CN105219823B - 一种酶法制备谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：(1)利用GshF在反应罐中生成谷胱甘肽；(2)在反应罐中加入再生酶，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP；(3)在反应罐中分离固定化的GshF和再生酶，或使用过滤设备分离游离的GshF和再生酶；以及(4)分离产物GSH及反应液中的ATP、ADP和AMP。本发明的制备方法使用GshF酶代替Gsh I酶和Gsh II酶，使两步反应变为一步反应，节省了时间，也降低了GSH对两步反应的反馈抑制；建立了GSH生产的ATP再生系统，减少了ATP用量，降低了成本；避免了使用酵母再生ATP引入的色素等杂质，易于纯化；建立了酶的回收体系，可大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及制备谷胱甘肽的方法，特别涉及一种酶法制备谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。
GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的三肽。相对分子质量为307.32，等电点为5.93，常温下为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。
目前谷胱甘肽的主要制备方法有：溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。从谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已较少使用。化学合成法合成GSH，由于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。目前国内外GSH生产基本采用发酵法，原理是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，使用微生物发酵生产GSH。酵母发酵法，工艺较成熟，但生产周期长，产量偏低，且过多的副产物使下游工艺处理复杂。
近年来酶法生产GSH技术逐步提高，使大规模生产变为可能。经典的酶法生产GSH依赖于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh I)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II)两种酶，Gsh I催化L-谷氨酸和L-半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，Gsh II催化γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。在GSH合成过程中，由于Gsh I催化过程受到终产物GSH的反馈抑制，因此使生成γ-谷氨酰半胱氨酸的第一步反应成为整个GSH合成的限速步骤。
随着进一步研究，人们在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等十几种细菌中都发现了一种双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)。该酶同时具有Gsh I与Gsh II的活性，可一步催化GSH合成，且该酶反馈抑制作用较小，非常适和应用于酶法合成谷胱甘肽。
酶法合成GSH的最大问题是ATP的大量消耗，为了解决这方面的问题，可使用酵母糖酵解再生ATP的方法与之偶联。专利CN201210201691.2中使用该方法再生ATP，效果稳定。但使用酵母会在反应体系中引入色素等杂质，给进一步纯化增加难度，使用酶系再生ATP是近年来的研究方向。研究表明，在某些细菌体内存在着依赖于多聚磷酸盐的酶系，可利用ADP或AMP再生ATP。该酶系包含多聚磷酸盐激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(Pap)中的一种或多种，其中，Ppk催化ADP与多聚磷酸盐反应生成ATP，Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap则催化AMP与多聚磷酸盐反应生成ADP，三种酶互相组合或单独使用，均有再生ATP的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法制备谷胱甘肽的方法，从而克服现有技术的上述缺陷。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种酶法制备谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
(1)利用GshF在反应罐中生成谷胱甘肽；
(2)在反应罐中加入再生酶，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP；
(3)在反应罐中分离固定化的GshF和再生酶，或使用过滤设备分离游离的GshF和再生酶；以及
(4)分离产物GSH及反应液中的ATP、ADP和AMP。
优选地，上述方法进一步包括以下步骤：
(5)步骤(3)中分离的GshF和再生酶的循环利用，即将分离的GshF和再生酶添加至反应罐中生成谷胱甘肽及再生ATP的连续反应；以及
(6)GshF和再生酶的连续分离，即连续分离固定化的GshF酶和再生酶或使用过滤设备连续分离游离的GshF和再生酶。
优选地，上述方法进一步包括以下步骤：
(7)产物GSH的连续分离。
(8)ATP、ADP和AMP的连续分离。
优选地，上述技术方案中，循环利用GshF酶和再生酶，即重复所述步骤(4)至所述步骤(8)至少一次或重复多次。
优选地，上述技术方案中，步骤(7)和步骤(8)反应生成的GSH及ATP、ADP和AMP通过直接取出，或通过过滤或离子交换方法分离。
优选地，上述技术方案中，上述再生酶为Ppk、Adk或Pap酶的一种或任意几种组合。
优选地，上述技术方案中，上述步骤(1)中在反应罐中生成谷胱甘肽的反应如下：
反应温度为25-55℃；
反应pH为5-10的条件下；
