CN112899260A

CN112899260A - 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用

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Publication number: CN112899260A
Application number: CN202110295291.1A
Authority: CN
Inventors: 尚海涛; 汪阳; 穆晓玲
Original assignee: Nanjing Hyde Bioengineering Co ltd
Current assignee: Nanjing Hyde Bioengineering Co ltd
Priority date: 2021-03-19
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-03-19
Also published as: CN112899260B

Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体。本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体与野生型谷氨酸脱羧酶相比，在更宽的pH值范围内能够保持较高的活性，且结构稳定性和热稳定性均得到明显提高。本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体可以用于催化L‑谷氨酸制备γ‑氨基丁酸，反应过程中不调控pH值的条件下，仍能实现较高的转化率。

Description

一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程和微生物工程技术领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric，简称GABA)是一种天然活性成分，广泛分布于动植物体内。植物如豆属、参属、中草药等的种子、根茎和组织液中都含有γ-氨基丁酸。在动物体内，γ-氨基丁酸几乎只存在于神经组织中，其中脑组织中的含量大约为0.1-0.6mg/克组织，免疫学研究表明，其浓度最高的区域为大脑中黑质。γ-氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，它是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，具有极其重要的生理功能，它能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的γ-氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。2009年9月27日，卫生部批准γ-氨基丁酸为新资源食品，在国内进入崭新纪元，目前，γ-氨基丁酸已被广泛应用于医药、食品保健、化工及农业等行业。

目前，γ-氨基丁酸的制备方法有化学合成法、生物合成法(发酵法和酶转化法)。相比而言，化学合成γ-氨基丁酸安全性差、环境污染严重；生物合成法，具有条件温和、能耗低、产量高等优点而成为主要的生产方法。其中，酶转化法具有转化率高、反应时间短、生产成本低。酶法合成的原理是采用谷氨酸脱羧酶专一、不可逆地催化L-谷氨酸裂解为γ-氨基丁酸和CO₂。目前，化学法已逐渐被生物法所取代。

L-谷氨酸脱羧酶(L-glutamate decarboxylase，GAD)是酶转化法生产γ-氨基丁酸的关键酶。但是，现有的谷氨酸脱羧酶仍然有一些缺陷，缺陷如下：

一方面，现有的谷氨酸脱羧酶最适pH范围窄，例如，来源于短乳杆菌Lactobacillus brevis的谷氨酸脱羧酶，其最适pH范围为pH 4.5，在pH 4.0-pH 5.0之间保留较高活性，当pH低于4.0或高于5.0时，酶活力快速下降；来源于大肠杆菌E.coli的谷氨酸脱羧酶，其最适pH范围为pH 5.0，在pH 4.5-5.5之间保留较高活性，但是当pH低于4.5或高于5.5时，酶活力直线下降，pH 4时酶活力仅为最高酶活力的30％，pH 6.0时酶活力仅为最高酶活力的10％。而谷氨酸脱羧酶用于L-谷氨酸脱羧制备γ-氨基丁酸过程中，不调节pH条件下，初始pH一般只有3.3左右，随着脱羧反应的进行，pH逐渐升高并达到pH 8.0以上。可见，L-谷氨酸脱羧反应过程中pH变化范围较宽，而已有谷氨酸脱羧酶作用pH范围窄，要发挥已有谷氨酸脱羧酶的催化效率，必须通过先流加碱液或流加酸液来调节pH在一个较窄的范围，才能有利于反应的进行。然而，酸碱的添加将导致后续分离纯化压力较大，且生成较多的废弃物；如果不调节pH，目前已有的谷氨酸脱羧酶难以适应上述过程，效率很低。

另一方面，现有的谷氨酸脱羧酶热稳定性有待提高，例如，来源于短乳杆菌Lactobacillus brevis的谷氨酸脱羧酶，其最适温度为40-50℃，在70℃下的半衰期仅有15min；来源于大肠杆菌E.coli的谷氨酸脱羧酶，其最适温度为50℃，在70℃下的半衰期仅有5min。而谷氨酸脱羧酶为胞内酶，应用过程中常以全细胞形式进行催化，一般通过加热来提高细胞膜通透性，热稳定性更好的谷氨酸脱羧酶对工业化应用将更为有利。

