CN111826405B - 一种生物催化还原丙酮酸产d-乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物催化还原丙酮酸产D‑乳酸的方法及其应用。该方法中，利用还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为还原剂，D‑乳酸脱氢酶为催化剂，催化还原丙酮酸产D‑乳酸。该方法可以与还原烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法偶联，通过促进还原剂再生，推动D‑乳酸积累。该偶联体系可以用于酶催化和生物转化，还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸可作为还原剂选择性介导还原丙酮酸产D‑乳酸，具有应用潜力和经济价值。

Description

一种生物催化还原丙酮酸产D-乳酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamidecytosine dinucleotide，NCDH)驱动生物催化还原丙酮酸产D-乳酸的方法及其应用。该方法可以与NCDH再生的方法偶联，通过促进还原剂的再生，提供更多的还原力推动D-乳酸的积累。该偶联的体系可以用于酶催化和全细胞催化过程，NCDH作为还原剂可选择性的介导D-乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸产D-乳酸。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态(NADH)作为氢和电子的载体，在细胞中参与多种氧化还原反应。在复杂的代谢网络中，现阶段通常采用辅因子工程对目标代谢途径进行调控。常见的策略有，1)改变胞内辅酶合成，降解，回补代谢和不同辅酶分子相互转化的能力，2)改变氧化还原酶的辅酶偏好性，3)在细胞内表达可再生辅酶的酶，如葡萄糖脱氢酶等，并在培养环境中额外添加相应酶的底物。但是，由于NAD(H)是一种通用的辅酶，胞内NAD(H)水平及不同氧化态的扰动往往会对细胞生理及代谢等产生难以预测的全局性影响。因此，为了实现特异性调控目标代谢网络，亟需一种方法使目标代谢网络从复杂代谢网络中独立出来，即需要重新设计出一个生物正交系统(K.Shokat,et al.Drug DiscoveryToday.2002,7,872)。

在依赖于NAD类似物的生物正交系统中，NAD(H)类似物可以在该正交代谢途径中传递，而不影响其他利用NAD(H)的代谢途径，同样，其他代谢途径中的NAD(H)也不会影响到生物正交代谢途径。因此，仅靠调控NAD(H)类似物的含量就可以对生物正交系统进行特异性的代谢调控，从而达到提高目标途径产量的目的。

在已报道的NAD类似物中，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)是一种具有较好生物相容性的NAD类似物(Ji,D.,et al.Creation of bioorthogonal redox systems dependingon nicotinamide flucytosine dinucleotide.Journal of the American ChemicalSociety.2011,133,20857；赵宗保等，一种NAD类似物的还原方法，申请号：201410117146.6)。目前，也报道了NCD的生物合成方法，以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，实现在纯酶水平和微生物胞内NCD的生物合成。同时也报道了一些可识别NCD的酶，如苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、亚磷酸脱氢酶psPDH(Genbank069054)L151V/D213Q突变体和rPDH(Genbank AEQ29500)I151R或I151R/E213C突变体、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体以及甲酸脱氢酶(pseFDH，UniProtKB/Swiss-Prot P33160.3)突变体pseFDH-H223S/L257R等。

利用NAD类似物及识别它们的酶，可以构建更经济有效的生物催化体系(纪德彬等,利用人工氧化酶体系催化L-苹果酸氧化脱羧反应.催化学报,2012,33,530)。如，过表达ME-L310R/Q401C和NOX的大肠杆菌基因工程菌的细胞裂解液，在NAD类似物存在下，可以高效、选择性将苹果酸转化为丙酮酸；而在NAD存在下，丙酮酸被内源的乳酸脱氢酶进一步还原为乳酸。可见，通过选择合适的NAD类似物及识别它们的酶，可利用粗酶液进行反应达到纯酶催化的效果，实现在辅酶水平控制复杂生物催化转化体系。目前，已经实现利用NCD进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，经过rPDH-I151R的催化反应产生还原型的NCDH，ME-L310R/Q401C可利用NCDH将丙酮酸还原为苹果酸，实现了特异性的生物催化调控(Wang L,et al.Synthetic cofactor-linked metabolic circuits for selectiveenergy transfer.ACS Catalysis,2017,7,1977)。

