CN113481177B

CN113481177B - 一种胞外分泌能力增强的淀粉分支酶突变体

Info

Publication number: CN113481177B
Application number: CN202110887864.XA
Authority: CN
Inventors: 李兆丰; 何萌; 李才明; 顾正彪; 班宵逢; 程力; 洪雁
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113481177A

Abstract

本发明公开了一种胞外分泌能力增强的淀粉分支酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供了一种淀粉分支酶突变体，所述淀粉分支酶突变体是将来源于海洋红嗜热盐菌来源的淀粉分支酶的第3位、第4位同时突变，或第3位、第4位、第10位和第11位同时得到的。本发明的方法安全、高效，其制备得到的含有淀粉分支酶突变体W3K/L4K/R10K/R11K、W3R/L4R的粗酶液活力与原始酶相比分别提高了1.29倍、1.68倍；并且采用本发明的方法获得的重组酶是胞外酶，有利于后期大规模生产的提取纯化，在工业中能够得到广泛的应用。

Description

一种胞外分泌能力增强的淀粉分支酶突变体

技术领域

本发明涉及一种胞外分泌能力增强的淀粉分支酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme；GBE；EC 2.4.1.18)作为一种与淀粉生物合成直接相关的重要糖基转移酶，其具有调控淀粉分子内α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键含量的独特性能，可显著增强淀粉稳定性、抗老化性及慢消化性能，在生物酶法改性淀粉中有着巨大的应用潜力。目前，国内外已经把开发高支化淀粉生产所必需的微生物来源淀粉分支酶作为了非常重要的研究主题，并取得了一定的进展，这些研究主要集中于淀粉分支酶的异源表达与改性应用方面。而随着改性淀粉在食品、医药等工业中的需求越来越大，对淀粉分支酶的产量与安全性方面的要求也会不断提高，由于天然菌株存在胞内表达、产酶能力低等问题，现如今大多采用基因工程技术，实现其异源表达。

尽管近年来的研究结果显示，淀粉分支酶在基因工程菌尤其是大肠杆菌中成功实现了异源表达，但现有报道的大多数淀粉分支酶产量仍然较低，对其酶活提高方面的研究大多基于培养条件的优化，涉及其表达体系及策略的优化较少且缺乏针对性，极大地限制了重组淀粉分支酶的工业化应用。

因此，将具有优良特性的淀粉分支酶进行有效表达，并探索出一种更具针对性的高效表达策略，成为了现如今的一个重要发展趋势，开发高安全性、高酶活、高产量的淀粉分支酶对于进一步促进淀粉分支酶的工业化应用也显得尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术中存在的淀粉分支酶的胞外分泌能力差等问题，本发明通过对来源于海洋红嗜热盐菌Rhodothermus obamensis STB05编码的淀粉分支酶进行突变得到胞外表达量显著提高的突变体W3K/L4K/R10K/R11K、W3R/L4R，其胞外酶活分别提高了1.29倍、1.68倍，进一步促进了淀粉分支酶在大肠杆菌表达系统及食品级枯草芽孢杆菌表达系统中的高效表达。

本发明提供了一种淀粉分支酶突变体，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第3位和第4位同时突变得到的；

或所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第3位、第4位、第10位和第11位同时突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶为来源于海洋红嗜热盐菌Rhodothermus obamensis STB05的淀粉分支酶，所述淀粉分支酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的淀粉分支酶的第3位的色氨酸突变为精氨酸，并将第4位的亮氨酸突变为精氨酸得到的，命名为W3R/L4R，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

或者，所述淀粉分支酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第3位的色氨酸突变为赖氨酸，并将第4位的亮氨酸突变为赖氨酸，并将第10位的精氨酸突变为赖氨酸，并将第11位的精氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为W3K/L4K/R10K/R11K，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种编码上述突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体以pST载体为表达载体，所述pST表达载体公开于“直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及其酶学性质与产物合成研究，潘思惠，江南大学”中。

本发明还提供了携带上述基因，或上述载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为宿主细胞。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为宿主，表达了上述淀粉分支酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，以Bacillus subtilis WB600或E.coli BL21(DE3)为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以pST为表达载体。

