CN112111536B - 一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌，属于生物工程技术领域。本发明构建了表达精氨酸脱羧酶、胍基丁胺脲水解酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸‑β‑半醛脱氢酶、羧基亚精胺脱氢酶、羧基亚精胺脱羧酶、葡萄糖脱氢酶、多聚磷酸盐激酶2‑I的重组细胞或者重组细胞的组合，并利用重组细胞或者重组细胞的组合催化天冬氨酸和精氨酸合成亚精胺。本发明选用的氧化还原酶类均能高效使用NAD(NADH)为辅酶、反应过程无产物反馈抑制，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌
技术领域
本发明涉及一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌，属于生物工程技术领域。
背景技术
亚精胺(Spermidine)，线性分子式为NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2，广泛存在于微生物、植物和动物体内，是一种重要的生理活性物质。亚精胺具有延长动物寿命的功效，并抵消与年龄相关的疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。
如图1所示，生物体中主要有两条途径合成亚精胺(1)经由羧基化腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶的作用下直接合成亚精胺，羧基化腺苷甲硫氨酸可由常见的甲硫氨酸(Met)，经过相关酶的腺苷化和脱羧化催化得到，该途径在动物、植物和微生物体内，是比较常见的传统亚精胺合成的途径；(2)经由天冬氨酸-β-半醛和腐胺在羧基亚精胺脱氢酶和脱羧酶的催化下合成亚精胺，天冬氨酸-β-半醛可经常见氨基酸如天冬氨酸(Asp)经相关酶的磷酸化和脱氢化催化合成，该途径为新发现的替代合成途径，主要存在于一些细菌中，包括重要的人类病原体，肠道菌群等。两条途径都涉及到重要的中间体-腐胺(Put)，腐胺可由常见的氨基酸-鸟氨酸(Orn)或精氨酸(Arg)经过相关酶催化合成得到，在亚精胺的合成过程中，是重要的中间底物。由于这些途径中的酶受到高度调控，动植物体的亚精胺含量较低，目前也未发现可以大量生产亚精胺的微生物。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是以氨基酸为底物合成亚精胺，尤其是构建多酶共表达的基因工程菌，利用该基因工程菌以氨基酸为底物合成亚精胺，实现亚精胺的高效生产。
[技术方案]
本发明提供了以氨基酸为底物合成亚精胺的方法，所述氨基酸为天冬氨酸和精氨酸；L-精氨酸被精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase)脱羧生成胍基丁胺，进一步被胍基丁胺脲水解酶(Agmatine ureohydrolase)作用生成腐胺；L-天冬氨酸被天冬氨酸激酶(Aspartokinase)以ATP为辅酶催化生成天冬氨酰-β-磷酸和ADP，天冬氨酰-β-磷酸被天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase)以NADPH或NADH为辅酶催化生成L-天冬氨酸半醛和NAD(NADP)，羧基亚精胺脱氢酶(Carboxyspermidinedehydrogenase)以NADPH或NADH为辅酶将L-天冬氨酸半醛和腐胺合成为羧基亚精胺，辅酶再生为NAD(NADP)，最后羧基亚精胺脱羧酶(Carboxyspermidine decarboxylase)将羧基亚精胺脱羧生成亚精胺；在以上过程中由葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase)实现NADH(NADPH)的再生、由多聚磷酸盐激酶2-I(polyphosphate kinase 2-I,PPK2-I)实现ATP的再生。
在一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶来自于Escherichia coli BL21(DE3)。或者，所述精氨酸脱羧酶是氨基酸序列是NCBI上accession NO.为ACT44585.1的序列。或者，编码所述精氨酸脱羧酶的基因的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为CP001509REGION:complement(2914793..2916769)所示的序列。或者，编码所述精氨酸脱羧酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
在一种实施方式中，所述胍基丁胺脲水解酶为来自于Escherichia coli BL21(DE3)。或者，所述胍基丁胺脲水解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO.为ACT44584.1的序列。或者，所述胍基丁胺脲水解酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为CP001509REGION:complement(2913735..2914655)的序列。
在一种实施方式中，所述L-天冬氨酸激酶为来自于Clostridium symbiosum ATCC14940、Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC 700819、Bacillus coagulans DSM 1。或者，所述L-天冬氨酸激酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为ERI80757.1、YP_002344012.1、AJH79997.1的序列。或者，L-天冬氨酸激酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO.为AWSU01000003REGION:complement(10218..11426)、NC_002163REGION:541843..543045、CP009709REGION:complement(957019..958248)的序列。
在一种实施方式中，所述天冬氨酸-β-半醛脱氢酶为来自于Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Bacillus coagulansDSM 1、Prevotella bivia DSM 20514、Lactobacillus fermentum ATCC 14931，Lactobacillus reuteri DSM 20016、Ruminococcus callidus ATCC 27760、Bacteroidescellulosilyticus DSM 14838。或者，所述天冬氨酸-β-半醛脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为YP_354457.1、ERI74627.1、AJH78885.1、EIM32299.1、EEI21839.1、KRK52213.1、ERJ96894.1、EEF86657.1的序列。或者，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_007493REGION:3154877..3155899、AWSU01000307REGION:complement(28522..29628)、CP009709REGION:215590..216636、JH660660REGION:605188..606201、ACGI01000096REGION:complement(87687..88739)、AZDD01000002REGION:42759..43835、AWVF01000093REGION:108774..109862、ACCH01000503REGION:1..871的序列。
