CN116200318A - 一种胞外分泌表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents

一种胞外分泌表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胞外分泌表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌为宿主，以质粒pST为表达载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶。本发明通过构建D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的枯草芽孢杆菌分泌表达系统，胞外酶活达130.74U/mL，不仅实现D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的胞外分泌表达，且酶活高于现有报道的绝大多数D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶。

Description

一种胞外分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢 杆菌
技术领域
本发明涉及一种胞外分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位上的差向异构体，属于稀有糖，其甜度是蔗糖的70％，但是能量值只有其0.3％。D-阿洛酮糖具有高溶解度、高甜度、低热量和低血糖反应等优良特性，因此被视为理想的蔗糖取代物。D-阿洛酮糖的吸收率远低于其他甜味剂，还可以抑制D-果糖和D-葡萄糖的吸收。其安全性于2011年得到美国食品药品监督管理局的正式认证，可应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中，具有广阔的开发应用前景。
然而，D-阿洛酮糖在自然界中存在量极其稀少，难以提纯获得。而化学法合成困难，且存在一些弊端，例如复杂的纯化过程、化学废弃物污染、生成副产物且价格昂贵等。生物转化法具有选择性好、反应条件温和的优点，且合成速度快、反应专一性强、对环境友好、产物纯化过程简单、底物廉价易得，因此D-阿洛酮糖的生物合成法成为了研究的热点。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase，简称DPE酶，EC5.1.3.30)是制备阿洛酮糖的关键酶，可催化果糖在C-3位置上发生差向异构化反应。该反应是一个可逆的平衡反应，目前国内外报道关于催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的转化率在30％左右。自2005年首次发现了来源于Agrobacterium tumefacien的DPE酶，此后不同来源的DPE酶在异源宿主中得到表达，且以重组大肠杆菌表达系统的研究居多。大肠杆菌表达系统在工业应用上存在低表达量、内毒素、形成包涵体以及目的蛋白质错误折叠等诸多问题。此外，生物合成法制备D-阿洛酮糖通常是用游离酶液转化得到，但是现有报道的不同来源DPE酶几乎都在胞内表达，粗酶的制备必须经过细胞破碎后离心获得，过程繁琐且大幅增加了生产成本。为促进DPE酶在食品工业中的应用，进一步扩大D-阿洛酮糖的规模化生产，有必要建立更安全高效的表达体系，并实现DPE酶的高效分泌表达，以适应工业化生产的需求。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种胞外分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，将DPE酶通过质粒pST整合至枯草芽孢杆菌中，建立了更安全的食品级表达体系，不仅实现了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的胞外分泌表达，且胞外酶活(130.74U/mL)高于现有报道的绝大多数D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
本发明的第一个目的是提供一种胞外分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌为宿主，以质粒pST为表达载体，表达氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
进一步地，编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
进一步地，所述质粒pST的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述宿主为枯草芽孢杆菌WB600。
进一步地，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法为：通过同源重组将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因与表达载体pST连接，构建重组质粒pST/dpe，随后将其转化至枯草芽孢杆菌中。
本发明的第二个目的是提供一种生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，包括应用上述重组枯草芽孢杆菌进行发酵的步骤，主要地，通过上述重组枯草芽孢杆菌进行胞外分泌表达。
进一步地，所述的发酵为，将所述重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
进一步地，所述种子培养基的组成为：酵母粉2-8g/L，胰蛋白胨5-15g/L，NaCl 5-15g/L，pH 6.5-7.5。
进一步地，所述发酵培养基的组成为：玉米淀粉5-10g/L，酵母粉25-35g/L，K2HPO415-20g/L，KH2PO4 1-3g/L，pH 7-8。
进一步地，所述活化培养或发酵培养的条件为25-37℃、180-280r/min。优选地，在37℃下培养84-96h。
本发明的第三个目的是提供一种生产D-阿洛酮糖的方法，以上述重组枯草芽孢杆菌为全细胞催化剂或以该重组菌的胞外酶液为催化剂，催化底物生成D-阿洛酮糖。
进一步地，以D-果糖为底物，促进D-果糖转化生成D-阿洛酮糖这一功能性稀有糖，所得D-阿洛酮糖可直接用于食品、药品等生产。
进一步地，催化剂可为重组枯草芽孢杆菌发酵生产得到的粗酶液或经分离纯化后得到的纯酶。
本发明的有益效果：
