlan Nutrition 0.000 description 2
- 229940078035 curdlan Drugs 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101100127656 Caenorhabditis elegans lam-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 229920000855 Fucoidan Polymers 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000013494 PH determination Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940012843 omega-3 fatty acid Drugs 0.000 description 1
- 239000006014 omega-3 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39突变体及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。所述昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39突变体在降解昆布多糖中的应用，或在制备昆布寡糖中的应用。本发明在昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39的基础上通过突变改造得到了昆布多糖降解酶OUC‑ScLam39突变体，与突变前相比，酶活更高，可达6.99 U/mg，且温度稳定性、pH稳定性更佳。本发明对于昆布寡糖的工业化制备具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。
背景技术
褐藻作为地球上最具生产力和环境可持续性的植物之一，含有多种功能活性物质，如ω-3脂肪酸、甘露醇以及海洋多糖等。昆布多糖（laminarin）、褐藻胶和岩藻聚糖硫酸酯是褐藻中最丰富的多糖，占干脱脂藻类生物量的40%～80%。昆布多糖是一种来源于昆布、海带、裙带菜等褐藻的存在于细胞液泡中的水溶性多糖，有抗凝血、抗氧化、调节肠道菌群等多种生理活性功能，在食品、药品、化妆品等领域有应用。
昆布多糖由大约20～25个葡萄糖残基通过β-1,3-糖苷键连接，较高的分子量使其溶解度较低，一定程度上限制了其在食品领域的应用。具有低分子量和较高生物利用度的昆布寡糖（Laminarin oligosaccharides，LOSs）是当前的研究热点，研究者发现寡糖聚合度与功能活性密切相关，比如昆布二糖可以被单子叶植物识别，昆布四糖可以刺激水稻悬浮细胞中的几丁质酶活性，昆布五糖可以增强烟草细胞的免疫反应。因此实现具有特定聚合度的LOSs的高效制备非常重要。
昆布多糖酶能有效催化昆布多糖β-1,3糖苷键的水解，根据CAZy数据库的分类，昆布多糖酶来自12个不同的糖苷水解酶家族，其中GH64家族酶的水解产物以昆布五糖为主，因此该家族又被称为产五糖型昆布多糖酶，其对生产特定聚合度寡糖具有重要意义。但已报道的GH64家族酶的酶活和稳定性都较低，比如中国发明专利申请CN 115927508 A所公开的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39，其比酶活仅为3.64 U/mg，且温度稳定性和pH稳定性均不理想。
发明内容
针对上述现有技术，本发明公开了昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用，属于功能酶技术领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体在降解昆布多糖中的应用，或在制备昆布寡糖中的应用。
进一步地，所述昆布寡糖为昆布五糖。
进一步地，具体应用时，将20μL含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶液加入到100μL昆布多糖溶液中，在35℃下反应15 min；其中，含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶液的浓度为0.5 mg/mL，昆布多糖溶液的浓度为4 mg/mL，昆布多糖溶液的溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液。
本发明在昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的基础上，通过突变改造得到了昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体，与突变前相比，酶活更高，可达6.99 U/mg，且温度稳定性、pH稳定性更佳，在30～40℃下放置48 h，酶活仍可保留80%以上；在pH 5.0～6.0的缓冲液中保留96 h，酶活也能保留80%以上。利用本发明的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体降解昆布多糖，可以得到具有特定聚合度的昆布寡糖——昆布五糖，本发明对于昆布寡糖的工业化制备具有重要意义，对于后续的工业化应用以及研究特定聚合度寡糖的活性也具有重要意义。本发明构建了重组表达载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：各洗脱液的SDS-PAGE电泳图，其中，Marker为标准蛋白；穿透液为粗酶液；10mM、40 mM、80 mM、100 mM、150 mM表示在此浓度的咪唑溶液洗脱下得到的洗脱液。
图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。
图3：pH变化对相对酶活的影响示意图。
图4：在不同温度下孵育不同时间对相对酶活的影响示意图。
图5：在不同pH下孵育不同时间对相对酶活的影响示意图。
图6：降解不同底物时的相对酶活示意图。
图7：昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的降解产物的TLC图，其中，Glu指葡萄糖，Lam2、Lam3、Lam4和Lam5分别指昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖和昆布五糖；底物指昆布多糖，混标指混合标品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的改造