本发明还提供了一种改性麦芽糊精的方法，所述方法为，将上述淀粉分支酶突变体，或上述重组细胞添加至含有麦芽糊精的反应体系中，对麦芽糊精进行改性。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体的添加量为：75～125U/g底物。

在本发明的一种实施方式中，对麦芽糊精进行改性的反应条件为：在50～65℃条件下，反应12～24h。

本发明还提供了一种合成支链淀粉的方法，其特征在于，将上述淀粉分支酶突变体，或上述重组细胞添加至含有直链淀粉的反应体系中，反应制备得到支链程度提高的淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述直链淀粉为0.1％(w/v)马铃薯直链淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体的添加量为：0.1mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述反应条件为：50～65℃反应1～2h。

本发明还提供了一种提高淀粉分支酶胞外分泌能力的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第3位的色氨酸突变为精氨酸，并将第4位的亮氨酸突变为精氨酸；

或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第3位的色氨酸突变为赖氨酸，并将第4位的亮氨酸突变为赖氨酸，并将第10位的精氨酸突变为赖氨酸，并将第11位的精氨酸突变为赖氨酸。

本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞在制备含有改性麦芽糊精的产品或含有支链淀粉的产品中的应用。

有益效果

(1)本发明通过将来源于海洋红嗜热盐菌Rhodothermus obamensis STB05的淀粉分支酶的第3位、第4位、第10位和第11位的氨基酸突变成赖氨酸或精氨酸，显著提高了海洋红嗜热盐菌来源淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌及大肠杆菌中的胞外表达水平，本发明的方法安全、高效，其制备得到的含有淀粉分支酶突变体W3K/L4K/R10K/R11K、W3R/L4R的粗酶液活力与原始酶相比分别提高了1.29倍、1.68倍；并且采用本发明的方法获得的重组酶是胞外酶，有利于后期大规模生产的提取纯化，产品符合食品要求。

(2)本发明促进了淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌中的胞外分泌表达，且表达水平较高，这在一定程度上创新了淀粉分支酶在食品级枯草芽孢杆菌表达系统中的现有表达水平，可进一步促进淀粉分支酶在食品工业中的生产应用。

附图说明

图1：野生型和突变体粗酶液的SDS-PAGE电泳分析，其中M为Marker。

图2：野生型和突变体发酵全过程的酶活曲线。

图3：野生型和突变体纯酶的碘结合曲线。

图4：野生型和突变体粗酶的碘结合曲线。

图5：野生型和突变体改性的麦芽糊精溶液置于室温储存30天后的效果图。

具体实施方式

本发明选用的载体pST公开于“直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及其酶学性质与产物合成研究，潘思惠，江南大学”中。

下述实施例中所涉及的麦芽糊精(DE 7-9，水分含量3.6％)购自山东保龄宝生物技术有限公司。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

LB固体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH 7.0。

TB培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，KH₂PO₄ 2.32g/L，K₂HPO₄˙3H₂O 16.43g/L，甘油5g/L，pH 7.0。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

淀粉分支酶的酶活的检测：

用50mM PBS缓冲液(pH 7.5)配制0.25％(w/v)马铃薯支链淀粉，向5mL离心管中加入900μL底物，于65℃下保温5min，然后加入100μL酶液，在65℃下反应15min。反应结束后用沸水浴灭酶20min，取300μL反应液于10mL离心管中，加入5.0mL碘液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I₂，pH 6.0)振荡混匀，显色15min后在530nm下测定吸光值。整个过程均以灭活的酶作为空白对照。

酶活(U/mL)定义：在上述条件下，吸光值每分钟降低1％为一个酶活单位(U)。

淀粉分支酶的比活是指，在特定条件下，单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数，利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，因此通过酶活与蛋白浓度计算出比酶活。

直链淀粉-碘复合物吸收光谱的测定方法

用50mM PBS缓冲液(pH 7.5)配制0.1％(w/v)马铃薯直链淀粉，向5mL离心管中加入990μL底物，于50～65℃下保温5min，然后加入10～12U/mL Ro-GBE野生型或突变体粗酶液，在50～65℃下反应1～2h。反应结束后用沸水浴灭酶30min，取300μL反应液于10mL离心管中，加入5.0mL碘液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I₂，pH 6.0)振荡混匀，显色15min后使用扫描光谱(500～800nm)测定淀粉反应物的吸收光谱和最大吸收波长(λ_max)。