本发明通过构建D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌表达系统，并对基因工程菌的摇瓶发酵温度及时间进行优化，得到的胞外酶酶活达130.74U/mL。本发明实现了D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达，根本上解决胞内表达存在的细胞破碎问题，简化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备过程，有利于打破国外垄断，提高我国D-阿洛酮糖生产水平，降低应用成本，并对D-果糖的综合高效利用具有重要意义。
附图说明
图1为D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组质粒的构建流程；其中，F1、F2为目的基因扩增引物，短线表示同源臂；
图2为发酵温度和时间对D-阿洛酮糖3-差向异构酶摇瓶发酵的影响；其中，(a)为胞外酶活；(b)为胞外粗酶的SDS-PAGE分析；
图3为应用重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶制备产物时的HPAEC-PAD分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
涉及的检测方法：
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶活测定方法如下：将200μL酶液加入到800μL含有果糖的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.5，0.1mM Co2+)中，使得果糖终浓度为80g/L，反应总体积为1mL。振荡混匀后置于60℃水浴锅中反应10min，随后转移至沸水中灭酶10min，以终止反应；其中，用等量的Tris-HCl缓冲液替换酶液，作为空白对照。待灭酶处理后，将反应液在10000rpm条件下离心10min，取上清液过0.22μm的水系膜去除杂质后，即可用高效阴离子交换色谱分析反应液中D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度。
酶活单位定义：在标准酶反应条件下，单位时间内酶催化D-果糖生成1μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量为一个酶活单位。
利用高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析产物中D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度。分析条件为：采用CarboPac PA200色谱柱，以0.25M NaOH、1M NaAc和超纯水为流动相，其中分离流动相为30mM NaOH，设置流速为0.5mL/min，柱温35℃，进样量10μL。
涉及的序列：
D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如下：
MKHGIYYAYWEKQWQADYIPYIEKAAQLGFDILEIAASPLPFYSEQQ
MKDIKACAEANGITLTCGHGPSPDQNLASSDPAVRAHAKSFFTDLLSRLEK
MDIHVIGGGIYSYWPVDYSMPIDKPGDWARSVEGVAEMAKVAESCGVDY
CLEVLNRFEGYLLNTAEEAVQFVQEVNHPRVKIMLDTFHMNIEEDSIGGAI
RRAGQHLGHFHTGECNRRVPGRGRTPWREIGEALRDIGYTGAVVMEPFVR
MGGQVGSDIKIWREMNPGADDAQLDLDAKNAVTFQRYMLD
编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因的核苷酸序列如下：
ATGAAACATGGCATTTATTATGCATATTGGGAAAAACAATGGCAAGCAGATTATATTCCGTATATTGAAAAAGCAGCACAACTGGGCTTTGATATTCTGGAAATTGCAGCATCACCGCTGCCGTTTTATTCAGAACAACAAATGAAAGATATTAAAGCATGCGCAGAAGCAAATGGCATTACACTGACATGCGGCCATGGCCCGTCACCGGATCAAAATCTGGCATCATCAGATCCGGCAGTTAGAGCACATGCAAAATCATTTTTTACAGATCTGCTGTCAAGACTGGAAAAAATGGATATTCATGTTATTGGCGGAGGCATTTATTCATATTGGCCGGTTGATTATTCAATGCCGATTGATAAACCGGGCGATTGGGCAAGATCAGTTGAAGGCGTTGCAGAAATGGCAAAAGTTGCAGAATCATGCGGCGTTGATTATTGCCTGGAAGTTCTGAATAGATTTGAAGGCTATCTGCTGAATACAGCAGAAGAAGCAGTTCAATTTGTTCAAGAAGTTAATCATCCGAGAGTTAAAATTATGCTGGATACATTTCATATGAATATTGAAGAAGATTCAATTGGCGGCGCAATTAGAAGAGCGGGCCAACATCTGGGCCATTTTCATACGGGCGAATGCAATAGAAGAGTTCCGGGCAGAGGCAGAACACCGTGGAGAGAAATTGGCGAAGCACTGAGAGATATTGGCTATACGGGCGCAGTTGTTATGGAACCGTTTGTTAGAATGGGCGGCCAAGTTGGCTCAGATATTAAAATTTGGAGAGAAATGAATCCGGGCGCAGATGATGCACAACTGGATCTGGATGCAAAAAATGCAGTTACATTTCAAAGATATATGCTGGATTAA
pST质粒的核苷酸序列如下：
TCCGGCGACAGGGACAAGCCTGGAATTCAAACGATTACATAGGAG
GTATAACGGCGTGAGGGATAGGCGGCTACATTCATCGGGAAAGGCGAC
TATATGACGTCCGTTCCGTAAGCAACCGCTCATCGCTCCGTTCAAACCG
CCACAGGCTGATCTTCAGCCAAAAAAGAGGGGACCTTTCCCCTCTTTTT
TATTTTCCGTTGGGGATCCGGTGATTGATTGAGCAAGCTTCGGGACCCC
TATCTAGCGAACTTTTAGAAAAGATATAAAACATCAGAGTATGGACAG
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AATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCA
AAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACC
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TCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTC
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TCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCG
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TTGTAAATTCTATATGTGATAATAAATGTAATATAAGGGAAATTAGTGG
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AATCATGTTAGATTACATTAAACCTGTAGACTTTAATAAAAATAGACCA
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TAGTAAAGAGGTGTAATTTCGTAACTGCCATTGAAATAGACCATAAAT
TATGCAAAACTACAGAAAATAAACTTGTTGATCACGATAATTTCCAAG
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TAAAATATATGGTAATATACCTTATAACATAAGTACGGATATAATACG
CAAAATTGTTTTTGATAGTATAGCTAATGAGATTTATTTAATCGTGGAA
TACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTGGCATTAC
TTTTAATGGCAGAAGTTGATATTTCTATATTAAGTATGGTTCCAAGAGA
ATATTTTCATCCTAAACCTAAAGTGAATAGCTCACTTATCAGATTAAGT
AGAAAAAAATCAAGAATATCACACAAAGATAAACAAAAGTATAATTA
TTTCGTTATGAAATGGGTTAACAAAGAATACAAGAAAATATTTACAAA
AAATCAATTTAACAATTCCTTAAAACATGCAGGAATTGACGATTTAAA
CAATATTAGCTTTGAACAATTCTTATCTCTTTTCAATAGCTATAAATTAT
TTAATAAGTAAGTTAAGGGATGCATAAACTGCATCCCTTAACTTGTTTT
TCGTGTGCCTATTTTTTGTGAATCGAATTCGGTCCTCGGGATATGATAA
GATTAATAGTTTTAGCTATTAATCTTTTTTTATTTTTATTTAAGAATGGC
TTAATAAAGCGGTTACTTTGGATTTTTGTGAGCTTGGACTAGAAAAAAA
CTTCACAAAATGCTATACTAGGTAGGTAAAAAAATATTCGGAGGAATT
TTGAAATGGCAATCGTTTCAGCAGAAAAATTCGTAATTCGAGCTCGCCC
GTACCCGGGGA
实施例1枯草芽孢杆菌分泌表达系统的构建
表达载体pST/dpe的构建过程如图1所示。首先根据D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因设计相应的扩增引物：
上游引物：
5’-TTCAGCCCTGCCCAGGCCAAACATGGCATTTATTATGCATATTG GGAAAAACAAT-3’；
下游引物：
5’-CGCCTATCCCTCACGCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAT-3’。
利用上述引物以含SEQ ID NO.2所示基因的合成质粒为模板，克隆出两端含有同源臂的目的基因。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的PCR体系为：
Figure BDA0003983755120000101
Max Master Mix 25μL，正向引物(10μM)2μL，反向引物(10μM)2μL，模板DNA1μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：98℃预变性3min；再进行30个循环(98℃10s，60℃15s，68℃1min)；最后68℃保温10min。
根据pST质粒的基因设计相应的扩增引物：
上游引物：5’-TAAGGCGTGAGGGATAGGC-3’；
下游引物：5’-GGCCTGGGCAGGGCTGAAAAG-3’。
利用上述引物以pST质粒(SEQ ID NO.3)为模板，经PCR扩增得到线性化pST载体。PCR扩增条件以98℃10s，60℃15s，68℃6min为一个循环。将PCR扩增出的含有同源臂的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因与线性pST载体进行同源重组。重组反应体系为：载体0.03pmol，目的基因0.06pmol，5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，加入双蒸水至20μL。37℃反应30min，得到表达载体pST/dpe。之后转化至Escherichia coli JM109中，涂布具有氨苄青霉素的LB平板，挑取转化子进行测序、菌落PCR验证，提取得到含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的重组质粒。将重组质粒转入表达宿主Bacillus subtilis WB600中，得到重组基因工程菌B.subtilis WB600(pST/dpe)。
实施例2重组D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的发酵生产
LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
TB培养基：玉米淀粉6g/L，酵母粉30g/L，K2HPO4 16.432g/L，KH2PO42.314g/L，pH7.5。
(1)宿主菌活化培养：将实施例1中得到的含有表达载体质粒pST/dpe的B.subtilis WB600在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中。接种前添加终浓度为5μg/mL卡那霉素。锥形瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养12h。