上述缺陷均使得现有的谷氨酸脱羧酶无法很好的用于γ-氨基丁酸的工业化生产。因此，亟需找到一种pH范围更广且热稳定性高的谷氨酸脱羧酶。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种pH范围更广且热稳定性高的谷氨酸脱羧酶突变体。

具体而言，本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体，其是将野生型L-谷氨酸脱羧酶的第398位和444位氨基酸进行突变得到的。

作为本发明的优选方案，所述谷氨酸脱羧酶突变体是将野生型L-谷氨酸脱羧酶的第398位的精氨酸突变成半胱氨酸、同时将第444位的丝氨酸突变成半胱氨酸得到的。在本发明中，将上述方案命名为R398C/S444C。

作为本发明的优选方案，所述谷氨酸脱羧酶突变体具有如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。

SEQ ID No:1具体为：

MDQKLLTDFR SELLDSRFGA KAISTIAESK RFPLHEMRDD VAFQIINDEL YLDGNARQNLATFCQTWDDE NVHKLMDLSI NKNWIDKEEY PQSAAIDLRC VNMVADLWHA PAPKNGQAVG TNTIGSSEACMLGGMAMKWR WRKRMEAAGK PTDKPNLVCG PVQICWHKFA RYWDVELREI PMRPGQLFMD PKRMIEACDENTIGVVPTFG VTYTGNYEFP QPLHDALDKF QADTGIDIDM HIDAASGGFL APFVAPDIVW DFRLPRVKSISASGHKFGLA PLGCGWVIWR DEEALPQELV FNVDYLGGQI GTFAINFSRP AGQVIAQYYE FLRLGREGYTKVQNASYQVA AYLADEIAKL GPYEFICTGR PDEGIPAVCF KLKDGEDPGY TLYDLSECLR LRGWQVPAFTLGGEATDIVV MRIMCRRGFE MDFAELLLED YKACLKYLSD HPKLQGIAQQ NSFKHT

本发明的第二目的是提供编码所述谷氨酸脱羧酶突变体的基因序列。

作为本发明的优选方案，所述基因序列具有如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，或与其相似度为90％以上的核苷酸序列。

SEQ ID No:2具体为：

ATGGACCAGA AGCTGTTAAC GGATTTCCGC TCAGAACTAC TCGATTCACG TTTTGGCGCAAAGGCCATTT CTACTATCGC GGAGTCAAAA CGATTTCCGC TGCACGAAAT GCGCGATGAT GTCGCATTTCAGATTATCAA TGATGAATTA TATCTTGATG GCAACGCTCG TCAGAACCTG GCCACTTTCT GCCAGACCTGGGACGACGAA AACGTCCATA AATTGATGGA TTTGTCGATC AATAAAAACT GGATCGACAA AGAAGAATATCCGCAATCCG CAGCCATCGA CCTGCGTTGC GTAAATATGG TTGCCGATCT GTGGCATGCG CCTGCGCCGAAAAATGGTCA GGCCGTTGGC ACCAACACCA TTGGTTCTTC CGAGGCCTGT ATGCTCGGCG GGATGGCGATGAAATGGCGT TGGCGCAAGC GTATGGAAGC TGCAGGCAAA CCAACGGATA AACCAAACCT GGTGTGCGGTCCGGTACAAA TCTGCTGGCA TAAATTCGCC CGCTACTGGG ATGTGGAGCT GCGTGAGATC CCTATGCGCCCCGGTCAGTT GTTTATGGAC CCGAAACGCA TGATTGAAGC CTGTGACGAA AACACCATCG GCGTGGTGCCGACTTTCGGC GTGACCTACA CCGGTAACTA TGAGTTCCCA CAACCGCTGC ACGATGCGCT GGATAAATTCCAGGCCGACA CCGGTATCGA CATCGACATG CACATCGACG CTGCCAGCGG TGGCTTCCTG GCACCGTTCGTCGCCCCGGA TATCGTCTGG GACTTCCGCC TGCCGCGTGT GAAATCGATC AGTGCTTCAG GCCATAAATTCGGTCTGGCT CCGCTGGGCT GCGGCTGGGT TATCTGGCGT GACGAAGAAG CGCTGCCGCA GGAACTGGTGTTCAACGTTG ACTACCTGGG TGGTCAAATT GGTACTTTTG CCATCAACTT CTCCCGCCCG GCGGGTCAGGTAATTGCACA GTACTATGAA TTCCTGCGCC TCGGTCGTGA AGGCTATACC AAAGTACAGA ACGCCTCTTACCAGGTTGCC GCTTATCTGG CGGATGAAAT CGCCAAACTG GGGCCGTATG AGTTCATCTG TACGGGTCGCCCGGACGAAG GCATCCCGGC GGTTTGCTTC AAACTGAAAG ATGGTGAAGA TCCGGGATAC ACCCTGTACGACCTCTCTGA ATGTCTGCGT CTGCGCGGCT GGCAGGTTCC GGCCTTCACT CTCGGCGGTG AAGCCACCGACATCGTGGTG ATGCGCATTA TGTGTCGTCG CGGCTTCGAA ATGGACTTTG CTGAACTGTT GCTGGAAGACTACAAAGCCT GCCTGAAATA TCTCAGCGAT CACCCGAAAC TGCAGGGTAT TGCCCAGCAG AACAGCTTTAAACACACCTG A

