CN114410605B - 一种利用角质酶突变体促进重组蛋白胞外表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用角质酶突变体促进重组蛋白胞外表达的方法，属于生物工程、酶工程、微生物工程技术领域。本发明采用角质酶突变体和目标蛋白在枯草芽孢杆菌中共表达，目标蛋白包括木糖异构酶、4,6‑α‑葡萄糖基转移酶、4‑α‑糖基转移酶、海藻糖合酶和分支酶等，可实现胞内定位目标蛋白胞外表达，提高生产效率、简化后提取工艺，具有较高的学术意义和应用价值。

Description

一种利用角质酶突变体促进重组蛋白胞外表达的方法
本申请是针对原申请号为：CN202011208395.6，原申请日为2020年11月3日，发明名称为一种利用角质酶促进蛋白在枯草芽孢杆菌中胞外表达的方法的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种利用角质酶突变体促进重组蛋白胞外表达的方法，属于基因工程、酶工程、微生物工程技术领域。
背景技术
蛋白质的胞外表达可简化下游纯化工艺，节约成本，在大规模工业化生产中具有绝对优势。而对于天然胞内定位型蛋白，通常只能在细胞内进行表达，并且需要利用物理或化学方法对细胞进行破碎才能获得目的蛋白，后续提取工艺不但繁琐而且成本较高，因此寻找能够有效的简化下游提取步骤降低产物纯化成本成为了研究者的目标。
发明人课题组在前期研究中发现，角质酶在无信号肽介导的情况下实现了在大肠杆菌系统中高效胞外基质“分泌”型表达，尽管这种“分泌”机制还未完全解析，但是推测该现象与角质酶有限的磷脂水解活性引发的膜通透性增强有关。此外，发明人课题组还发现，当角质酶在大肠杆菌中与胞内蛋白共表达时，该效应还能够引发天然胞内定位型蛋白的胞外释放，并且在此过程中未发现明显的细胞裂解现象，因此，不会对下游分离提取过程产生明显的不利影响。当角质酶与天然胞内定位型蛋白在大肠杆菌中共表达时，角质酶能够在一定程度水解细胞膜的磷脂成分，增加细胞膜的通透性，保证细胞完整性的情况下使天然胞内定位型蛋白分泌到胞外，为重组胞内定位型酶的胞外表达提供了一种新的方向；但是大肠杆菌是非食品用菌株，其安全性不可控，因此，无法扩大其应用范围。
而枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，具备无致病性，环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，而且还具有良好的发酵基础，其培养简单快速，已被美国食品药物管理局和中国相关部门认定为食品安全级菌株GRAS(Generally recognized as safe)，目前广泛用于生产各种工业用酶。
发明人课题组尝试将角质酶与天然胞内定位型蛋白在大肠杆菌中共表达的技术方案应用于枯草芽孢杆菌表达系统中时，由于大肠杆菌的细胞膜的组成成分与枯草芽孢杆菌细胞膜的组成成分不同，以及大肠杆菌表达系统与枯草芽孢杆菌表达系统的差异，导致天然胞内定位型蛋白的胞外分泌效果不佳，因此，如何实现天然胞内定位型蛋白胞外分泌，以及如何才能得到一种安全、高效的天然胞内定位型蛋白胞外分泌成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中采用大肠杆菌表达系统实现天然胞内定位型蛋白的胞外表达中，存在的不安全性问题，本发明为了得到一种安全、高效的天然胞内定位型蛋白胞外分泌的方法，首先提供了一种角质酶突变体，所述角质酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角质酶的第175、177、178、207、209、213、214位中的一个或多个位点进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶来源于嗜热单孢菌Thermobifidafusca。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角质酶的第175、177、178、207、209、213或214位的氨基酸突变为丙氨酸得到的，分别命名为：L175A、T177A、I178A、T207A、F209A、I213A、P214A。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第175位置的亮氨酸(Leu)变成丙氨酸(Ala)，同时将第177位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，得到L175A/T177A。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第207位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，同时将第209位置的苯丙氨酸(Phe)变成丙氨酸(Ala)，得到T207A/F209A。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第213位置的异亮氨酸(Ile)变成丙氨酸(Ala)，同时将第214位置的苯丙氨酸(Phe)变成丙氨酸(Ala)，得到I213A/P214A。
本发明还提供了编码上述突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
本发明还提供了上述基因，或上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以枯草芽孢杆菌为表达宿主。
本发明还提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌共表达了上述角质酶突变体与胞内蛋白。
所述胞内蛋白是天然胞内定位型蛋白，即合成于核糖体后在伴侣蛋白的辅助下，仍定位在细胞质中的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述胞内蛋白包括但不限于木糖异构酶、4,6-α-葡萄糖基转移酶、4-α-糖基转移酶、海藻糖合酶和分支酶。
在本发明的一种实施方式中，所述木糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述木糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述4-α-糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的一种实施方式中，所述4-α-糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一种实施方式中，所述海藻糖合酶的NCBI登录号:WP_011291031.1。
在本发明的一种实施方式中，所述分支酶的NCBI登录号:WP_011228999.1。
在本发明的一种实施方式中，是以枯草芽孢杆菌WS5、枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌W600、枯草芽孢杆菌W800、枯草芽孢杆菌RIK1285中的任一为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，是以pHY300PLK、PUB110、pBE-S、pWB980中的任一为表达载体。
本发明还提供了构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，将编码角质酶突变体的基因和编码胞内蛋白的基因连接到表达载体上，得到重组表达载体，然后将重组表达载体转化到表达宿主中。
在本发明的一种实施方式中，包括如下步骤：
(1)将编码角质酶和胞内蛋白的基因同pHY300PLK质粒连接，得到重组质粒，将重组质粒作为定点突变的模板，设计定点突变的突变引物进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的重组突变体质粒。
(2)将步骤(1)得到的重组突变体质粒转化进枯草芽孢杆菌宿主细胞(Bacillussubtilis)WS5。
(3)挑选步骤(2)中的阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞发酵上清液即为胞内蛋白的粗酶液。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016536，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5记载于公开号为CN106754466A，申请号为201611025858.9的专利申请文本中。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述载体在促进枯草芽孢杆菌将重组胞内酶在胞外表达的中应用。所述应用为，将上述突变体或上述基因与胞内蛋白共表达，或在上述载体上连接有角质酶基因与胞内蛋白的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述应用为将上述重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中。
本发明还提供了一种生产胞外蛋白的方法，将上述重组枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，离心，收集发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将上述重组枯草芽孢杆菌工程菌先接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8-10h，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养20～26h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基成分包含8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含20～25g/L的酵母浸膏、5～10g/L的大豆蛋白胨以及4～6g/L的甘油；所述发酵培养基的初始pH为6～7。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组细胞，或上述重组枯草芽孢杆菌在发酵产酶或参与酶解催化反应方面的应用。
有益效果
(1)本发明提供了一种利用角质酶突变体促进枯草芽孢杆菌系统的重组胞内酶在胞外分泌，以木糖异构酶、4,6-α-葡萄糖基转移酶、4-α-葡萄糖基转移酶、海藻糖合酶及分支酶为例，本发明成功实现了木糖异构酶、4,6-α-葡萄糖基转移酶、4-α-葡萄糖基转移酶、海藻糖合酶及分支酶的胞外表达，可简化下游纯化工艺，节约成本，在大规模工业化生产中具有绝对优势。
