CN112342232B - 一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法 - Google Patents

一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex‑YG‑TrMU202001基因工程菌。本发明构建的dex‑YG‑TrMU202001基因工程菌合成的糖苷产物单一，且转化率高，分离纯化简单，同条件下，经产率计算发现，本发明构建的dex‑YG‑TrMU202001基因工程菌能将大部分咖啡酸苯乙酯转化为2G‑咖啡酸苯乙酯，二糖苷产率由原来的24％提高到了84％，且反应液中无原料剩余，二糖苷产物提高了3.46倍。

Description

一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的 构建方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法。
背景技术
多酚类天然化合物种类繁多，化学结构多样、新颖，广泛存在于自然界中，具有抗肿瘤、抗氧化，消炎、抗菌、保护心脑血管等多种重要的生理及药理功能，因此受到广泛关注，但未加修饰的天然产物水溶性差、生物利用度低，限制了其的应用，经研究发现糖基化是改善天然产物水溶性和稳定性，进而调节其生物活性的有效途径。酶促反应具有立体选择性和区域选择性高以及合成步骤数量少，催化效率高，反应条件温和等特点，因此环境更友好，合成更安全，已被证明可以克服大多数化学修饰的缺点，酶促糖基化改善天然产物理化性质，扩大天然产物的应用逐渐成为国内外研究的热点。
右旋糖酐蔗糖酶dextransucrase(EC2.4.1.5)是由白串珠菌属、链球菌属以及乳酸菌属的乳酸菌产生的胞外酶，属于70家族糖苷水解酶(GH70)，可以利用蔗糖为糖基供体，基于不同类型的受体，发生三种不同的反应：1)葡聚糖延伸反应，初期主要通过水解蔗糖，形成葡萄糖单元，以及以蔗糖为受体的寡聚糖，中后期主要以延伸大分子葡聚糖链为主，在果糖浓度高时也会形成明串珠菌二糖；2)以水为受体，将蔗糖水解为果糖和葡萄糖的水解反应；3)以多羟基化合物为受体，对多羟基化合物进行糖基化修饰的受体反应。根据目前已解析出来的GH70三维结构，认为从N端到C端，多肽链构成域依次为V、IV、B、A、C、A、B、IV和V，呈u型排列，催化核心由A、B、C三个结构域构成，与核心结构域相连的是两个额外的区域，即IV和V。在催化区域，-1位点氨基酸对维持催化过程过渡态稳定性至关重要，+1、+2是受体结合部位。
目前右旋糖酐蔗糖酶的受体反应已用于改善多种多羟基化合物的理化性质，其中包括槲皮素、对苯二酚、咖啡酸苯乙酯等，在水溶性及细胞毒性方面都有极大的改善，但由于该酶的三种催化反应同时存在，使得反应产物包含多种糖苷产物，且单一产物含量低。例如李瑶等人利用P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶dextransucrase(EC2.4.1.5)糖基化了咖啡酸苯乙酯，主要得到两种糖基化产物混合物:咖啡酸苯乙酯二糖苷产物(咖啡酸苯乙酯-2G)和单糖苷产物(咖啡酸苯乙酯-G)，但是产量都很低，需严格把控反应时间否则会转化成多糖基化合物，造成了分离纯化过程的繁琐，为获得单一产物，降低成本，适合工业生产，扩大实际应用价值，利用蛋白质工程对受体结合部位氨基酸残基进行理性设计，提高右旋糖酐蔗糖酶转塘基产物的特异性的已成为国际研究热点和解决问题的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其可以解决上述背景技术提出的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌。
优选地，一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，具体包括以下步骤：以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接，引物设计、重组质粒构建和宿主菌转化。
优选地，所述以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接的具体步骤如下，将咖啡酸苯乙酯与P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶蛋白活性位点通过EasyModeller、Discovery Studio、PyMOL软件模拟对接，找到相关氨基酸，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺，进行可行性分析。
优选地，所述引物设计是根据P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因序列和载体pET-28a-(+)的序列，借助SnapGene软件设计突变引物如下：
上游引物：
5’-----GTGTAGATGCAGTCGACCAGGTGGATGCTG-----3’
下游引物：
5’-----CTGGTCGACTGCATCTACACGAATACCATC-----3’。
优选地，所述重组质粒构建是以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，利用所设计引物，通过PCR扩增技术，经DMT消化原始模板，得到重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-TrMU202001。
优选地，所述宿主菌转化是将重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-TrMU202001转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，经过卡那霉素抗性筛选、酶切、菌液PCR和DNA测序验证后，获得适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌。
