CN105813625A - 生产酰基氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及:表达氨基酸N酰基转移酶(优选为重组的)和酰基CoA合成酶(优选为重组的)的细胞,其中所述细胞具有减弱的脂肪酸降解能力;生产酰基氨基酸的方法,其包括使氨基酸与酰基CoA在存在氨基酸N酰基转移酶(优选为分离的和/或重组的)的情况下接触的步骤,其中所述氨基酸N酰基转移酶优选为人类氨基酸N酰基转移酶,或培养所述细胞的步骤;以及反应混合物,其包含氨基酸N酰基转移酶(优选为分离的和/或重组的)、酰基CoA合成酶(优选为分离的和/或重组的)、氨基酸以及脂肪酸CoA,或是脂肪酸和酰基CoA合酶。
Description
本发明涉及:表达氨基酸-N-酰基转移酶(优选为重组的)和酰基-CoA合成酶(优选为重组的)的细胞,其中所述细胞具有减弱的脂肪酸降解能力;生产酰基氨基酸的方法,其包括使氨基酸与脂肪酸-CoA在存在氨基酸-N-酰基转移酶(优选为分离的和/或重组的)的情况下接触的步骤,其中所述氨基酸-N-酰基转移酶优选为人类氨基酸-N-酰基转移酶,或培养所述细胞的步骤;以及反应混合物,其包含氨基酸-N-酰基转移酶(优选为分离的和/或重组的)、酰基-CoA合成酶(优选为分离的和/或重组的)、氨基酸以及脂肪酸-CoA,或脂肪酸和酰基-CoA合酶。
酰基氨基酸是一类有着多种用途的表面活性剂,例如用作洗涤目的的去垢剂、食物产品中的乳化剂以及作为各种个人护理产品(如洗发水、肥皂、保湿剂等)中重要的成分。除了同时具有疏水性和亲水性区域(作为表面活性剂使用的前提),化合物(表面活性剂)还是由天然存在的分子(更具体地讲,氨基酸和脂肪酸)制成的,其不仅无害且在环境上可接受,还可使用廉价的生物原材料容易地大规模生产。在药理学研究中,酰基氨基酸被用作新药物靶标的神经调质和探针。
已经从大量生物来源分离出了酰基氨基酸,并且据信,其具有一系列功能,例如作为哺乳动物组织中的信号分子(Tan,B.,O'Dell,D.K.,Yu,Y.W.,Monn,M.F.,Hughes,H.V.,Burstein,S.,Walker,J.M.(2010),Identificationofendogenousacylaminoacidsbasedonatargetedlipidomicsapproach,J.LipidRes.51(1),112-119))、作为细菌培养中抗生素的结构单元(Clardy,J.,与Brady,S.F.(2007),CyclicAMPdirectlyactivatesNasP,anN-acylaminoacidantibioticbiosyntheticenzymeclonedfromanunculturedbeta-proteobacterium,J.Bacteriol.189(17),6487-6489)或作为涉及细菌蛋白质分选的化合物(Craig,J.W.,Cherry,M.A.,Brady,S.F.(2011),Long-chainN-acylaminoacidsynthasesarelinkedtotheputativePEP-CTERM/exosortaseprotein-sortingsysteminGram-negativebacteria,J.Bacteriol.193(20),5707-5715)。
传统上,已经在工业规模上从来源于石油化学产品的材料起始来生产酰基氨基酸。更具体地讲,以酸性氯化物形式提供的活化的脂肪酸可被用于在碱性水介质中酰化氨基酸(如GB1483500中所述)。此类方法的缺点包括需要添加有害的化学品如硫酸或其酸酐。其它合成方法伴随有副产物(如氯盐)的积聚,其对表面活性有不良影响。
已经描述了一系列生产酰基氨基酸的生物技术途径。然而,由于低产率、纯度不足以及需要多步骤的纯化工序,它们中无一可以胜任酰基氨基酸的大规模商业化生产。具体地讲,饲喂给生物技术上可用的生物体的碳基质的仅一小部分被真正转化成了所期望的产物,而其大部分则是通过基础代谢反应被消耗掉了。
与生物技术途径相关的另一个问题在于所得到的是产物的混合物,因而难以控制其组成。更具体地讲,一系列脂肪酸均可被转化成酰基氨基酸,即使可能只需要生产单一的加合物。由于混合物包含在化学结构上高度相关的化合物,使得以高效而直接的方式纯化或至少富集单一组分通常在技术上不具备可行性。
所附权利要求书的主题可以解决这些问题。具体地讲,本发明可提供高效的生产酰基氨基酸的生物技术途径。具体地讲,相比现有方法,本发明的产品的产率和纯度,就催化剂或不期望的副产物而言,可以得到改善。