(2)当木糖异构酶单独表达时，木糖异构酶胞外酶活未检出，采用本发明提供的技术方案，木糖异构酶胞外酶活最高可达5.6U/mL。
(3)当4,6-α-葡萄糖基转移酶单独表达时，4,6-α-葡萄糖基转移酶胞外酶活未检出，采用本发明提供的技术方案，4,6-α-葡萄糖基转移酶胞外酶活最高可达745.2U/mL，实现重组胞内定位型酶的高效胞外制备。
(4)当4-α-葡萄糖基转移酶单独表达时，4-α-葡萄糖基转移酶胞外酶活未检出，采用本发明提供的技术方案，4-α-葡萄糖基转移酶胞外酶活最高可达11.4U/mL。
具体实施方式
下述实施例所涉及的培养基如下：
LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl、0.2g/L的琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl。
种子培养基：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉以及10g/L的氯化钠。
发酵培养基：24g/L的酵母浸膏、12g/L的大豆蛋白胨以及5g/L的甘油，12.54g/L的K2HPO4，2.31g/L的KH2PO4；初始pH为6～7。
下述实施例所涉及的检测方法如下：
木糖异构酶酶活检测方法：
向反应体系(底物3mol·L-1，葡萄糖溶液100μL，50mmol·L-1MgSO4溶液100μL，0.3mol·L-1、pH 7.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液100μL，H2O 600μL)中加入待测液100μL。在70℃条件下反应10min后，加入0.5mol L-1的HClO4 1mL停止反应。取上述反应液500μL，加入半胱氨酸盐酸盐溶液(15g L-1)100μL，75％浓H2SO4 3mL和咔唑-酒精溶液100μL，震荡混匀，60℃显色10min。冰浴冷却，于560nm波长处测定吸光度(以同样操作的灭活酶液作为空白对照)。
酶活力定义为，上述反应条件下，每分钟生成果糖量1μmol所需的酶量。
4,6-α-葡萄糖基转移酶酶活测定方法：
(1)1％直链淀粉母液配制：40mg的直链淀粉加入2mL的蒸馏水充分润湿，加入2mL的2M的NaOH溶液，漩涡振荡充分溶解，用时取500μL的直链淀粉母液加250μL的2M的HCl溶液，然后加入3250μL的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 7.0)配成0.125％的底物。
(2)鲁戈碘液的配制：0.26g碘与2.60g碘化钾溶于10mL的容量瓶中(提前3天配制，确保碘完全溶解)，用时取100μL的鲁戈碘液，加入50μL的2M的HCl溶液然后补水到26mL配成碘显色液。
反应体系为，取200μL的步骤(1)配制的底物于1.5mL离心管中，35℃温浴10min。加入200μL的待测酶液，35℃反应10min，反应结束后取200μL反应液加入到3800μL的碘显色液中显示5min，分光光度计测定660nm下的吸光度。对照用缓冲液代替酶液，空白取200μL的缓冲液加入到3800μL的碘显色液中显示5min。
酶活单位定义为，单位时间吸光值下降一个百分点为一个酶活单位。
海藻糖合酶酶活检测方法：
取400μL稀释合适倍数的酶液，加入400μL用20mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液配制的5％(w/v)麦芽糖溶液，混合溶液30℃反应30min，然后沸水浴10min终止酶反应，用HPLC测定生成的海藻糖含量。HPLC检测条件为流动相:乙腈:水＝80:20，流速:0.8mL/min，柱温:40℃，NH2柱，示差检测器。
酶活定义：在上述反应条件下，每分钟形成1μmol海藻糖所需的酶量定义为1个酶活力单位。
分支酶酶活检测方法：
配置底物：0.01g直链淀粉(0.1g支链淀粉)+0.2mL 96％乙醇，3-4min后加入0.5mL，2mol·L-1的NaOH溶液，加入10mL的水，搅拌10min溶解淀粉，再加入0.5mL 2mol·L-1的HCL溶液，加入50mmol·L-1，pH 6.5的磷酸缓冲液定容到10mL调节pH(现配现用)。
配置终止反应液：鲁戈碘液(母液)：0.26g碘与2.60g碘化钾溶于10mL的容量瓶中，避光室温保存。0.1mL的鲁戈碘液加50μL的2mol·L-1盐酸溶液，定容到26mL(现配现用)。
取50μL粗酶液加50μL底物，在60℃下水浴30min，在加入2mL的终止反应液，室温放置20min后660nm处测吸光值。
酶活定义：常温下在660nm处，吸光值每分钟降低1％为一个酶活单位。
4-α-糖基转移酶检测方法：
取25μL的0.02％(w·v-1)马铃薯直链淀粉溶液(溶解于90％的二甲亚砜中)于试管中，70℃水浴预热10min，加入25μL稀释的酶液(溶解于50mmol·L-1pH 5.5Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中)，震荡混匀，70℃反应30min，加入1mL碘液(0.1mL原碘液+0.1mL的1N HCl，稀释到26mL)终止反应。其中原碘液为26％KI+2.6％I2。
酶活单位定义：在酶活测量体系下，每分钟吸光值A660下降0.1所需的酶量。
实施例1：重组质粒的构建
(1)以实验室保存的质粒pHYPΜLd4P(含有普鲁兰酶pμL和伴侣蛋白prsA基因，构建方法记载于江南大学张康博士学位论文“枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究”，2018)为模板，分别设计正、反向引物：
pHY300PLK-F1：5’-AAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTCC-3’；
pHY300PLK-R1：5’-TCTTGACACTCCTTATTTGATTTTT-3’；
扩增表达载体pHY300PLK-prsA片段；
(2)以实验室保存的质粒xylA/pET24a(+)(记载以中国发明专利ZL201210581801.2)为模板，分别设计正、反向引物：
xylA-F：5’-GGAGTGTCAAGAATGAGCAACTACCAGCCCACAC-3’；
xylA-R：5’-TTTATTACCAAGCTTTTAGCGCACGCCCAGGAGGTAG-3’；
扩增木糖异构酶基因片段；
(3)将步骤(1)得到的表达载体pHY300PLK-prsA片段和步骤(2)得到的木糖异构酶基因片段通过Infusion连接，将连接后的产物进行转化导入E.coli JM109感受态中，得到转化产物，提取转化产物中的质粒进行Hind III酶切验证后测序，获得重组质粒pHY300PLK-xylA-prsA；
以重组质粒pHY300PLK-xylA-prsA为模板，分别设计正、反向引物：
pHY300PLK-F2：5’-GAGCTCGGTACCCTCGAGGG-3’；
pHY300PLK-R2：5’-ACGCGTCCCTCTCCTTTTGC-3’；
扩增表达载体pHY300PLK-xylA片段；
(4)以实验室保存的质粒pET20b-Tfu_0883(构建方法记载于Chen S,Tong X,Woodard RW,Du GC,Wu J,Chen J,Identification and Characterization of BacterialCutinase,Journal of Biological Chemistry,2008,283(28):25854-25862)为模板，分别设计正、反向引物：
cut-F：5’-AGGAGAGGGACGCGTATGGCCAACCCCTACGAGCGCGG-3’；
cut-R：5’-GAGGGTACCGAGCTCTTAGAACGGGCAGGTGGAGCG-3’；
扩增角质酶基因cut；
将步骤(3)得到的表达载体pHY300PLK-xylA片段和上述角质酶基因片段通过Infusion连接，将连接后的产物进行转化导入E.coli JM109感受态中，得到转化产物，提取转化产物中的质粒进行Hind III酶切验证后测序，获得重组质粒pHY300PLK-xylA-cut；
(5)以重组质粒pHYPΜLd4(含有普鲁兰酶pμL基因，构建方法记载于江南大学张康博士学位论文“枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究”，2018)为模板，采用正、反向引物(pHY300PLK-F1和pHY300PLK-R1)，扩增表达载体pHY300PLK片段；以实验室保存的质粒xylA/pET24a(+)(公开于专利号为ZL201210581801.2的专利中)为模板，采用正、反向引物(xylA-F和xylA-R)扩增木糖异构酶基因片段；将表达载体pHY300PLK片段和木糖异构酶基因片段通过Infusion连接，将连接后的产物进行转化导入E.coli JM109感受态细胞中，得到转化产物，将转化产物中的质粒进行Hind III酶切验证后测序，获得重组质粒pHY300PLK-xylA。
实施例2：角质酶突变体的构建
以实施例1中的步骤(4)得到的重组质粒pHY300PLK-xylA-cut为模板，根据角质酶的基因序列，分别设计并合成引入L175A/T177A、T207A/F209A、I213A/P214A、I178A、L175A、T177A、T207A、F209A、I213A和P214A突变的引物，对角质酶基因进行定点突变并通过测序验证，获得含角质酶突变基因的各重组表达载体pHY300PLK-xylA-L175A/T177A，pHY300PLK-xylA-T207A/F209A，pHY300PLK-xylA-I213A/P214A，pHY300PLK-xylA-I178A，pHY300PLK-xylA-L175A，pHY300PLK-xylA-T177A，pHY300PLK-xylA-T207A，pHY300PLK-xylA-F209A，pHY300PLK-xylA-I213A，pHY300PLK-xylA-P214A。
引入L175A/T177A突变的定点突变引物为：
L175A/T177A-F:5’-GATCATCGGGGCCGACGCAGACGCGATCGCGCCGGTCG-3’
L175A/T177A-R:5’-CGACCGGCGCGATCGCGTCTGCGTCGGCCCCGATGATC-3’
引入T207A/F209A突变的定点突变引物为：
T207A/F209A-F：5’-GGAGCTGGACGGCGCAGCCCACGCAGCCCCGAACATCCCC-3’
T207A/F209A-R：5’-GGGGATGTTCGGGGCTGCGTGGGCTGCGCCGTCCAGCTCC-3’
引入I213A/P214A突变的定点突变引物为：
I213A/P214A-F:5’-CCACTTCGCCCCGAACGCCGCCAACAAGATCATCGG-3’