反应体系为含有底物谷氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、镁离子、钾离子、钠离子、Tris或磷酸盐的水溶液；
在反应体系中添加ATP和GshF酶，或添加再生的ATP和分离的GshF酶，反应生成谷胱甘肽；
再添加Ppk、Adk或Pap酶的一种或几种，同时添加多聚磷酸或其盐，反应生成谷胱甘肽的同时再生ATP。
优选地，上述技术方案中，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁或硝酸镁中的一种或多种；所述钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾或柠檬酸钾中的一种或多种；所述钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种；所述多聚磷酸盐选自于多聚磷酸钠或多聚磷酸钾中的一种或多种。
本发明方法中循环利用的GshF和再生酶为游离或者固定化的GshF和再生酶。
本发明方法中所提及的氨基酸或其盐均为L型氨基酸或其盐。
更具体地，本发明方法包括以下步骤：
(1)生成谷胱甘肽：
在反应体系中添加ATP和GshF酶，在25-55℃、pH为5-10的条件下反应生成GSH，其中所述反应体系为含有底物谷氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐和甘氨酸或其盐、以及镁离子、钾离子、钠离子和Tris或磷酸根离子的水溶液；
(2)ATP再生：
加入再生酶系，加入多聚磷酸或其盐，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP。其中所述再生酶系为Ppk、Adk和Pap酶的一种或多种组合，即单独使用Ppk或Adk或Pap，或使用Ppk和Adk组合或Adk和Pap组合或Ppk和Pap组合或Ppk和Adk和Pap组合；
(3)分离GshF和再生酶：
固定化的GshF和再生酶在反应罐中直接分离。固定方法为戊二醛交联、海藻酸钠包埋等本领域技术人员熟知的固定方法。
游离的GshF和再生酶通过滤器中超滤膜分离，其中所述过滤器具有进料口、出料口和回流口，内设截留分子量小于50kDa的膜。经过滤器的滤出液为分离出酶之后的反应液；以及
(4)分离产物GSH及ATP、ADP和AMP
通过本领域技术人员熟知的离子交换方法，从所述步骤(3)的滤出液中分离产物GSH，经离子交换后的穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP。
本发明的方法中所述步骤(1)至所述步骤(4)可以重复至少一次，优选重复多次，例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次等。
本发明所采用的GshF、Ppk、Adk和Pap酶来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
本发明方法步骤(1)添加的ATP为1-50g/L；添加的GshF酶的浓度为0.01-5g/L；所述步骤(1)或步骤(1)的连续反应步骤中，反应温度为25-55℃，优选30-50℃；反应pH为5-10，优选6-9；反应体系为含有底物1-12g/L谷氨酸或其盐；1-12g/L半胱氨酸或其盐；1-10g/L甘氨酸或其盐；以及0.01-0.1M镁离子；0.01-0.3M钾离子；0.01-0.3M钠离子；和2-12g/LTris或1-15g/L磷酸盐的溶液。
本发明方法步骤(2)添加的多聚磷酸盐为1-20g/L；添加的Ppk酶的浓度为0.01-5g/L；Adk酶的浓度为0.01-5g/L；Pap酶的浓度为0.01-5g/L；所述步骤(2)或步骤(2)的连续反应步骤中，反应温度为25-55℃,优选30-50℃；反应的pH值为5-10，优选6-9。
本发明方法步骤(3)和步骤(4)中采用的膜选自醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。
本发明的酶法制备谷胱甘肽的方法，将合成GSH的反应，即利用固定化或游离的GshF酶生成GSH的反应，和ATP再生的反应，即利用固定化或游离的Ppk、Adk和Pap酶的一种或多种组合再生ATP的反应，选择最佳反应条件在反应罐中同时进行，具有如下优点：
1)使用GshF酶代替Gsh I酶和Gsh II酶，使酶促反应两步反应变为一步反应，节省了反应时间，同时降低了GSH对两步反应的反馈抑制；
2)建立了更加适合GSH生产的ATP再生系统，减少了ATP用量，降低了生产成本；
3)使用酶再生ATP，避免了使用酵母再生ATP引入的色素等杂质，更加易于纯化；以及
4)建立了适合GshF和再生酶的稳定回收体系，可以大规模连续生产。
附图说明
图1为本发明所表达的GshF酶的SDS-PAGE图。
图2为本发明所表达的Ppk、Adk和Pap酶的SDS-PAGE图。
图3为本发明方法使用游离酶制备GSH的工艺流程图。
图4为本发明方法使用固定酶制备GSH的工艺流程图。
图5为本发明反应的HPLC图谱。
图6为本发明反应的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
实施例1GshF酶的制备
本发明方法中的GshF酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
GshF酶的制备过程如下：
根据GshF基因序列(GenBank:NC_008532)，设计一对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引物序列如下：
GshF正义引物：5’-CCATATGACATTAAACCAACTTCTTCAAAAACTG-3’；和
GshF反义引物：5’-CGAATTCTTAAGTTTGACCAGCCACTATTTC-3’；
提取噬热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株(CGMCC 1.6472)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出gshF基因片段，并将其分别连接至pET 22b载体(购于Invitrogen公司)，经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(购于天根生化科技有限公司)。