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因，来源于天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor A3(2)（购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号4.7168），序列号为CAC16439.1。该基因片段包含了1197个碱基，如SEQ ID NO.2所示，编码398个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。该酶经过镍柱纯化后的比酶活可达3.64 U/mg，在25～45℃下放置36小时，酶活仍可保留50%以上；在pH 5.0～7.0的缓冲液中保留36小时，酶活也能保留50%以上（该段内容记载在中国发明专利申请CN 115927508 A中）。
为进一步地提高昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶活和稳定性，本发明对该酶进行改造，过程如下：使用Alphafold2对昆布多糖降解酶OUC-ScLam39（去掉前端的由34个氨基酸残基组成的信号肽序列）的结构进行预测，将结构文件和序列信息上传至PROSS平台进行蛋白结构理性设计，输出结果为多个多位点突变体，其中突变数量最少的是一个八位点突变体，命名为昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示。将昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体表达、纯化，并验证其酶活、稳定性、降解产物等，具体见下述实施例。
所述PROSS平台的网址为：https://pross.weizmann.ac.il/step/pross-terms/。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1所示，下划线所示序列为信号肽序列：
MLSRLRHRLLAVAAAAGLTGALLSFGAAPPADAAVPATIPLKITNNSARGDAVHIYNLGTSLTTGQQGWADENGTFHAWPAGGNPPTPAPDASIPGPAAGQTKTIRIPKLSGRIYFSYGQKLDFRLTTGGLVQPAVQNPSDPNRNILFNWSEYTLNDGGLWLNSTQVDMFSAPYTVGVQRADGGVTSAGQLKAGGYRGVFDALRAQPGWGGLIQTRPDGTVLRALAPLYGVETGALPASVMDDYINRVWQKYTTTTLTVTPFGDRPDTKYFGRVSGNVMNFTNTSGAVVTSFQKPDASSVFGCHRLLDAPNDQVRGPISRTLCAGFNRSTLLSNPNQPDPSAANFYRDPVTNHYARIIHERMADGKAYAFAFDDVGNHESLVHDGNPAEARLTLAPLD。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示，如SEQ ID NO.2所示：
GTGCTCTCCCGACTCAGACACCGTCTGCTCGCCGTGGCCGCGGCCGCAGGCCTGACCGGCGCCCTGCTCTCGTTCGGCGCCGCACCGCCCGCGGACGCCGCGGTGCCCGCCACCATCCCCCTGAAGATCACCAACAACTCCGCTCGTGGCGACGCCGTCCACATCTACAACCTGGGCACCTCGCTGACGACCGGTCAGCAGGGCTGGGCGGACGAGAACGGAACCTTCCACGCCTGGCCCGCCGGCGGCAATCCCCCCACTCCCGCACCGGACGCGTCCATCCCTGGACCGGCCGCGGGACAGACCAAGACCATCCGGATCCCGAAGCTGTCGGGACGCATCTACTTCTCCTACGGCCAGAAGCTGGACTTCCGGCTCACCACCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGCCGTGCAGAACCCCAGCGACCCCAACCGCAACATCCTCTTCAACTGGTCCGAGTACACGCTCAACGACGGCGGGCTGTGGCTGAACAGCACCCAGGTCGACATGTTCTCCGCGCCCTACACGGTCGGCGTGCAGCGCGCCGACGGCGGCGTGACCAGCGCCGGACAGCTCAAGGCCGGTGGCTACCGCGGGGTGTTCGACGCGCTGCGGGCCCAGCCGGGCTGGGGCGGGCTGATCCAGACCCGGCCCGACGGCACCGTACTGCGGGCGCTGGCGCCGCTGTACGGGGTGGAGACCGGGGCGCTGCCCGCGTCGGTCATGGACGACTACATCAACCGGGTCTGGCAGAAGTACACGACGACCACGCTCACCGTCACGCCCTTCGGCGACCGTCCGGACACCAAGTACTTCGGACGCGTCTCGGGCAACGTCATGAACTTCACCAACACCTCCGGCGCGGTCGTCACCAGCTTCCAGAAGCCGGACGCCTCCAGCGTCTTCGGCTGCCACCGGCTCCTGGACGCGCCCAACGACCAGGTGCGCGGGCCGATCTCGCGCACGCTGTGCGCCGGCTTCAACCGCTCGACGCTGCTGAGCAACCCCAACCAGCCCGATCCCTCGGCGGCGAACTTCTACCGGGACCCGGTGACCAACCACTACGCCCGGATCATCCACGAGCGCATGGCCGACGGGAAGGCGTACGCGTTCGCCTTCGACGACGTCGGCAACCACGAGTCGCTGGTGCACGACGGCAACCCGGCCGAGGCGAGGCTCACGCTCGCCCCGCTCGACTGA。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.3所示，下划线所示为突变位点：
VPATIPLKITNNSGRGDAVHIYNLGTDLTTGQQGWADENGTFHAWPAGGNPPTPAPDASIPGPAAGQTKTIRIPKMSGRIYFSYGQKLDFRLTTGGLVQPAVQNPSDPNRNILFNWSEYTLNDGGLWLNSTQVDMFSAPYTVGVQRADGGVTSTGQLKPGGYRGVFDALRAQPGWGGLIQTRPDGTVLRALAPLYGVETGALPASYMDDYINRVWQKYTTTTLTVTPFGDRPDTKYFGRVSGNVMNFTNTSGAVVTSFQKPDASSVFGCHGLLDAPNDQVRGPIARTLCAGFNRSTLLSNPNQPDPSAANFYRDPVTNHYARIIHERMADGKAYAFAFDDVGNHESLVHDGNPAEARLTLAPLD。
昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的编码基因的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示，如SEQ ID NO.4所示：
GTGCCCGCCACCATCCCCCTGAAGATCACCAACAACTCCGGCCGTGGCGACGCCGTCCACATCTACAACCTGGGCACCGACCTGACGACCGGTCAGCAGGGCTGGGCGGACGAGAACGGAACCTTCCACGCCTGGCCCGCCGGCGGCAATCCCCCCACTCCCGCACCGGACGCGTCCATCCCTGGACCGGCCGCGGGACAGACCAAGACCATCCGGATCCCGAAGATGTCGGGACGCATCTACTTCTCCTACGGCCAGAAGCTGGACTTCCGGCTCACCACCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGCCGTGCAGAACCCCAGCGACCCCAACCGCAACATCCTCTTCAACTGGTCCGAGTACACGCTCAACGACGGCGGGCTGTGGCTGAACAGCACCCAGGTCGACATGTTCTCCGCGCCCTACACGGTCGGCGTGCAGCGCGCCGACGGCGGCGTGACCAGCACGGGACAGCTCAAGCCGGGTGGCTACCGCGGGGTGTTCGACGCGCTGCGGGCCCAGCCGGGCTGGGGCGGGCTGATCCAGACCCGGCCCGACGGCACCGTACTGCGGGCGCTGGCGCCGCTGTACGGGGTGGAGACCGGGGCGCTGCCCGCGTCGTACATGGACGACTACATCAACCGGGTCTGGCAGAAGTACACGACGACCACGCTCACCGTCACGCCCTTCGGCGACCGTCCGGACACCAAGTACTTCGGACGCGTCTCGGGCAACGTCATGAACTTCACCAACACCTCCGGCGCGGTCGTCACCAGCTTCCAGAAGCCGGACGCCTCCAGCGTCTTCGGCTGCCACGGCCTCCTGGACGCGCCCAACGACCAGGTGCGCGGGCCGATCGCGCGCACGCTGTGCGCCGGCTTCAACCGCTCGACGCTGCTGAGCAACCCCAACCAGCCCGATCCCTCGGCGGCGAACTTCTACCGGGACCCGGTGACCAACCACTACGCCCGGATCATCCACGAGCGCATGGCCGACGGGAAGGCGTACGCGTTCGCCTTCGACGACGTCGGCAACCACGAGTCGCTGGTGCACGACGGCAACCCGGCCGAGGCGAGGCTCACGCTCGCCCCGCTCGAC。
实施例2 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的编码基因的获得
以昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的编码基因为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增7次，每次扩增所采用的引物的核苷酸序列如表1所示（如SEQ ID NO.5～18所示），表1中各序列下划线所示部分为目的片段与载体的同源序列。最后一次扩增后，得到核苷酸序列如SEQID NO.4所示的基因片段。
表1 引物的核苷酸序列
PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTPs 7μl，引物各1.5μl，模板2μl，KOD Fx酶1μl，无菌水2μl，PCR Enhancer 10μl，总体系50μl。
PCR反应条件为：95℃预变性5 min，98℃变性20 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，反应30个循环，68℃后延伸10 min。
最后一次PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳后回收1092 bp的PCR产物片段。
实施例3 重组表达载体、重组质粒及工程菌的构建
将实施例2中最后一次扩增得到的PCR原液转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体抗性平板上，37℃培养箱中培养16小时；挑取单克隆至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220 rpm摇床培养12小时。进行阳性克隆验证。将条带大小正确的单克隆送至测序公司测序。序列比对完全正确后将验证成功的重组质粒提取出来并命名为pET28a-OUC-ScLam39-突变体，将其保存在-20℃备用。
测序所用引物的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示：
正向引物：TAATACGACTCACTATAGG，如SEQ ID NO.19所示。
反向引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGG，如SEQ ID NO.20所示。
将上述抽提的重组表达载体pET28a-OUC-ScLam39-突变体转化至宿主大肠杆菌BL21感受态细胞中,构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出，得到重组表达菌株。将重组表达菌株于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养12小时。保藏菌液置于10%甘油中，保存在-80℃备用。
实施例4 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的制备
重组表达菌株在5 mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中活化12 h，按1%的接种量接入含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养4 h。按1‰的比例加入100 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），20℃、200 rpm摇床培养18 h，诱导表达昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体。