I213A/P214A-R:5’-CCGATGATCTTGTTGGCGGCGTTCGGGGCGAAGTGG-3’
引入I178A突变的定点突变引物为：
I178A-F：5’-CCGACCTCGACACGGCAGCGCCGGTCGCCAC-3’
I178A-R：5’-GTGGCGACCGGCGCTGCCGTGTCGAGGTCGG-3’
引入L175A突变的定点突变引物为：
L175A-F：5’-GATCATCGGGGCCGACGCAGACACGATCGCGCCG-3’
L175A-R：5’-CGGCGCGATCGTGTCTGCGTCGGCCCCGATGATC-3’
引入T177A突变的定点突变引物为：
T177A-F：5’-GGGCCGACCTCGACGCGATCGCGCCGGTCG-3’
T177A-R：5’-CGACCGGCGCGATCGCGTCGAGGTCGGCCC-3’
引入T207A突变的定点突变引物为：
T207A-F：5’-GGAGCTGGACGGCGCAGCCCACTTCGCCCCGAAC-3’
T207A-R：5’-GTTCGGGGCGAAGTGGGCTGCGCCGTCCAGCTCC-3’
引入F209A突变的定点突变引物为：
F209A-F：5’-GCTGGACGGCGCAACCCACGCAGCCCCGAACATCCCC-3’
F209A-R：5’-GGGGATGTTCGGGGCTGCGTGGGTTGCGCCGTCCAGC-3’
引入I213A突变的定点突变引物为：
I213A-F：5’-CCACTTCGCCCCGAACGCCCCCAACAAGATCATCGG-3’
I213A-R：5’-CCGATGATCTTGTTGGGGGCGTTCGGGGCGAAGTGG-3’
引入P214A突变的定点突变引物为：
P214A-F：5’-CCACTTCGCCCCGAACATCGCCAACAAGATCATCGG-3’
P214A-R：5’-CCGATGATCTTGTTGGCGATGTTCGGGGCGAAGTGG-3’
实施例3：角质酶突变体与木糖异构酶共表达重组菌构建
(1)感受态细胞的制备：
用接种环沾取冻存的Bacillus subtilis WS5，然后在LB平板上划线，37℃培养过夜活化；挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养8h；取2.5mL转接入40mL含有0.5M山梨醇的LB培养基，37℃，200rpm震荡培养4～5h；将菌液冰水浴10min，然后4℃5000rpm离心5min，收集菌体。用50mL预冷的电转缓冲液重悬菌体，4℃5000rpm离心5min，去上清，如此漂洗4次；将洗涤后的菌体重悬于1mL电转培养基中，分装到1.5mL EP管中，每管200μL，得到感受态细胞。
(2)感受态细胞的转化：
向步骤(1)得到的感受态细胞中分别加入实施例1和2所得的各重组质粒，冰浴18min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次(2.4kv，25μF，200Ω)；电击完毕后立即加入1mL预冷的RM培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇91g/L，甘露醇69g/L)，37℃，200rpm，复苏3h后，涂含四环素抗性(50ug/mL)的平板，即得到重组菌：
Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-cut，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-L175A/T177A，Bacillus subtilisWS5/pHY300PLK-xylA-T207A/F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-I213A/P214A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-I178A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-L175A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-T177A，Bacillussubtilis WS5/pHY300PLK-xylA-T207A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-I213A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-xylA-P214A。
实施例4：摇瓶发酵产木糖异构酶
具体步骤如下：
(1)分别将实施例3中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm条件下培养8～10h，分别得到种子液；
(2)分别将步骤(1)得到的各种子液按照5％(v/v)接种量转接至发酵培养基中，于33℃、200rpm下培养24h，然后在12000r·min-1，10min离心后获得发酵上清液，分别对发酵上清液进行木糖异构酶酶活检测，检测结果如表1所示：
表1发酵上清液中木糖异构酶酶活
Figure BDA0003489085490000091
由检测结果可以看出：当木糖异构酶单独表达时，木糖异构酶胞外酶活未检出；与角质酶、或其突变体共表达时，在胞外均测到了酶活，证明本发明的技术方案，实现了木糖异构酶的在枯草芽孢杆菌中的胞外分泌，同时，采用木糖异构酶与角质酶突变体I213A/P214A共表达时的酶活，是采用木糖异构酶与野生型角质酶共表达的酶活的7倍。
实施例5：共表达角质酶突变体促进4,6-α-葡萄糖基转移酶的胞外表达
具体步骤如下：
(1)采用实施例1-3的方法构建重组质粒pHY300PLK-gtfB，pHY300PLK-gtfB-cut，pHY300PLK-gtfB-L175A/T177A，pHY300PLK-gtfB-T207A/F209A，pHY300PLK-gtfB-I213A/P214A，pHY300PLK-gtfB-I178A，pHY300PLK-gtfB-L175A，pHY300PLK-gtfB-T177A，pHY300PLK-gtfB-T207A，pHY300PLK-gtfB-F209A，pHY300PLK-gtfB-I213A，pHY300PLK-gtfB-P214A并转化Bacillus subtilis WS5，得到重组菌：
Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-cut，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-L175A/T177A，Bacillus subtilisWS5/pHY300PLK-gtfB-T207A/F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-I213A/P214A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-I178A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-L175A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-T177A，Bacillussubtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-T207A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-I213A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-gtfB-P214A；
(2)将上述重组枯草芽孢杆菌菌株分别接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm条件下培养8～10h，分别得到种子液；
(3)分别将步骤(2)得到的各种子液按照5％(v/v)接种量转接至发酵培养基中，于33℃、200rpm下培养24h，然后在12000r·min-1，10min离心后获得发酵上清液，分别对发酵上清液进行4,6-α-葡萄糖基转移酶酶活检测，检测结果如表2所示：
表2发酵上清液中4,6-α-葡萄糖基转移酶酶活
Figure BDA0003489085490000101
Figure BDA0003489085490000111
由检测结果可以看出：当4,6-α-葡萄糖基转移酶单独表达时，4,6-α-葡萄糖基转移酶胞外酶活未检出。
采用4,6-α-葡萄糖基转移酶与角质酶突变体I213A/P214A共表达时的酶活，是采用木4,6-α-葡萄糖基转移酶与野生型角质酶共表达的酶活的6倍。
实施例6：共表达角质酶突变体促进4-α-糖基转移酶的胞外表达
具体步骤如下：
(1)采用实施例1-3的方法构建重组质粒pHY300PLK-4GT，pHY300PLK-4GT-cut，pHY300PLK-4GT-L175A/T177A，pHY300PLK-4GT-T207A/F209A，pHY300PLK-4GT-I213A/P214A，pHY300PLK-4GT-I178A，pHY300PLK-4GT-L175A，pHY300PLK-4GT-T177A，pHY300PLK-4GT-T207A，pHY300PLK-4GT-F209A，pHY300PLK-4GT-I213A，pHY300PLK-4GT-P214A并转化Bacillus subtilis WS5，得到重组菌：
Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT-cut，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT-L175A/T177A，Bacillus subtilisWS5/pHY300PLK-4GT-T207A/F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT I213A/P214A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT-I178A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT-L175A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT-T177A，Bacillussubtilis WS5/pHY300PLK-4GT-T207A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT-F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT-I213A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-4GT-P214A；