将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导5小时后，收集菌体，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mM IPTG诱导5小时后，离心收集菌体约1000g。
其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。然后加50％饱和的硫酸铵，离心收集沉淀。经Tris缓冲液pH 8.0溶解后，使用G25柱(购于通用电气医疗生物科学有限公司)脱盐，再经DEAE-Sepharose FF(购于通用电气医疗生物科学有限公司)层析可得到初步纯化的GshF酶。
图1为所制备酶的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于北京中科瑞泰生物技术有限公司)；泳道2为GshF酶，约85kDa；泳道3为初步纯化的GshF酶。
使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到1mg/ml GshF酶活性约为300U，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
实施例2Ppk、Adk和Pap酶的制备
本发明方法中的Ppk、Adk和Pap酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
Ppk、Adk和Pap酶的制备过程如下：
根据ppk、adk及pap基因序列，设计三对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引物序列如下：
ppk正义引物：5’-CCATATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCG-3’；
ppk反义引物：5’-CGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGATT-3’；
adk正义引物：5’-CCATATGCGTATCATTCTGCTTGGCGCTCCGG-3’；
adk反义引物：5’-CGGATCCTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATC-3’；
pap正义引物：5’-GCCATGGATACAGAAACGATCGCCAGTGCAG-3’；和
pap反义引物：5’-CGGATCCTTAATCCGTGTCGCGATCCGCTT-3’；
提取大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株(购于天根生化科技有限公司)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出ppk与adk基因片段，并将其分别连接至pET 22b载体(购于Invitrogen公司)；提取约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)菌株(CGMCC 1.8030)DNA，以其为模板，通过PCR扩增出pap基因片段，并将其连接至pET 22b载体(购于Invitrogen公司)。三段连接序列经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(购于天根生化科技有限公司)。
将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导5小时后，收集菌体，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mM IPTG诱导5小时后，离心收集菌体约1000g。
其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。然后加40-60％饱和的硫酸铵，离心收集沉淀。经Tris缓冲液pH 8.0溶解后，使用G25柱(购于通用电气医疗生物科学有限公司)脱盐，再经DEAE-Sepharose FF(购于通用电气医疗生物科学有限公司)层析可得到初步纯化的Ppk、Adk和Pap酶。
图2为所制备酶的SDS-PAGE图，如图所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于北京中科瑞泰生物技术有限公司)；泳道2为Ppk酶，约60kDa；泳道3为Adk酶，约24kDa；泳道4为Pap酶，约56kDa。
使用现有技术记载的公知的测定酶活性的方法，检测到1mg/ml Ppk、Adk和Pap酶活性分别约为100U、1000U和200U，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
实施例3使用游离酶制备谷胱甘肽
图3为本发明方法使用游离酶制备GSH的工艺流程图。参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备谷胱甘肽：
(1)在反应罐中生成谷胱甘肽GSH：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物800g谷氨酸、800g半胱氨酸和600g甘氨酸，以及2000gATP、600g磷酸氢二钠、1100g氯化钾、870g氯化钠和800g氯化镁的溶液，加氢氧化钾调节pH值至约7.0，在反应体系中添加100g GshF酶液开始反应。反应期间控制pH值为6.5-7.5，温度为35-38℃。
(2)在反应罐中再生ATP：
在反应罐中补入500g Ppk酶、50gAdk酶、250g Pap酶，补入500g多聚磷酸钠，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP。