D-乳酸是一种用途广泛的工业化学品，作为前体物质可以用于生产聚乳酸。D-乳酸可以通过化学方法和生物方法进行合成，但是化学方法合成过程存在目标产物光学纯度的问题，而生物合成方法能够选择性的合成D-乳酸。D-乳酸的生物合成主要以葡萄糖、木糖或淀粉等为底物，用微生物工程菌进行生物转化(Zhang,Y.,et al.Biosynthesis of D-lactic acid from lignocellulosic biomass.Biotechnology Letter,2018,40,1167)。虽然在葡萄糖转化成乳酸的过程中，氧化还原水平没有改变，但是葡萄糖代谢为丙酮酸所产生的NADH除了用于还原丙酮酸产乳酸之外，还要参与呼吸作用、细胞生长以及其他的氧化还原反应。利用NCDH偏好性D-乳酸脱氢酶，以NCDH为还原剂，能够实现选择性的调控丙酮酸到D-乳酸的还原反应，可以提高D-乳酸的合成效率及产量，具有较好的应用前景。

基于以上背景和优势，本发明利用定向进化的方法，以获得特异性以NCDH为还原剂选择性的催化丙酮酸到D-乳酸的突变体。

发明内容

本发明涉及一种生物催化还原丙酮酸产D-乳酸的方法，具体来说是以丙酮酸为底物，以NCDH为还原剂，以D-乳酸脱氢酶为催化剂合成D-乳酸。可以通过化学方法还原NCD得到NCDH，或者偶联NCD偏好型氧化还原酶将NCD还原成NCDH。因此，本发明的方法可应用在生物催化和生物转化领域，具有重要价值。

本发明涉及的D-乳酸脱氢酶具有NCD偏好性，是在来源于LactobacillushelveticusD-乳酸脱氢酶(DLDH，NCBI蛋白数据库编号CAA47255，含1至337位完整氨基酸序列)V152R突变体(突变位点用氨基酸序号和突变前后的氨基酸名称表示，如V198I表示第198位氨基酸由V突变成I，其余位点类似)基础上继续突变得到，包括DLDH-V152R/V210N/N213E、DLDH-V152R/I177K/N213I和DLDH-V152R/N213E中。V152R代表第152位氨基酸由V突变成R，其它类同。

本发明涉及的还原剂NCDH通过化学方法还原NCD得到，或者由具有辅因子偏好型的氧化还原酶还原NCD产生，氧化还原酶包括但不局限于苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C，亚磷酸脱氢酶突变体rPDH-I151R/P176R/M207A，甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R，源于Bacillus methanolicus的甲醇脱氢酶BmMDH(NCBI蛋白数据库编号P31005.3)突变体BmMDH-D212E/M219R。

本发明中表达NCDH再生的氧化还原酶和D-乳酸脱氢酶的基因构建在表达载体上，通过RF克隆的方法构建到载体上。纯酶的表达和纯化参照在大肠杆菌中表达其他氧化还原酶的文献方法进行(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systemsdepending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.Journal of the AmericanChemical Society,2011,133,20857)。反应在缓冲体系中进行，缓冲体系包括但不限于磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，MOPS缓冲液中的一种或两种以上。

在反应体系中，再生NCDH时添加氧化还原酶对应的底物，亚磷酸脱氢酶对应的底物为亚磷酸盐，苹果酸酶对应的底物为L-苹果酸盐，甲酸脱氢酶对应的底物为甲酸盐，甲醇脱氢酶对应的底物为甲醇或异戊醇等短链醇。在反应中，再生NCDH的反应底物使用浓度为1mM-25mM。

本发明所述的方法可在纯酶体系或粗酶液体系中进行。在纯酶反应体系中，再生NCDH的氧化还原酶的使用浓度为4μg/mL-500μg/mL，D-乳酸脱氢酶的使用浓度为5μg/mL-1000μg/mL。在粗酶液反应体系中，粗酶液通过裂解表达用于还原NCDH的氧化还原酶和D-乳酸脱氢酶的大肠杆菌工程菌，离心取上清获得。在反应体系中，NCD的使用浓度为0.01mM-2mM，丙酮酸使用浓度为0.1mM-20mM。反应条件为：pH 3.0-9.0，温度20℃-55℃，时间0.2-30h。

所述NCD可以通过在微生物中表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体NadD-P22G/Y84A/C132D，以胞内的烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，自主合成NCD。NCDH驱动D-乳酸脱氢酶还原丙酮酸产D-乳酸的反应可以在细胞内进行，微生物细胞包括但不局限于原核微生物，如大肠杆菌，乳酸乳球菌等或真核微生物，如酿酒酵母等。

本发明的优点和有益效果：生物催化还原条件温和，反应效率高，产物纯度高，应用于胞内体系时可利用还原力选择性的驱动丙酮酸到D-乳酸的合成，有效提高D-乳酸的产量和产率。