(2)将上述重组枯草芽孢杆菌菌株分别接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm条件下培养8～10h，分别得到种子液；
(3)分别将步骤(2)得到的各种子液按照5％(v/v)接种量转接至发酵培养基中，于33℃、200rpm下培养24h，然后在12000r·min-1，10min离心后获得发酵上清液，分别对发酵上清液进行4-α-糖基转移酶酶活检测，检测结果如表3所示：
表3发酵上清液中4-α-葡萄糖基转移酶酶活
Figure BDA0003489085490000112
Figure BDA0003489085490000121
由检测结果可以看出：当4-α-葡萄糖基转移酶单独表达时，4-α-葡萄糖基转移酶胞外酶活未检出。
采用4-α-葡萄糖基转移酶与角质酶突变体T207A/F209A共表达时的酶活，是采用木糖异构酶与野生型角质酶共表达的酶活的4.6倍。
实施例7：共表达角质酶突变体促进海藻糖合酶的胞外表达
具体步骤如下：
(1)采用实施例1-3的方法构建重组质粒并转化Bacillus subtilis WS5，得到重组菌：
Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-cut，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-L175A/T177A，Bacillus subtilisWS5/pHY300PLK-treS-T207A/F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-I213A/P214A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-I178A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-L175A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-T177A，Bacillussubtilis WS5/pHY300PLK-treS-T207A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-I213A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-treS-P214A(其中，质粒构建涉及的文献分别为：江南大学张康博士学位论文“枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究”，2018，罗锋,段绪果,宿玲恰,吴敬,Thermobifida fusca海藻糖合成酶基因的克隆表达及发酵优化,中国生物工程杂志,2013,33(8):98-104)；
(2)分别将上述重组枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm条件下培养8～10h，分别得到种子液；
(3)分别将步骤(2)得到的各种子液按照5％(v/v)接种量转接至发酵培养基中，于33℃、200rpm下培养24h，然后在12000r·min-1，10min离心后获得发酵上清液，分别对发酵上清液进行海藻糖合成酶酶活检测，其中当海藻糖合成酶单独表达时，海藻糖合成酶胞外酶活未检出；与角质酶、或其突变体共表达时，在胞外均测到了酶活。
实施例8：共表达角质酶突变体促进分支酶的胞外表达
具体步骤如下：
(1)采用实施例1-3的方法构建重组质粒并转化Bacillus subtilis WS5，得到重组菌：
Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-cut，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-L175A/T177A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-T207A/F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-I213A/P214A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-I178A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-L175A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-T177A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-T207A，Bacillus subtilisWS5/pHY300PLK-TtSBE-F209A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-I213A，Bacillus subtilis WS5/pHY300PLK-TtSBE-P214A(其中，质粒构建涉及的文献为：2017年江南大学刘军硕士学位论文)；
(2)分别将上述重组枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm条件下培养8～10h，分别得到种子液；
(3)分别将步骤(2)得到的种子液按照5％(v/v)接种量转接至发酵培养基中，于33℃、200rpm下培养24h，然后在12000r·min-1，10min离心后获得发酵上清液，分别对发酵上清液进行分支酶酶活检测，其中，当分支酶单独表达时，分支酶胞外酶活未检出；与角质酶、或其突变体共表达时，在胞外均测到了酶活。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用角质酶突变体促进重组蛋白胞外表达的方法
<130> BAA201219A
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Pro Thr Asp Ala Leu Leu Glu
1 5 10 15
Ala Ser Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Asn Val Ser Arg Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Pro Arg Glu Asn
35 40 45
Asn Thr Tyr Gly Ala Val Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Thr Gly Thr Glu
50 55 60
Ala Ser Ile Ala Trp Leu Gly Glu Arg Ile Ala Ser His Gly Phe Val
65 70 75 80
Val Ile Thr Ile Asp Thr Ile Thr Thr Leu Asp Gln Pro Asp Ser Arg
85 90 95
Ala Glu Gln Leu Asn Ala Ala Leu Asn His Met Ile Asn Arg Ala Ser
100 105 110
Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Asp Ser Ser Arg Leu Ala Val Met Gly
115 120 125
His Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg Pro
130 135 140
Asp Leu Lys Ala Ala Ile Pro Leu Thr Pro Trp His Leu Asn Lys Asn
145 150 155 160
Trp Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu Asp
165 170 175
Thr Ile Ala Pro Val Ala Thr His Ala Lys Pro Phe Tyr Asn Ser Leu
180 185 190
Pro Ser Ser Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr His
195 200 205
Phe Ala Pro Asn Ile Pro Asn Lys Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val Ala
210 215 220
Trp Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe Leu
225 230 235 240
Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr Arg
245 250 255
Ser Thr Cys Pro Phe
260
<210> 2
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgctcgaagc cagcagcggc 60
cccttctccg tcagcgagga gaacgtctcc cggttgagcg ccagcggctt cggcggcggc 120
accatctact acccgcggga gaacaacacc tacggtgcgg tggcgatctc ccccggctac 180
accggcactg aggcttccat cgcctggctg ggcgagcgca tcgcctccca cggcttcgtc 240
gtcatcacca tcgacaccat caccaccctc gaccagccgg acagccgggc agagcagctc 300
aacgccgcgc tgaaccacat gatcaaccgg gcgtcctcca cggtgcgcag ccggatcgac 360
agcagccgac tggcggtcat gggccactca atgggcggcg gcggcaccct gcgtctggcc 420
tcccagcgtc ccgacctgaa ggccgccatc ccgctcaccc cgtggcacct caacaagaac 480
tggagcagcg tcaccgtgcc gacgctgatc atcggggccg acctcgacac gatcgcgccg 540
gtcgccacgc acgcgaaacc gttctacaac agcctgccga gctccatcag caaggcctac 600