反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为15g/L，90％以上ATP耗尽，转化为ADP(AMP)。请一并参见图5，其为反应4小时10倍稀释反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm。流动相为含有6.8g/L磷酸二氢钾、2.0g/L庚烷磺酸钠和3％甲醇的水溶液，pH＝3.0。
使用实施例1中描述方法，检测1mg/ml GshF酶的活性约为260-290U。
使用实施例2中描述方法，检测1mg/ml Ppk、Adk、Pap酶的活性分别约为80-90U、750-950U、260-290U。
(3)在过滤器中分离GshF、Adk及Pap酶：
通过超滤方法，将步骤(2)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离GshF、Ppk、Adk及Pap酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。
(4)分离产物谷胱甘肽：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(购于杭州争光树脂厂)，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质，可加入反应罐中重新再生。
使用0.2M NaOH、0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约1300-1400g，收率约90％。
(5)反应罐生成谷胱甘肽的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将步骤(3)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-15％的新酶进行反应。
在37℃、pH为7.0的条件下进行生成谷胱甘肽的连续反应；4小时后，HPLC检测谷胱甘肽的生成量约为15g/L，90％以上ATP转化为ADP(AMP)。HPLC检测条件同上述步骤(2)。在该步骤中，酶被循环利用。
实施例4酶的固定
GshF、Ppk、Adk和Pap酶均分别以海藻酸钠包埋固定。
取粗纯酶混入2-3％的海藻酸钠溶液，充分混合均匀。之后将混合液缓慢滴入1-3％氯化钙溶液中，搅拌制成球状凝胶颗粒。过滤后，使用磷酸盐缓冲液清洗凝胶颗粒表面，即可得固定酶。
GshF、Ppk、Adk和Pap酶固定化后，活性降低至原活性的10-50％不等。
实施例5使用固定酶制备谷胱甘肽
图4为本发明方法使用固定酶制备GSH的工艺流程图。参见图4，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用固定酶按照如下步骤制备谷胱甘肽：
(1)在反应罐中生成GSH：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物800g谷氨酸、800g半胱氨酸和600g甘氨酸，以及2000gATP、600g磷酸氢二钠、1100g氯化钾、870g氯化钠和800g氯化镁的溶液，加氢氧化钾调节pH值至约7.0。将固定的GshF酶凝胶颗粒装入至特制多孔器皿中，放入反应体系开始反应。反应期间控制pH值为6.5-7.5，温度为35-38℃。
(2)在反应罐中再生ATP：
将固定的Ppk、Adk和Pap酶凝胶颗粒装入至特制多孔器皿中，放入反应体系开始反应。补入500g多聚磷酸钠，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP。
反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为14g/L，90％以上ATP耗尽，转化为ADP(AMP)。请一并参见图6，其为反应4小时10倍稀释反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。HPLC检测条件同实施例3步骤(2)。
使用实施例1中描述方法，检测固定GshF酶的活性基本不变。
使用实施例2中描述方法，检测固定Ppk、Adk、Pap酶的活性基本不变。
(3)分离固定酶及反应液：
反应结束后，取出装有酶凝胶颗粒的多孔容器，得到含有GSH、少量ATP、大量ADP和/或AMP及氨基酸等物质的反应液。
(4)分离产物谷胱甘肽：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(购于杭州争光树脂厂)，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质，可加入反应罐中重新再生。
使用0.2MNaOH、0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约1200-1300g，收率约90％。
(5)反应罐生成谷胱甘肽的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将装有酶凝胶颗粒的多孔容器重新加入至反应体系中进行反应。
在37℃、pH为7.0的条件下进行生成谷胱甘肽的连续反应；4小时后，HPLC检测谷胱甘肽的生成量约为14g/L，90％以上ATP转化为ADP(AMP)。HPLC检测条件同上述实施例3中的步骤(2)。在该步骤中，酶被循环利用。
固定化酶循环反应10次以上或者储存时间一周以上，酶活性快速降低，需补加新酶。
实施例6使用氨基酸盐制备谷胱甘肽
参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备谷胱甘肽：
(1)在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物1020g谷氨酸钠、1160g半胱氨酸盐酸盐和780g甘氨酸钠，以及2000gATP、600g磷酸氢二钠、1100g氯化钾、870g氯化钠和800g氯化镁的溶液，加氢氧化钾调节pH值至约7.0，在反应体系中添加100g GshF酶液开始反应。反应期间控制pH值为6.5-7.5，温度为35-38℃。
(2)在反应罐中再生ATP：
在反应罐中补入50gAdk酶、250g Pap酶，补入500g多聚磷酸钠，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP。