实施例1：淀粉分支酶突变体基因序列的制备

具体步骤如下：

(1)重组质粒pST/gbe的构建

将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的淀粉分支酶基因连接到载体pST上，得到重组质粒pST/gbe，具体构建过程参见文献“直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及其酶学性质与产物合成研究，潘思惠，江南大学”论文的的第10页第2.2.2小节。

(2)含有突变体的重组质粒的构建

以表达载体pST/gbe为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照TaKaRa公司STAR Primer GXL试剂盒说明书所示方法进行定点突变，分别制备得到pST-W3K/L4K/R10K/R11K、pST-W3R/L4R、pST-W3V/L4V/R10V/R11V。

PCR体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTAR GXL DNAPolymerase(1.25U/μL)1μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：98℃预变性3min；再进行30个循环(98℃10s，60℃15s，68℃2.5min)；最后68℃保温10min。

表1淀粉分支酶突变位点的引入

注：¹下划线碱基对应于相应突变氨基酸。

实施例2：基因工程菌的构建

具体步骤如下：

(1)分别在37℃下，用DpnI过夜处理实施例1中得到的PCR产物(即含有突变体的重组质粒)及重组质粒pST/gbe，随后分别将处理好的PCR产物及重组质粒pST/gbe转化到E.coli JM109中，分别得到转化子，分别将转化子菌液涂布到含有10μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，在37℃恒温箱中过夜培养12h，从中分别挑选出单菌落；

(2)将步骤(1)得到的单菌落分别接种到含有10μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下、200r/min培养12h，并按照质粒提取试剂盒说明书所示方法提取质粒进行测序。

(3)随后将构建成功的重组质粒通过化学转化法转入表达宿主Bacillussubtilis WB600感受态细胞中，最终分别得到基因工程菌B.subtilis WB600/pST-gbe、B.subtilis WB600/pST-W3K/L4K/R10K/R11K、B.subtilis WB600/pST-W3R/L4R、B.subtilis WB600/pST-W3V/L4V/R10V/R11V。

按照上述(1)～(3)的步骤，分别制备得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pST-gbe、E.coli BL21(DE3)/pST-W3K/L4K/R10K/R11K、E.coli BL21(DE3)/pST-W3R/L4R、E.coli BL21(DE3)/pST-W3V/L4V/R10V/R11V。

实施例3：淀粉分支酶突变体的表达

具体步骤如下：

(1)重组菌的培养：

分别将实施例2中得到的重组菌株B.subtilis WB600/pST-gbe、B.subtilisWB600/pST-W3K/L4K/R10K/R11K、B.subtilis WB600/pST-W3R/L4R、B.subtilis WB600/pST-W3V/L4V/R10V/R11V，及基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pST-gbe、E.coli BL21(DE3)/pST-W3K/L4K/R10K/R11K、E.coli BL21(DE3)/pST-W3R/L4R、E.coli BL21(DE3)/pST-W3V/L4V/R10V/R11V在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养12h，随后分别挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，接种前添加10μg/mL卡那霉素，将锥形瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养8～12h，分别制备得到种子液。

(2)发酵培养：

分别将步骤(1)制备得到的种子液以4％(v/v)的接种量转接至装有50mL TB培养基(添加10μg/mL卡那霉素)的250mL锥形瓶中，在37℃摇床中振荡培养60～90h，转速为200r/min。

枯草表达系统：

结束发酵后，分别将发酵液于4℃、10,000rpm条件下离心20min，收集上清液，即分别得到含有野生型gbe的粗酶液、含有突变体W3K/L4K/R10K/R11K的粗酶液、含有突变体W3R/L4R的粗酶液、含有突变体W3V/L4V/R10V/R11V的粗酶液；分别对粗酶液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示，结果显示，淀粉分支酶野生型和突变体均得到了表达，并且，从图1中野生型及突变体粗酶液的SDS-PAGE电泳结果可以看出，突变体的胞外表达量得到了相应提高。