本发明还提供了制造酰基氨基酸的方法,其中被转化成酰基氨基酸的脂肪酸的范围较现有方法更宽。具体地讲,本发明的方法可适用于将短的且不饱和的脂肪酸转化成酰基氨基酸。
本发明还可提供制造酰基氨基酸的生物技术方法,其中所述酰基氨基酸产物的酰基残基的长度可以是可控的,优选使得月桂基为富集的或普遍的。
在第一个方面,本发明提供了表达氨基酸-N-酰基转移酶(其优选为重组的)和酰基-CoA合成酶(其优选为重组的)的细胞,其中所述细胞具有减弱的脂肪酸降解能力。具体地讲,相比野生型细胞,所述细胞中氨基酸-N-酰基转移酶和/或酰基-CoA合成酶的表达增加。
在第一方面的第一实施方案中,相比野生型细胞,由于至少一种酶的活性降低,使得所述细胞的脂肪酸降解能力可能减弱,所述至少一种酶选自酰基-CoA脱氢酶、2,4-二烯酰基-CoA还原酶、烯酰基-CoA水合酶和3-酮酰基-CoA硫解酶,优选酰基-CoA脱氢酶。
在第二实施方案(也是所述第一实施方案的实施方案)中,其中氨基酸-N-酰基转移酶可以是人类氨基酸-N-酰基转移酶,优选SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或其变体。具体地讲,氨基酸-N-酰基转移酶可具有包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或其变体的多肽序列。
在第三实施方案(也是所述第一至第二实施方案的实施方案)中,细胞可以是细菌细胞,优选肠细菌细胞,更优选大肠杆菌(E.coli)。
在第四实施方案(也是所述第一至第三实施方案的实施方案)中,细胞能够制造蛋白原氨基酸和/或脂肪酸。
在第五实施方案(也是所述第一至第四实施方案的实施方案)中,细胞表达酰基-CoA硫酯酶,所述酰基-CoA硫酯酶优选为重组的并且更优选地为SEQIDNO:1或其变体。
在第六实施方案(也是所述第一至第五实施方案的实施方案)中,酰基-CoA合成酶可以是SEQIDNO:6或其变体。
在第二个方面,本发明提供了生产酰基氨基酸的方法,包括步骤:
b)使氨基酸与酰基CoA在存在氨基酸-N-酰基转移酶(其优选为分离的和/或重组的)的情况下接触,
其中所述氨基酸-N-酰基转移酶其优选为人类氨基酸-N-酰基转移酶,更优选为SEQIDNO4、SEQIDNO5或其变体,并且
其中所述酰基-CoA合成酶优选为SEQIDNO6或其变体,
或根据所述第一个方面或其任何实施方案来培养所述细胞。
在第二个方面的第一实施方案中,除步骤b)以外,所述方法还包括步骤:
a)使用酰基-CoA合成酶(其优选为分离的和/或重组的)将脂肪酸转化成酰基CoA
以及/或
c)氢化。
在第二实施方案(也是所述第二个方面的第一实施方案的实施方案)中,可将选自氨基酸-N-酰基转移酶和酰基-CoA合成酶中的至少一种酶(优选所有酶)以表达所述酶的细胞的形式提供。
在第三实施方案(也是所述第二个方面的第一或第二实施方案的实施方案)中,表达所述一种或多种酶的细胞可以是根据所述第一个方面或其任何实施方案的细胞。
在第三个方面,本发明提供了反应混合物,其包含:
氨基酸-N-酰基转移酶(其优选为分离的和/或重组的)、
酰基-CoA合成酶(其优选为分离的和/或重组的)、
氨基酸和/或
酰基-CoA,或是脂肪酸和酰基-CoA合成酶,
其中所述氨基酸-N-酰基转移酶其优选为人类氨基酸-N-酰基转移酶,更优选为SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或其变体,并且
其中所述酰基-CoA合成酶优选为SEQIDNO:6或其变体。
在第三个方面的第一实施方案中,可将选自氨基酸-N-酰基转移酶和酰基-CoA合成酶中的至少一种酶(优选所有酶)以细胞(优选根据所述第一个方面或其任何实施方案的细胞)的形式提供。
在第二实施方案(也是所述第一实施方案的实施方案)中,氨基酸可以是蛋白原氨基酸,优选地选自甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和丙氨酸,并且可更优选地为甘氨酸。
在第三实施方案(也是所述第一至第二实施方案的实施方案)中,脂肪酸可以是不饱和脂肪酸并且可优选自肉豆蔻脑酸、月桂烯酸、棕榈油酸和顺式异油酸。
在第二或第三个方面的另一个实施方案中,脂肪酸可以是饱和脂肪酸并且可优选自月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸。
在第二或第三个方面的另一个实施方案中,可将脂肪酸以包含液体有机溶剂和所述脂肪酸的有机相的形式提供,其中所述有机溶剂其优选为所述脂肪酸的酯。
