CN113355312B

CN113355312B - 大肠杆菌l-谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用

Info

Publication number: CN113355312B
Application number: CN202110687582.5A
Authority: CN
Inventors: 徐沙; 石贵阳; 李方迪; 顾正华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2021-06-21
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-06-21
Also published as: CN113355312A

Abstract

本发明公开了大肠杆菌L‑谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供的大肠杆菌L‑谷氨酸脱羧酶突变体G125F、S126G、S273F、S273G、L276A、G125F/S273F、S273F/L276A、L276A/G125F、G125F/S273F/L276A，所述突变体的大肠杆菌L‑谷氨酸脱羧酶活性比野生型分别提高了20％、19％、36％、13％、29％、42％、46％、41％、53％；GABA的产量较野生型提高了29g/L、27g/L、51g/L、15g/L、34g/L、77g/L、95g/L、72g/L、127g/L，最高可达694g/L。GABA产量的提高更有利于扩大其工业化应用范围。

Description

大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用

技术领域

本发明涉及大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种天然的、四碳非蛋白氨基酸，也称γ-氨酪酸，分子式为C₄H₉NO₂，相对分子质为103.12，由谷氨酸(Glutamic acid，Glu)经谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)催化而来。由于具有降血压、抗抑郁、抗焦虑、改善脑机能等多种生理功能。近来发现GABA还具有抑制肿瘤细胞增殖、改善脑血栓、降低1型糖尿病等功能。尽管GABA具有诸多功能性，但是人体内GABA含量会随着人的年龄以及外界环境压力的增加而日益减少，因此在日常饮食中补充GABA对改善人体健康具有要意义。

GABA生产方法主要有3种，分别是化学合成法、植物富集法、微生物发酵法，它们在实际生产中的应用各不相同。动植物体中天然存在的GABA含量较低导致生产成本较高，因此需要开发GABA的高效生产方法。目前GABA制备方法以化学合成法和微生物合成法为主。化学合成法生产制备GABA的工艺有很多，其工艺生产的GABA纯度高，但生产过程能耗高，对温度要求严格，污染环境，安全性差，成本高，不符合绿色生产的理念，因此这些生产工艺不被业内所推崇。微生物发酵法是利用微生物体内的L-谷氨酸脱羧酶将L-Glu或其盐脱羧转化成GABA，该方法具有专一性高、设备简单、环保、成本低、生产菌种多样且易获得等优点，但是天然L-谷氨酸脱羧酶活和催化稳定性较差，还不能够适用于大规模产业化生产。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的活性，提高GABA的产量，为扩大其工业化应用创造条件。

本发明提供了大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体，所述突变体是将E.coli BL21(DE3)来源的大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)为亲本，在亲本第125位、126位、273位或276位的一个或多个多位突变体。

在一种实施方式中，所述E.coli BL21(DE3)来源的大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第125位甘氨酸(Gly)突变为苯丙氨酸(Phe)，并将突变体命名为G125F。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第126位丝氨酸(Ser)突变为谷氨酸(Gly)，并将突变体命名为S126G。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第273位丝氨酸(Ser)突变为苯丙氨酸(Phe)，并将突变体命名为S273F。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第273位丝氨酸(Ser)突变为谷氨酸(Gly)，突变体命名为S273G。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第276位赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)，突变体命名为L276A。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第125位甘氨酸(Gly)突变为苯丙氨酸(Phe)，并将第273位丝氨酸(Ser)突变为苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为G125F/S273F。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第273位丝氨酸(Ser)突变为苯丙氨酸(Phe)，并将第276位赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)，突变体命名为S273F/L276A。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第276位赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)，并将第125位甘氨酸(Gly)突变为苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为L276A/G125F。

在一种实施方式中，所述突变体是将亲本第125位甘氨酸(Gly)突变为苯丙氨酸(Phe)，第273位丝氨酸(Ser)突变为苯丙氨酸(Phe)、将第276位赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)，突变体命名为G125F/S273F/L276A。

本发明提供了编码所述大肠杆菌谷氨酸脱羧酶突变体的基因。

本发明提供了携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列。

在一种实施方式中，所述表达载体包括pET-28a。

本发明提供了表达所述大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体，或含有所述编码所述大肠杆菌谷氨酸脱羧酶突变体的基因的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为宿主。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于E.coli BL21(DE3)系列。