大肠表达系统：

结束发酵后，分别将发酵液于4℃、10,000rpm条件下离心20min，收集上清液，即分别得到含有野生型gbe的粗酶液、含有突变体W3K/L4K/R10K/R11K的粗酶液、含有突变体W3R/L4R的粗酶液、含有突变体W3V/L4V/R10V/R11V的粗酶液；分别对粗酶液进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示，淀粉分支酶野生型和突变体均得到了表达。

实施例4：淀粉分支酶突变体表达水平的测定

由于大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌的表达系统均能够实现突变体和原始酶的表达，本申请以枯草芽孢杆菌表达系统为例，但大肠杆菌表达系统同样也可以达到本申请的技术效果。

(1)淀粉分支酶活力的测定：

分别检测实施例3制备得到淀粉分支酶野生型和突变体粗酶液的酶活，结果如表2所示：

表2野生型和突变体粗酶液的活力

注：¹每个值为3次平行实验的平均值

淀粉分支酶突变体的粗酶液活力如表2所示，相较于野生型而言，突变体W3K/L4K/R10K/R11K、W3R/L4R的胞外酶活分别提高了1.29倍、1.68倍。

(2)淀粉分支酶发酵全过程的酶活曲线测定方法：

在利用基因工程菌发酵生产淀粉分支酶过程中，每隔12h取样，测定其活力，根据时间和对应活力绘制曲线，即得到该酶在发酵全过程中的活力变化趋势。

淀粉分支酶突变体在发酵全过程中的酶活曲线如图2所示，从图中可以看出，两种突变体的胞外分泌水平均显著高于野生型，说明这两种突变体均具有可替代野生型进行应用以减少加酶量、降低成本的潜力，因突变可能会造成其他性质的改变或下降，故有必要进一步探究这两种突变体的应用价值。

(3)分别将实施例3制备得到的含有野生型gbe的粗酶液、含有突变体W3K/L4K/R10K/R11K的粗酶液、含有突变体W3R/L4R的粗酶液、含有突变体W3V/L4V/R10V/R11V的粗酶液进行纯化，步骤为：

将实施例3中得到的发酵粗酶液通过0.45μm水系膜过滤，并使用5-mL HiTrapPhenyl HP柱进行一步疏水纯化。用5-10倍柱体积的50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液平衡疏水柱，并保持流速恒定，上样60mL后，先用50mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液平衡疏水柱，再用超纯水以1.5mL/min的流速洗脱柱上的目的蛋白，然后通过测定活力及SDS-PAGE蛋白电泳的方式进行鉴定。

淀粉分支酶蛋白浓度的测定方法：使用上海碧云天的Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)，按照说明书测定蛋白质浓度，该试剂盒采用Bradford方法。使用牛血清白蛋白绘制标准曲线；野生型和突变体纯酶的蛋白浓度如表3所示。

表3野生型和突变体纯酶的蛋白浓度

(4)淀粉分支酶比酶活的测定方法：以牛血清蛋白作为标品绘制标准曲线，通过Bradford方法测定了淀粉分支酶野生型和突变体的蛋白浓度。

淀粉分支酶突变体的比酶活力如表4所示，其比酶活力与野生型并无显著性差异，说明该突变并未影响到淀粉分支酶的催化特性，突变体仍然保持野生型的催化转苷能力。

表4野生型和突变体纯酶的比酶活力

其中，a代表无显著性差异。

实施例5：淀粉分支酶突变体的应用

由于直链淀粉可以结合碘分子形成蓝色的聚合物，在660nm处左右存在最大吸收波长(λ_max)，而当Ro-GBE作用淀粉后，能够缩短淀粉分子链长度，减弱碘分子结合力，降低吸光值，同时α-1,6-分支点的增加使得支链增多，会造成λ_max向支链淀粉-碘复合物的最大吸收波长530nm处偏移。因此，采用淀粉-碘复合物全波长光谱图能够反映直链淀粉经Ro-GBE作用后的结构变化。