反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为15g/L，90％以上ATP耗尽，转化为ADP(AMP)。
从结果可以看出：使用谷氨酸盐和半胱氨酸盐替代相同摩尔浓度的谷氨酸和半胱氨酸对反应结果没有影响。生产中可使用谷氨酸盐、半胱氨酸盐及甘氨酸盐替代谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。
实施例7谷胱甘肽的制备
参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备谷胱甘肽：
(1)在反应罐中生成谷胱甘肽GSH：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物100g谷氨酸、100g半胱氨酸和100g甘氨酸，以及100gATP、100g Tris、75g氯化钾、59g氯化钠和95g氯化镁的溶液，加氢氧化钾调节pH值至约5.0，在反应体系中添加1g GshF酶液开始反应。反应期间控制pH值为5.0，温度为55℃。
(2)在反应罐中再生ATP：
在反应罐中补入1gAdk酶、1g Pap酶，补入100g多聚磷酸钠，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP。
反应7小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为1g/L，90％以上ATP耗尽，转化为ADP(AMP)。HPLC检测条件同实施例3步骤(2)。
(3)在过滤器中分离GshF、Adk及Pap酶：
通过超滤方法，将步骤(2)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离GshF、Adk及Pap酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。
(4)分离产物谷胱甘肽：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(购于杭州争光树脂厂)，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质，可加入反应罐中重新再生。
使用0.2M NaOH、0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约70g，收率约70％。
(5)反应罐生成谷胱甘肽的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将步骤(3)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-15％的新酶进行反应。
在55℃、pH为5.0的条件下进行生成谷胱甘肽的连续反应；7小时后，HPLC检测谷胱甘肽的生成量约为1g/L，90％以上ATP转化为ADP(AMP)。HPLC检测条件同上述实施例3中的步骤(2)。在该步骤中，酶被循环利用。
实施例8谷胱甘肽的制备
参见图3，根据本发明制备GSH的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备谷胱甘肽：
(1)在反应罐中生成谷胱甘肽GSH：
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物1200g谷氨酸、1200g半胱氨酸和1000g甘氨酸，以及5000gATP、1500g磷酸氢二钠、2240g氯化钾、1760g氯化钠和950g氯化镁的溶液，加氢氧化钾调节pH值至约10.0，在反应体系中添加500g GshF酶液开始反应。反应期间控制pH值为10.0，温度为25℃。
(2)在反应罐中再生ATP：
在反应罐中补入500g Ppk酶、500g Pap酶，补入2000g多聚磷酸钠，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP。
反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为12g/L，70％以上ATP耗尽，转化为ADP(AMP)。HPLC检测条件同实施例3步骤(2)。
(3)在过滤器中分离GshF、Adk及Pap酶：
通过超滤方法，将步骤(2)的反应体系的反应液经过过滤器过滤分离GshF、Ppk及Pap酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量8kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。
(4)分离产物谷胱甘肽：
使用盐酸调节滤出液的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(购于杭州争光树脂厂)，溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质，可加入反应罐中重新再生。
使用0.2MNaOH、0-0.8MNaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量约1100g，收率约90％。
(5)反应罐生成谷胱甘肽的连续反应，即步骤(1)的连续反应：
将步骤(3)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-15％的新酶进行反应。
在25℃、pH为10.0的条件下进行生成谷胱甘肽的连续反应；4小时后，HPLC检测谷胱甘肽的生成量约为12g/L，70％以上ATP转化为ADP(AMP)。HPLC检测条件同上述实施例3中的步骤(2)。在该步骤中，酶被循环利用。
对比例1
在反应罐中，100L无菌水的反应体系为含有底物800g谷氨酸、800g半胱氨酸和600g甘氨酸，以及4000gATP、600g磷酸氢二钠、1100g氯化钾、870g氯化钠和800g氯化镁的溶液，加氢氧化钾调节pH值至约7.0，在反应体系中添加100g GshF酶液开始反应。反应期间控制pH值为6.5-7.5，温度为35-38℃。反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量约为10g/L，90％以上ATP耗尽，转化为ADP(AMP)。
从结果可以看出：没有偶联适合GSH生产的ATP再生系统，反应体系需要的ATP量增加。由于加入大量ATP，使反应体系中离子强度等发生变化，因此使GSH生成量降低。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用固定化的或游离的GshF在反应罐中生成谷胱甘肽；
(2)在反应罐中加入再生酶，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP；
(3)分离固定化的GshF和再生酶，或使用超滤分离游离的GshF和再生酶；
(4)分离产物GSH及反应液中的ATP、ADP和AMP；
(5)所述步骤(3)中分离的GshF和再生酶的循环利用，即将分离的GshF和再生酶添加至反应罐中生成谷胱甘肽及再生ATP的连续反应；
所述再生酶为Ppk、Adk或Pap酶的任意两种或三种的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
(6)GshF和再生酶的连续分离，即连续分离固定化的GshF酶和再生酶或使用超滤设备连续分离游离的GshF和再生酶；
(7)产物GSH的连续分离；以及
(8)ATP、ADP和AMP的连续分离。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)反应生成的GSH及ATP、ADP和AMP通过超滤或离子交换方法分离。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当选用三种再生酶时，用量按照质量比计算Ppk酶：Adk酶：Pap酶为(1-10):1:(1-5)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，再生酶的用量按照质量比计算Ppk酶：Adk酶：Pap酶为10:1:5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中在反应罐中生成谷胱甘肽的反应如下：
反应温度为25-55℃；
反应pH为5-10的条件下；
反应体系为含有底物谷氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、镁离子、钾离子、钠离子、Tris或磷酸盐的水溶液；
在反应体系中添加ATP和GshF酶，或添加再生的ATP和分离的GshF酶，反应生成谷胱甘肽；
再添加Ppk、Adk或Pap酶的任意两种或三种组合，同时添加多聚磷酸或其盐，反应生成谷胱甘肽同时再生ATP。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁或硝酸镁中的一种或多种；所述钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾或柠檬酸钾中的一种或多种；所述钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种；所述多聚磷酸盐选自于多聚磷酸钠或多聚磷酸钾中的一种或多种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190509 Address after: 246000 Phoenix Apartment, No. 99 Huancheng West Road, Daguan District, Anqing City, Anhui Province Patentee after: Anhui Gute Biotechnology Co. Ltd. Address before: 518103 Xinguobang Logistics Park, 87 Yongfu Road, Fuyong Town, Baoan District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee before: SHENZHEN GUTE XINSHENG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method for preparing glutathione by means of enzymic method Effective date of registration: 20200109 Granted publication date: 20180605 Pledgee: Anqing rural commercial bank Limited by Share Ltd Pledgor: Anhui Gute Biotechnology Co. Ltd. Registration number: Y2020980000055 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220510 Granted publication date: 20180605 Pledgee: Anqing rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: Anhui Gute Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2020980000055 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method for preparing glutathione by enzymatic method Effective date of registration: 20220510 Granted publication date: 20180605 Pledgee: Anqing rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: Anhui Gute Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980005350 |
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