本发明的第三目的是提供携带所述基因序列的重组质粒。

作为本发明的优选方案，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。在本发明的一种具体实施方式中，所述重组质粒的载体选用pET24a载体。

作为本发明的优选方案，所述重组质粒采用包括如下步骤的方法制备而成：以插入野生型L-谷氨酸脱羧酶基因序列的载体为模板，采用第398位氨基酸的正向引物SEQ IDNo:3和反向引物SEQ ID No:4，以及第444位氨基酸的正向引物SEQ ID No:5和反向引物SEQID No:6，进行定点突变，获得重组质粒(即突变体质粒)。其中：

SEQ ID No:3为：5’-TCTGAATGTCTGCGTCTGCGC-3’。

SEQ ID No:4为：5’-GCAGACGCAGACATTCAGAGAGGT-3’。

SEQ ID No:5为：5’-TACAAAGCCTGCCTGAAATATCTCAGCG-3’。

SEQ ID No:6为：5’-ATATTTCAGGCAGGCTTTGTAGTCTTCC-3’。

本发明的第四目的是提供表达所述谷氨酸脱羧酶突变体的宿主细胞，所述宿主细胞中外源转入了所述的重组质粒。

作为本发明的优选方案，所述宿主细胞为细菌或真菌。在本发明的一种具体实施方式中，所述宿主为大肠杆菌。

本发明优选提供一种表达所述谷氨酸脱羧酶突变体的重组大肠杆菌。具体而言，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，转化所述重组质粒。

本发明的第五目的是提供所述谷氨酸脱羧酶突变体、所述基因序列、所述重组质粒、所述宿主细胞或所述重组大肠杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。

将本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体应用于谷氨酸脱羧制备γ-氨基丁酸过程中，酶的应用性能发生显著提升，为谷氨酸脱羧酶在γ-氨基丁酸工业生产中的应用提供了有利保障。

本发明的第六目的是一种生产γ-氨基丁酸的方法，该方法利用本发明所述谷氨酸脱羧酶突变体，将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。

作为本发明的一种优选方案，所述方法在反应过程中不进行pH值的调控。本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体最适pH仍为5.0，但是作用pH范围变宽，在pH 4.0～7.0可以保留60％以上的活性，在pH3.5时酶活力为最高酶活力的40％，pH 8.0时酶活力为最高酶活力的30％。因此，采用本发明提供谷氨酸脱羧酶突变体，可以在不加入任何酸性或碱性物质干预pH值的情况下，可以以较高的转化率将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。

作为本发明的一种优选方案，所述方法在温度30～45℃或45～60℃下进行。本发明提供谷氨酸脱羧酶突变体的最适温度提高显著提高，在60℃的半衰期达到3h。针对全细胞催化过程中加热提高细胞膜通透性工艺过程中，本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体更加稳定，不易出现热变性导致的酶活迅速降低现象，有利于该酶工业生产的稳定性。

附图说明

图1为野生型谷氨酸脱羧酶蛋白的三维模拟结构。

图2为谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C的三维模拟结构。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109以及大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET24a载体购自Novagen公司。(上述菌株大肠杆菌JM109、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)均为市售购得)