发酵结束后，菌液于8000 g、4℃条件下离心10 min，收集菌体，细胞重悬于50 mM、pH 7.0的Tirs-HCl缓冲液中，并且用相同缓冲液进行三次置换，然后将菌体置于冰水浴中超声破碎30 min（40%功率，3 s开，3 s关），然后在8000 g、4℃条件下再次离心10 min，收集上清液，即为粗酶液。
粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，首先使用平衡缓冲溶液（500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）平衡柱子，然后用10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）洗脱结合力较差的杂蛋白，再分别用40 mM、80 mM、100 mM、150 mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，收集得到4种洗脱液，进行SDS-PAGE检测以验证条带是否单一，大小是否准确，结果如图 1所示，结果显示，目的蛋白在40 mM溶液和80 mM咪唑溶液下被洗脱，重组蛋白分子量大小约为35～48 kDa，与突变前基本一致。取80 mM咪唑溶液洗脱后的洗脱液，使用10 kDa超滤离心管在4000 rpm下低温离心20 min以去除咪唑，得到纯酶液，经检测，蛋白含量为7.9mg/mL，用纯水稀释至0.05 mg/mL，作为酶液用于下述实施例5～7的研究。
实施例5 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的比酶活测定
标准测定方法为：120μL的反应体系中，包含20μL酶液，以及100μL浓度为4 mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液），在35℃下反应15 min，沸水浴10 min对酶灭活，冷却后加入180μL的DNS试剂，并在沸水浴中煮沸5 min进行显色。12000 rpm离心1min，在540 nm处测定吸光值。
酶活力定义为：在标准条件下每分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量。
所用昆布多糖，购自北京索莱宝科技有限公司，商品货号L8030，CAS：9008-22-4。
经测定，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶活力为6.99 U/mg。相比而言，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶活为3.64 U/mg（记载在CN 115927508 A的说明书第0045段），可见，本发明的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶活明显更高。在同等的酶解效率下，本发明的酶解速度更快，所需时间更短。
实施例6 最适反应条件和稳定性的测定
最适温度的测定：选取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的反应温度，按照实施例5的测定方法测定酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图2所示，最适温度为35℃，在20℃～50℃范围内酶活均比较高，相对酶活高于80%。
最适pH的测定：选用pH为3.0～9.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，按照实施例5的测定方法测定酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图3所示，最适pH为5.0。
温度稳定性的测定：分别在4℃、30℃、35℃、40℃的温度条件下对酶液进行孵育，孵育时间分别为12 h、24 h、36 h、48 h、60 h，按照实施例5的测定方法测定孵育不同时间后的残留酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图4所示，在4℃孵育12～60h，残留酶活仍然很高，在90%以上，说明昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体在4℃条件短期储存不会造成酶活大幅度降低。在30～40℃孵育48 h，残留酶活仍然很高，在90%以上，在40℃孵育60 h，残留酶活约68%，说明昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的耐热性能优异。而昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的耐热性能一般，在30～40℃孵育36 h，残留酶活就降低至50%～60%。
pH稳定性的测定：酶液分别与不同pH的缓冲液（pH 3.0～10.0）混合，并于35℃中孵育，孵育时间分别为24 h、48 h、72 h、96 h，按照实施例5的测定方法测定孵育不同时间后的残留酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图5所示，在pH 5.0～6.0的缓冲液中孵育96 h，残留酶活也能保留80%以上，说明昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的pH稳定性较好。而昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的pH稳定性一般，在pH 5.0～6.0的缓冲液中孵育36 h，残留酶活就降低至50%～60%。
实施例7 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的底物选择性
用pH 5.0的柠檬酸缓冲液配制浓度均为4 mg/mL的凝胶多糖溶液、香菇多糖溶液、酵母聚糖溶液、茯苓多糖溶液、昆布多糖溶液共5种溶液。各溶液各取100μL，加入20μL的酶液，混合均匀，按照实施例5的测定方法测定酶活，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，结果如图6所示，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体对昆布多糖的催化活性最强，对香菇多糖、酵母聚糖、茯苓多糖的催化活性一般，对凝胶多糖几乎无活性，说明昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的底物特异性良好。