具体步骤如下：

1、相同蛋白浓度的淀粉分支酶对直链淀粉作用后的结构变化

具体步骤如下：

分别将实施例4制备得到的野生型及突变体纯酶液按照0.1mg/mL的添加量，添加至含有1mL、浓度为0.1％(w/v)的马铃薯直链淀粉的反应体系中，在65℃条件下反应1h，分别得到反应液，分别将得到的反应液进行全波长扫描，扫描结果如图3所示。

结果显示，从图3可知，当使用相同蛋白浓度的野生型及各突变体纯酶作用于直链淀粉时，野生型及各突变体均使得λ_max从626nm左迁至569nm处，说明该突变并未改变Ro-GBE的转苷作用，在保持蛋白浓度相同时，发挥转苷作用的酶量也基本一致。

2、相同添加量的淀粉分支酶对直链淀粉作用后的结构变化

具体步骤如下：

分别将实施例3制备得到的野生型及突变体粗酶液10μL添加至含有1mL、浓度为0.1％(w/v)的马铃薯直链淀粉的反应体系中，在65℃条件下反应1h，分别得到反应液，分别将得到的反应液进行全波长扫描，扫描结果如图4所示。

结果显示，当采用同一添加量的不同粗酶作用于直链淀粉，随着表达量的提高，各突变体作用直链淀粉后使得λ_max左迁的程度均有所不同，Ro-GBE野生型及各突变体的λ_max分别左迁至569nm(野生型)、557nm(W3K/L4K/R10K/R11K)、546nm(W3R/L4R)，这也进一步凸显了突变体在工业应用中的优势，即在不影响Ro-GBE转苷作用的前提下，减少了Ro-GBE的加酶量，或在相同加酶量的情况下可以得到更多的改性产物，进而降低了工业上的生产成本，提高了生产效率。

实施例6：淀粉分支酶突变体对麦芽糊精的改性

具体步骤如下：

(1)以50mM PBS缓冲液(pH 7.0)配制30％(w/w)麦芽糊精溶液，并将此溶液置于65℃恒温水浴摇床中预热15min；

(2)向预热后的麦芽糊精溶液中按照75～125U/g_底物的加酶量添加Ro-GBE野生型或突变体粗酶液(枯草芽孢杆菌表达系统制备得到的粗酶液)，反应12～24h，沸水浴30min终止反应。

采用Ro-GBE野生型及各突变体粗酶液改善麦芽糊精溶液稳定性的效果图如图5及表5所示(图5及表5是采用100U/g_底物的加酶量，反应24h得到的麦芽糊精溶液放置30天的效果图)。

表5野生型和突变体改性后放置30天的麦芽糊精澄清度

结果可知，麦芽糊精溶液在室温下储存2-3天则会回生沉淀，而经Ro-GBE改性后，其透明度稳定性显著提高，可维持澄清透明长达30天以上，从图中可以看出，野生型及突变体均可达到改性效果，且突变体的添加量低于野生型，由此说明突变体可代替野生型进行改性麦芽糊精的生产，进而降低成本。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种胞外分泌能力增强的淀粉分支酶突变体

<130> BAA210817A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 621

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp Ile Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr

1 5 10 15

Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Asp Glu Gly

20 25 30

Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Gly Val Ser Val Leu

35 40 45

Gly Ala Phe Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asn Pro Leu Glu Arg Tyr

50 55 60

Gly Gly Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Arg Pro Gly His

65 70 75 80

Thr Tyr Lys Tyr Arg Ile Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr

85 90 95

Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu

100 105 110

Gly Leu Ala Ser Ile Ile Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Trp His Asp Asp

115 120 125

Glu Trp Met Arg Arg Arg Lys Gly Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val

130 135 140

Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg His Lys Arg Pro Gly

145 150 155 160

Glu Ser Phe Ser Tyr Arg Glu Ile Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val

165 170 175

Gln Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu His

180 185 190

Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro

195 200 205

Thr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr

210 215 220

Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His

225 230 235 240

Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu

245 250 255

Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Lys Met Arg Tyr His Pro Asp Trp Gly Thr

260 265 270

Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser

275 280 285

Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val

290 295 300

Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp

305 310 315 320

Thr Pro Asn Ile Phe Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Phe

325 330 335

Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met

340 345 350

Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr

355 360 365

Tyr Asn Asn Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met

370 375 380

His Asp Thr Leu Asp Tyr Ile Gln Arg Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr

385 390 395 400

His His Asp Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu His

405 410 415

Tyr Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Gly Ser

420 425 430

Leu Trp Gly Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu

435 440 445

Arg Leu Leu Phe Gly His Met Trp Gly His Pro Gly Lys Lys Leu Leu

450 455 460

Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln His His Glu Trp Asn His Asp Thr

465 470 475 480

Gln Leu Glu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Gly Ile Gln

485 490 495

Leu Trp Val Cys Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Thr Asn Pro Ala Leu

500 505 510

Trp His Asp Gly Pro Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Phe Ser Asp Arg

515 520 525

Asp Gln Ser Val Ile Cys Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Gly Arg Met Leu

530 535 540

Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val

545 550 555 560

Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala

565 570 575

Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala

580 585 590

Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu

595 600 605

Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly

610 615 620

<210> 2

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtcatggc tgacagaaga agatattaga agatgggaat caggaacatt ttatgatagc 60

tatagaaagc tgggcgcaca tccggatgat gaaggaacat ggttttgcgt ttgggcgccg 120

catgcggatg gagtgagcgt gcttggagcg tttaatgatt ggaatccgga agcgaatccg 180

ctggaaagat atggaggcgg cctgtgggca ggatatgttc cgggagcgag accgggccat 240

acatataaat atagaattag acacggcttc taccaagcgg ataaaacaga tccgtatgca 300

tttgcgatgg aaccgccgac aggctcaccg attgaaggcc tggcgagcat tattacaaga 360

ctggattata catggcatga tgatgaatgg atgagaagaa gaaaaggacc ggcgagcctg 420

tatgaaccgg tgtcaatcta tgaagtgcat cttggaagct ggagacataa aagaccgggc 480

gaatcatttt catatagaga aattgcagag ccgcttgcgg attatgttca ggaaatggga 540

ttcactcatg tggaacttct gccggttatg gaacatccgt attatggcag ctggggctat 600

caggttgttg gatattatgc gccgacattt cgctatggat caccgcaaga tctgatgtat 660

ctgattgatt atctgcatca aagaggaatt ggagtgattc tggattgggt tccgagccat 720

tttgcggcag atccgcaagg ccttgttttc tttgatggaa caacactttt tgaatacgat 780

gatccgaaaa tgagatatca tccggattgg ggaacatacg tttttgatta taataagccg 840

ggcgttagaa attttctgat tagcaatgcg cttttctggc ttgaaaaata tcatgtggat 900

ggacttagag tggatgcagt ggcatcaatg ctttatagag attattcaag aaaggagtgg 960

acaccgaata tttttggcgg aagagaaaat cttgaagcaa ttgattttat caagaagttc 1020

aacgaaacgg tgtatcttca ttttccggaa gcaatgacaa ttgcggaaga aagcacagca 1080

tggccgggcg tgagcgcacc gacatataat aatggccttg gatttctgta taagtggaat 1140

atgggctgga tgcatgatac actggattat attcagagag atccgatcta tagaaaatat 1200

catcatgatg aactgacgtt tagcctttgg tatgcgttta gcgaacatta tgtgcttccg 1260

ctttcacatg atgaagttgt tcatggaaaa ggcagcctgt ggggaaaaat gccgggcgat 1320

gattggcaaa aagcagcgaa tcttagactt ctgtttggcc acatgtgggg acatccgggc 1380

aaaaaactgc tgtttatggg cggagaattt ggacaacatc atgaatggaa tcatgataca 1440

cagcttgaat ggcatctgct tgatcaaccg tatcatagag gcattcagct ttgggtgtgc 1500

gatctgaatc atctgtatag aacaaatccg gcgctgtggc atgatggacc ggaaggattt 1560

gaatggattg attttagcga tagagatcag agcgtgattt gttatcttag aaaaaatgcg 1620

ggaagaatgc tgctgtttgt tctgaatttt acaccggttc cgagagaaca ttatagagtg 1680

ggcgttccga ttggaggccc gtggcatgaa gtgctgaata gcgatgcagt tgcgtatgga 1740

ggatcaggaa tgggcaattt tggaagagtt gaagcagtgc cggaatcatg gcatggcaga 1800

ccgtttcatc ttgaactgac acttccgccg cttgcagcgc tgattctgga accggaacat 1860

ggactggaa 1869

<210> 3

<211> 621

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Lys Lys Thr Glu Glu Asp Ile Lys Lys Trp Glu Ser Gly Thr