在第四个方面,本发明提供了组合物,其包含:
第一酰基氨基酸,包含具有8至16个碳原子的饱和酰基和甘氨酸或由其组成、
第二酰基氨基酸,包含具有10至18个碳原子的不饱和酰基和甘氨酸或由其组成、
和任选地,第三酰基氨基酸,包含具有12个碳原子的饱和或不饱和酰基和选自谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸和天冬酰胺的氨基酸或由其组成。
在第四个方面的第一实施方案中,第一酰基氨基酸可包含具有12个碳原子的饱和酰基(优选月桂基)和甘氨酸或由其组成。
在第四个方面的第二实施方案(也是所述第四个方面的第一实施方案的实施方案)中,第二酰基氨基酸可包含具有12或14个碳原子的不饱和酰基和甘氨酸或由其组成。
根据本发明的任何一个方面,所形成的酰基氨基酸可以是氨基酸的混合物。氨基酸的混合物可包含至少两种如下定义的蛋白原氨基酸。具体地讲,氨基酸的混合物可含有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21种蛋白原氨基酸。在一个实例中,氨基酸的混合物可被用于形成椰油基甘氨酸及其盐。
本发明基于这样的令人惊奇的发现:氨基酸-N-酰基转移酶与酰基-CoA合成酶的组合(优选由具有减弱的脂肪酸降解能力的细胞表达)可被用于将一系列脂肪酸(更优选包含不饱和与饱和脂肪酸的混合物)转化成酰基氨基酸。
此外,本发明基于这样的令人惊奇的发现:存在这样的氨基酸-N-酰基转移酶,其可被用于将短的不饱和脂肪酸(如月桂烯酸)转化成酰基氨基酸。
此外,本发明基于这样的令人惊奇的发现:采用能够将一系列脂肪酸(包括短的不饱和脂肪酸如月桂烯酸)转化成酰基氨基酸的氨基酸-N-酰基转移酶可提高所生产的酰基氨基酸的产率。
此外,本发明基于这样的令人惊奇的发现:在细胞中生产的酰基氨基酸的组成,更具体地讲,掺入到此类酰基氨基酸中的脂肪酸的长度,可以通过向所述细胞中引入一种或多种特定的酰基-CoA硫酯酶或改变所述细胞所外源性表达的一种或多种酰基-CoA硫酯酶的表达来控制。
本发明以氨基酸-N-酰基转移酶和酰基-CoA合成酶在制造酰基氨基酸上的用途为中心。在优选的实施方案中,术语“氨基酸-N-酰基转移酶”,如本文中所用,指代能够催化酰基-CoA(优选月桂烯酸的CoA酯)和氨基酸(优选蛋白原氨基酸、更优选甘氨酸)向酰基氨基酸的转化的酶。合适的氨基酸-N-酰基转移酶已在现有技术有所描述,例如在Waluk,D.P.,Schultz,N.,与Hunt,M.C.(2010),IdentificationofglycineN-acyltransferase-like2(GLYATL2)asatransferasethatproducesN-acylglycinesinhumans,FASEBJ.24,2795-2803中。在优选的实施方案中,氨基酸-N-酰基转移酶包含SEQIDNO:4的核苷酸序列。具体地讲,氨基酸-N-酰基转移酶的氨基酸序列可选自:NP_001010904.1、NP_659453.3、XP_001147054.1、AAH16789.1、AAO73139.1、XP_003275392.1、XP_002755356.1、XP_003920208.1、XP_004051278.1、XP_006147456.1、XP_006214970.1、XP_003801413.1、XP_006189704.1、XP_003993512.1、XP_005862181.1、XP_007092708.1、XP_006772167.1、XP_006091892.1、XP_005660936.1、XP_005911029.1、NP_001178259.1、XP_004016547.1、XP_005954684.1、ELR45061.1、XP_005690354.1、XP_004409352.1、XP_007519553.1、XP_004777729.1、XP_005660935.1、XP_004824058.1、XP_006068141.1、XP_006900486.1、XP_007497585.1、XP_002821801.2、XP_007497583.1、XP_003774260.1、XP_001377648.2、XP_003909843.1、XP_003801448.1、XP_001091958.1、XP_002821798.1、XP_005577840.1、XP_001092197.1、NP_001207423.1、NP_001207425.1、XP_003954287.1、NP_001271595.1、XP_003909848.1