优选地，一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌，所述的BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，分类命名为适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)，保藏日期为2020年08月10日，保藏编号为CGMCC No.20509。
优选地，一种利用适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌制备适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括以下步骤：将基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001按体积分数0.5％的接种量接种到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培养基中，转速250r/min，在37℃下培养14小时；从上述培养液中吸取2mL加入至200mL的A培养基中，放置于37℃下摇床培养，当富集培养的菌液用蒸馏水稀释10倍后的OD600在0.20～0.24时，即可加入500μL IPTG开始诱导产酶，保持25℃诱导发酵3.5～4小时，将诱导发酵后的菌悬液在0℃下，6000r/min离心12～15min，一支离心管对应一瓶菌悬液，然后加入蒸馏水振荡清洗，再次离心；向每支离心管中加入5～10mL pH值5.4的醋酸-醋酸钙缓冲液震荡摇匀，外加冰水浴，超声破碎5～10min，离心分离，上清液即为适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶，酶活为10～20U/mL。
优选地，每升所述的A培养基中含有5g甘油、5g葡萄糖、10g蛋白胨、10g硝酸钾、17.105g Na2HPO4·12H2O、3g KH2PO4、1g NH4Cl、0.1mM MgSO4·7H2O。
优选地，一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的用途，所述基因工程菌发酵制备得到的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为糖基供体，以多酚天然化合物为糖基受体，特异转移两个葡萄糖，可获得受体二糖苷修饰产物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明构建的dex-YG-TrMU202001基因工程菌合成的糖苷产物单一，且转化率高，分离纯化简单，同条件下，经产率计算发现，本发明构建的dex-YG-TrMU202001基因工程菌能将大部分咖啡酸苯乙酯转化为2G-咖啡酸苯乙酯，二糖苷产率由原来的24％提高到了84％，且反应液中无原料剩余，二糖苷产物提高了3.46倍。
2)适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶在P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶(Genbank No.DQ345760)的基础上，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺，重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌生产的，以蔗糖为糖基供体，以多酚类天然化合物为糖基受体，特异转移两个葡萄糖，获得受体二糖苷修饰产物。以咖啡酸苯乙酯糖基化反应为例，相同条件下反应相同时间，工程菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001表达的右旋糖酐蔗糖酶二糖苷产率(84.5％)较起始酶(24.4％)提高了3.46倍。
3)本发明可以特异生产多酚类天然化合物二糖苷产物，简化了分离纯化步骤，降低了生产成本，为更好的应用于生产提供了一定基础，将代替未修饰的天然产物应用于食品、药品、化妆品行业，扩大其应用。
附图说明
图1是右旋糖酐蔗糖酶根据受体类型不同的三种反应；
图2是以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接是将咖啡酸苯乙酯与P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶蛋白活性位点通过EasyModeller、DiscoveryStudio、PyMOL等软件模拟对接图；
图3是本发明和本发明未改造前的右旋糖酐蔗糖酶在同样条件下二糖苷产物时间进程；
图4是本发明分离纯化出的咖啡酸苯乙酯二糖苷一维碳谱；
图5是本发明分离纯化出的咖啡酸苯乙酯二糖苷hmbc谱；
图6是本发明分离纯化出的咖啡酸苯乙酯二糖苷一维氢谱；
图7是本发明分离纯化出的咖啡酸苯乙酯二糖苷的结构示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌。所述的BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，分类命名为适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)，保藏日期为2020年08月10日，保藏编号为CGMCC No.20509。
所述构建方法具体包括以下步骤：以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接，引物设计、重组质粒构建和宿主菌转化。