附图说明

图1为DLDH-V152R/V210N/N213E-NCD复合物晶体结构图；

图2为DLDH-V152R/I177K/N213I-NCD复合物晶体结构图；

图3为DLDH-V152R/N213E-NCD复合物晶体结构图。

具体实施方式

以下实施例可以进一步阐明本发明，通过参考以下的实施例将更容易理解本发明。这些实施例仅用于示例性说明，但不局限于本发明的内容。

本发明中，使用的NCD参照文献方法(Ji DB,et al.Synthesis of NAD analogsto develop bioorthogonal redox system.Sci China Chem,2013,56,296)制备，或者参照文献方法(赵宗保等，酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，CN 106884029A)通过表达来源于E.coli的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体NadD-P22G/Y84A/C132D进行酶法合成。

本发明中，大肠杆菌转化的方法参照《分子克隆指南》中电转化的方法，酿酒酵母转化的方法参照文献(Gietz,R.D.,et al.Nature Protocols.2007,2,31)中醋酸锂转化方法。

本发明中，D-乳酸的检测方法为离子色谱，安捷伦离子色谱仪及变色龙软件工作站，IonPac AS11–HC阴离子交换分析柱(250mm×4mm，Dionex)，IonPac AG11–HC阴离子交换分析柱阴离子交换保护柱(50mm×4mm，Dionex)。流速1mL/min，柱温：30℃，进样量：25μL。等度方法：10mM NaOH溶液，分析10min。硫酸再生液浓度：30mM，氮气压力：40psi。

对比实施例1：无NCDH条件下D-乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸的反应

将1mM的NCD用两当量的连二亚硫酸钠进行还原，丙酮沉淀后获得还原型NCDH，将NCDH制备成5mM溶液，备用。

将1mM的NCDH和2mM的丙酮酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为50μg/mL的D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E，混匀，37℃反应2h，取100μL，加900μL乙腈甲醇水混合液(体积比，乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。

用离子色谱检测反应中D-乳酸的浓度，在3.7min没有特征峰，仅检测到丙酮酸的特征峰。说明在没有NCDH条件下，D-乳酸脱氢酶不能还原丙酮酸产D-乳酸。

对比实施例2：酶失活条件下催化还原丙酮酸产D-乳酸的反应

将D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E在80℃水浴加热20min，使酶失活后备用。

将1mM的NCDH和2mM的丙酮酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为200μg/mL的失活的D-乳酸脱氢酶，混匀，37℃反应2h，取100μL，加900μL乙腈甲醇水混合液(体积比，乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。

用离子色谱检测反应中D-乳酸的浓度，在3.7min没有特征峰，仅检测到丙酮酸的特征峰。说明存在NCDH条件下，加热失活的D-乳酸脱氢酶不能还原丙酮酸产D-乳酸。

对比实施例3：以NADH为还原剂，D-乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸产D-乳酸

将1mM的NADH和0.5mM的丙酮酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为100μg/mL的D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E，混匀，37℃反应2h，取100μL，加900μL乙腈甲醇水混合液(体积比，乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。

离子色谱检测反应中D-乳酸和丙酮酸的浓度，没有检测到D-乳酸，仅检测到丙酮酸，并且丙酮酸的量没有减少。说明在存在NADH条件下，NCD偏好型的D-乳酸脱氢酶不能还原丙酮酸产D-乳酸。

实施例1：以NCDH为还原剂，D-乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸产D-乳酸

将0.5mM的NCDH和0.1mM的丙酮酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的磷酸缓冲液中，加入终浓度为5μg/mL的D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E，混匀，37℃反应0.2h，取100μL，加900μL乙腈甲醇水混合液(体积比，乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。

用离子色谱检测反应中D-乳酸的浓度，检测到D-乳酸的特征峰，同时也检测到丙酮酸的特征峰。对D-乳酸和丙酮酸定量，体系中63％的丙酮酸被还原为D-乳酸。

实施例1的结果表明，以NCDH为还原剂，乳酸脱氢酶能催化还原丙酮酸产D-乳酸。综合实施例1、对比实施例1、对比实施例2和对比实施例3的结果说明，以NCDH为还原剂，NCD偏好型的D-乳酸脱氢酶能够催化丙酮酸产D-乳酸，并且还原剂NCDH和催化剂NCD偏好型D-乳酸脱氢酶起到了不可替代的作用。