、XP_004087850.1、XP_004051279.1、XP_003920209.1、XP_005577835.1、XP_003774402.1、XP_003909846.1、XP_004389401.1、XP_002821802.1、XP_003774401.1、XP_007497581.1、EHH21814.1、XP_003909845.1、XP_005577839.1、XP_003774403.1、XP_001092427.1、XP_003275395.2、NP_542392.2、XP_001147271.1、XP_005577837.1、XP_003826420.1、XP_004051281.1、XP_001147649.2、XP_003826678.1、XP_003909847.1、XP_004682812.1、XP_004682811.1、XP_003734315.1、XP_004715052.1、BAG62195.1、XP_003777804.1、XP_003909849.1、XP_001092316.2、XP_006167891.1、XP_540580.2、XP_001512426.1、EAW73833.1、XP_003464217.1、XP_007519551.1、XP_003774037.1、XP_005954680.1、XP_003801411.1、NP_803479.1、XP_004437460.1、XP_006875830.1、XP_004328969.1、XP_004264206.1、XP_004683490.1、XP_004777683.1、XP_005954681.1、XP_003480745.1、XP_004777682.1、XP_004878093.1、XP_007519550.1、XP_003421399.1、EHH53167.1、XP_006172214.1、XP_003993453.1、AAI12537.1、XP_006189705.1、Q2KIR7.2、XP_003421465.1、NP_001009648.1、XP_003464328.1、XP_001504745.1、ELV11036.1、XP_005690351.1、XP_005216632.1、EPY77465.1、XP_005690352.1、XP_004016544.1、XP_001498276.2、XP_004264205.1、XP_005690353.1、XP_005954683.1、XP_004667759.1、XP_004479306.1、XP_004645843.1、XP_004016543.1、XP_002928268.1、XP_006091904.1、XP_005331614.1、XP_007196549.1、XP_007092705.1、XP_004620532.1、XP_004869789.1、EHA98800.1、XP_004016545.1、XP_004479307.1、XP_004093105.1、NP_001095518.1、XP_005408101.1、XP_004409350.1、XP_001498290.1、XP_006056693.1、XP_005216639.1、XP_007455745.1、XP_005352049.1、XP_004328970.1、XP_002709220.1、XP_004878092.1、XP_007196553.1、XP_006996816.1、XP_005331615.1、XP_006772157.1、XP_007196552.1、XP_004016546.1、XP_007628721.1、NP_803452.1、XP_004479304.1、DAA21601.1、XP_003920207.1、XP_006091906.1、XP_003464227.1、XP_006091903.1、XP_006189706.1、XP_007455744.1、XP_004585544.1、XP_003801410.1、XP_007124812.1、XP_006900488.1、XP_004777680.1、XP_005907436.1、XP_004389356.1、XP_007124811.1、XP_005660937.1、XP_007628724.1、XP_003513512.1、XP_004437813.1、XP_007628723.1、ERE78858.1、EPQ15380.1、XP_005862178.1、XP_005878672.1、XP_540581.1、XP_002928267.1、XP_004645