所述以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接的具体步骤如下，将咖啡酸苯乙酯与P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶蛋白活性位点通过EasyModeller、Discovery Studio、PyMOL软件模拟对接，找到相关氨基酸，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺，进行可行性分析。
所述引物设计是根据P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因序列和载体pET-28a-(+)的序列，借助SnapGene软件设计突变引物如下：
上游引物：
5’-----GTGTAGATGCAGTCGACCAGGTGGATGCTG-----3’
下游引物：
5’-----CTGGTCGACTGCATCTACACGAATACCATC-----3’。
所述重组质粒构建是以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，利用所设计引物，通过PCR扩增技术，经DMT消化原始模板，得到重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-TrMU202001。
所述宿主菌转化是将重组表达质粒pET-28a-(+)-dex-YG-TrMU202001转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，经过卡那霉素抗性筛选、酶切、菌液PCR和DNA测序验证后，获得适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌。
所述宿主菌转化具体包括以下步骤：
(1)从-70℃冰箱中取200μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自北京全式金生物公司)悬液，置于冰上解冻；
(2)加入制备的重组表达质粒的溶液，每50ul感受态细胞加入约5ul质粒DNA，轻轻摇匀，冰上放置30分钟；
(3)42℃水浴中热激45秒，热激后迅速置于冰上冷却2分钟；
(4)向管中加入500ml灭菌后的LB液体培养基(不含抗生素)混匀后，37℃培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因；
(5)将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置半小时，当菌液完全被培养基吸收后倒置培养基，37℃培养16～24小时；挑选阳性菌落，菌液PCR进行验证后，获得适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌。
实施例2
适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌的表达
将基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001按0.5％的接种量接种到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培养基中，转速250r/min，37℃培养14小时；从上述培养液中吸取2mL加入至200mL的A培养基中，37℃摇床培养，当富集培养的菌液用蒸馏水稀释10倍后的OD600在0.20～0.24时即可加入500μL IPTG开始诱导产酶，25℃诱导发酵3.5～4小时后，进行破碎离心，对所取样品做SDS-PAGE电泳分析，所表达出的重组右旋糖酐蔗糖酶的蛋白分子量约170KDa，与预测值一致。其中，每升所述的A培养基中含有5g甘油、5g葡萄糖、10g蛋白胨、10g硝酸钾、17.105g Na2HPO4·12H2O、3g KH2PO4、1g NH4Cl、0.1mM MgSO4·7H2O。
实施例3
适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌的发酵产酶，具体包括以下步骤：
将基因工程菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001按体积分数0.5％的接种量接种到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培养基中，转速250r/min，在37℃下培养14小时；从上述培养液中吸取2mL加入至200mL的A培养基中，放置于37℃下摇床培养，当富集培养的菌液用蒸馏水稀释10倍后的OD600在0.20～0.24时，即可加入500μL IPTG开始诱导产酶，保持25℃诱导发酵3.5～4小时，将诱导发酵后的菌悬液在0℃下，6000r/min离心12～15min，一支离心管对应一瓶菌悬液，然后加入蒸馏水振荡清洗，再次离心；向每支离心管中加入5～10mL pH值5.4的醋酸-醋酸钙缓冲液震荡摇匀，外加冰水浴，超声破碎5～10min，离心分离，上清液即为适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶，酶活为10～20U/mL。其中，每升所述的A培养基中含有5g甘油、5g葡萄糖、10g蛋白胨、10g硝酸钾、17.105g Na2HPO4·12H2O、3gKH2PO4、1g NH4Cl、0.1mM MgSO4·7H2O。
实施例4
适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶的应用如下：