下述实施例中涉及的培养基如下：

(1)LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、卡那霉素30μg·mL^-1。

(2)LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉15g/L、卡那霉素30μg·mL^-1。

(3)TB培养基：甘油5.0g·L^-1、胰蛋白胨12.0g·L^-1、酵母粉24.0g·L^-1、K₂HPO₄·3H₂O 16.4g·L^-1、KH₂PO₄ 2.3g·L^-1、卡那霉素30μg·mL^-1。

下述实施例中涉及的谷氨酸脱羧酶酶活测定方法如下：

将含有0.1M L-谷氨酸和0.15mM磷酸吡哆醛的pH 5.0 0.1M Na₂HPO₄-50 mM柠檬酸缓冲液的溶液共同组成400μL底物溶液，在37℃恒温水浴锅中预热5分钟。加入200μL适当稀释的谷氨酸脱羧酶粗酶液，37℃反应30分钟。反应结束后，然后用600μL 0.2molL^-1pH＝10硼酸缓冲液终止反应。反应液，煮沸10min后10000rpm离心20min，取上清并采用纯水稀释，经过衍生试剂邻苯二甲醛(OPA)和抗氧化试剂2-巯基乙醇处理后，再用0.22μm水相针式滤器过滤后用于HPLC检测。

检测条件：HPLC为Waters 2695；紫外检测波长338nm；色谱柱5μm(4.6mm×150mm)Eclipse XDB-C18；柱温40℃；流速：0.8mL/min。

酶活单位定义为：在酶活测量体系下，在1分钟内能转化生成1微摩尔γ-氨基丁酸的酶量。

实施例1：谷氨酸脱羧酶酶突变体制备及表达

重组质粒pET24a-gad构建：根据谷氨酸脱羧酶蛋白氨基酸序列(如SEQ ID NO.7所示)，合成其谷氨酸脱羧酶编码基因片段gad(SEQ ID NO.8所示)，并连接至pET24a质粒的酶切位点Nde I和Hind III之间，获得重组质粒pET24a-gad。

所述SEQ ID NO.7具体为：

MDQKLLTDFR SELLDSRFGA KAISTIAESK RFPLHEMRDD VAFQIINDEL YLDGNARQNLATFCQTWDDE NVHKLMDLSI NKNWIDKEEY PQSAAIDLRC VNMVADLWHA PAPKNGQAVG TNTIGSSEACMLGGMAMKWR WRKRMEAAGK PTDKPNLVCG PVQICWHKFA RYWDVELREI PMRPGQLFMD PKRMIEACDENTIGVVPTFG VTYTGNYEFP QPLHDALDKF QADTGIDIDM HIDAASGGFL APFVAPDIVW DFRLPRVKSISASGHKFGLA PLGCGWVIWR DEEALPQELV FNVDYLGGQI GTFAINFSRP AGQVIAQYYE FLRLGREGYTKVQNASYQVA AYLADEIAKL GPYEFICTGR PDEGIPAVCF KLKDGEDPGY TLYDLSERLR LRGWQVPAFTLGGEATDIVV MRIMCRRGFE MDFAELLLED YKASLKYLSD HPKLQGIAQQ NSFKHT