845.1、EPQ05184.1、XP_003513511.1、XP_006214972.1、XP_007196545.1、XP_007196547.1、XP_006772160.1、XP_003801409.1、NP_001119750.1、XP_003801412.1、XP_006772159.1、EAW73832.1、XP_006091897.1、XP_006772163.1、XP_006091898.1、XP_005408105.1、XP_006900487.1、XP_003993454.1、XP_003122754.3、XP_007455746.1、XP_005331618.1、XP_004585337.1、XP_005063305.1、XP_006091895.1、XP_006772156.1、XP_004051276.1、XP_004683488.1、NP_666047.1、NP_001013784.2、XP_006996815.1、XP_006996821.1、XP_006091893.1、XP_006173036.1、XP_006214971.1、EPY89845.1、XP_003826423.1、NP_964011.2、XP_007092707.1、XP_005063858.1、BAL43174.1、XP_001161154.2、XP_007124813.1、NP_083826.1、XP_003464239.1、XP_003275394.1、ELK23978.1、XP_004878097.1、XP_004878098.1、XP_004437459.1、XP_004264204.1、XP_004409351.1、XP_005352047.1、Q5RFP0.1、XP_005408107.1、XP_007659164.1、XP_003909852.1、XP_002755355.1、NP_001126806.1、AAP92593.1、NP_001244199.1、BAA34427.1、XP_005063859.1、NP_599157.2、XP_004667761.1、XP_006900489.1、XP_006215013.1、XP_005408100.1、XP_007628718.1、XP_003514769.1、XP_006160935.1、XP_004683489.1、XP_003464329.1、XP_004921258.1、XP_003801447.1、XP_006167892.1、XP_004921305.1、AAH89619.1、XP_004706162.1、XP_003583243.1、EFB16804.1、XP_006728603.1、EPQ05185.1、XP_002709040.1、XP_006875861.1、XP_005408103.1、XP_004391425.1、EDL41477.1、XP_006772158.1、EGW06527.1、AAH15294.1、XP_006772162.1、XP_005660939.1、XP_005352050.1、XP_006091901.1、XP_005878675.1、XP_004051323.1、EHA98803.1、XP_003779925.1、EDM12924.1、XP_003421400.1、XP_006160939.1、XP_006160938.1、XP_006160937.1、XP_006160936.1、XP_005702185.1、XP_005313023.1、XP_003769190.1、XP_002714424.1、XP_004715051.1、XP_007661593.1、XP_004590594.1、ELK23975.1、XP_004674085.1、XP_004780477.1、XP_006231186.1、XP_003803573.1、XP_004803176.1、EFB16803.1、XP_006056694.1、XP_005441626.1、XP_005318647.1XP_004605904.1、XP_005862182.1、XP_003430682.1、XP_004780478.1、XP_005239278.1、XP_003897760.1、XP_007484121.1、XP_004892683.1、XP_004414286.1、XP_006927013.1、XP_003923145.1、XP_852587.2、AAP97178.1、EHH53105.1、XP_005408113.1、XP_002915474.1、XP_005377590.1、XP_527