(2)发酵培养：将活化后的种子液以4％(v/v)的接种量转接至装有50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在分别于25、30、37℃摇床中振荡培养12～96h(转速为200r/min)，接种前添加终浓度为5μg/mL卡那霉素。结束发酵后，将发酵液于4℃、10,000×g条件下离心15min，收集上清液即得到粗酶液。测定粗酶液的酶活力，结果如图2所示，随着发酵时间的延长，胞外酶活逐渐提高。且37℃下菌体生长更快，胞外酶活更高。在37℃、200r/min条件下振荡培养96h后胞外酶活可达130.74U/mL。
实施例3重组D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的分离纯化
用5个柱体积的Binding buffer(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH 7.5)平衡镍柱；发酵粗酶液采用0.45μm水系膜进行过膜处理后，开始上样，流速为2mL/min；继续用Bindingbuffer重新平衡后，先用Wash buffer(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,20mM咪唑,pH 7.5)洗去部分杂蛋白，随后用Elution buffer(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,500mM咪唑,pH 7.5)洗下目的蛋白。收集的目的蛋白利用透析液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)在4℃下透析24h，随后通过SDS-PAGE蛋白电泳及酶活测定的方式进行鉴定。据报道，重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶的计算分子量为32.3kDa，与SDS-PAGE估算分子量相符。
实施例4重组D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用生产
利用重组D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行D-阿洛酮糖的生产制备，其反应过程如下：首先将含有300g/L D-果糖的底物溶液(50mM Tris-HCl，pH 6.5，0.1mM Co2+)置于60℃水浴摇床中预热15min，随后加入1μM纯酶，在60℃水浴摇床中反应3h，随后转移至沸水中灭酶30min，以终止反应；其中，用等量的Tris-HCl缓冲液替换酶液，作为空白对照。待灭酶处理后，将反应液在10000rpm条件下离心10min，取上清液过0.22μm的水系膜去除杂质后，即可用HPAEC-PAD分析反应液中D-果糖和D-阿洛酮糖的浓度。色谱分析结果如图3所示，计算得到转化率可达33％。
对比例
具体实施方式同实施例1-3，区别在于，将来源于Clostridia bacterium的基因替换为其他来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，或替换不同宿主及表达载体。按照实施例1-2相同的策略方法构建重组基因工程菌，相同条件培养得到酶液，对其活力进行测定，并按照实施例3相同的策略方法获得纯酶应用于D-阿洛酮糖生产，结果如表1所示。由表中数据可知，大部分D-阿洛糖糖3-差向异构酶在胞内表达，胞外活力为0。SEQ ID NO.1所示氨基酸序列表达的D-阿洛糖糖3-差向异构酶不仅实现了胞外分泌，且胞外活力高于现有报道的水平，同时D-阿洛酮糖的转化率也高于现有水平，因此具有十分广阔的应用潜力。
表1不同来源D-阿洛酮糖3-差向异构酶
Figure BDA0003983755120000121
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Figure BDA0003983755120000131
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种胞外分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：以枯草芽孢杆菌为宿主，以质粒pST为表达载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述质粒pST的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法包括以下步骤：通过同源重组将编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因与表达载体pST连接，将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌中，得到所述重组枯草芽孢杆菌。
4.一种生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于：包括应用权利要求1-3任一项所述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的发酵为，将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述种子培养基的组成为：酵母粉2-8g/L，胰蛋白胨5-15g/L，NaCl 5-15g/L，pH 6.5-7.5。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：玉米淀粉5-10g/L，酵母粉25-35g/L，K2HPO4 15-20g/L，KH2PO4 1-3g/L，pH 7-8。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在25-37℃、180-280r/min条件下进行培养。
9.一种生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：以权利要求1-3任一项所述的重组枯草芽孢杆菌为全细胞催化剂或以所述重组枯草芽孢杆菌的胞外酶液为催化剂，催化底物生成D-阿洛酮糖。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：以D-果糖为底物。
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