在一种实施方式中，所述羧基亚精胺脱氢酶为来自于Bacillus coagulans DSM1、Clostridium sp.DSM 8431、Prevotella bivia DSM 20514、Ruminococcus callidusATCC 27760、Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC 700819、Porphyromonascatoniae ATCC 51270、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808、Clostridiumsymbiosum ATCC 14940。或者，所述羧基亚精胺脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为AJH78404.1、SFU79043.1、EIM32270.1、ERJ96771.1、YP_002343630.1、EWC93538.1、YP_351518.1、ERI79986.1的序列。或者，羧基亚精胺脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为CP009709REGION:2139242..2140441、FPBY01000164REGION:458..1657、JH660660REGION:573354..574616、AWVF01000096REGION:13704..14912、NC_002163REGION:complement(167807..169012)、JDFF01000004REGION:complement(69139..70371)、NC_007493REGION:59748..60986、AWSU01000043REGION:complement(9703..10905)的序列。
在一种实施方式中，所述羧基亚精胺脱羧酶为来自于Bacteroidescellulosilyticus DSM14838、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Campylobacterjejuni subsp.jejuni ATCC 700819、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808。或者，所述羧基亚精胺脱羧酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为EEF87925.1、ERI79985.1、YP_002344893.1、YP_351517.1的序列。或者，羧基亚精胺脱羧酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为ACCH01000346REGION:346..1506、AWSU01000043REGION:complement(8508..9659)、NC_002163REGION:complement(1450328..1451476)、NC_007493REGION:58614..59711的序列。
在一种实施方式中，所述多聚磷酸盐激酶2-I为来自于Sinorhizobium_meliloti。或者，所述多聚磷酸盐激酶2-I，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为NP_384613.1的序列。或者，多聚磷酸盐激酶2-I的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_003047REGION:complement(564142..565044)的序列。
在一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶来自Bacillus subtilis ATCC 13952。或者，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013351020.1序列。或者，所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_CP009748REGION:386154..38693。
本发明还提供了一种能够以氨基酸为底物合成亚精胺的重组细胞或者重组细胞的组合，所述重组细胞表达了精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase)、胍基丁胺脲水解酶(Agmatineureohydrolase)、天冬氨酸激酶(Aspartokinase)、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase)、羧基亚精胺脱氢酶、羧基亚精胺脱羧酶(Carboxyspermidine decarboxylase)、葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase)、多聚磷酸盐激酶2-I(polyphosphate kinase 2-I,PPK2-I)。所述重组细胞的组合，含两个或两个以上的重组细胞，每个重组细胞表达8种酶中的一种或以上，重组细胞的组合共同实现上述8种酶的表达。
所述重组细胞或者重组细胞的组合可以选择大肠杆菌为宿主，例如Escherichiacoli BL21(DE3)。
所述8种酶可以在宿主中借助载体进行表达融合表达或共表达，或者整合到宿主的基因组上进行表达。所述8种酶借助载体进行表达时，可以选择多个载体，每个载体表达8种酶中的一种或多种。
在一种实施方式中，本发明提供了一种以氨基酸为底物合成亚精胺的重组大肠杆菌，是将编码8种酶的基因分配到pETDuet-1、pACYCDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFduet-1这4种质粒上，每个质粒上携带两个基因。例如，将8种基因按照如下方式分配到不同载体上：
pRSFDuet-1-ecadm1-ecau+pETDuet-1-csak-pbasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pACYCDuet-1-pccsdh-bccsdc、
pRSFDuet-1-ecadm1-ecau+pETDuet-1-csak-rcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pACYCDuet-1-pccsdh-bccsdc、
pRSFDuet-1-ecadm1-ecau+pETDuet-1-csak-rsasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pACYCDuet-1-pccsdh-bccsdc、
pRSFDuet-1-ecadm1-ecau+pETDuet-1-csak-rcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pACYCDuet-1-rscsdh-cscsdc、
pRSFDuet-1-pccsdh-bccsdc+pETDuet-1-csak-rcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pACYCDuet-1-ecadm1-ecau、
pRSFDuet-1-ecadm1-ecau+pETDuet-1-smpkk-bsgdh+pCDFDuet-1-csak-rcasadh+pACYCDuet-1-pccsdh-bccsdc、
pRSFDuet-1-smpkk-bsgdh+pETDuet-1-csak-rcasadh+pCDFDuet-1-ecadm3-ecau+pACYCDuet-1-pccsdh-bccsdc、
pRSFDuet-1-ecadm1-ecau+pETDuet-1-cjak-rcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pACYCDuet-1-pccsdh-cjcsdc、
pRSFDuet-1-ecad-ecau+pETDuet-1-cjak-rcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pACYCDuet-1-pccsdh-cjcsdc、
pRSFDuet-1-ecadm2-ecau+pETDuet-1-bcak-bcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pACYCDuet-1-pccsdh-bccsdc、
pRSFDuet-1-ecadm1-ecau+pETDuet-1-smpkk-bsgdh+pCDFDuet-1-csak-bcasadh+pACYCDuet-1-pbcsdh-bccsdc。
在一种实施方式中，本发明提供了一种以氨基酸为底物合成亚精胺的重组大肠杆菌的组合，是将8种酶分配到两个或两个以上(例如3个)的大肠杆菌中进行表达。例如：