404.2、XP_005552830.1、XP_004044211.1、NP_001180996.1、XP_003513513.2、XP_001498599.2、XP_002746654.1、XP_005072349.1、XP_006149181.1、EAX04334.1、XP_003833230.1、XP_005216635.1、XP_003404197.1、XP_007523363.1、XP_007433902.1、XP_003254235.1、XP_004471242.1、XP_005216634.1、XP_006860675.1、XP_004771956.1、XP_006038833.1、NP_001138534.1、XP_007068532.1、XP_003510714.1、ERE87950.1、XP_003986313.1、XP_006728644.1、XP_004878099.1、XP_003468014.1、XP_007095614.1、XP_004648849.1、XP_004869795.1、XP_004018927.1、XP_005696454.1、XP_006201985.1、XP_005960697.1、XP_004813725.1、XP_005496926.1、ELR45088.1、XP_004696625.1、XP_005860982.1、XP_005911003.1、XP_006260162.1、EPQ04414.1、XP_006099775.1、NP_001138532.1、XP_006190795.1、XP_004649775.1、XP_004424497.1、XP_004390885.1、XP_005911004.1、XP_003777803.1、XP_004312259.1、XP_005529140.1、XP_005314582.1、XP_006926523.1、XP_006926522.1、XP_004683491.1、XP_003826680.1、XP_003215018.1、XP_003215087.1、EGW12611.1、XP_006113023.1、XP_006882182.1、XP_007425200.1、XP_006041342.1、NP_001138533.1、EMP27694.1、XP_007497753.1、XP_006034252.1或其变体。贯穿本申请,除非有相反的规定,否则任何数据库编码指代可得自NCBI数据库(优选于2013年8月5日上线的版本)的序列,并且若此类序列为核苷酸序列,则包含通过翻译前者而获得的多肽序列。
在优选的实施方案中,术语“酰基氨基酸”,如本文中所用,指代由氨基酸-N-酰基转移酶所催化的反应的产物,更优选地,由式酰基-CO-NH-CHR-COOH所代表的化合物,其中R为蛋白原氨基酸的侧链,并且其中术语“酰基”指代脂肪酸的酰基残基。在本发明的优选的实施方案中,如本文中所用的术语“脂肪酸”意指具有至少6个、优选8个、更优选10个、最优选12个碳原子的羧酸,优选链烷酸。在优选的实施方案中,其为直链脂肪酸,在另一个实施方案中,其为支链的。在优选的实施方案中,其为饱和脂肪酸。在特别优选的实施方案中,其为不饱和的。在另一个实施方案中,其为具有至少12个碳原子的、包含双键(优选在位置9上)的直链脂肪酸。在另一个优选的实施方案中,其为在位置9或11上具有一个双键的简单不饱和脂肪酸。在最优选的实施方案中,其为月桂烯酸(9-十二烯酸)。在特别优选的实施方案中,其为具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个碳原子(优选12个碳原子)的脂肪酸。
贯穿本申请,指代代表能够在水溶液中离解的化合物的离解或未离解状态的化学基团的式,包括离解和未离解状态两者以及该基团的各种盐的形式。例如,残基–COOH包括质子化的(–COOH)以及未质子化的(–COO-)羧酸两者。
在本发明的反应中消耗的酰基-CoA底物可以自细胞纯化、化学合成或使用酰基-CoA合成酶生产,而后者是优选项。在优选的实施方案中,术语“酰基-CoA合成酶”,如本文中所用,指代能够催化脂肪酸和CoA向酰基CoA的ATP依赖型转化的酶。
根据本发明的任何一个方面,术语‘酰基-CoA合成酶’可指代酰基-CoA/ACP合成酶,其能够生产酰基甘氨酸酯和/或催化以下反应:
脂肪酸+CoA/ACP+ATP酰基-CoA/ACP+ADP+Pi