ctggagctgg acggcgcaac ccacttcgcc ccgaacatcc ccaacaagat catcggcaag 660
tacagtgtcg cctggctcaa gcggttcgtc gacaacgaca cccgctacac ccagttcctc 720
tgccccggac cgcgcgacgg actcttcggc gaggtcgaag agtaccgctc cacctgcccg 780
ttc 783
<210> 3
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ser Asn Tyr Gln Pro Thr Pro Glu Asp Arg Phe Ser Phe Gly Leu
1 5 10 15
Trp Thr Val Gly Trp Arg Gly His Asn Thr Phe Gly Lys Ala Val Arg
20 25 30
Pro Gln Leu Asp Pro Val Asp Val Val Trp Lys Leu Arg Glu Leu Gly
35 40 45
Ala Tyr Gly Ile Thr Phe His Asp Asp Asp Leu Leu Pro Pro Asp Ser
50 55 60
Thr Pro Ala Glu Arg Asp Ala Ile Ile Lys Arg Phe Thr Arg Ala Leu
65 70 75 80
Glu Glu Ser Gly Met Thr Val Pro Met Val Thr Thr Asp Leu Phe Ser
85 90 95
His Pro Val Phe Arg Asp Gly Gly Phe Thr Ser Asn Ser Arg Asp Val
100 105 110
Arg Arg Tyr Ala Leu Arg Lys Val Met Arg Asn Ile Asp Arg Ala Ala
115 120 125
Glu Leu Gly Ala Arg Thr Tyr Val Cys Trp Gly Gly Met Asp Gly Ala
130 135 140
Glu Tyr Glu Pro Ala Lys Asn Ile Ser Ala Ala Leu Asp Arg Leu Arg
145 150 155 160
Glu Ala Phe Asn Ile Leu Cys Glu Tyr Val Arg Ser Lys Gly Tyr Asn
165 170 175
Leu Arg Phe Ala Leu Glu Pro Lys Pro Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile
180 185 190
Leu Leu Pro Thr Ile Gly His Ala Ile Ala Phe Ile Asn Glu Leu Asp
195 200 205
His Pro Glu Met Val Gly Leu Asn Pro Glu Val Gly His Glu Gln Met
210 215 220
Ala Gly Leu Asn Phe Thr His Gly Ile Ala Gln Ala Leu Trp His Gly
225 230 235 240
Lys Leu Phe His Ile Asp Leu Asn Gly Gln Arg Gly Ile Lys Tyr Asp
245 250 255
Gln Asp Leu Arg Phe Gly Ala Gly Asp Val Arg Asp Ala Phe Phe Leu
260 265 270
Val Asn Leu Leu Glu Ser Ser Gly Tyr Asp Gly Pro Arg His Phe Asp
275 280 285
Phe Lys Thr Pro Arg Thr Glu Asp Val Asp Gly Val Trp Glu Ala Ala
290 295 300
Arg Asn Cys Met Arg Asn Tyr Leu Ile Phe Lys Glu Lys Ala Glu Ala
305 310 315 320
Phe Arg Ala Asp Pro Glu Val Arg Glu Ala Met Glu Ala Ala Arg Val
325 330 335
Phe Glu Leu Glu Gln Ser Thr Leu Ala Glu Gly Glu Thr Leu Asp Asp
340 345 350
Leu Leu Ala Glu Asp Ile Asn Leu Asp Glu Val Ala Gln Arg Gly Tyr
355 360 365
His Phe Glu Arg Leu Asp Gln Leu Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Val
370 375 380
Arg
385
<210> 4
<211> 1158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgagcaact accagcccac acccgaggac cggttcagct tcggactgtg gactgtggga 60
tggcgcggcc acaacacctt cggcaaggcc gtacgcccgc aactcgaccc cgtcgacgtc 120
gtctggaaac tccgcgaact cggcgcctac ggcatcacct tccacgacga cgacctcctc 180
ccgccggaca gcacccccgc ggaacgcgac gccatcatca aacgcttcac ccgggcgctc 240
gaagagagcg gcatgaccgt ccccatggtc actaccgacc tcttcagcca ccccgtcttc 300
cgcgacggcg gcttcacctc caacagccgc gacgtgcgcc gctacgccct gcgcaaggtc 360
atgcgcaaca tcgaccgcgc cgcggaactc ggcgcccgca cctacgtgtg ctggggcggc 420
atggacggcg ccgaatacga acccgccaag aacatctccg ccgcgctcga ccgcctgcgc 480
gaagccttca acatcctgtg cgaatacgtc cgcagcaagg gctacaacct gcggttcgcc 540
ctcgaaccca aacccaacga gccccgcggc gacatcctcc tgcccaccat cggccacgcc 600
atcgccttca tcaacgagct cgaccacccc gaaatggtcg gcctcaaccc cgaagtcggc 660
cacgaacaga tggccggact caacttcacc cacggcatcg cccaagccct ctggcacggc 720
aaactgttcc acatcgacct caacggccag cgcggcatca aatacgacca ggacctgcgc 780
ttcggcgccg gcgacgtgcg cgacgcgttc ttcctcgtca acctgctgga aagcagtggc 840
tacgacggac cgcgccactt cgacttcaag accccgcgca ccgaagacgt cgacggcgtg 900
tgggaagcgg cacgcaactg catgcgcaac tacctcatct tcaaggagaa ggctgaagcg 960
ttccgcgccg accccgaagt ccgcgaagcc atggaagccg cccgggtctt cgaactggag 1020
cagtccaccc tcgccgaagg ggagaccctg gacgacctgc tcgccgaaga catcaacctg 1080
gacgaagtgg cccagcgcgg ctaccacttc gaacgcctcg accagctcgc cctcgactac 1140
ctcctgggcg tgcgctaa 1158
<210> 5
<211> 1151
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Phe Gly Asn Asp Gly Arg Ile Ala Thr Lys Val Thr Pro Trp Ala
1 5 10 15
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Asp Pro Leu Thr Tyr Leu Arg Val Asp Asn
20 25 30
Asn Tyr Val Gln Ser Gln Trp Gly Leu Trp Tyr Met Phe Gly Asn Asp
35 40 45
Gly Arg Val Gln Ser Gly Val Gln Arg Trp Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr
50 55 60
Phe Asp Pro Thr Thr Tyr Leu Arg Val Asp Asp Asp Tyr Val Thr Ser
65 70 75 80
Gln Trp Gly Leu Lys Tyr Met Phe Gly Lys Asp Gly Arg Ile Val Ser
85 90 95
Asp Leu Tyr Lys Trp Asp Lys Lys Asn Gln Trp Tyr Tyr Phe Asp Pro
100 105 110
Val Thr Tyr Leu Ala Val Thr Asn Asn Tyr Ile Lys Ala Asn Asp Gly
115 120 125
Asn Trp Tyr Leu Phe Thr Ala Asp Gly Thr Ala Ala Ser Lys Val Ala
130 135 140
Pro Trp Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Asp Pro Val Thr His Leu Arg
145 150 155 160
Val Asp Asn Asp Tyr Val Gln Ser Gln Trp Gly Asp Trp Tyr Met Phe
165 170 175
Gly Asn Asp Gly Arg Ile Val Thr Gly Pro Val Thr Trp Tyr Gly Ser
180 185 190
Asn Tyr Tyr Phe Asp Pro Thr Thr Tyr Leu Lys Val Thr Asn Arg Trp
195 200 205