本发明提供了一种生产大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的方法，所述方法是将所述微生物细胞在37℃、220r/min培养8-9h，获得种子液；以1～3％(1～3mL/100mL)接种量将种子液接入TB培养基，37℃、220r/min下培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG继续培养，培养12h后，收集细胞。

本发明提供了一种生产γ-氨基丁酸的方法，所述方法是利用所述大肠杆菌谷氨酸脱羧酶突变体催化L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸。

在一种实施方式中，将所述微生物细胞在37℃、220r/min培养8-9h，获得种子液；以2％(2mL/100mL)接种量将种子液接入TB培养基，37℃、220r/min下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG继续培养，培养12h后，收集细胞。

在一种实施方式中，将得到的细胞加入含有反应体系中含有磷酸吡哆醛0.5mM。

在一种实施方式中，所述细胞在反应体系中的浓度为20～30g/L。

在一种实施方式中，细胞在反应体系中的浓度优选为25g/L。

在一种实施方式中，每1～2h向反应体系中加入等量的L-谷氨酸，在35～40℃，搅拌转速50～100rpm下反应。

在一种实施方式中，分别在反应的0h，1.0h，2.0h，3.5h，5.5h，7.5h，8.5h，11h添加160g的L-谷氨酸。

在一种实施方式中，在38℃，搅拌转速60rpm下反应至L-谷氨酸固体消失。

本发明提供了所述大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体，或所述基因，或所述微生物细胞在水解L-谷氨酸或L-谷氨酸衍生物中的应用。

本发明提供了所述大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体，或所述基因，或所述微生物细胞在生产γ-氨基丁酸中的应用。

有益效果：本发明提供了大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶酶活提高的突变体，以L-谷氨酸为底物，突变体G125F、S126G、S273F、S273G、L276A、G125F/S273F、S273F/L276A、L276A/G125F、G125F/S273F/L276A的大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶活性比野生型分别提高了20％、19％、36％、13％、29％、42％、46％、41％、53％；GABA的产量较野生型提高了29g/L、27g/L、51g/L、15g/L、34g/L、77g/L、95g/L、63g/L、127g/L。

具体实施方式

LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，加入1L去离子水灭菌，121℃，20min。

培养细胞培养基(发酵培养基)：

TB培养基：酵母粉24g，蛋白胨12g，KH₂PO₄2.31 g，K₂HPO₄ 12.54g，甘油4mL。

实施例1：野生型大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的表达

(1)野生型大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的构建

以大肠杆菌E.coli基因组为模板，用设计好的引物GAD-F/GAD-R进行PCR扩增得到基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，经过琼脂糖凝胶检测后，进行回收纯化，引物序列见表1，纯化之后的片段通过同源重组克隆到载体pET-28a中，载体由引物pET28a-F/pET28a-R以pET-28a为模版扩增得到，经E.coli JM109扩增后，通过DNA测序(Sangon，China)证实表达质粒(pET-28a-GAD)正确构建，将成功构建的质粒转化到E.coli BL21(DE3)。

表1实验所需的引物序列

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃3-7min30s)；72℃继续延伸10min。

将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中37℃培养12h.挑取单菌落接种于5mL的LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的kana抗生素，37℃、220r/min下恒温摇床振荡培养8-9h，将种子接种于50mL的终浓度为50μg/mL的kana抗生素的TB培养基中，37℃、220r/min下恒温摇床振荡培养到OD₆₀₀至0.6-0.8之间，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，30℃、220r/min下继续培养12h。离心收集细胞(6000r/min，5min)，用去离子水洗涤菌体2次，4℃下保存备用。

实施例2：大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体的制备及表达

(1)大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体的构建

利用快速PCR技术，根据实施例1所扩增得到的基因序列(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，分别设计并合成引入G125F、S126G、S273F、S273G、L276A的突变的引物对大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶基因进行定点突变(下划线为突变碱基)。

引入序列G125F突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-accaacaccattTTTtcttccgaggcctgta-3’，

反向引物：5’-tacaggcctcggaagaAAAaatggtgttggt-3’；

引入序列如S126G突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-accaacaccattggtGGTtccgaggcct-3’，

反向引物：5’-aggcctcggaACCaccaatggtgttggt-3’；

引入序列如S273F突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-gaaatcgatcagtgctTTTggccataaattc-3’，

反向引物：5’-gaatttatggccAAAagcactgatcgatttc-3’；

引入序列如S273G突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-gaaatcgatcagtgctGGAggccataaat-3’，