酰基-CoA/ACP合成酶的实例可包括EC6.2.1.3、EC6.2.1.10、EC6.2.1.15、EC6.2.1.20等。现有技术描述了检测酰基-CoA合成酶活性的各种方法。例如,酰基-CoA合成酶的活性可通过如下方式测定:在存在250μM月桂酰-CoA、500μM甘氨酸和DTNB(5,5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸,也被称为埃尔曼(Ellman’s)试剂)的条件下,将目标样品温育在100mMTris-HCl(pH8)中,并且采用分光光度法通过410nm的吸光度来监测其后随着反应进行以CoASH的形式释放的游离硫醇基团以及与埃尔曼试剂的反应。
各种酰基-CoA合成酶已经在现有技术中有所描述,例如YP_001724804.1、WP_001563489.1和NP_707317.1。在优选的实施方案中,酰基-CoA合成酶包含SEQIDNO6或YP_001724804.1或其变体。酰基-CoA合成酶的活性可如现有技术中所述进行测定,例如Kang,Y.,Zarzycki-Siek,J.,Walton,C.B.,Norris,M.H.,和Hoang,T.T.(2010),MultipleFadDAcyl-CoASynthetasesContributetoDifferentialFattyAcidDegradationandVirulenceinPseudomonasaeruginosa,PLOSONE5(10),e13557。简而言之,呈未反应的CoASH形式的游离硫醇的量是通过如下方式确定的:加入埃尔曼试剂并且采用分光光度法监测在410nm的吸光度,优选地在包含150mMTris-HCl(pH7.2)、10mMMgCl2、2mMEDTA、0.1%TritonX-100、5mMATP、0.5mM辅酶A(CoASH)和脂肪酸(30至300mM)的反应缓冲液中。
在一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰以过表达至少下列酶:氨基酸-N-酰基转移酶和酰基-CoA合成酶。具体地讲,细胞可过表达下列酶:甘氨酸N-酰基转移酶和酰基-CoA/ACP合成酶。
本发明的教导不仅可以使用具有在本申请中明确提及的(例如通过名称或登录号)或隐含提及的完全一样的氨基酸或核酸序列的生物大分子实施,还可以使用此类序列的变体实施。在优选的实施方案中,术语“变体”,如本文中所用,包括分别与参照氨基酸或核酸序列具有至少70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸或核酸序列,其中优选除了对于功能(例如蛋白质的催化活性)而言必不可少的那些以外的氨基酸或分子折叠或结构通过插入而缺失、置换或取代,或必需氨基酸以保守方式被取代致使参照序列或源自其的分子的生物活性得以保留。现有技术包括可用于比对两条给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的算法,参见ArthurLesk(2008),Introductiontobioinformatics,第3版、Thompson等人,NucleicAcidsResearch22,4637-4680,1994和Katoh等人,GenomeInformation,16(1),22-33,2005。术语“变体”可与术语“同系物”同义并互换使用。此类变体可通过在氨基酸或核酸序列中引入缺失、插入或置换以及引入包含此类大分子或其变体的融合体来制备。在优选的实施方案中,在谈到氨基酸序列时,术语“变体”在除以上序列同一性之外,还优选地包括包含一个或多个相对于相应的参照或野生型序列的保守氨基酸变化的氨基酸序列,或包括编码包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列的核酸序列。在优选的实施方案中,术语氨基酸序列或核酸序列的“变体”在除以上的序列同一性程度之外,还优选地分别包括氨基酸序列或核酸序列的任何活性部分和/或片段,或包括编码氨基酸序列的活性部分和/或片段的任何核酸序列。在优选的实施方案中,术语“活性部分”,如本文中所用,分别指代小于全长氨基酸序列的氨基酸序列或编码小于全长氨基酸序列的核酸序列,其中氨基酸序列或所编码的氨基酸序列分别保留至少部分其必要的生物活性。例如,蛋白酶的活性部分和/或片段能够水解多肽的肽键。在优选的实施方案中,术语“保留至少部分其必要的生物活性”,如本文中所用,意指所讨论的氨基酸序列具有超过并且不同于背景活性的生物活性,并且表征所述活性的动力学参数,更具体地讲kcat和KM,优选地在由相对于特定底物的参照分子所显示的值的3个数量级以内,更优选在2个数量级以内,最优选在一个数量级以内。