Ile Asn Asp Lys Tyr Tyr Gly Ser Asp Gly Arg Gln Ala Val Ser Gln
210 215 220
Ser Glu Lys Ile Asn Asn Lys Phe Tyr Tyr Phe Asp Glu Asn Gly Ser
225 230 235 240
Ile Ile Arg Asn Gln Phe Lys Lys Ile Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Phe
245 250 255
Gly Asp Asp Gly Ala Ala Leu Ile Gly Leu His Val Ile Asp Gly Lys
260 265 270
Asn Tyr Asn Phe Ala Ser Asp Gly Gln Leu Leu Gly Lys Thr Tyr Gly
275 280 285
Lys Ile Glu Asn Gly Lys Phe Asn Ile Tyr Asp Ala Thr Ser Asn Lys
290 295 300
Leu Leu Lys Thr Leu Asp Ser Gly Asp Trp Glu Asn Leu Ala Asp Ser
305 310 315 320
Phe Asp Ser Ser Ser Ile Asn Asn Ile Asp Gly Tyr Leu Ser Tyr Gly
325 330 335
Gly Trp Tyr Arg Pro Tyr Gly Thr Ser Gln Asp Gly Lys Thr Trp His
340 345 350
Lys Thr Thr Ala Ser Asp Trp Arg Pro Leu Leu Met Tyr Val Tyr Pro
355 360 365
Ser Lys Asp Val Glu Ala Lys Tyr Ile Lys Tyr Phe Val Ser Asn Gly
370 375 380
Tyr Thr Asn Thr Asp Tyr Gly Leu Thr Lys Asp Asn Val Ala Asn Leu
385 390 395 400
Ser Gln Asp Thr Asp Ser Ala Thr Leu Asn Lys Tyr Ala Arg Asn Leu
405 410 415
Arg Phe Val Ile Glu Lys Ser Ile Ala Ile Asn Lys Ser Thr Ser Pro
420 425 430
Leu Ala Asn Asp Ile Asn Lys Phe Met Thr Thr Ile Pro Glu Leu Ser
435 440 445
Ala Lys Ser Glu Leu Pro Ser Tyr Ser Gln Asn Asp Gln Leu Val Phe
450 455 460
Val Asn Asn Asn Ser Ser Asn Gln Ala Lys Gly Asn Thr Ser Tyr Ala
465 470 475 480
Asp Ser Asn Tyr Arg Leu Met Asp Arg Thr Leu Asn Asn Gln Thr Asn
485 490 495
Asn Asp Ser Ser Asp His Ser Pro Glu Met Leu Leu Gly Asn Asp Ile
500 505 510
Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Asn Leu Asn Trp Glu Tyr
515 520 525
Phe Leu Leu Asn Tyr Gly Lys Leu Met Gln Tyr Asn Ala Asn Ala Ser
530 535 540
Val Asn Gly Asn Phe Asp Gly Phe Arg Val Asp Ala Ala Asp His Ile
545 550 555 560
Asp Ala Asp Val Leu Asp Gln Leu Gly Gln Leu Met Asn Asp Leu Tyr
565 570 575
His Thr Lys Gly Asn Gln Val Asn Ala Asn Ser His Leu Val Tyr Asn
580 585 590
Glu Gly Tyr Asn Tyr Gly Asp Leu Arg Met Leu Asn Gly Lys Asn Asn
595 600 605
Pro Ala Leu Tyr Leu Asp Ser Gly Tyr Trp Ser Gln Leu Glu Ser Ser
610 615 620
Leu Gly Arg Asn Ala Asp Asn Arg Asp Ser Ile Ser Asn Leu Met Thr
625 630 635 640
Asn Ser Ile Val Asn Arg Ala Asn Asp Val Thr Glu Asn Thr Ala Thr
645 650 655
Pro Asn Trp Ser Phe Val Thr Asn His Asp Gln Arg Asn Asn Leu Val
660 665 670
Asn Arg Ile Val Tyr Asp Lys Asp Ile Thr Ala Gln Lys Ala Trp Asp
675 680 685
Met Phe Tyr Ala Asp Gln Ala Lys Thr Asp Lys Gln Tyr Ala Gln Tyr
690 695 700
Asn Met Pro Ala Gln Tyr Ala Leu Leu Leu Ser Asn Lys Asp Thr Val
705 710 715 720
Pro Gln Val Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Asn Glu Thr Asp Gln Tyr Met
725 730 735
Lys Thr Lys Ser Met Tyr Tyr Asp Ala Ile Thr Thr Leu Met Lys Ala
740 745 750
Arg Arg Thr Phe Val Asn Gly Gly Gln Thr Met Thr Lys Leu Asn Asn
755 760 765
Asn Leu Ile Ala Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly Val Ser Asp Ala Ser
770 775 780
Gly Lys Gly Thr Asp Ser Leu Ser Arg Thr Thr Gly Met Ala Val Ile
785 790 795 800
Val Gly Asn Asn Pro Thr Met Ser Glu Gln Val Val Gln Ile Asn Met
805 810 815
Gly Val Ala His Ala Asn Glu Gln Tyr Arg Ser Leu Ile Asn Ser Thr
820 825 830
Asp Asn Gly Leu Thr Tyr Asp Gly Met Gly Ser Thr Phe Leu Thr Thr
835 840 845
Asp Ser Lys Gly Ile Leu Arg Val Thr Val Lys Gly Tyr Ser Asn Pro
850 855 860
Tyr Val Asn Gly Tyr Leu Ser Val Trp Val Pro Val Ile Ser Gly Thr
865 870 875 880
Gln Asn Ala Gln Thr Asn Ala Gln Glu Val Asn Asn Val Ser Gly Lys
885 890 895
Thr Phe Ala Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ala His Met Ile Tyr Gln Asp
900 905 910
Phe Ser Leu Ala Gln Pro Glu Pro Thr Thr Ile Asn Asn His Ala Tyr
915 920 925
Asn Val Ile Lys Ala Asn Ala Ala Leu Phe Asn Gln Leu Gly Ile Thr
930 935 940
Asp Phe Trp Met Ala Pro Ala Tyr Met Pro Val Asn Ser Ser Lys Tyr
945 950 955 960
Gln Asp Gly Tyr Ala Thr Asp Asp Arg Tyr Asn Leu Gly Thr Thr Asp
965 970 975
Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Ser Gly Glu Glu Leu Ala Asn Ala Ile Ala
980 985 990
Ala Leu His Gln Glu Gly Leu Lys Val Gln Glu Asp Leu Val Met Asn
995 1000 1005
Gln Met Phe Gly Phe Pro Ser Gln Glu Ala Val Thr Val Thr Arg
1010 1015 1020
Ala Asp Ser Tyr Gly Lys Gln Phe Tyr Val Asp Gly Lys Thr Phe
1025 1030 1035
Ala Asn Gln Ile Tyr Phe Gly Tyr Thr Arg Asn Gly Ser Gln Asn
1040 1045 1050
Gln Gln Gln Asn Tyr Gly Gly Arg Tyr Leu Gly Glu Leu Asn Gln
1055 1060 1065
Lys Tyr Pro Asp Leu Phe Thr Thr Lys Ala Ala Ser Ser Gly Val
1070 1075 1080
Ala Pro Asp Pro Asn Thr Arg Ile Thr Glu Trp Ser Ala Lys Tyr
1085 1090 1095
Glu Asn Gly Thr Ser Leu Gln Asn Val Gly Val Gly Leu Ala Ile
1100 1105 1110
Lys Met Pro Asn Gly Tyr Tyr Ala Tyr Leu Asn Asn Gly Ser Asn
1115 1120 1125
Lys Thr Phe Asn Thr Thr Leu Pro Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp
1130 1135 1140
Tyr Tyr Ala Asn Lys Ala Asp Leu
1145 1150
<210> 6
<211> 3462