利用实施例3获得的右旋糖酐蔗糖酶粗酶液对咖啡酸苯乙酯进行糖基化修饰，酶反应体系配制：8mm/l咖啡酸苯乙酯、800mm/l蔗糖、10％DMSO助溶、乙酸乙酸钙缓冲液(PH＝5.4)，2U/ML酶活的反应体系，在25℃、220-250r/min的摇床反应12小时，取出反应液加入等倍无水乙醇，醇沉出右旋糖酐，咖啡酸苯乙酯二糖苷产物溶于上清液中，利用硅胶柱层析分离纯化得到咖啡酸苯乙酯二糖苷，洗脱条件如下，乙酸乙酯：甲醇＝20:1(体积比)洗脱咖啡酸苯乙酯，乙酸乙酯：甲醇＝10:1(体积比)洗脱咖啡酸苯乙酯单糖酐产物，乙酸乙酯：甲醇＝5:1(体积比)洗脱咖啡酸苯乙酯-2G咖啡酸苯乙酯二糖酐产物。将纯化产物用紫外液相检测，检测条件为：C18柱，紫外检测器，流动相乙腈：水＝50:50(体积比)，流速1ml/min，一维氢谱、一维碳谱和hmbc谱解析确认二糖苷结构。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺后重组转化到 BL21（DE3）大肠杆菌中获得的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌 BL21（DE3）/dex-YG-TrMU202001基因工程菌，野生型右旋糖酐蔗糖酶的基因序列号为Genbank No. DQ345760。
2.根据权利要求1所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接，引物设计、重组质粒构建和宿主菌转化。
3.根据权利要求2所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接的具体步骤如下，将咖啡酸苯乙酯与P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶蛋白活性位点通过EasyModeller、Discovery Studio、PyMOL软件模拟对接，找到相关氨基酸，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺，进行可行性分析。
4.根据权利要求3所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述引物设计是根据P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因序列和载体 pET-28a-(+)的序列，借助SnapGene软件设计突变引物如下：
上游引物：
5’ -----GTGTAGATGCAGTCGACCAGGTGGATGCTG -----3’
下游引物：
5’ -----CTGGTCGACTGCATCTACACGAATACCATC -----3’。
5.根据权利要求4所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述重组质粒构建是以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，利用所设计引物，通过 PCR 扩增技术，经DMT消化原始模板，得到重组表达质粒 pET-28a-(+)-dex-YG-TrMU202001。
6.根据权利要求5所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述宿主菌转化是将重组表达质粒pET-28a+dex-YG-TrMU202001转化到大肠杆菌感受态细胞 BL21（DE3）中，经过卡那霉素抗性筛选、酶切、菌液 PCR 和 DNA测序验证后，获得适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌 BL21（DE3）/dex-YG-TrMU202001基因工程菌。
7.一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌，其特征在于：权利要求1中所述的 BL21（DE3）/dex-YG-TrMU202001 基因工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21（DE3）（Escherichia coli），保藏日期为2020年08月10日，保藏编号为CGMCCNo.20509。
8.一种利用权利要求7所述的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌制备适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：将基因工程菌BL21（DE3）/dex-YG-TrMU202001按体积分数0.5%的接种量接种到含有40～60μg/ml卡那霉素的LB培养基中，转速250 r/min，在37℃下培养 14小时；从上述培养液中吸取2mL加入至200mL的A培养基中，每升所述的A培养基中含有5g甘油、5g葡萄糖、10g蛋白胨、10g硝酸钾、17.105g Na2HPO4·12H2O、3g KH2PO4、1g NH4Cl、0.1mM MgSO4·7H2O放置于37℃下摇床培养，当富集培养的菌液用蒸馏水稀释10倍后的OD600在0.20～0.24时，即可加入500μLIPTG 开始诱导产酶，保持25℃诱导发酵3.5～4小时，将诱导发酵后的菌悬液在0℃下，6000r/min离心12～15min，一支离心管对应一瓶菌悬液，然后加入蒸馏水振荡清洗，再次离心；向每支离心管中加入5～10 mL pH 值5.4的醋酸-醋酸钙缓冲液震荡摇匀，外加冰水浴，超声破碎5～10min，离心分离，上清液即为适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶，酶活为10～20 U/mL。
9.根据权利要求7所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的用途，其特征在于：所述基因工程菌发酵制备得到的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为糖基供体，以多酚天然化合物为糖基受体，特异转移两个葡萄糖，可获得受体二糖苷修饰产物。
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