实施例8 TLC法鉴定昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的降解产物
（1）分别以昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体、昆布多糖降解酶OUC-ScLam39降解昆布多糖，共设置4组，如下：
实验组1：将实施例4的纯酶液用纯水稀释至0.5 mg/mL，取20μL，与100μL浓度为4mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液）混合，在35℃下反应15 min，得降解产物。
对照组1：将实施例4的纯酶液用纯水稀释至0.5 mg/mL，取20μL，进行灭酶处理（沸水浴10 min），然后与100μL浓度为4 mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液）混合，在35℃下反应15 min。
实验组2：取20μL含昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶液（浓度0.5 mg/mL），与100μL浓度为4 mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 6.0的磷酸盐缓冲液）混合，在35℃下反应15min，得降解产物。
对照组2：取20μL含昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的酶液（浓度0.5 mg/mL），进行灭酶处理（沸水浴10 min），与100μL浓度为4 mg/mL的昆布多糖溶液（溶剂为pH 6.0的磷酸盐缓冲液）混合，在35℃下反应15 min。
（2）采用聚丙烯酰胺凝胶柱层析进行分离和制备，流动相为超纯水，通过TLC检测产物，具体方法如下：展开剂为正丁醇、乙酸和水的混合溶液，正丁醇、乙酸和水的体积比为3:2:2；显色剂为3,5-二羟基甲苯、浓硫酸（质量分数98%）和乙醇的混合溶液，3,5-二羟基甲苯的浓度为2 mg/mL，浓硫酸的浓度为10%（体积百分比）；于90℃条件下加热3 min。以昆布多糖底物、混合标品（混合标品中含有葡萄糖、昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖和昆布五糖）和昆布五糖标品作为参照，对上述4组的降解产物进行TLC分析。
结果如图7所示，昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的降解产物中含有昆布五糖，不含昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖，与昆布多糖降解酶OUC-ScLam39的降解产物一致。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (5)
1.一种昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的编码基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述的昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体在降解昆布多糖中的应用，或在制备昆布寡糖中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述昆布寡糖为昆布五糖。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：具体应用时，将20μL含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶液加入到100μL昆布多糖溶液中，在35℃下反应15 min；其中，含有昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体的酶液的浓度为0.5 mg/mL，昆布多糖溶液的浓度为4 mg/mL，昆布多糖溶液的溶剂为pH 5.0的柠檬酸缓冲液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410199315.7A CN117778354B (zh) | 2024-02-23 | 2024-02-23 | 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410199315.7A CN117778354B (zh) | 2024-02-23 | 2024-02-23 | 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117778354A true CN117778354A (zh) | 2024-03-29 |
| CN117778354B CN117778354B (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90389205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410199315.7A Active CN117778354B (zh) | 2024-02-23 | 2024-02-23 | 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117778354B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106103727A (zh) * | 2014-03-21 | 2016-11-09 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 用产生昆布五糖的β‑1,3‑葡聚糖酶处理酵母细胞壁的方法 |
| CN114196655A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-03-18 | 中国海洋大学 | 耐热性昆布多糖降解酶OUC-SaLam66及其应用 |
| CN114410611A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-04-29 | 中国海洋大学 | 昆布多糖降解酶OUC-BsLam26及其应用 |
-
2024
- 2024-02-23 CN CN202410199315.7A patent/CN117778354B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106103727A (zh) * | 2014-03-21 | 2016-11-09 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 用产生昆布五糖的β‑1,3‑葡聚糖酶处理酵母细胞壁的方法 |