所述SEQ ID NO.8具体为：

ATGGACCAGA AGCTGTTAAC GGATTTCCGC TCAGAACTAC TCGATTCACG TTTTGGCGCAAAGGCCATTT CTACTATCGC GGAGTCAAAA CGATTTCCGC TGCACGAAAT GCGCGATGAT GTCGCATTTCAGATTATCAA TGATGAATTA TATCTTGATG GCAACGCTCG TCAGAACCTG GCCACTTTCT GCCAGACCTGGGACGACGAA AACGTCCATA AATTGATGGA TTTGTCGATC AATAAAAACT GGATCGACAA AGAAGAATATCCGCAATCCG CAGCCATCGA CCTGCGTTGC GTAAATATGG TTGCCGATCT GTGGCATGCG CCTGCGCCGAAAAATGGTCA GGCCGTTGGC ACCAACACCA TTGGTTCTTC CGAGGCCTGT ATGCTCGGCG GGATGGCGATGAAATGGCGT TGGCGCAAGC GTATGGAAGC TGCAGGCAAA CCAACGGATA AACCAAACCT GGTGTGCGGTCCGGTACAAA TCTGCTGGCA TAAATTCGCC CGCTACTGGG ATGTGGAGCT GCGTGAGATC CCTATGCGCCCCGGTCAGTT GTTTATGGAC CCGAAACGCA TGATTGAAGC CTGTGACGAA AACACCATCG GCGTGGTGCCGACTTTCGGC GTGACCTACA CCGGTAACTA TGAGTTCCCA CAACCGCTGC ACGATGCGCT GGATAAATTCCAGGCCGACA CCGGTATCGA CATCGACATG CACATCGACG CTGCCAGCGG TGGCTTCCTG GCACCGTTCGTCGCCCCGGA TATCGTCTGG GACTTCCGCC TGCCGCGTGT GAAATCGATC AGTGCTTCAG GCCATAAATTCGGTCTGGCT CCGCTGGGCT GCGGCTGGGT TATCTGGCGT GACGAAGAAG CGCTGCCGCA GGAACTGGTGTTCAACGTTG ACTACCTGGG TGGTCAAATT GGTACTTTTG CCATCAACTT CTCCCGCCCG GCGGGTCAGGTAATTGCACA GTACTATGAA TTCCTGCGCC TCGGTCGTGA AGGCTATACC AAAGTACAGA ACGCCTCTTACCAGGTTGCC GCTTATCTGG CGGATGAAAT CGCCAAACTG GGGCCGTATG AGTTCATCTG TACGGGTCGCCCGGACGAAG GCATCCCGGC GGTTTGCTTC AAACTGAAAG ATGGTGAAGA TCCGGGATAC ACCCTGTACGACCTCTCTGA ACGTCTGCGT CTGCGCGGCT GGCAGGTTCC GGCCTTCACT CTCGGCGGTG AAGCCACCGACATCGTGGTG ATGCGCATTA TGTGTCGTCG CGGCTTCGAA ATGGACTTTG CTGAACTGTT GCTGGAAGACTACAAAGCCT CCCTGAAATA TCTCAGCGAT CACCCGAAAC TGCAGGGTAT TGCCCAGCAG AACAGCTTTAAACACACCTG A

pET24a-R398C/S444C突变质粒的构建：

首先，突变位点的选择。根据谷氨酸脱羧酶蛋白三维结构(如图1所示)，采用软件分析，从466个氨基酸位点中初步筛选出36个潜在突变位点，再经过进一步筛选，综合考虑多重影响因素，选定398位的精氨酸和444位的丝氨酸进行突变。谷氨酸脱羧酶突变体基因序列(SEQ ID NO.2)构建所用引物如下：

R398C-For：5’-TCTGAATGTCTGCGTCTGCGC-3’(SEQ ID No.3)；

R398C-Rev：5’-GCAGACGCAGACaTTCAGAGAGGT-3’(SEQ ID No.4)；

S444C-For：5’-TACAAAGCCTgCCTGAAATATCTCAGCG-3’(SEQ ID No.5)；

S444C-Rev：5’-ATATTTCAGGcAGGCTTTGTAGTCTTCC-3’(SEQ ID No.6)；

其次，构建突变体。以pET24a-gad质粒为模板，经PCR，引入R398C/S444C定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现其它突变，由此可以判断突变质粒pET24a-R398C/S444C构建成功。

具体步骤如下：

利用全质粒PCR技术，分别以R398C-For/R398C-Rev和S444C-For/S444C-Rev为突变引物，以重组质粒pET24a-gad为模板进行定点突变，获得突变体R398C/S444C。

PCR反应过程：95℃预变性2min；95℃解链20s，55℃退火10s，70℃延伸7min，共30个循环；70℃延伸20min；10℃保温。PCR反应体系参照表。

PCR反应结束后，取2μL的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。确认PCR成功后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下保温反应2h。酶切反应结束后，使用PCR快速纯化试剂盒进行产物纯化。最后取5μL纯化后的PCR产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。然后挑取阳性克隆子进行质粒抽提和DNA测序。将测序成功的突变体质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，于含30μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养8～10h，挑选转化子，此转化子即为含有编码突变体基因的重组菌。构建获得的突变体基因重组菌，用于突变体酶的诱导表达。

分别将含有野生型和编码突变R398C/S444C基因的重组菌分别在LB液体培养基中于37℃培养8～10h，然后接入TB培养基中于37℃培养4h，再用0.4mM异丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)于30℃诱导培养24h，得到发酵液。将发酵液置于4℃、l0000rpm离心20min，收集菌体备用。