反向引物：5’-atttatggccTCCagcactgatcgatttc-3’；

引入序列如L276A突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-agtgcttcaggccatGCTttcggtctggct-3’，

反向引物：5’-agccagaccgaaAGCatggcctgaagcact-3’。

PCR扩增条件为：98℃预变性5min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃5min30s)；72℃继续延伸10min。

PCR产物经验证正确后，用DpnⅠ消化后转化至大肠杆菌JM109感受态，将感受态细胞在LB固体培养基(含50mg/L kana)培养过夜后，挑克隆于含50mg/L kana的LB液体培养基培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。获得重组菌株，分别命名为G125F、S126G、S273F、S273G、L276A。

(2)突变体酶的表达

将步骤(1)筛选获得的阳性克隆挑取单菌落接种于装有2mL LB培养基的试管中，37℃、220r/min培养8-9h，获得种子液；以2％(2mL/100mL)接种量将种子液转接至50mL的终浓度为50μg/mL的kana抗生素的TB培养基中，37℃、220r/min下恒温摇床振荡培养到OD₆₀₀至0.6-0.8之间，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)继续培养12h。离心收集细胞(6000r/min，5min)，用去离子水洗涤菌体2次，4℃下保存备用(用于酶活测定和全细胞转化)。

实施例3：大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的催化能力分析

(1)L-谷氨酸脱羧酶突变体的酶活测定

1、500μL的反应体系中包含有300μL的水(缓冲液)，100μL菌体(25g/L菌体)；

2、将反应体系在水浴锅中水浴5min，在迅速加入提前预热的L-谷氨酸，反应每组三个平行；

3、反应之后的上清400μL，再依次加入NaCO₃(1M)100μL，硼酸缓冲液(0.2M)500μL，6％苯酚1mL，混合均匀；

4、加入NaClO 200μL，混合均匀后室温放置8min；

5、100℃水浴锅反应10min；

6、立即转移至冰水浴中放置5min；

7、加入2mL 60％的乙醇，混合均匀后室温放置，直至回复室温；

8、在波长640nm测量OD值，并记录；

9、在37℃的条件下每分钟释放1μmol GABA所需要的酶量，定义为一个酶活力单位U。

(2)全细胞转化生产GABA

①全细胞催化体系反应(反应体系1L)：25g/L大肠杆菌湿菌体，0.5mM磷酸吡哆醛，L-谷氨酸分多次添加反应，在0h，1.0h，2.0h，3.5h，5.5h，7.5h，8.5h，11h分别添加160g的L-谷氨酸，转化温度38℃，搅拌转速60rpm。待全细胞催化体系没有固体L-谷氨酸可视为完全转化，结束计量体积，检测GABA浓度。

②反应液L-谷氨酸和γ-氨基丁酸测定方法：

按照法见岛津AJS-01分析方法包说明书分析方法使用岛津液相检测，其中γ-氨基丁酸标样大约在12.9分钟左右出峰，其谷氨酸标样大约在2分钟左右出峰，对其最终反应液稀释后进行检测，其最终产量列于表2。

酶活测定和全细胞转化结果见表2，结果表明，各个突变体的酶活均高于野生型，表达G125F、S126G、S273F、S273G、L276A的重组大肠杆菌的全细胞的相对酶活分别提高了20％、19％、36％、13％、29％。对L-谷氨酸脱羧的能力增加，GABA的产量分别提高了29g/L、27g/L、51g/L、15g/L、34g/L。

表2野生型大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶和单突变体酶的相对酶活及对GABA产量

实施例4：多突变体的制备和表达及酶的性能分析

分别以实施例2构建的突变体G125F、S273F、L276A的质粒作为模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速PCR技术，对携带编码突变体G125F、S273F、L276A的基因的质粒进行定点突变，构建多突变体G125F/S273F、S273F/L276A、L276A/G125F、G125F/S273F/L276A。

分别测序确认大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶多突变体的编码基因是否正确，并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到表达L-谷氨酸脱羧酶多突变的大肠杆菌。按照实施例2和3中的方法，检测突变体的酶活及GABA的产量。

野生型大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶(WT)和突变体全细胞酶活及对GABA生产能力列于表3，结果表明，各个突变体的酶活均高于野生型，分别提高了42％、46％、41％、53％，对L-谷氨酸脱羧的能力增加，GABA的产量提高，分别提高了77g/L(13.58％)、95g/L(16.75％)、72g/L(12.70％)、127g/L(22.40％)。