一种重组大肠杆菌的组合，由Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm1-ecau、Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-csak-rcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh、Escherichia coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-pccsdh-bccsdc-bsgdh组成；
一种重组大肠杆菌的组合，由Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm2-ecau、Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-cjak-rcasadh+pETDuet-1-smpkk-bsgdh、Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-cscsdh-cjcsdc-bsgdh组成；
一种重组大肠杆菌的组合，由Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm2-ecau+pETDuet-1-smpkk-cjak、Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-rcasadh-cscsdh+pETDuet-1-bsgdh-cjcsdc组成；
一种重组大肠杆菌的组合，由Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-bsgdh-smpkk(命名为E12)、Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm4-ecau+pETDuet-1-csak-lfasadh(命名为E13)、Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-pccsdh-bccsdc组成。
本发明还提供了一种全细胞催化生产亚精胺的方法，是利用本发明的重组细胞或者重组细胞的组合为全细胞催化剂，以天冬氨酸和精氨酸为底物合成亚精胺。所述全细胞催化剂的制备，是培养、繁殖重组细胞或者重组细胞的组合，并使得重组细胞或者重组细胞的组合表达所述8种酶，然后收集重组细胞。使用所述全细胞催化剂时，除了提供底物，还需要维持适当的温度和pH，必要时还提供一些辅酶或者营养物质，以帮助全细胞催化剂更好地发挥催化作用。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括细胞湿重为1-200g/L，L-精氨酸1-100g/L，L-天冬氨酸1-100g/L，六聚偏磷酸钠1-300g/L，ATP 0-1g/L，NAD 0-1g/L，pH5.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。
[有益效果]
本发明构建了强化表达8种酶的基因工程菌应用于亚精胺的生产。本发明采用的底物为L-精氨酸和L-天冬氨酸，这两种氨基酸易于得到并且价格便宜。本发明选用的氧化还原酶类均能高效使用NAD(NADH)为辅酶、反应过程无产物反馈抑制。总的来说，本发明提供的生产亚精胺的方法过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1两种现有的合成亚精胺的途径
具体实施方式
1、本发明所涉及的菌株及质粒
购自美国菌种保藏中心ATCC的Clostridium symbiosum ATCC 14940、Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC 700819、Rhodobacter sphaeroides ATCCBAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Lactobacillus fermentum ATCC 14931、Lactobacillus reuteri DSM20016、Ruminococcus callidus ATCC 27760、Bacteroidescellulosilyticus DSM 14838、Clostridium sp.DSM 8431、Prevotella bivia DSM20514、Ruminococcus callidus ATCC 27760、Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC700819、Porphyromonas catoniae ATCC 51270、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Bacillus subtilis ATCC 13952，购自Novagen公司的pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838、Bacillus coagulans DSM 1、Prevotella bivia DSM 20514购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ。
2、多基因共表达体系的构建及细胞的培养
目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，基因后带有T7终止子。理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。每个质粒上包含两个基因，将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于单抗或混合抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
3、相关酶的选择
(1)精氨酸脱羧酶
参见实施例3。
(2)胍基丁胺脲水解酶
从Escherichia coli BL21(DE3)中克隆得到胍基丁胺脲水解酶基因ecau进行过表达。氨基酸序列在NCBI上accession NO为ACT44584.1。
(3)L-天冬氨酸激酶
参见实施例4。
(4)天冬氨酸-β-半醛脱氢酶
参见实施例1。
(5)羧基亚精胺脱氢酶
参见实施例2。
(6)羧基亚精胺脱羧酶
参见实施例5。
(7)葡萄糖脱氢酶
在生物转化反应中，α-羟基羧酸脱氢酶需要以NADH和/或NADPH为辅酶，采常有甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、亚磷酸酸脱氢酶等，葡萄糖脱氢酶相对于其它酶活力最高，因此本发明从Bacillus subtilis ATCC 13952得到葡萄糖脱氢酶基因bsgdh(相应氨基酸序列是WP_013351020.1)。
(8)多聚磷酸盐激酶2-I
选择源于Sinorhizobium_meliloti的编码多聚磷酸盐激酶2-I的基因smpkk，基因smpkk在NCBI上accession NO为NC_003047REGION:complement(564142..565044)，对应的氨基酸序列是NP_384613.1。
4、样品的检测分析
腐胺、亚精胺、羧基亚精胺含量的测定方法根据文献进行测定(An AlternativePolyamine Biosynthetic Pathway Is Widespread in Bacteria and Essential forBiofilm Formation in Vibrio cholerae，J Biol Chem.2009Apr 10；284(15):9899–9907.)。
天冬氨酸-β-半醛脱氢酶和羧基亚精胺脱氢酶活力采用经典的NADH生成或减少的方法进行测定(The kinetics and mechanism of liver alcohol dehydrogenase withprimary and secondary alcohols as substrates.Biochemical Journal 1966,100:34.)。比酶活(U mg-1)定义为每mg酶所具有的酶活力单位。一个酶活力单位(U)定义为1min生成或减少1μmol NADH所需的酶量。
天冬氨酸-β-半醛脱氢酶活力根据文献以NAD为辅酶进行测定(Aspartate-β-Semialdehyde dehydrogenase from escherichia coli，methods in enzymology，1985，113:600-602)。比酶活(U mg-1)定义为每mg酶所具有的酶活力单位。一个酶活力单位(U)定义为1min减少1μmol NADH所需的酶量。
羧基亚精胺脱氢酶活力测定：3ml反应体积中腐胺1mM、天冬半醛1mM、NADH0.12mM、pH8、温度35℃，340nm测定NADH的减少速率。比酶活(U mg-1)定义为每mg酶所具有的酶活力单位。一个酶活力单位(U)定义为1min减少1μmol NADH所需的酶量。
天冬氨酸激酶活力测定：根据文献所述方法测定(Stadtman ER,Cohen GN,LeBrasG,et al.Feed-back inhibition and repression of aspartokinase activity inEscherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem.1961,236(7):2033-2038)。
羧基亚精胺脱羧酶活力测定：于3mL反应体系中含有5mM羧基亚精胺，50mM磷酸缓冲液(pH8.0)，2mM二硫苏糖醇和50μM MPLP，37℃水浴30min后，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，离心(8000rpm/min)5min后，HPLC分析亚精胺的生成量。比酶活表示为每分钟每mg酶形成的亚精胺的μmol。
实施例1：天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的筛选与表达
天冬氨酸-β-半醛脱氢酶广泛存在多种微生物中，通常以NADPH(NADP)为辅酶。通常菌体内的NAD比NADP更多，而且NAD价格更为便宜。本发明通过比较多种来源的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶筛选得到能较好地以NADH(NAD)为辅酶的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶。
分别从Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC14940、Bacillus coagulans DSM 1、Prevotella bivia DSM 20514、Lactobacillusfermentum ATCC 14931，Lactobacillus reuteri DSM 20016、Ruminococcus callidusATCC 27760、Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838克隆得到天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因rsasadh、csasadh、bcasadh、pbasadh、lfasadh、lrasadh、rcasadh、bcasadh。氨基酸序列在NCBI上accession NO为：YP_354457.1、ERI74627.1、AJH78885.1、EIM32299.1、EEI21839.1、KRK52213.1、ERJ96894.1、EEF86657.1。将克隆得到的基因连接到pETDuet-1载体上，并在Escherichia coli BL21(DE3)中得到诱导表达。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。破胞后histag标签法纯化酶，得到纯酶后测定活性。
当以天冬氨酸-β-半醛为底物，NAD为辅酶时，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因rsasadh、csasadh、bcasadh、pbasadh、lfasadh、lrasadh、rcasadh、bcasadh各自表达的酶的比酶活分别为：11.1、21.2、4.5、69.3、34.2、2.2、58.1、45.6U/mg。
实施例2：羧基亚精胺脱氢酶的筛选与表达
羧基亚精胺脱氢酶广泛存在多种微生物中，通常以NADPH(NADP)为辅酶。通常菌体内的NAD比NADP更多，而且NAD价格更为便宜。本发明通过比较多种来源的羧基亚精胺脱氢酶筛选得到以NADH(NAD)为辅酶的羧基亚精胺脱氢酶。
分别从Bacillus coagulans DSM 1、Clostridium sp.DSM 8431、Prevotellabivia DSM 20514、Ruminococcus callidus ATCC 27760、Campylobacter jejunisubsp.jejuni ATCC 700819、Porphyromonas catoniae ATCC 51270、Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940克隆得到羧基亚精胺脱氢酶基因bccsdh、cccsdh、pbcsdh、rccsdh、cjcsdh、pccsdh、rscsdh、cscsdh。氨基酸序列在NCBI上accession NO为AJH78404.1、SFU79043.1、EIM32270.1、ERJ96771.1、YP_002343630.1、EWC93538.1、YP_351518.1、ERI79986.1。表达产物用于合成羧基亚精胺。将克隆得到的基因分别连接到pETDuet-1载体上，与实施例1同样的方法表达纯化。
以腐胺和天冬半醛为底物，NAD为辅酶测定酶的活力，羧基亚精胺脱氢酶基因bccsdh、cccsdh、pbcsdh、rccsdh、cjcsdh、pccsdh、rscsdh、cscsdh各自表达的酶的比酶活分别为：1.3、13.2、34.1、1.2、22.6、47.8、36.2、24.3U/mg。
实施例3：精氨酸脱羧酶的表达
从Escherichia coli BL21(DE3)克隆得到精氨酸脱羧酶基因ecad，其氨基酸序列在NCBI上的accession NO为ACT44585.1。由于该酶会受到腐胺和亚精胺等胺类的反反馈抑制，因此根据经典定点突变方法(精编分子生物学实验指南(第五版)作者:(美)FM奥斯伯等主编金由辛等译校出版社:科学出版社出版时间:2019年05月)，将该基因进行定点突变解除抑制，得到ecadm1、ecadm2、ecadm3、ecadm4突变体。编码这些突变体的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。将编码上述突变体的基因连接到pETDuet-1载体上，并在Escherichia coli BL21(DE3)中得到诱导表达，诱导表达方法同实施例1。
测定所得到的纯酶催化精氨酸脱羧生成胍基丁胺的生成量，10mL反应体系中L-精氨酸10mM、腐胺50mM、Tris-HCL(pH＝7.5)50mM、MgSO4 4mM、PLP 1mM、二硫代苏糖醇0.1mM、纯酶0.1mg，40℃水浴30min后，加入1mL 40％三氯乙酸终止反应后，利用HPLC测定胍基丁胺生成量。ecad，ecadm1、ecadm2、ecadm3、ecadm4对应表达的纯酶在上述条件下生成的胍基丁胺分别为：1.3、8.9、8.1、7.9、8.2mM。
实施例4：L-天冬氨酸激酶的表达
分别从Clostridium symbiosum ATCC 14940、Campylobacter jejunisubsp.jejuni ATCC700819、Bacillus coagulans DSM 1克隆得到L-天冬氨酸激酶基因csak、cjak、bcak。氨基酸序列在NCBI上accession NO为ERI80757.1、YP_002344012.1、AJH79997.1。将编码上述突变体的基因连接到pETDuet-1载体上，并在Escherichia coliBL21(DE3)中得到诱导表达，诱导表达方法同实施例1。
以L-天冬氨酸为底物，ATP为辅酶，csak、cjak、baak各自表达的酶活分别为132、121、114U/mg。
实施例5：羧基亚精胺脱羧酶的表达
羧基亚精胺脱羧酶广泛存在多种微生物中，本发明分别从Bacteroidescellulosilyticus DSM14838、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Campylobacterjejuni subsp.jejuni ATCC 700819、Rhodobacter sphaeroides ATCC BAA-808中得到羧基亚精胺脱羧酶基因bccsdc(氨基酸序列是EEF87925.1)、cscsdc(氨基酸序列是ERI79985.1)、cjcsdc(氨基酸序列是YP_002344893.1)，rscsdc(氨基酸序列是YP_351517.1)。与实施例1同样的方法进行诱导表达和纯化。经过测定，羧基亚精胺脱羧酶基因bccsdc、cscsdc、cjcsdc、rscsdc各自表达的酶的比活力分别为81.2，63.1，74.4，62.3U/mg。
实施例6:同时表达8种酶的重组大肠杆菌的构建
重组大肠杆菌构建：从8种基因选择编码高活性的基因，连接到pETDuet-1、pACYCDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFduet-1质粒上，每个质粒上表达2个基因，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，基因后带有T7终止子。将4个质粒转化入大肠杆菌Escherichiacoli BL21，利用混合抗生平板筛选得到阳性转化子，即得到可强化表达8个基因的重组大肠杆菌。
将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重为200g/L，L-精氨酸20g/L，L-天冬氨酸20g/L，六聚偏磷酸钠100g/L，ATP 1g/L，NAD 1g/L，pH8；于30℃反应，时间24小时。转化结束后利用液相色谱测定反应液中亚精胺的浓度，结果如表1所示。
表1
实施例7:构建多个重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺
构建如下3种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm1-ecau(命名为E1)、Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-csak-rcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh(命名为E2)、Escherichia coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-pccsdh-bccsdc-bsgdh(命名为E3)。E1的功能是将L-精氨酸转化成腐胺、E2是功能是将L-天冬氨酸转化成天冬半醛、E3将腐胺与天冬氨半醛合成为亚精胺。E2和E3中均有基于NAD辅酶的氧化还原酶，因此均表达了葡萄糖脱氢酶。
根据实施例1所述的方法，将E1、E2、E3分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E1细胞湿重为30g/L，E2细胞湿重为30g/L、E3细胞湿重为30g/L、L-精氨酸10g/L，L-天冬氨酸10g/L，六聚偏磷酸钠60g/L，ATP 1g/L，NAD 1g/L，pH 8；于30℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为8.9g/L。
实施例8:构建多个重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺
与实施例7类似地构建如下3种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm2-ecau(命名为E4)、Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-cjak-rcasadh+pETDuet-1-smpkk-bsgdh(命名为E5)、Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-cscsdh-cjcsdc-bsgdh(命名为E6)。
根据实施例1所述的方法，将E4、E5、E6分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E4细胞湿重为60g/L，E5细胞湿重为60g/L、E6细胞湿重为60g/L、L-精氨酸40g/L，L-天冬氨酸40g/L，六聚偏磷酸钠300g/L，ATP 1g/L，NAD 1g/L，pH 7；于40℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为30.5g/L。
实施例9:构建多个重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺
与实施例7类似地构建如下2种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm2-ecau+pETDuet-1-smpkk-cjak(命名为E7)、Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-rcasadh-cscsdh+pETDuet-1-bsgdh-cjcsdc(命名为E8)。
根据实施例1所述的方法，将E7和E8分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E7细胞湿重为50g/L，E8细胞湿重为10g/L、L-精氨酸10g/L，L-天冬氨酸10g/L，六聚偏磷酸钠50g/L，ATP 1g/L，NAD 1g/L，pH 6；于15℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为2.1g/L。
实施例10：构建多个重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺
与实施例7类似地构建如下3种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm2-cjcsdc+pETDuet-1-cjak-smpkk(命名为E9)、Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-rcasadh-bsgdh(命名为E10)、Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-cscsdh-ecau-bsgdh(命名为E11)。
根据实施例1所述的方法，将E9、E10和E11分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E9细胞湿重为100g/L，E10细胞湿重为50g/，E11细胞湿重为50g/L、L-精氨酸3g/L，L-天冬氨酸3g/L，六聚偏磷酸钠30g/L，ATP 1g/L，NAD 1g/L，pH 5；于15℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为3.3g/L。
实施例11:构建多个重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺
构建如下3种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-bsgdh-smpkk(命名为E12),Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm4-ecau+pETDuet-1-csak-lfasadh(命名为E13)、Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-pccsdh-bccsdc(命名为E14)
根据实施例1所述的方法，将E12、E13和E14分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E12细胞湿重为10g/L，E13细胞湿重为10g/，E11细胞湿重为14g/L、L-精氨酸10g/L，L-天冬氨酸10g/L，六聚偏磷酸钠200g/L，ATP 1g/L，NAD 1g/L，pH 9；于40℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为3.7g/L。
实施例12:构建多个重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺
与实施例7类似地构建如下3种重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm-ecau(命名为E15)、Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-cjak-rcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh(命名为E16)、Escherichia coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-pbcsdh-bccsdc-bsgdh(命名为E17)。
根据实施例1所述的方法，将E1、E2、E3分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，E1细胞湿重为1g/L，E2细胞湿重为1g/L、E3细胞湿重为1g/L、L-精氨酸1g/L，L-天冬氨酸1g/L，六聚偏磷酸钠3g/L，ATP 1g/L，NAD 1g/L，pH 7；于30℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为0.7g/L。
实施例13：以重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺
构建重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm2-ecau+pETDuet-1-cjak-bcasadh+pCDFDuet-1-smpkk-bsgdh+pA CYCDuet-1-cccsdh-rscsdc，根据实施例1所述的方法，将其诱导表达，然后收集菌体。
于100ml反应体系中，细胞湿重为1g/L，L-精氨酸1g/L，L-天冬氨酸1g/L，六聚偏磷酸钠10g/L，pH 7；于30℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为1.2g/L。
实施例14：以重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺
构建重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-ecadm1-ecau+pETDuet-1-smpkk-bsgdh+pCDFDuet-1-csak-bcasadh+pACYCDuet-1-pbcsdh-bccsdc，根据实施例1所述的方法，将其诱导表达，然后收集菌体。
于100ml反应体系中，细胞湿重为200g/L，L-精氨酸100g/L，L-天冬氨酸100g/L，六聚偏磷酸钠300g/L，pH 6；于30℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为85g/L。
实施例15：应用八种酶体外合成亚精胺
将ecadm1、ecau、csak、pbasadh、smpkk、bsgdh、pccsdh、bccsdc八个基因分别连接到pEDTDuet-1载体上，采用与实施例1同样的方法表达纯化后得到八种纯酶。然后于100ml反应体系中加入这八种纯酶各1mg，L-精氨酸20g/L，L-天冬氨酸20g/L，六聚偏磷酸钠100g/L，ATP 1g/L，NAD 1g/L，pH 8；于30℃反应，时间5小时，最终液相色谱测定反应液中亚精胺浓度为18.1g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种以氨基酸为底物生产亚精胺的方法及工程菌
<130> BAA190533A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtctgacg acatgtctat gggtttgcct tcgtcagcgg gcgaacacgg tgtactacgc 60
tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120
attgcctggt ggggcaataa ctactatgac gttaacgagc tgggccacat tagcgtgtgc 180
ccggacccgg acgtcccgga agctcgcgtc gatctcgcgc agttagtgaa aactcgtgaa 240
gcacagggcc agcgtctgcc tgcactgttc tgtttcccac agatcctgca gcaccgtttg 300
cgttccatta acgccgcgtt caaacgtgcg agggaatcct acggctataa cggcgattac 360
ttccttgttt atccgatcaa agttaaccag caccgccgcg tgattgagtc cctgattcat 420
tcgggcgaac cgctgggtct ggaagccggt tccaaagccg agttgatggc agtactggca 480
catgctggca tgacccgtag cgtcatcgtc tgcaacggtt ataaagaccg cgaatatatc 540
cgcctggcat taattggcga gaagatgggg cacaaggtct atctggtcat tgagaagatg 600
tcagaaatcg ccattgtgct ggatgaagca gaacgtctga atgtcgttcc tcgtctgggc 660
gtgcgtgcac gtctggcttc gcagggttcg ggtaaatggc agtcctccgg cggggaaaaa 720
tcgaagttcg gcctggctgc gactcaggta ctgcaactgg ttgaaaccct gcgtgaagcc 780
gggcgtctcg acagcctgca actactgcac ttccacctcg gttcgcagat ggcgaatatt 840
cgcgatatcg cgacaggcgt tcgtgaatcc gcgcgtttct atgtggaact gcacaagctg 900
ggcgtcaata ttcagtgctt cgacgtcggc ggcggtctgg gcgtggatta tgaaggtact 960
cgttcgcagt ccgactgttc ggtgaactac ggcctcaatg aatacgccaa caacattatc 1020
tgggcgattg gcgatgcgtg tgaagaaaac ggtctgccgc atccgacggt aatcaccgaa 1080
tcgggtcgtg cggtgactgc gcatcacacc gtgctggtgt ctaatatcat cggcgtggaa 1140
cgtaacgaat acacggtgcc gaccgcgcct gcagaagatg cgccgcgcgc gctgcaaagc 1200
atgtgggaaa cctggcagga gatgcacgaa ccgggaactc gccgttctct gcgtgaatgg 1260
ttacacgaca gtcagatgga tctgcacgac attcatatcg gctactcttc cggcatcttt 1320
agcctgcaag aacgtgcatg ggctgagcag ctttatttga gcatgtgcca tgaagtgcaa 1380
aagcagctgg atccgcaaaa ccgtgctcat cgtccgatta tcgacgagct gcaggaacgt 1440
atggcggaca aaatgtacgt caacttctcg ctgttccagt cgatgccgga cgcatggggg 1500
atcgcccagt tgttcccggt tctgccgctg gaagggctgg atcaagtgcc ggaacgtcgc 1560
gctgtgctgc tggatattac ctgtgactct gccggtgcta tcgcccacta tattgatggt 1620
gacggtattg ccacgacaat gccaatgccg gagtacgatc cagagaatcc gccgatgctc 1680
ggtttcttta tggtcggcgc atatcaggag atcctcggca acatgcacaa cctgttcggt 1740
gataccgaag cggttgacgt gttcgtcttc cctgacggta gcgtagaagt agaactgtct 1800
gacgaaggcg ataccgtggc ggacatgctg caatatgtac agctcgatcc gaaaacgctg 1860
ttaacccagt tccgcgatca agtgaagaaa accgatcttg atgctgaact gcaacaacag 1920
ttccttgaag agttcgaggc aggtttgtac ggttatactt atcttgaaga tgagtaa 1977
<210> 2
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtctgacg acatgtctat gggtttgcct tcgtcagcgg gcgaacacgg tgtactacgc 60
tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120
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ttaacccagt tccgcgatca agtgaagaaa accgatcttg atgctgaact gcaacaacag 1920
ttccttgaag agttcgaggc aggtttgtac ggttatactt atcttgaaga tgagtaa 1977
<210> 3
<211> 1977
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtctgacg acatgtctat gggtttgcct tcgtcagcgg gcgaacacgg tgtactacgc 60
tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120
attgcctggt ggggcaataa ctactatgac gttaacgagc tgggccacat tagcgtgtgc 180
ccggacccgg acgtcccgga agctcgcgtc gatctcgcgc agttagtgaa aactcgtgaa 240
gcacagggcc agcgtctgcc tgcactgttc tgtttcccac agatcctgca gcaccgtttg 300
cgttccatta acgccgcgtt caaacgtgcg agggaatcct acggctataa cggcgattac 360
ttccttgttt atccgatcaa agttaaccag caccgccgcg tgattgagtc cctgattcat 420
tcgggcgaac cgctgggtct ggaagccggt tccaaagccg agttgatggc agtactggca 480
catgctggca tgacccgtag cgtcatcgtc tgcaacggtt ataaagaccg cgaatatatc 540
cgcctggcat taattggcga gaagatgggg cacaaggtct atctggtcat tgagaagatg 600
tcagaaatcg ccattgtgct ggatgaagca gaacgtctga atgtcgttcc tcgtctgggc 660
gtgcgtgcac gtctggcttc gcagggttcg ggtaaatggc agtcctccgg cggggaaaaa 720
tcgaagttcg gcctggctgc gactcaggta ctgcaactgg ttgaaaccct gcgtgaagcc 780
gggcgtctcg acagcctgca actactgcac ttccacctcg gttcgcagat ggcgaatatt 840
cgcgatatcg cgacaggcgt tcgtgaatcc gcgcgtttct atgtggaact gcacaagctg 900
ggcgtcaata ttcagtgctt cgacgtcggc ggcggtctgg gcgtggatta tgaaggtact 960
cgttcgcagt ccgactgttc ggtgaactac ggcctcaatg aatacgccaa caacattatc 1020
tgggcgattg gcgatgcgtg tgaagaaaac ggtctgccgc atccgacggt aatcaccgaa 1080
tcgggtcgtg cggtgactgc gcatcacacc gtgctggtgt ctaatatcat cggcgtggaa 1140
cgtaacgaat acacggtgcc gaccgcgcct gcagaagatg cgccgcgcgc gctgcaaagc 1200
atgtgggaaa cctggcagga gatgcacgaa ccgggaactc gccgttctct gcgtgaatgg 1260
ttacacgaca gtcagatgga tctgcacgac attcatatcg gctactcttc cggcatcttt 1320
agcctgcaag aacgtgcatg ggctgagcag ctttatttga gcatgtgcca tgaagtgcaa 1380
aagcagctgg atccgcaaaa ccgtgctcat cgtccgatta tcgacgagct gcaggaacgt 1440
atggcggaca aaatgtacgt caacttctcg ctgttccagt cgatgccgga cgcatggggg 1500
atcgaccagt tgttcccggt tctgccgctg gaagggctgg atcaagtgcc ggaacgtcgc 1560
gctgtgctgc tggatattac ctgtgactct gccggtgcta tcgaccacta tattgatggt 1620
gacggtattg ccacgacaat gccaatgccg gagtacgatc cagagaatcc gccgatgctc 1680
ggtttcttta tggtcggcgc atatcaggag atcctcggca acatgcacaa cctgttcggt 1740
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<212> DNA
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Claims (6)

1.一种能够以氨基酸为底物合成亚精胺的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，所述重组细胞表达了精氨酸脱羧酶、胍基丁胺脲水解酶、L-天冬氨酸激酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、羧基亚精胺脱氢酶、羧基亚精胺脱羧酶、葡萄糖脱氢酶、多聚磷酸盐激酶2-I；所述重组细胞的组合，含两个或两个以上的重组细胞，每个重组细胞表达8种酶中的一种或以上，重组细胞的组合共同实现上述8种酶的表达；
所述重组细胞或者重组细胞的组合选择大肠杆菌为宿主，包括Escherichia coliBL21(DE3)；
将编码8种酶的基因分配到pETDuet-1、pACYCDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFduet-1这4种质粒上，每个质粒上携带两个基因；
所述精氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4所示；
所述胍基丁胺脲水解酶来自于Escherichia coli BL21(DE3)，或者，所述胍基丁胺脲水解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO.为ACT44584.1的序列，或者，所述胍基丁胺脲水解酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为CP001509REGION:complement(2913735..2914655)的序列；
所述L-天冬氨酸激酶来自于Clostridium symbiosum ATCC 14940、Campylobacterjejuni subsp.jejuni ATCC 700819、Bacillus coagulans DSM 1，或者，所述L-天冬氨酸激酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO.为ERI80757.1、YP_002344012.1、AJH79997.1的序列，或者，L-天冬氨酸激酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为AWSU01000003REGION:complement(10218..11426)、NC_002163 REGION:541843..543045、CP009709REGION:complement(957019..958248)的序列；
所述天冬氨酸-β-半醛脱氢酶为来自于Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940、Bacillus coagulans DSM 1、Prevotella biviaDSM 20514、Lactobacillus fermentum ATCC 14931，Lactobacillus reuteriDSM 20016、Ruminococcuscallidus ATCC 27760、Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838，或者，所述天冬氨酸-β-半醛脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为YP_354457.1、ERI74627.1、AJH78885.1、EIM32299.1、EEI21839.1、KRK52213.1、ERJ96894.1、EEF86657.1的序列，或者，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_007493REGION:3154877..3155899、AWSU01000307 REGION:complement(28522..29628)、CP009709REGION:215590..216636、JH660660 REGION:605188..606201、ACGI01000096REGION:complement(87687..88739)、AZDD01000002 REGION:42759..43835、AWVF01000093REGION:108774..109862、ACCH01000503 REGION:1..871的序列；
所述羧基亚精胺脱氢酶为来自于Bacillus coagulans DSM 1、Clostridium sp.DSM8431、Prevotella bivia DSM 20514、RuminococcuscallidusATCC 27760、Campylobacterjejuni subsp.jejuni ATCC 700819、Porphyromonascatoniae ATCC 51270、Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808、Clostridium symbiosum ATCC 14940，或者，所述羧基亚精胺脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO.为AJH78404.1、SFU79043.1、EIM32270.1、ERJ96771.1、YP_002343630.1、EWC93538.1、YP_351518.1、ERI79986.1的序列，或者，羧基亚精胺脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为CP009709REGION:2139242..2140441、FPBY01000164 REGION:458..1657、JH660660 REGION:573354..574616、AWVF01000096 REGION:13704..14912、NC_002163 REGION:complement(167807..169012)、JDFF01000004 REGION:complement(69139..70371)、NC_007493REGION:59748..60986、AWSU01000043 REGION:complement(9703..10905)的序列；
所述羧基亚精胺脱羧酶为来自于Bacteroides cellulosilyticusDSM 14838、Clostridium symbiosumATCC 14940、Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC700819、RhodobactersphaeroidesATCC BAA-808，或者，所述羧基亚精胺脱羧酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为EEF87925.1、ERI79985.1、YP_002344893.1、YP_351517.1的序列，或者，羧基亚精胺脱羧酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为ACCH01000346REGION:346..1506、AWSU01000043 REGION:complement(8508..9659)、NC_002163 REGION:complement(1450328..1451476)、NC_007493 REGION:58614..59711的序列；
所述多聚磷酸盐激酶2-I为来自于Sinorhizobium_meliloti，或者，所述多聚磷酸盐激酶2-I，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为NP_384613.1的序列，或者，多聚磷酸盐激酶2-I的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NC_003047 REGION:complement(564142..565044)的序列；
所述葡萄糖脱氢酶来自Bacillus subtilis ATCC 13952，或者，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013351020.1序列，或者，所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_CP009748 REGION:386154..38693的序列。
2.根据权利要求1所述的一种能够以氨基酸为底物合成亚精胺的重组细胞或者重组细胞的组合，其特征在于，将8种酶分配到两个或两个以上的大肠杆菌中进行表达。
3.一种全细胞催化生产亚精胺的方法，其特征在于，是利用权利要求1或2所述的重组细胞或者重组细胞的组合为全细胞催化剂，以天冬氨酸和精氨酸为底物合成亚精胺。
4.根据权利要求3所述的一种全细胞催化生产亚精胺的方法，其特征在于，所述全细胞催化剂的制备，是培养、繁殖重组细胞或者重组细胞的组合，并使得重组细胞或者重组细胞的组合表达所述8种酶，然后收集重组细胞或者重组细胞的组合。
5.根据权利要求3或4所述的一种全细胞催化生产亚精胺的方法，其特征在于，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，L-精氨酸1-100g/L，L-天冬氨酸1-100g/L，ATP 0-1g/L，NAD 0-1g/L，六聚偏磷酸钠1-300g/L，pH 5.0-9.0；于15-40℃反应，反应时间1-48小时。
6.权利要求1或2所述的重组细胞或者重组细胞的组合在生产亚精胺或者含有亚精胺的产品或者以亚精胺为前体的物质中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Alternative Spermidine Biosynthetic Route Is Critical for Growth of Campylobacter jejuni and Is the Dominant Polyamine Pathway in Human Gut Microbiota;Colin C. Hanfrey et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20111216;第286卷(第50期);第43304页图2 *
An Alternative Polyamine Biosynthetic Pathway Is Widespread in Bacteria and Essential for Biofilm Formation in Vibrio cholerae;Jeongmi Lee et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20090410;第284卷(第15期);第9904页图5 *

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