实施例2:突变体酶的表达纯化

加入20mL缓冲液(pH 5.0 0.05M Na₂HPO₄-50mM柠檬酸缓冲液)充分悬浮菌体，在冰浴条件下，采用超声波细胞破碎仪进行破碎。超声破碎的条件为：工作时间2s，停止时间3s，共计10min。破碎液低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得粗酶液。粗酶液采用70％的(NH₄)₂SO₄进行盐析，离心收集沉淀；将沉淀复溶于pH 6.8、50mmol·L^-1的磷酸缓冲液中透析20h，中间更换一次缓冲液，得到透析样品；再用0.45μm微孔滤膜过滤后备用。将过滤后样品经DEAE阴离子交换色谱柱进行纯化，280nm紫外在线监测收集目的组分，分部收集含谷氨酸脱羧酶酶活的洗脱液，每管收集1mL液体。将收集的洗脱液置于透析袋中，4℃透析过夜后，得到纯化后的谷氨酸脱羧酶野生酶和突变体酶R398C/S444C。

本实施例所得谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C的三维模拟结构如图2所示。

实施例3：突变前后酶的最适pH及pH作用范围比较

将实施例2中获得的纯化后的野生型谷氨酸脱羧酶酶液和突变体谷氨酸脱羧酶R398C/S444C酶液分别在不同pH条件下，测定谷氨酸脱羧酶酶活，确定最适pH以及在不同pH下相对酶活，并以最高酶活作为100％，计算不同pH条件下的相对酶活。相对酶活(％)＝不同pH下酶活占最高酶活的比例。

结果显示，突变体谷氨酸脱羧酶R398C/S444C最适pH仍为5.0。与野生型谷氨酸脱羧酶相比，突变体谷氨酸脱羧酶R398C/S444C保留发挥催化作用的pH范围明显变宽。突变体谷氨酸脱羧酶R398C/S444C在pH 4.0～7.0可以保留60％以上的活性，在pH 3.5酶活力为最高酶活力的40％，pH 8.0时酶活力为最高酶活力的30％。

实施例4：突变前后酶的最适温度比较

将实施例2中获得的纯化后的野生型谷氨酸脱羧酶酶液和突变体谷氨酸脱羧酶R398C/S444C酶液分别在不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃)条件下，测定谷氨酸脱羧酶酶活，确定最适温度以及在不同温度下相对酶活，并以最高酶活作为100％，计算不同温度条件下的相对酶活。相对酶活(％)＝不同温度下酶活占最高酶活的比例。

结果显示，突变体谷氨酸脱羧酶R398C/S444C最适最适温度提高到65℃，比野生型酶最适温度提高了15℃。同时，突变体谷氨酸脱羧酶R398C/S444C在70℃高温条件下的相对酶活也有一定程度的提高。

实施例5：突变前后酶的热稳定性比较

本发明中谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C的热稳定性和结构稳定性，突变体R398C/S444C的结构稳定性(T_m)和热稳定性(半衰期t_1/2)均得到明显提高。突变体R398C/S444C T_m值由野生酶的53.5℃上升到69.3℃。突变体R398C/S444C在70℃的半衰期(t_1/2)增加到60min，为野生型的12倍(野生型酶在70℃的半衰期为5min)。

实施例6：突变前后酶的催化效率比较

本发明采用谷氨酸脱羧酶酶活测定方法，测定纯化后的野生型谷氨酸脱羧酶和谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C的酶活力。将野生型谷氨酸脱羧酶的酶活定义为相对酶活100％，谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C的相对酶活为97.3％，与野生型酶比活力没有明显变化。

实施例7：突变前后酶的应用比较

1、自动控制pH调节下，突变前后酶在催化谷氨酸脱羧制备γ-氨基丁酸应用中的比较

分别称取200克L-谷氨酸固体，加入到2个900mL去离子水体系中(总体积约1000mL)，检测体系pH，此时pH为3.3-3.4。按照100U/g底物的添加量，分别添加野生型谷氨酸脱羧酶和谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C，控制搅拌转速200rpm，反应温度37℃，设定pH值为5.0，通过自动流加10M/L氢氧化钠溶液和5M/L盐酸溶液控制反应体系pH在5.0附近，反应24h。分别取样用HPLC检测转化体系中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，计算转化率。结果显示，添加野生型谷氨酸脱羧酶转化体系，γ-氨基丁酸摩尔转化率为99.6％；添加谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C的反应体系，γ-氨基丁酸摩尔转化率为99.8％。可见控制pH，突变前后酶转化率没有明显变化。