实施例2：亚磷酸脱氢酶突变体再生NCDH，催化还原丙酮酸产D-乳酸的应用

参照文献(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systemsdepending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.Journal of the AmericanChemical Society,2011,133,20857)方法纯化制备亚磷酸脱氢酶突变体Pdh-I151R/P176R/M207A(Liu YX,et al.Structural insights into phosphite dehydrogenasevariants favoring a non-natural redox cofactor.ACS Catalysis,2019,9,1883)和D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/V210N/N213E。亚磷酸脱氢酶催化的反应为：亚磷酸+NCD→磷酸+NCDH产生的NCDH能推动D-乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸产D-乳酸。在该体系中NCD被循环使用，而且反应没有任何副产物，具有一定的潜力。其中具有代表性的实验过程如下：

采用50mM，pH 3.0的MES缓冲体系，100μL的反应体系组成为：1mM亚磷酸、10mM丙酮酸、0.01mM NCD，0.1mg/mL亚磷酸脱氢酶，0.05mg/mL D-乳酸脱氢酶。55℃反应5h，加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。离子色谱检测反应溶液中亚磷酸、丙酮酸和D-乳酸的浓度。检测结果表明，反应液中含0.05mM亚磷酸、9.1mM丙酮酸以及0.9mMD-乳酸。

在进行上述反应时，设置了另外4组对照实验体系，分别缺少亚磷酸、NCD、亚磷酸脱氢酶或D-乳酸脱氢酶中的一种，分析发现这些反应没有产生D-乳酸。

实验结果表明，在纯酶反应体系中亚磷酸脱氢酶还原NCD产生了NCDH，NCDH作为还原剂，几乎全部用于推动D-乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸产生D-乳酸。

实施例3：甲酸脱氢酶突变体再生NCDH，催化还原丙酮酸产D-乳酸

可以将再生NCDH的氧化还原酶和D-乳酸脱氢酶同时在细胞中表达，通过裂解细胞获得混合有两种酶的粗酶液，构建用粗酶液催化生产D-乳酸的体系。以在大肠杆菌中表达甲酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶为例予以说明。

构建同时表达甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R(中国专利申请号201711230338.6)和D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/I177K/N213I的大肠杆菌pUC表达载体，基因均用P_Lac启动子启动表达，将载体电转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在LB培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、0.2mM IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养24h。离心收集菌体，用MOPS缓冲液洗涤并重悬菌体，超声裂解细胞，离心取上清，获得含有甲酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶的粗酶液，粗酶液中总蛋白浓度为20mg/mL。

采用50mM，pH 9.0的MOPS缓冲体系，100μL的反应体系组成为：10mM甲酸、20mM丙酮酸、2mM NCD、5μL粗酶液。20℃反应8h，加900μL乙腈甲醇水混合液(体积比，乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。离子色谱检测反应溶液中甲酸、丙酮酸和D-乳酸的浓度。检测结果表明，反应液中含0.5mM甲酸、10.1mM丙酮酸以及9.5mM D-乳酸。

在进行上述反应的同时，设置不添加NCD的对照实验，其他成分和条件相同，分析发现反应液中甲酸和丙酮酸的浓度没有明显变化，没有检测到D-乳酸的生成，说明在偶联体系中没有NCD的条件下，D-乳酸脱氢酶不能催化还原丙酮酸产D-乳酸。

实验结果表明，在反应体系中甲酸脱氢酶还原NCD产生了NCDH，NCDH作为还原剂，几乎全部用于推动D-乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸产D-乳酸。

实施例4：NCDH在真核微生物胞内中选择性推动D-乳酸脱氢酶催化还原内源丙酮酸产生D-乳酸

可以将能够合成NCD的NCD合成酶，再生NCDH的氧化还原酶和D-乳酸脱氢酶同时在细胞中表达，通过添加相应的底物，在胞内实现NCDH选择性推动D-乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸产D-乳酸。以在酿酒酵母BY4741中表达NCD合成酶、甲醇脱氢酶和D-乳酸脱氢酶为例予以说明。

构建同时表达NCD合成酶NadD-P22G/Y84A/C132D、甲醇脱氢酶BmMDH-D212E/M219R和D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/I177K/N213I的酿酒酵母pESC-His表达载体，分别用P_TEF1、P_TDH3和P_TPI组成型启动子启动表达。此外，构建只表达NCD合成酶NadD-P22G/Y84A/C132D和D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/I177K/N213I、只表达NCD合成酶NadD-P22G/Y84A/C132D和甲醇脱氢酶BmMDH-D212E/M219R以及只表达D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/I177K/N213I和甲醇脱氢酶BmMDH-D212E/M219R的对照载体，分别用以上相同的组成型启动子启动表达，作为对照载体。分别将4种载体用醋酸锂转化的方法，转化到酿酒酵母BY4741中，构建工程菌株YXL01和对照菌株YXL02、YXL03以及YXL04。将工程菌分别在SD(Leu、Met、Ura)培养基中，以20g/L葡萄糖为碳源，在30℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体。

用pH 5.0的HEPES培养基分别洗涤重悬菌体，将菌体密度OD_600nm均调整到20。在上述工程菌悬液中分别加入25mM甲醇以及15mM葡萄糖，在30℃200rpm摇床中厌氧反应0h、10h、20h和30h后取样，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。

用离子色谱分析不同时间点样品中D-乳酸的浓度，结果表明工程菌株YXL01在反应0h、10h、20h和30h的样品中，D-乳酸的浓度分别为0mM，8.7mM、16.9mM以及20.4mM。对照菌YXL02在反应0h、10h、20h和30h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0mM，0.3mM、1.9mM以及6.4mM；对照菌YXL03在反应0h、10h、20h和30h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0mM，0.2mM、1.6mM以及5.9mM；而对照菌YXL04在反应0h、10h、20h和30h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0mM，0.4mM、1.8mM以及6.2mM。

用以上工程菌株和反应条件，以20mM异戊醇和15mM葡萄糖为底物，在反应0h、6h、12h和24h后取样，终止反应，并用相同的方法分析样品中D-乳酸的浓度。结果表明以异戊醇为底物时，工程菌株YXL01在反应0h、6h、12h和24h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0mM，7.6mM、13.7mM以及16.8mM。对照菌YXL02在反应0h、6h、12h和24h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0mM，0.2mM、1.5mM以及4.9mM；对照菌YXL03在反应0h、6h、12h和24h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0mM，0.2mM、1.4mM以及4.3mM；而对照菌YXL04在反应0h、6h、12h和24h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0mM，0.3mM、1.6mM以及5.0mM。

实施例4的结果表明，在胞内利用自身合成的NCD，在经过类似于及甲醇脱氢酶的氧化还原酶的还原之后，产生的NCDH能够作为还原剂，在胞内选择性的推动D-乳酸脱氢酶催化还原内源丙酮酸产D-乳酸。

实施例5：NCDH在原核微生物胞内中选择性推动D-乳酸脱氢酶催化内源丙酮酸产生D-乳酸

以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)AS1.2829说明NCDH在原核微生物胞内中选择性推动D-乳酸脱氢酶催化内源丙酮酸产生D-乳酸的应用。

构建同时表达NCD合成酶NadD-P22G/Y84A/C132D、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E在乳酸乳球菌的表达载体pMG36e，由组成型表达启动子P32控制基因的表达(GUCHTE MV,et al.Construction of a lactococcal expressionvector:expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactissubsp.Lactis.Apply Environment Microbiology,1989,55,224.)。同时，构建只表达NCD合成酶NadD-P22G/Y84A/C132D和D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E的表达载体。

将两种工程质粒导入乳酸乳球菌获得工程菌株YXL03和对照菌株YXL04，用pH 6.8的含有10g/L蔗糖、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L的KH₂PO₄、2g/L的MgSO₄和5mg/L红霉素的培养基诱导工程菌YXL05和对照菌YXL06表达上述功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的HEPES缓冲液洗涤重悬菌体，将菌体密度OD_600nm调整至20。

在上述工程菌悬液中分别加入15mM苹果酸和10mM葡萄糖，在30℃ 200rpm摇床中厌氧反应0h、6h、12h和24h后取样，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液(体积比，乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。

用离子色谱分析不同时间点样品中D-乳酸的浓度。结果表明，工程菌株YXL05在反应0h、6h、12h和24h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0.3mM，5.6mM、10.1mM以及13.2mM。而对照菌YXL06在反应0h、6h、12h和24h后的样品中，D-乳酸的浓度分别为0.1mM，0.4mM、1.3mM以及3.6mM。

实施例5的结果表明，在原核微生物胞内利用自身合成的NCD，在经过类似于甲醇脱氢酶的氧化还原酶的还原之后，产生的NCDH能够作为还原剂，在胞内选择性的推动D-乳酸脱氢酶催化还原内源丙酮酸产D-乳酸。

实施例6：D-乳酸脱氢酶突变体晶体解析

分别将D-乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R/V210N/N213E、DLDH-V152R/I177K/N213I和DLDH-V152R/N213E与NCD进行晶体解析，以获得含有配体NCD的晶体结构。

纯化后的蛋白，采用座滴法，选取Hampton Research and Wizard公司的结晶筛选试剂盒进行筛选。突变体DLDH-V152R/V210N/N213E用于衍射的晶体培养条件为0.1M硫酸铵，0.1M Tris(pH 7.0)，10％聚乙二醇单乙醚5000，蛋白浓度6mg/mL，温度30℃。突变体DLDH-V152R/I177K/N213I结晶条件为0.4M乙酸钠，0.3M甲次砷酸钠，0.1M MOPS(pH 8.0)，50％w/v的聚乙二醇8000。突变体DLDH-V152R/N213E结晶条件为0.1M NaCl，0.1M Bis-Tris(pH 6.5)，30％聚乙二醇3350，2％异丙醇。晶体衍射在上海同步辐射装置(SSRF)进行，波束线BL18U1。晶体浸母液中，添加5mM NCD，然后进行低温处理、数据收集。所获得的晶体结构如图1或图2或图3所示。

来源于Lactobacillus helveticusD-乳酸脱氢酶，NCBI蛋白数据库编号CAA47255，含1至337位完整氨基酸序列，如下：

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种生物催化还原丙酮酸产D-乳酸的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 337

<212> PRT

<213> D-乳酸脱氢酶(Lactobacillus helveticus)

<400> 1

Met Thr Lys Val Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Lys Asp Glu Glu Pro Phe

1 5 10 15

Leu Asn Glu Trp Lys Glu Ala His Lys Asp Ile Asp Val Asp Tyr Thr

20 25 30

Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Lys Gly Ala Asp

35 40 45

Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Asp Thr Leu Gln

50 55 60

Ala Leu Ala Asp Ala Gly Val Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly

65 70 75 80

Val Asp Asn Ile Asp Met Asp Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile

85 90 95

Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala

100 105 110

Ile Gln Ala Ala Arg Val Leu Arg Gln Asp Lys Arg Met Asp Glu Lys

115 120 125

Met Ala Lys Arg Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val

130 135 140

Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val

145 150 155 160

Phe Met Arg Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp

165 170 175

Ile Phe Lys Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser

180 185 190

Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro

195 200 205

Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Glu

210 215 220

Met Lys Asp Gly Val Val Ile Val Asn Cys Ser Arg Gly Arg Leu Val

225 230 235 240

Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile Phe Gly

245 250 255

Phe Val Met Asp Thr Tyr Glu Asp Glu Val Gly Val Phe Asn Lys Asp

260 265 270

Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Lys Arg Leu Ala Asp Leu Ile Asp

275 280 285

Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His

290 295 300

Ala Val Arg Asn Met Val Val Lys Ala Phe Asn Asn Asn Leu Lys Leu

305 310 315 320

Ile Asn Gly Glu Lys Pro Asp Ser Pro Val Ala Leu Asn Lys Asn Lys

325 330 335

Phe

Claims (6)

1.一种生物催化还原丙酮酸产D-乳酸的方法，其特征在于，以丙酮酸为底物，以还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为还原剂，酶催化合成D-乳酸；所述酶为经过基因工程改造的酶，即D-乳酸脱氢酶突变体DLDH-V152R/I177K/N213I、DLDH-V152R/N213E或DLDH-V152R/V210N/N213E中的一种或两种以上，其中，D-乳酸脱氢酶DLDH的序列为SEQ ID NO.1所示。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸可通过氧化还原酶催化还原烟酰胺胞嘧啶二核苷酸再生得到；

所述的氧化还原酶包括亚磷酸脱氢酶，甲醇脱氢酶，甲酸脱氢酶，苹果酸酶中的一种或两种以上。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的D-乳酸脱氢酶突变体和再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的氧化还原酶由相应的DNA序列编码获得。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的氧化还原酶和D-乳酸脱氢酶突变体，其相应的编码DNA序列克隆在一种蛋白质表达载体中，用于可控表达。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的氧化还原酶和D-乳酸脱氢酶突变体，由携带相应蛋白表达载体的微生物细胞产生，纯化相应蛋白或裂解细胞获得粗酶液，并用于体外酶促反应合成D-乳酸，反应条件为：pH 3.0-9.0，温度20 ℃-55 ℃。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，反应条件为：pH 4.0-8.0，温度15 ℃-40℃。

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