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgtttggta atgatggccg tattgcaacc aaagtgacac cgtgggccgg cacctattat 60
tactttgatc ctctgaccta tctgcgtgtt gacaataatt atgtgcaatc tcagtggggt 120
ctgtggtaca tgttcggcaa cgatggccgt gttcagtcag gtgtacagcg ctggagcggt 180
acgtattatt atttcgaccc taccacctat ctgcgcgttg atgacgatta tgttacatct 240
cagtggggac tgaaatacat gtttggcaaa gatggtcgta ttgtttctga tctgtataaa 300
tgggacaaaa agaatcagtg gtattatttc gatccggtga cctatctggc agttaccaac 360
aattatatta aagccaacga tgggaattgg tatctgttca ccgcagatgg tacggcagcg 420
agcaaagtgg caccgtggag cggtacctat tactattttg accctgttac ccatctgcgt 480
gtcgataatg attatgttca gtcacagtgg ggtgattggt atatgttcgg caatgatggt 540
cgtatcgtta ccgggccggt tacctggtat ggcagcaatt attattttga cccgaccacc 600
tatctgaaag ttacgaatcg ttggattaat gataaatact acggtagtga cggtcgtcag 660
gcagttagcc agagcgagaa aattaataac aaattttact acttcgacga gaacggcagc 720
attattcgta accagtttaa aaagatcaac ggcggcacct attactttgg agatgatgga 780
gcagcactga ttggactgca cgttatcgat ggtaaaaatt ataatttcgc cagcgatggt 840
cagctgctgg gtaaaacata cggtaaaatt gaaaacggaa aattcaacat ctacgatgca 900
accagcaaca aactgctgaa aacactggat agcggtgatt gggagaatct ggcagatagc 960
tttgatagta gcagcattaa taacatcgat ggctatctga gctatggtgg gtggtatcgc 1020
ccgtacggta cctctcagga cggtaaaaca tggcataaaa ccacagcaag cgattggcgt 1080
ccgctgctga tgtacgtgta cccgagcaaa gacgttgaag cgaaatatat taaatacttc 1140
gtgagcaacg ggtatacaaa tacagactac ggtctgacca aagataacgt ggcgaatctg 1200
agccaagaca ccgatagcgc aaccctgaat aaatatgcac gcaatctgcg cttcgttatt 1260
gaaaaatcaa ttgcaattaa caaaagcacg agcccgctgg caaacgatat taacaaattc 1320
atgaccacca ttccggaact gtctgcaaaa tccgaactgc cgtcttattc tcagaacgat 1380
caactggttt ttgtgaacaa taacagcagc aatcaagcaa aaggtaacac cagctatgcc 1440
gactcaaact accgtctgat ggatcgtacc ctgaataatc agaccaataa cgacagcagc 1500
gaccatagcc cggaaatgct gctgggaaac gacattgata atagcaatcc agttgttcag 1560
gccgaaaatc tgaattggga atattttctg ctgaactacg gcaaactgat gcagtacaac 1620
gcaaacgcaa gcgtgaatgg taatttcgat ggctttcgcg tcgatgccgc agatcatatc 1680
gatgcagatg ttctggatca gctgggtcaa ctgatgaatg atctgtacca taccaaaggt 1740
aaccaagtta atgccaatag ccatctggtg tataatgaag gttataatta cggtgacctg 1800
cgtatgctga atggtaaaaa taatccggca ctgtacctgg atagcggcta ttggagccag 1860
ctggagtcca gcctgggacg taatgcggac aaccgtgatt ccattagtaa tctgatgacc 1920
aactccatcg tgaatcgcgc aaatgatgtt accgaaaata cagcaacccc gaattggagc 1980
tttgttacaa accatgatca gcgtaataat ctggttaatc gtattgttta cgacaaagac 2040
attaccgcgc agaaagcatg ggatatgttt tatgcagacc aggcaaaaac cgataaacag 2100
tatgcacagt acaatatgcc tgcacagtat gcactgctgc tgagcaacaa agataccgtg 2160
ccacaggtat actatgggga tctgtataat gaaaccgatc aatatatgaa aaccaaaagc 2220
atgtactacg acgcgattac caccctgatg aaagcccgtc gtacattcgt gaatggtggt 2280
caaaccatga ccaaactgaa taataacctg attgcatccg ttcgctatgg caaaggcgtt 2340
tcggatgcaa gtggcaaagg caccgacagc ctgagccgta ccaccggtat ggcagtgatc 2400
gttggtaata acccgaccat gagcgaacag gttgttcaga ttaatatggg tgttgcacat 2460
gcaaatgaac agtaccgtag cctgatcaat agcaccgaca acggactgac ctatgacggg 2520
atgggcagca ccttcctgac cactgatagt aaaggtatcc tgcgtgttac cgtaaaaggt 2580
tacagcaatc cgtatgttaa tggctacctg agcgtttggg ttcctgttat tagcggtacc 2640
cagaatgcac agaccaacgc acaggaagtg aataatgtta gcgggaaaac attcgcaagc 2700
aatgcagcac tggatgcaca catgatttat caagacttta gcctggccca gccggaacca 2760
accaccatca ataaccacgc atataatgtt atcaaagcaa atgcagcact gtttaatcag 2820
ctgggtatta ccgatttttg gatggccccg gcatatatgc ctgttaattc aagcaaatat 2880
caggacggat atgcaaccga tgaccgttac aatctgggta caacagataa tccgaccaaa 2940
tatggcagcg gagaggagct ggcaaatgca attgccgcac tgcaccagga aggtctgaaa 3000
gtgcaggaag atctggtgat gaatcagatg tttgggttcc cgagtcagga agcagtgacg 3060
gttacccgtg cagatagcta tggcaaacag ttttatgtgg atggtaaaac attcgccaat 3120
caaatttatt tcggttacac acgtaacggt agccagaatc agcaacagaa ttatggtggg 3180
cgctatctgg gtgaactgaa tcagaaatat ccggatctgt ttaccaccaa agcagcaagt 3240
agcggtgttg caccagatcc taacacccgt attaccgaat ggagcgcaaa atatgaaaat 3300
gggaccagcc tgcaaaatgt aggcgtgggt ctggccatta aaatgccgaa tggatattat 3360
gcatacctga ataatggtag caataaaaca ttcaacacca ccctgccgga tgcaatcgca 3420
agcgttgatt actacgcgaa taaagcagat ctgtaaggat cc 3462
<210> 7
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Arg Leu Ala Gly Ile Leu Leu His Val Thr Ser Leu Pro Ser Pro
1 5 10 15
Tyr Gly Ile Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ala Tyr Arg Phe Leu Asp Phe
20 25 30
Leu Lys Glu Cys Gly Phe Ser Leu Trp Gln Val Leu Pro Leu Asn Pro
35 40 45
Thr Ser Leu Glu Ala Gly Asn Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ser Leu Phe
50 55 60
Ala Gly Asn Tyr Val Leu Ile Asp Pro Glu Glu Leu Leu Glu Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ile Lys Glu Arg Asp Leu Lys Arg Phe Pro Leu Gly Glu Ala Leu
85 90 95
Tyr Glu Val Val Tyr Glu Tyr Lys Lys Glu Leu Leu Glu Lys Ala Phe
100 105 110
Lys Asn Phe Arg Arg Phe Glu Leu Leu Glu Asp Phe Leu Lys Glu His
115 120 125
Ser Tyr Trp Leu Arg Asp Tyr Ala Leu Tyr Met Ala Ile Lys Glu Glu
130 135 140
Glu Gly Lys Glu Trp Tyr Glu Trp Asp Glu Glu Leu Lys Arg Arg Glu
145 150 155 160
Lys Glu Ala Leu Lys Arg Val Leu Asn Lys Leu Lys Gly Arg Phe Tyr
165 170 175
Phe His Val Phe Val Gln Phe Val Phe Phe Lys Gln Trp Glu Lys Leu
180 185 190
Arg Arg Tyr Ala Arg Glu Arg Gly Ile Ser Ile Val Gly Asp Leu Pro
195 200 205
Met Tyr Pro Ser Tyr Ser Ser Ala Asp Val Trp Thr Asn Pro Glu Leu
210 215 220
Phe Lys Leu Asp Gly Asp Leu Lys Pro Leu Phe Val Ala Gly Val Pro
225 230 235 240
Pro Asp Phe Phe Ser Lys Thr Gly Gln Leu Trp Gly Asn Pro Val Tyr
245 250 255
Asn Trp Glu Glu His Glu Lys Glu Gly Phe Arg Trp Trp Ile Arg Arg
260 265 270
Val His His Asn Leu Lys Leu Phe Asp Phe Leu Arg Leu Asp His Phe
275 280 285
Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Glu Val Pro Tyr Gly Glu Glu Thr Ala
290 295 300
Val Asn Gly Arg Trp Val Lys Ala Pro Gly Lys Thr Leu Phe Lys Lys
305 310 315 320
Leu Leu Ser Tyr Phe Pro Lys Asn Pro Phe Ile Ala Glu Asp Leu Gly
325 330 335
Phe Ile Thr Asp Glu Val Arg Tyr Leu Arg Glu Thr Phe Lys Ile Pro
340 345 350
Gly Ser Arg Val Ile Glu Phe Ala Phe Tyr Asp Lys Glu Ser Glu His
355 360 365
Leu Pro His Asn Val Glu Glu Asn Asn Val Tyr Tyr Thr Ser Thr His
370 375 380
Asp Leu Pro Pro Ile Arg Gly Trp Phe Glu Asn Leu Gly Glu Glu Ser
385 390 395 400
Arg Lys Arg Leu Phe Glu Tyr Leu Gly Arg Glu Ile Lys Glu Glu Lys
405 410 415
Val Asn Glu Glu Leu Ile Arg Leu Val Leu Ile Ser Arg Ala Lys Phe
420 425 430
Ala Ile Ile Gln Met Gln Asp Leu Leu Asn Leu Gly Asn Glu Ala Arg
435 440 445
Met Asn Tyr Pro Gly Arg Pro Phe Gly Asn Trp Arg Trp Arg Ile Lys
450 455 460
Glu Asp Tyr Thr Gln Lys Lys Glu Phe Ile Lys Lys Leu Leu Gly Ile
465 470 475 480
Tyr Gly Arg Glu
<210> 8
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgagattgg caggtatttt acttcacgta acttcacttc cctctcctta cgggataggg 60
gatctcggaa aagaagccta caggtttctg gacttcttaa aggagtgcgg ttttagcctt 120
tggcaggttc tacctctgaa ccccacttca cttgaggcgg gaaactcacc ctacagttca 180
aactccctct tcgcgggcaa ttacgtacta atagaccctg aagaattatt ggaggaggac 240
ttaataaaag aaagggactt aaaaagattt cccttgggtg aagcccttta cgaagtcgtg 300
tacgagtata aaaaagagtt gctcgaaaaa gcctttaaaa atttcaggag atttgaactg 360
cttgaagatt ttctgaagga acactcttac tggctcagag attacgcact ttacatggct 420
ataaaagaag aagagggaaa ggagtggtat gaatgggatg aagaattgaa gaggagagaa 480
aaagaggctt taaaaagggt gttaaataag ttaaagggga ggttttactt ccacgtattc 540
gtccagtttg ttttcttcaa gcagtgggaa aaactgagaa gatacgcaag ggaaaggggg 600
ataagcatag ttggagatct tccaatgtac ccctcgtact caagtgcgga cgtgtggaca 660
aatcctgaac tttttaaact ggacggagat ttaaaacccc tttttgtagc gggtgttcct 720
cctgattttt tcagtaaaac gggacagctg tggggaaatc ccgtttacaa ctgggaagaa 780
cacgaaaagg aaggcttcag atggtggata aggagagttc atcacaactt aaaactcttt 840
gactttttaa gacttgacca cttcagggga tttgaggcgt actgggaggt tccttacggt 900
gaagaaactg cggtaaacgg aaggtgggta aaggctcccg gaaagacact atttaaaaaa 960
ctcttatcat acttcccgaa gaacccattc atagcggagg acttaggttt tataacggac 1020
gaagtgaggt acttgaggga aacttttaaa atcccgggaa gcagagttat tgagtttgcc 1080
ttctacgata aggaaagtga gcaccttccc cacaacgttg aagagaacaa cgtttactac 1140
acttcaactc atgaccttcc tccgataaga ggatggtttg agaatttagg agaagaatca 1200
agaaaacgat tatttgaata cttgggaagg gagattaaag aggaaaaagt taacgaggag 1260
cttataagac tcgttttaat ctcaagggcg aagttcgcaa taatccagat gcaggactta 1320
ctcaatctcg gcaatgaagc gaggatgaat taccccggaa gacctttcgg aaattggagg 1380
tggagaataa aggaagatta cacacaaaag aaggaattta ttaaaaaact cctcggaatt 1440
tacggaagag aagtttaa 1458

Claims (11)

1.一种角质酶突变体，其特征在于，所述角质酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角质酶的第209位氨基酸突变为丙氨酸得到的；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角质酶的第207位和第209位氨基酸同时突变为丙氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述重组载体的重组细胞。
5.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，共表达了权利要求1所述的角质酶突变体与胞内蛋白。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述胞内蛋白包括但不限于木糖异构酶、4,6-α-葡萄糖基转移酶、4-α-糖基转移酶、海藻糖合酶和分支酶。
7.根据权利要求6所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌WS5、枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌W600、枯草芽孢杆菌W800、枯草芽孢杆菌RIK1285中的任一为表达宿主。
8.根据权利要求6所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以pHY300PLK、PUB110、pBE-S、pWB980中的任一为表达载体。
9.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体在促进枯草芽孢杆菌将重组胞内酶在胞外表达的中应用。
10.一种生产胞外蛋白的方法，其特征在于，将权利要求5~8任一所述的重组枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中，得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集发酵上清液。
11.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4所述的重组细胞，或权利要求5~8任一所述的重组枯草芽孢杆菌在发酵产酶或参与酶解催化反应方面的应用。
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