但是对比发现，谷氨酸脱羧反应过程中，初始pH只有3.3左右，pH控制体系自动流加碱液，调节pH至5.0，此过程约需要消耗100mL10 M/L氢氧化钠溶液。随着脱羧反应的进行，反应体系的pH一直在自行升高，此时pH控制体系自动流加酸液，调节pH至5.0。反应到结束约需要消耗200mL 5M/L盐酸溶液。尽管采用自动控制pH可以达到较好的转化效果，但是需要消耗较多的酸液和碱液。

2、不控制pH，突变前后酶在催化谷氨酸脱羧制备γ-氨基丁酸应用中的比较

分别称取200克L-谷氨酸固体，加入到2个900mL去离子水体系中(总体积约1000mL)，检测体系pH，此时pH为3.3-3.4。按照100U/g底物的添加量，分别添加野生型谷氨酸脱羧酶和谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C，控制搅拌转速200rpm，反应温度37℃，不控制pH，反应24h，分别取样用HPLC检测转化体系中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，计算转化率。

结果显示，添加野生型谷氨酸脱羧酶转化体系，γ-氨基丁酸摩尔转化率为40.2％；添加谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C的反应体系，γ-氨基丁酸摩尔转化率为99.3％。谷氨酸脱羧酶突变体R398C/S444C反应过程中不添加任何的酸碱溶液，即可达到接近调控pH反应过程的转化效果。说明本发明获得的突变体具有更好的操作稳定性，更适合工业化操作过程，在γ-氨基丁酸工业生产中具有更好的应用潜能。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京海德生物工程有限公司

<120> 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用

<130> RYP2010644.7

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 谷氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列

<400> 1

Met Asp Gln Lys Leu Leu Thr Asp Phe Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Phe Gly Ala Lys Ala Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe

20 25 30

Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp

35 40 45

Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys

50 55 60

Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile

65 70 75 80

Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile

85 90 95

Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala

100 105 110

Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly

145 150 155 160

Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu

165 170 175

Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys

180 185 190

Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr

195 200 205

Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His

210 215 220

Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met

225 230 235 240

His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro

245 250 255

Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala

260 265 270

Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile

275 280 285

Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp

290 295 300

Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro

305 310 315 320

Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr

340 345 350

Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr

355 360 365

Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp

370 375 380

Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Cys Leu Arg

385 390 395 400

Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr

405 410 415

Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp

420 425 430

Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Cys Leu Lys Tyr Leu

435 440 445

Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys

450 455 460

His Thr

465

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码谷氨酸脱羧酶突变体的基因序列

<400> 2

atggaccaga agctgttaac ggatttccgc tcagaactac tcgattcacg ttttggcgca 60

aaggccattt ctactatcgc ggagtcaaaa cgatttccgc tgcacgaaat gcgcgatgat 120

gtcgcatttc agattatcaa tgatgaatta tatcttgatg gcaacgctcg tcagaacctg 180

gccactttct gccagacctg ggacgacgaa aacgtccata aattgatgga tttgtcgatc 240

aataaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctgcgttgc 300

gtaaatatgg ttgccgatct gtggcatgcg cctgcgccga aaaatggtca ggccgttggc 360

accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420

tggcgcaagc gtatggaagc tgcaggcaaa ccaacggata aaccaaacct ggtgtgcggt 480

ccggtacaaa tctgctggca taaattcgcc cgctactggg atgtggagct gcgtgagatc 540

cctatgcgcc ccggtcagtt gtttatggac ccgaaacgca tgattgaagc ctgtgacgaa 600

aacaccatcg gcgtggtgcc gactttcggc gtgacctaca ccggtaacta tgagttccca 660

caaccgctgc acgatgcgct ggataaattc caggccgaca ccggtatcga catcgacatg 720

cacatcgacg ctgccagcgg tggcttcctg gcaccgttcg tcgccccgga tatcgtctgg 780

gacttccgcc tgccgcgtgt gaaatcgatc agtgcttcag gccataaatt cggtctggct 840

ccgctgggct gcggctgggt tatctggcgt gacgaagaag cgctgccgca ggaactggtg 900

ttcaacgttg actacctggg tggtcaaatt ggtacttttg ccatcaactt ctcccgcccg 960

gcgggtcagg taattgcaca gtactatgaa ttcctgcgcc tcggtcgtga aggctatacc 1020

aaagtacaga acgcctctta ccaggttgcc gcttatctgg cggatgaaat cgccaaactg 1080

gggccgtatg agttcatctg tacgggtcgc ccggacgaag gcatcccggc ggtttgcttc 1140

aaactgaaag atggtgaaga tccgggatac accctgtacg acctctctga atgtctgcgt 1200

ctgcgcggct ggcaggttcc ggccttcact ctcggcggtg aagccaccga catcgtggtg 1260

atgcgcatta tgtgtcgtcg cggcttcgaa atggactttg ctgaactgtt gctggaagac 1320

tacaaagcct gcctgaaata tctcagcgat cacccgaaac tgcagggtat tgcccagcag 1380

aacagcttta aacacacctg a 1401

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

tctgaatgtc tgcgtctgcg c 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

gcagacgcag acattcagag aggt 24

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

tacaaagcct gcctgaaata tctcagcg 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

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<210> 7

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列

<400> 7

Met Asp Gln Lys Leu Leu Thr Asp Phe Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Phe Gly Ala Lys Ala Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe

20 25 30

Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp

35 40 45

Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys

50 55 60

Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile

65 70 75 80

Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile

85 90 95

Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala

100 105 110

Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly

145 150 155 160

Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu

165 170 175

Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys

180 185 190

Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr

195 200 205

Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His

210 215 220

Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met

225 230 235 240

His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro

245 250 255

Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala

260 265 270

Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile

275 280 285

Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp

290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr

340 345 350

Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr

355 360 365

Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp

370 375 380

Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg

385 390 395 400

Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr

405 410 415

Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp

420 425 430

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435 440 445

Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys

450 455 460

His Thr

465

<210> 8

<211> 1401

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码氨酸脱羧酶的基因序列

<400> 8

atggaccaga agctgttaac ggatttccgc tcagaactac tcgattcacg ttttggcgca 60

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aacagcttta aacacacctg a 1401

Claims

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，是将野生型L-谷氨酸脱羧酶的第398位和第444位氨基酸进行突变得到的；

优选地，是将野生型L-谷氨酸脱羧酶的第398位的精氨酸突变成半胱氨酸、同时将第444位的丝氨酸突变成半胱氨酸得到的。

2.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，具有如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。

3.编码权利要求1或2所述谷氨酸脱羧酶突变体的基因序列；

优选地，所述基因序列具有如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，或与其相似度为90％以上的核苷酸序列。

4.携带权利要求3所述基因序列的重组质粒；

优选地，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体；

更优选地，所述重组质粒采用包括如下步骤的方法制备而成：以插入野生型L-谷氨酸脱羧酶基因序列的载体为模板，采用第398位氨基酸的正向引物SEQ ID No:3和反向引物SEQ ID No:4，以及第444位氨基酸的正向引物SEQ ID No:5和反向引物SEQ ID No:6，进行定点突变，获得重组质粒。

5.表达权利要求1或2所述谷氨酸脱羧酶突变体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中外源转入了权利要求4所述的重组质粒；

优选地，所述宿主细胞为细菌或真菌。

6.表达权利要求1或2所述谷氨酸脱羧酶突变体的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，转化权利要求4所述重组质粒；

优选地，所述重组质粒是携带权利要求3所述基因序列的pET24a载体。

7.一种谷氨酸脱羧酶突变体酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求4所述重组质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)，挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；离心菌体，重悬后超声破碎，层析纯化得到谷氨酸脱羧酶突变体酶。

8.权利要求1或2所述谷氨酸脱羧酶突变体、权利要求3所述基因序列、权利要求4所述重组质粒、权利要求5所述宿主细胞、权利要求6所述重组大肠杆菌或者权利要求7所述方法制备得到谷氨酸脱羧酶突变体在生产γ-氨基丁酸中的应用。

9.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述谷氨酸脱羧酶突变体或者权利要求7所述方法制备得到谷氨酸脱羧酶突变体，将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸；

优选地，所述方法在反应过程中不进行pH值的调控。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法在温度30～45℃或45～60℃下进行。