表3野生型大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶和多突变体酶的相对酶活及对GABA产量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用

<130> BAA210707A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggataaga agcaagtaac ggatttaagg tcggaactac tcgattcacg ttttggtgcg 60

aagtctattt ccactatcgc agaatcaaaa cgttttccgc tgcacgaaat gcgcgacgat 120

gtcgcattcc agattatcaa tgacgaatta tatcttgatg gcaacgctcg tcagaacctg 180

gccactttct gccagacctg ggacgacgaa aatgtccaca aattgatgga tttatccatt 240

aacaaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctgcgttgc 300

gtaaatatgg ttgccgatct gtggcatgcg cctgcgccga aaaatggtca ggccgttggc 360

accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420

tggcgcaagc gtatggaagc tgcaggcaaa ccaacggata aaccaaacct ggtgtgcggt 480

ccggtacaaa tctgctggca taaattcgcc cgctactggg atgtggagct gcgtgagatc 540

cctatgcgcc ccggtcagtt gtttatggac ccgaaacgca tgattgaagc ctgtgacgaa 600

aacaccatcg gcgtggtgcc gactttcggc gtgacctaca ctggtaacta tgagttccca 660

caaccgctgc acgatgcgct ggataaattc caggccgata ccggtatcga catcgacatg 720

cacatcgacg ctgccagcgg tggcttcctg gcaccgttcg tcgccccgga tatcgtctgg 780

gacttccgcc tgccgcgtgt gaaatcgatc agtgcttcag gccataaatt cggtctggct 840

ccgctgggct gcggctgggt tatctggcgt gacgaagaag cgctgccgca ggaactggtg 900

ttcaacgttg actacctggg tggtcaaatt ggtacttttg ccatcaactt ctcccgcccg 960

gcgggtcagg taattgcaca gtactatgaa ttcctgcgcc tcggtcgtga aggctatacc 1020

aaagtacaga acgcctctta ccaggttgcc gcttatctgg cggatgaaat cgccaaactg 1080

gggccgtatg agttcatctg tacgggtcgc ccggacgaag gcatcccggc ggtttgcttc 1140

aaactgaaag atggtgaaga tccgggatac accctgtatg acctctctga acgtctgcgt 1200

ctgcgcggct ggcaggttcc ggccttcact ctcggcggtg aagccaccga catcgtggtg 1260

atgcgcatta tgtgtcgtcg cggcttcgaa atggactttg ctgaactgtt gctggaagac 1320

tacaaagcct ccctgaaata tctcagcgat cacccgaaac tgcagggtat tgcccaacag 1380

aacagcttta aacatacctg a 1401

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe

20 25 30

Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp

35 40 45

Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys

50 55 60

Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile

65 70 75 80

Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile

85 90 95

Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala

100 105 110

Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly

145 150 155 160

Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu

165 170 175

Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys

180 185 190

Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr

195 200 205

Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His

210 215 220

Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met

225 230 235 240

His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro

245 250 255

Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala

260 265 270

Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile

275 280 285

Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp

290 295 300

Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro

305 310 315 320

Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr

340 345 350

Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr

355 360 365

Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp

370 375 380

Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg

385 390 395 400

Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr

405 410 415

Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp

420 425 430

Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu

435 440 445

Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys

450 455 460

His Thr

465

Claims

1.大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体以氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的L-谷氨酸脱羧酶为亲本，将亲本第125位甘氨酸突变为苯丙氨酸。

2.编码权利要求1所述大肠杆菌谷氨酸脱羧酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的表达载体。

4.表达权利要求1所述突变体，或含有权利要求2所述基因的微生物细胞。

5.一种产大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，将权利要求4所述的微生物细胞在TB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.3～0.6mmol/L的IPTG诱导10～13h，将细胞破碎后离心取上清，即得到大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶液。

6.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体、或权利要求4所述微生物细胞水解L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求4所述的微生物细胞在TB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.3～0.6mmol/L的IPTG诱导10～13h，收集细胞；将细胞加入含有磷酸吡哆醛和L-谷氨酸的反应体系中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在每1～2h向反应体系中加入等量的L-谷氨酸，在35～40℃，搅拌转速50～100rpm下反应。

9.权利要求1所述大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求4所述微生物细胞在水解L-谷氨酸或生产γ-氨基丁酸中的应用。