1 5 10 15

Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Asp Glu Gly

20 25 30

Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Gly Val Ser Val Leu

35 40 45

Gly Ala Phe Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asn Pro Leu Glu Arg Tyr

50 55 60

Gly Gly Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Arg Pro Gly His

65 70 75 80

Thr Tyr Lys Tyr Arg Ile Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr

85 90 95

Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu

100 105 110

Gly Leu Ala Ser Ile Ile Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Trp His Asp Asp

115 120 125

Glu Trp Met Arg Arg Arg Lys Gly Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val

130 135 140

Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg His Lys Arg Pro Gly

145 150 155 160

Glu Ser Phe Ser Tyr Arg Glu Ile Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val

165 170 175

Gln Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu His

180 185 190

Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro

195 200 205

Thr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr

210 215 220

Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His

225 230 235 240

Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu

245 250 255

Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Lys Met Arg Tyr His Pro Asp Trp Gly Thr

260 265 270

Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser

275 280 285

Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val

290 295 300

Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp

305 310 315 320

Thr Pro Asn Ile Phe Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Phe

325 330 335

Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met

340 345 350

Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr

355 360 365

Tyr Asn Asn Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met

370 375 380

His Asp Thr Leu Asp Tyr Ile Gln Arg Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr

385 390 395 400

His His Asp Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu His

405 410 415

Tyr Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Gly Ser

420 425 430

Leu Trp Gly Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu

435 440 445

Arg Leu Leu Phe Gly His Met Trp Gly His Pro Gly Lys Lys Leu Leu

450 455 460

Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln His His Glu Trp Asn His Asp Thr

465 470 475 480

Gln Leu Glu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Gly Ile Gln

485 490 495

Leu Trp Val Cys Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Thr Asn Pro Ala Leu

500 505 510

Trp His Asp Gly Pro Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Phe Ser Asp Arg

515 520 525

Asp Gln Ser Val Ile Cys Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Gly Arg Met Leu

530 535 540

Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val

545 550 555 560

Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala

565 570 575

Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala

580 585 590

Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu

595 600 605

Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly

610 615 620

<210> 4

<211> 621

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ser Arg Arg Thr Glu Glu Asp Ile Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr

1 5 10 15

Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Asp Glu Gly

20 25 30

Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Gly Val Ser Val Leu

35 40 45

Gly Ala Phe Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asn Pro Leu Glu Arg Tyr

50 55 60

Gly Gly Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Arg Pro Gly His

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Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu

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Gln Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu His

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Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro

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Thr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr

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Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His

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Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu

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Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser

275 280 285

Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val

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Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp

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Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met

340 345 350

Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr

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His Asp Thr Leu Asp Tyr Ile Gln Arg Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr

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500 505 510

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530 535 540

Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val

545 550 555 560

Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala

565 570 575

Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala

580 585 590

Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu

595 600 605

Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly

610 615 620

Claims

1.一种淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述淀粉分支酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第3位的色氨酸突变为精氨酸，并将第4位的亮氨酸突变为精氨酸得到的；

或者，所述淀粉分支酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第3位的色氨酸突变为赖氨酸，并将第4位的亮氨酸突变为赖氨酸，并将第10位的精氨酸突变为赖氨酸，并将第11位的精氨酸突变为赖氨酸得到的。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述载体的重组细胞。

5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为宿主细胞。

6.一种改性麦芽糊精的方法，其特征在于，将权利要求1所述的淀粉分支酶突变体，或权利要求4或5所述的重组细胞添加至含有麦芽糊精的反应体系中，对麦芽糊精进行改性。

7.一种合成支链淀粉的方法，其特征在于，将权利要求1所述的淀粉分支酶突变体，或权利要求4或5所述的重组细胞添加至含有直链淀粉的反应体系中，反应制备得到支链程度增高的淀粉。

8.权利要求1所述的突变体，或权利要求4或5所述的重组细胞在制备含有改性麦芽糊精的产品或含有支链淀粉的产品中的应用。