| CN114196655A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-03-18 | 中国海洋大学 | 耐热性昆布多糖降解酶OUC-SaLam66及其应用 |
| CN114410611A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-04-29 | 中国海洋大学 | 昆布多糖降解酶OUC-BsLam26及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BOLORMAA ENKHBAATAR ET AL.: "dentification and Characterization of a Xyloglucan-Specific Family 74 Glycosyl Hydrolase from Streptomyces coelicolor A3(2)", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 78, no. 2, 15 January 2012 (2012-01-15), pages 607 * |
| YI HUANG ET AL.: "Laminarin and Laminarin Oligosaccharides Originating from Brown Algae: Preparation, Biological Activities, and Potential Applications", JOURNAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA, vol. 20, no. 3, 11 May 2021 (2021-05-11), pages 641, XP037450025, DOI: 10.1007/s11802-021-4584-8 * |
| 姚国玉: "链霉菌Streptomyces sp. S27来源的β-1，3-葡聚糖酶和β-甘露糖苷酶的基因克隆与性质研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑, no. 1, 15 January 2010 (2010-01-15), pages 006 - 28 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117778354B (zh) | 2024-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109022408B (zh) | 一种新型褐藻胶裂解酶Aly08及其应用 | |
| CN112725319B (zh) | polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用 | |
| CN114410611B (zh) | 昆布多糖降解酶OUC-BsLam26及其应用 | |
| CN112342232B (zh) | 一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法 | |
| CN110066777A (zh) | 一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用 | |
| CN109988778A (zh) | 一种蔗糖磷酸化酶基因及其应用 | |
| CN113980937A (zh) | λ-卡拉胶酶OUC-G150-L7及其应用 | |
| CN114457057B (zh) | 一种壳聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN114480350A (zh) | 卡拉胶酶在降解κ-卡拉胶和红藻胶中的应用 | |
| CN114774392A (zh) | 一种甘露聚糖酶及其应用 | |
| CN111334488B (zh) | 昆布多糖酶ouc-l1及其编码基因与应用 | |
| CN116622747A (zh) | 一种编码右旋糖酐蔗糖酶的基因及其应用 | |
| CN117778354B (zh) | 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用 | |
| CN113736762B (zh) | 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用 | |
| CN109022404A (zh) | 一种新型冷适应性褐藻胶裂解酶AlgA7及其应用 | |
| CN115820608A (zh) | λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ及其应用 | |
| CN111808836B (zh) | 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用 | |
| CN111471667B (zh) | 壳聚糖酶Csn-PT及其应用 | |
| CN114807094A (zh) | 甲壳素酶SvChiAJ54及其编码基因与应用 | |
| CN109402090B (zh) | 一种魁蚶来源的具有免疫增强活性的β-1，3葡聚糖内切酶及其编码多核苷酸 | |
| CN114196655A (zh) | 耐热性昆布多糖降解酶OUC-SaLam66及其应用 | |
| US20020068349A1 (en) | Gene encoding recombinant trehalose phosphorylase, vector containing the gene, transformant transformed by the gene, and method for producing recombinant trehalose phosphorylase with the use of transformant | |
| CN109055344A (zh) | 一种具有热恢复特性的褐藻胶裂解酶及其应用 | |
| CN115261367B (zh) | 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用 | |
| CN116286712B (zh) | 鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |