CN112831488A - 一种谷氨酸脱羧酶及γ-氨基丁酸高产菌株 - Google Patents

一种谷氨酸脱羧酶及γ-氨基丁酸高产菌株 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域，涉及一种酶活及稳定性提高的谷氨酸脱羧酶，以及高密度发酵生产γ‑氨基丁酸的方法。所述谷氨酸脱羧酶突变体，是在SEQ ID NO.1所示的来源于大肠杆菌MG1655的野生型谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的基础上，发生T62S或Q309A突变所得，酶活较野生型提高4‑13％，pH稳定性较野生型提高6‑10％，温度稳定性较野生型提高19‑27％。同时过表达上述突变体编码基因的大肠杆菌重组菌生产γ‑氨基丁酸的能力也稳步提升，具有较高的生产应用价值。

Description

一种谷氨酸脱羧酶及γ-氨基丁酸高产菌株
技术领域：
本发明公开一种酶活及稳定性提高的谷氨酸脱羧酶，以及高密度发酵生产γ-氨基丁酸的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种极易溶于水的非蛋白质氨基酸，被广泛应用于食品和制药工业中，市场需求量极大。可通过化学合成法、植物富集法、生物转化法和微生物直接发酵法生产。
化学合成法常见的原料如下：邻二甲苯和γ-氯丁氰或丁内酯、吡咯烷酮和氯化钙及碳酸氢铵、丁酸和氨水、丙氨和甲酸、溴醋酸甲酯和乙烯。化学合成GABA的产量相对较高，但这一系列操作过程较繁琐，设备成本高，且生产所用化学试剂对人体有害，安全性差，难以控制，很难实现工业化的生产。因此，化学合成法生产GABA的工艺还需要改进。
植物富集法生产GABA如下：第一种方法利用了植物GABA支路途径中的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD),它可将谷氨酸α-脱羧生成GABA和CO2。第二种方法利用了植物的多胺降解途径，此途径以多胺为底物，经GAD、二胺氧化物、多胺氧化物等物质的催化，生成GABA。植物富集法相对于化学合成法操作简单、安全性好。但是其生产效率低，分离难度大，获得的GABA含量少，从而使得生产成本较高。
微生物直接发酵法是指利用具有产GABA能力的菌株，在满足菌株正常生长的营养环境中，发酵生成GABA的方法。在这个过程中，利用了微生物具有合成自身所需GABA的能力，即利用了微生物的代谢调控机制。直接通过发酵生产GABA，周期比较长，且不同菌株的遗传特性不同，产GABA的能力也有差距，在后期的分离提纯环节中，操作较为繁琐。
生物转化法是指微生物在代谢过程中产生的一类或一系列酶对底物的催化或修饰反应。即在GABA的生产中，底物利用酶的催化作用，直接生成GABA。这种生产方法具有可选择的微生物种类多、酶系丰富、特异选择性高、条件温和、转化率高、污染小、分离提纯方便等优点。随着现代生物技术的发展，理性改造和半理性改造为培育出更多性能优越的GABA生产菌株提供了新思路。
大肠杆菌是很早确定了的具有产GABA能力的菌株，所以利用大肠杆直接发酵生产比较成熟。而直接发酵生产GABA的原理是，谷氨酸脱羧酶在依赖于辅酶磷酸吡哆醛(PLP)的情况下，催化L-谷氨酸脱去羧基，释放出一分子CO2，进而得到GABA。在自然界中，各种菌种因谷氨酸脱羧酶活性的不同，他们产GABA的能力也有着很大区别。其次，将筛选好的大肠杆菌用于直接发酵，环境因素也会影响大肠杆菌细胞的生长，进而影响GABA的产量，加之野生菌株的不稳定性，就很难控制直接发酵过程中的发酵条件。随着生物技术的发展，利用大肠杆菌生物法高效合成GABA的技术得到重视。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明通过将大肠杆菌(Escherichia coli)K-12MG1655来源的谷氨酸脱羧酶(以下简称GAD)进行定点突变，获得两个酶活及稳定性提高的谷氨酸脱羧酶，且用定点突变菌株进行高密度发酵时，γ-氨基丁酸的比生产速率显著提高，为扩大及稳定生产GABA提供了参考。
本发明提供的技术方案之一，是一种谷氨酸脱羧酶突变体，是在SEQ ID NO.1所示的来源于大肠杆菌MG1655的野生型谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的基础上，发生第62位氨基酸突变-T62S或第309位氨基酸突变-Q309A所得(以下简称T62S突变体或Q309A突变体)；
具体的，所述谷氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或5所示；进一步地，所述谷氨酸脱羧酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或6所示；
T62S突变体或Q309A突变体具有如下酶学性质：
(1)在温度为37℃时，最适反应pH为4.3，此时GAD的相对酶活最高，T62S突变体或Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，分别为104％、113％；
(2)在温度为4℃，pH 6.5下保持12h，T62S突变体和Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，由野生型的18％提高到24％和28％，T62S突变体和Q309A突变体相对于野生型GAD的pH稳定性得到提高；
(3)在pH为4.3，最适反应温度为37℃，此时GAD的相对酶活最高，T62S突变体和Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，分别为104％、113％；
(4)在pH为4.3，温度45℃下保持12h，T62S突变体和Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，由野生型的22％提高到41％和49％。T62S突变体和Q309A突变体相对于野生型GAD的热稳定性得到提高。
本发明提供的技术方案之二，是一株高产γ-氨基丁酸的大肠杆菌重组菌，所述大肠杆菌重组菌，是将大肠杆菌宿主中表达T62S突变体或Q309A突变体编码基因所得；
优选地，所述大肠杆菌宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)；
进一步地，所述大肠杆菌重组菌的构建方法如下：
以质粒pET30a-gadB为模板设计引物，通过PCR扩增反应获得含有突变点的重组质粒pET30a-gadB-T/S、pET30a-gadB-Q/A，转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达。
具体地，获得突变菌株的方法如下:
(1)突变载体的构建
以质粒pET30a-gadB为模板设计引物，通过PCR扩增反应获得含有突变点的重组质粒pET30a-gadB-T/S,pET30a-gadB-Q/A；
将两个重组质粒分别转化至DH5α感受态细胞中，筛选转化子，获得重组菌株，提取质粒测序；
(2)含突变体的基因工程菌的获得
将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE3)细胞中诱导表达，筛选转化子，获得重组菌株.
本发明提供的技术方案之三，是上述重组菌在生产GABA中的应用，特别是发酵生产GABA中的应用，方法如下：
(1)摇瓶发酵
将培养好的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，控制pH在6.0-7.0之间，温度在36.5-37.5℃之间，180-200r/min，摇瓶发酵48-50h。
进一步地，种子培养基组成为：葡萄糖1g，蔗糖0.5g，酵母粉1g，豆粕粉1.5g，NaCl0.2g，K2HPO4 0.1g，尿素0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，丁二酸0.03g，蒸馏水100ml；调节pH至6.5-7.0，115℃灭菌30min后，冷却至室温。
进一步地，摇瓶发酵培养基组成为：(a)L-谷氨酸3g，葡萄糖4g，蔗糖2g，酵母粉10g，豆粕粉15g，NaCl 0.6g，尿素0.5g，K2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，丁二酸0.1g，蛋氨酸0.5g，甘氨酸0.5g，蒸馏水90ml；115℃灭菌30min后，冷却至室温。(b)维生素B2 1μg，生物素1μg，PLP 1.5mg，常温无菌水10ml。将(a)和(b)混匀，pH不调。
经过48h的摇瓶发酵，野生型重组菌株，T62S重组菌株，Q309A重组菌株发酵液中GABA浓度分别为18.14g/L，19.90g/L，22.85g/L，产率分别为65.02％，70.87％，81.79％；
(2)发酵罐发酵
将培养好的种子液以5-10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵培养基中PLP的终浓度为60μmol/L，待OD600达到50左右，添加终浓度0.2mM IPTG进行诱导。
发酵中控制pH在6.0-7.0之间，温度在36.5-37.5℃之间，转速为220～240r/min，溶氧量为30％左右；发酵中以恒速补料的方式，将补料培养基加入发酵罐中，控制发酵液中葡萄糖浓度在15-20g/L，控制蔗糖浓度为3-5g/L，控制L-谷氨酸含量在45-50g/L，发酵时长30-32h。
进一步地，种子培养基组成为：葡萄糖10g，蔗糖5g，酵母粉10g，豆粕粉15g，NaCl2g，K2HPO4 1g，尿素3g，MgSO4·7H2O 0.5g，丁二酸0.3g；调节pH至6.5-7.0，121℃，蒸馏水1L；调节pH至6.5-7.0，115℃灭菌30min后，冷却至室温。
进一步地，发酵培养基组成为：(c)L-谷氨酸30g，葡萄糖40g，蔗糖20g，酵母粉100g，豆粕粉150g，NaCl 6g，尿素5g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 1g，丁二酸1g，蛋氨酸5g，甘氨酸5g，蒸馏水900mL；pH不调，115℃灭菌30min后，冷却至室温。(d)维生素B2 10μg，生物素10μg，PLP 15mg，常温无菌水100ml。将(c)和(d)混匀，pH不调。
进一步地，补料培养基组成为：葡萄糖100g，蒸馏水500ml；蔗糖50g，蒸馏水500ml；L-谷氨酸200g，蒸馏水500ml；115℃分开灭菌30min，冷却至室温后混匀，用于补料。
高密度发酵30h后，野生型重组菌株，T62S重组菌株，Q309A重组菌株发酵液中GABA浓度分别为219.09g/L，238.42g/L，276.66g/L，产率分别为78.02％，85.04％，98.58％。
有益效果：
1、本发明获得的谷氨酸脱羧酶突变体T62S或Q309A相对于野生型酶活及稳定性均得以提高，37℃，pH为4.3时，酶活分别为野生型的104％和113％；在温度为4℃，pH 6.5下保持12h，T62S突变体和Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，由野生型的18％提高到24％和28％；在pH为4.3，温度45℃下保持12h，T62S突变体和Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，由野生型的22％提高到41％和49％。
2、采用谷氨酸脱羧酶突变体T62S或Q309A编码基因构建的GABA生产菌株较野生型基因的生产菌株GABA的产量均有较高提升，经过48h的摇瓶发酵，野生型重组菌株，T62S重组菌株，Q309A重组菌株发酵液中GABA浓度分别为18.14g/L，19.90g/L，22.85g/L，产率分别为65.02％，70.87％，81.79％；高密度发酵30h后，野生型重组菌株，T62S重组菌株，Q309A重组菌株发酵液中GABA浓度分别为219.09g/L，238.42g/L，276.66g/L，产率分别为78.02％，85.04％，98.58％。
附图说明：
图1SDS-PAGE分析；
图中M为Marker，1为野生型的谷氨酸脱羧酶蛋白条带，2为T62S蛋白条带，3为Q309A蛋白条带。
图2酶活测定曲线；
其中，a-GAD在不同pH下的相对酶活；b-GAD的pH稳定性；c-GAD在不同温度下的相对酶；d-GAD的热稳定性；
gad B为本发明野生型GAD，gad B-62为T62S突变体；gad B-309为Q309A突变体；
图3摇瓶发酵的生长曲线；
图4摇瓶发酵的GABA的积累曲线；
图5发酵罐发酵的生长曲线；
图6发酵罐发酵的GABA的积累曲线；
图3-6中，gad B为本发明野生型GAD重组菌株，gad B-62为含有T62S突变体编码基因的重组菌株；gad B-309为含有Q309A突变体编码基因的重组菌株。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明采用的GAD酶活测定方法：
酶活力单位定义：在反应液中，每分钟催化底物生成1μmolγ-氨基丁酸所需的酶量为1个活力单位(U)。
配制成980μL(含0.05mM PLP、200mM L-谷氨酸钠)底物缓冲液，20μL突变前、后经过纯化的GAD酶蛋白液(待测酶液，超纯水稀释至浓度为10mg/mL)，混匀，总反应液为1ml，反应液的pH使用磷酸盐缓冲液调节。在不同条件下反应后用高效液相色谱法测定GABA的含量，以确定突变前后GAD的催化性能：
(1)37℃下，分别将突变前后经纯化的酶液在不同pH(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.3，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5)的反应液(含980μL底物缓冲液和20μLGAD酶蛋白液)中反应1h后，80℃热水浴15min灭活GAD酶蛋白，离心，上清液过0.45μm的滤膜，最后使用高效液相色谱法测定GABA的含量，考察GAD的相对酶活。
(2)在4℃下，分别将GAD酶蛋白液(待测酶液，超纯水稀释至浓度为10mg/mL)，在不同pH(3.5，4.0，4.3，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5)下保持12h后，与底物缓冲液(含0.05mM PLP、200mM L-谷氨酸钠)混匀，在37℃，pH 4.3下反应1h，再80℃热水浴15min灭活GAD酶蛋白，离心，上清液过0.45μm的滤膜，最后使用高效液相色谱法测定GABA的含量，考察GAD的相对酶活。
(3)分别将pH4.3的反应液(含980μL底物缓冲液和20μL GAD酶蛋白液)在不同温度(25℃，28℃，31℃，34℃，37℃，40℃，43℃，46℃)下反应1h后，80℃热水浴15min灭活GAD，离心，上清液过0.45μm的滤膜，最后使用高效液相色谱法测定GABA的含量，考察GAD的相对酶活。
(4分别将pH 4.3的GAD酶蛋白液(待测酶液，超纯水稀释至浓度为10mg/mL)，在不同温度(15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)下保持12h后，与底物缓冲液(含0.05mMPLP、200mM L-谷氨酸钠)混匀，在37℃，pH 4.3下反应1h，再80℃热水浴15min灭活GAD酶蛋白，离心，上清液过0.45μm的滤膜，最后使用高效液相色谱法测定GABA的含量，考察GAD的相对酶活。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1突变表达质粒的构建及重组菌株的获得
根据KEGG中大肠杆菌Escherichia coli K-12MG1655谷氨酸脱羧酶gad B的基因序列(SEQ ID NO.2所示)，设计能扩增出gad B基因全长的正、反向引物(引物1和引物2)。再设计用于62号氨基酸定点突变的正、反向引物(引物3和引物4)，用于309号氨基酸定点突变的正、反向引物(引物5和引物6)。利用PCR扩增反应获得突变基因。
引物1 5'-ACGC(GTCGAC)ATGGATAAGAAGCAAGTAACGGA-3'
引物2 5'-CCG(CTCGAG)TCAGGTATGTTTAAAGCTGTTCTGT-3'
引物3 5'-GGTCTGGCAGAAAGAGGCCAGGTTCTGAC-3'
引物4 5'-GTCAGAACCTGGCCTCTTTCTGCCAGACC-3'
引物5 5'-GATGGCAAAAGTACCAATTGCACCACCCAGGTAGTCAACG-3'
引物6 5'-CGTTGACTACCTGGGTGGTGCAATTGGTACTTTTGCCATC-3'
提取大肠杆菌Escherichia coli K-12MG1655的DAN作为模板，用引物1和引物2进行扩增。
PCR反应条件1：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸5min，4℃保存。
将所得的基因片段经酶切胶回收后与pET30a连接，转化至DH5α感受态细胞中，筛选转化子，提取质粒测序。将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE3)细胞中，筛选转化子，获得含有野生型GAD的重组菌株。
以提取的重组质粒为模板，用引物3和引物4进行扩增，获得含有T62S突变点的质粒。
PCR反应条件2:95℃预变性5min，95℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸6min，72℃延伸5min，4℃保存。
以提取的重组质粒为模板，用引物5和引物6进行扩增，获得含有Q309A突变点的质粒。
PCR反应条件3：95℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火40s，72℃延伸6min，72℃延伸5min，4℃保存。
将扩增所得质粒，加入DpnI消化酶消化掉甲基化模板后，转化至DH5α感受态细胞中，筛选转化子，获得重组菌株，提取质粒测序，质粒中含gad B目的片段的正确序列如SEQID NO.4和SEQ ID NO.6所示。将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE3)细胞中，筛选转化子，分别获得含有T62S突变体编码基因和Q309A突变体编码基因的重组菌株。
实施例2含突变点重组菌株GAD的表达及纯化
在SOB固体培养基平板上挑选实施例1获得的含有野生型GAD的重组菌株、含有T62S突变体编码基因和Q309A突变体编码基因的重组菌株的菌落，分别接种至含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，37℃180r/min培养到OD600为0.7-0.8左右。取一部分菌液作为对照组，其他的菌液加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，16℃，150r/min诱导8h。
将过夜诱导表达的菌液于12000r/min，4℃离心5min，收集菌体，用pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体，超声波破碎细胞，然后经0.45μm滤膜过滤，获得蛋白质，由于选用表达载体Pet-30a中含有His蛋白编码序列，经过镍柱纯化GAD，获得纯化后的谷氨酸脱羧酶蛋白，如图1SDS-PAGE分析，检测到突变前后GAD均能在53kDa处出现条带。
实施例3重组菌和突变菌在不同温度及pH下酶活力的测定
配制成980μL(含0.05mM PLP、200mM L-谷氨酸钠)底物缓冲液和20μL纯化后稀释至浓度为10mg/mL的GAD酶蛋白液(由实施例2获得的纯化后的谷氨酸脱羧酶蛋白制备)，混匀后总反应液为1ml，反应液的pH使用磷酸盐缓冲液调节。在不同条件下反应后用，高效液相色谱法测定GABA的含量，以确定突变前后GAD的催化性能(以下均以野生型GAD在37℃，pH4.3时的酶活作为100％，计算相对酶活)。
(1)37℃下，分别将突变前后纯化的酶液在不同pH(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.3，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5)的反应液(含980μL底物缓冲液和20μL GAD酶蛋白液)中反应1h后，80℃热水浴15min灭活GAD酶蛋白，离心，上清液过0.45μm的滤膜，最后使用高效液相色谱法测定GABA的含量，考察GAD的相对酶活。
(2)在4℃下，分别将GAD酶蛋白液(待测酶液，超纯水稀释至浓度为10mg/mL)，在不同pH(3.5，4.0，4.3，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5)下保持12h后，与底物缓冲液(含0.05mM PLP、200mM L-谷氨酸钠)混匀，在37℃，pH 4.3下反应1h，再于80℃热水浴15min灭活GAD酶蛋白，离心，上清液过0.45μm的滤膜，最后使用高效液相色谱法测定GABA的含量，考察GAD的相对酶活。
(3)分别将pH4.3的反应液(含980μL底物缓冲液和20μLgad B酶蛋白液)在不同温度(25℃，28℃，31℃，34℃，37℃，40℃，43℃，46℃)下反应1h后，80℃热水浴15min灭活gadB酶蛋白，离心，上清液过0.45μm的滤膜，最后使用高效液相色谱法测定GABA的含量，考察GAD的相对酶活。
(4)分别将pH 4.3的GAD酶蛋白液(待测酶液，超纯水稀释至浓度为10mg/mL)，在不同温度(15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)下保持12h后，与底物缓冲液(含0.05mMPLP、200mM L-谷氨酸钠)混匀，在37℃，pH 4.3下反应1h，再于80℃热水浴15min灭活GAD酶蛋白，离心，上清液过0.45μm的滤膜，最后使用高效液相色谱法测定GABA的含量，考察GAD的相对酶活。
流动相的制备：流动相A为醋酸钠缓冲液，pH为7.3，流动相B为乙腈，二者比例为80％：20％。衍生试剂为苯二甲醛(OPA)，于pH为10.0硼酸盐缓冲液中进行衍生反应：吸取硼酸缓冲液80μL，OPA衍生试剂40μL，样品20μL，混合均匀后室温反应5min。衍生结束后，进样测定GABA含量。色谱柱采用月旭C18柱(5μm，4.6×250mm)，流速为1m L/min，检测波长338nm，柱温40℃。
以GABA的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，测定样品GABA含量，考察GAD的相对酶活。
(1)在温度为37℃下，pH 4.3时GAD的相对酶活最高，T62S突变体、Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，分别为104％、113％。如图2a所示；
(2)GAD在靠近中性pH时，稳定性降低而影响GABA产率。GAD酶蛋白液在温度4℃，pH6.5下保持12h，T62S突变体或Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，由原来的18％提高到24％或28％。T62S突变体或Q309A突变体相对于野生型GAD的pH稳定性得到提高。如图2b所示；
(3)在pH为4.3下，温度37℃时GAD的相对酶活最高，T62S突变体或Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，分别为104％、113％。如图2c所示；
(4)GAD在较高温度时，稳定性降低而影响GABA产率。在pH 4.3，温度45℃下保持12h，T62S突变体或Q309A突变体相对于野生型GAD的酶活，由原来的22％提高到41％或49％。T62S突变体或Q309A突变体相对于野生型GAD的热稳定性得到提高。如图2d所示。
实施例4目的菌株高密度发酵生产GABA
生产菌株：实施例1制备的重组菌株。
摇瓶发酵：将已保藏在甘油管中的菌种接至斜面培养基中，活化培养10-12h，然后接种于种子培养基，培养7-8h后，再以2％的接种量接种于250mL的摇瓶中(装液量为50mL发酵培养基)，控制pH为6.0-7.0之间，温度37℃，180-200r/min摇瓶发酵50h。每隔2h取样，测OD值，测葡萄糖、蔗糖，L-谷氨酸、GABA含量。
发酵罐发酵：将已保藏在甘油管中的菌种接至斜面培养基中，活化培养10-12h，然后接种于种子培养基，培养7-8h后，再以10％的接种量接种于5L全自动发酵罐中(装液量为2L发酵培养基，PLP的终浓度为60μmol/L)，待OD600达到50左右，添加终浓度0.2mM IPTG进行诱导。发酵中控制pH为6.5-7.0，控制温度在36.5-37.5之间，220-240r/min，溶氧30％。发酵中采用恒速补料的方式，将补料培养基加入发酵罐中，控制发酵液中葡萄糖浓度在15-20g/L，控制蔗糖浓度为3-5g/L，控制L-谷氨酸含量在45-50g/L，发酵时长30h。
经过48h的摇瓶发酵，野生型重组菌株，T62S重组菌株，Q309A重组菌株发酵液中GABA浓度分别为18.14g/L，19.90g/L，22.85g/L，产率分别为65.02％，70.87％，81.79％；图2和图3为摇瓶发酵的生长曲线及GABA的积累曲线。
发酵罐高密度发酵30h后，野生型重组菌株，T62S重组菌株，Q309A重组菌株发酵液中GABA浓度分别为219.09g/L，238.42g/L，276.66g/L，产率分别为78.02％，85.04％，98.58％；图4和图5为发酵罐发酵的生长曲线及发酵罐发酵的GABA的积累曲线。
本实施例所用培养基如下：
摇瓶种子培养基组成为：葡萄糖1g，蔗糖0.5g，酵母粉1g，豆粕粉1.5g，NaCl 0.2g，K2HPO4 0.1g，尿素0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，丁二酸0.03g，蒸馏水100ml；调节pH至6.5-7.0，115℃灭菌30min后，冷却至室温。
摇瓶发酵培养基组成为：(a)L-谷氨酸3g，葡萄糖4g，蔗糖2g，酵母粉10g，豆粕粉15g，NaCl 0.6g，尿素0.5g，K2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，丁二酸0.1g，蛋氨酸0.5g，甘氨酸0.5g，蒸馏水90ml；115℃，灭菌30min后，冷却至室温。(b)维生素B2 1μg，生物素1μg，PLP1.5mg，常温无菌水10ml。将(a)和(b)混匀，pH不调。
发酵罐种子培养基组成为：葡萄糖10g，蔗糖5g，酵母粉10g，豆粕粉15g，NaCl 2g，K2HPO4 1g，尿素3g，MgSO4·7H2O 0.5g，丁二酸0.3g；调节pH至6.5-7.0，121℃，蒸馏水1L；调节pH至6.5-7.0，115℃灭菌30min后，冷却至室温。
发酵罐发酵培养基组成为：(c)L-谷氨酸30g，葡萄糖40g，蔗糖20g，酵母粉100g，豆粕粉150g，NaCl 6g，尿素5g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 1g，丁二酸1g，蛋氨酸5g，甘氨酸5g，蒸馏水900mL；pH不调，115℃灭菌30min后，冷却至室温。(d)维生素B2 10μg，生物素10μg，PLP15mg，常温无菌水100ml。将(c)和(d)混匀，pH不调。
发酵罐补料培养基组成为：葡萄糖100g，蒸馏水500ml；蔗糖50g，蒸馏水500ml；L-谷氨酸200g，蒸馏水500ml；115℃分开灭菌30min，冷却至室温后混匀，用于补料。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权力要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁夏大学
<120> 一种谷氨酸脱羧酶及γ-氨基丁酸高产菌株
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）K-12 MG1655
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Claims (10)

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，是在SEQ ID NO.1所示野生型谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的基础上发生第62位氨基酸由T突变为S或第309位氨基酸由Q突变为A所得的谷氨酸脱羧酶突变体，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3或5所示。
2.权利要求1所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID NO.4或6所示。
4.包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，是在大肠杆菌宿主细胞中表达权利要求1所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因所得。
6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述大肠杆菌宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，所述谷氨酸脱羧酶突变体编码基因如序列表SEQ ID NO.4或6所示。
7.权利要求1所述谷氨酸脱羧酶突变体在生产γ-氨基丁酸中的应用。
8.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产γ-氨基丁酸中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，采用所述重组菌株摇瓶发酵生产γ-氨基丁酸的方法如下：将培养好的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，控制pH在6.0-7.0之间，温度在36.5-37.5℃之间，180-200r/min，摇瓶发酵48-50h。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，采用所述重组菌株发酵罐发酵生产γ-氨基丁酸的方法如下：将培养好的种子液以5-10％的接种量接种于发酵培养基中，待OD600达到50左右，添加终浓度0.2mM IPTG进行诱导；
发酵中控制pH在6.0-7.0之间，温度在36.5-37.5℃之间，转速为220～240r/min，溶氧量为30％左右；发酵中以恒速补料的方式，将补料培养基加入发酵罐中，控制发酵液中葡萄糖浓度在15-20g/L，控制蔗糖浓度为3-5g/L，控制L-谷氨酸含量在45-50g/L，发酵时长30-32h。
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