在优选的实施方案中,术语核酸的“变体”包括其互补链杂交(优选在严格条件下)至参照或野生型核酸的核酸。可至少在图6中提供了氨基酸-N-酰基转移酶变体的实例。技术人员将能够容易地确定那些将能够制造蛋白原氨基酸和/或脂肪酸的氨基酸-N-酰基转移酶。具体地讲,变体可包括但不限于选自以下生物体的氨基酸-N-酰基转移酶:白颊长臂猿(Nomascusleucogenys)(Nl,XP_003275392.1,SEQIDNo:53)、亚马逊松鼠猴(Saimiriboliviensis)(Sb,XP_003920208.1,SEQIDNo:54)、家猫(Feliscatus)(Fc,XP_003993512.1,SEQIDNo55)、牛(Bostaurus)(Bt,NP_001178259.1,SEQIDNo:56)、小家鼠(Musmusculus)(Mm,NP_666047.1,SEQIDNo:57)。
杂交反应的严格性易于由本领域普通技术人员所确定,并且通常是依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常,更长的探针需要更高的温度以正确退火,而更短的探针需要更低的温度。杂交通常取决于当存在于低于其解链温度的环境中时,经变性的DNA再退火至互补链的能力。探针与可杂交的序列之间所需的同源性程度越高,可使用的相对温度就越高。因此,其遵循:更高的相对温度将趋于使反应条件变得更严格,而更低的温度使之更宽松。有关杂交反应严格性的额外细节和解释,参见F.M.Ausubel(1995),CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWiley&Sons,Inc.。此外,本领域技术人员可按照在手册“TheDIGSystemUsersGuideforFilterHybridization”,BoehringerMannheimGmbH,Mannheim,Germany,1993中以及在Liebl等人,InternationalJournalofSystematicBacteriology41:255-260(1991)中给出的说明,采用杂交来识别DNA序列。在优选的实施方案中,严格条件被应用于任何杂交,即仅当探针与靶序列的同一性为70%或以上时,才会发生杂交。相对于靶序列具有更低程度同一性的探针可以杂交,但在严格条件下,此类杂交不稳定并且将在洗涤步骤中被移除,例如将盐浓度降至2xSSC或,任选地并随后降至0.5xSSC,当温度为(以优先级递增的顺序)大约50℃–68℃、大约52℃–68℃、大约54℃–68℃、大约56℃–68℃、大约58℃–68℃、大约60℃–68℃、大约62℃–68℃、大约64℃–68℃、大约66℃–68℃时。在特别优选的实施方案中,温度为大约64℃–68℃或大约66℃–68℃。可以将盐浓度调整至0.2xSSC或甚至0.1xSSC。可以分离出相对于参照或野生型序列具有至少70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的同一性程度的多核苷酸片段。在优选的实施方案中,术语核酸序列的“同系物”,如本文中所用,指代本着遗传密码的简并性,与参照核酸序列编码相同氨基酸序列的任何核酸序列。
如果用于实施本发明的酶中的一者或多者是以细胞的形式提供的,那么优选地,该细胞具有减弱的脂肪酸降解能力。在优选的实施方案中,术语“具有减弱的脂肪酸降解能力”,如本文中所用,意指相应的细胞以相比具有正常的脂肪酸降解能力的类似细胞或野生型细胞在相同条件下将具有的速率更低的速率降解脂肪酸(优选从环境中摄取的那些)。在优选的实施方案中,由于至少一个编码涉及β-氧化途径的酶的基因的缺失、抑制或失活,所以此类细胞的脂肪酸降解会更低。在本发明的优选的实施方案中,至少一种涉及β-氧化途径的酶相对于同一种酶在类似条件下于相应的野生型微生物中的活性,已经丧失了(以优先级递增的顺序)5、10、20、40、50、75、90或99%的活性。本领域技术人员熟悉可用于缺失编码酶的基因或减弱此类酶在细胞中的活性的各种技术,例如通过将细胞暴露于放射中然后积聚或筛选所得的突变体、定点诱导点突变或敲除编码活性酶的染色体整合的基因,如Sambrook/Fritsch/Maniatis(1989)中所述。另外,可以过表达转录抑制因子FadR从而抑制涉及β-氧化途径的酶的表达(Fujita,Y.,Matsuoka,H.,和Hirooka,K.(2007)Mol.Microbiology66(4),829-839)。在优选的实施方案中,术语“基因缺失”,如本文中所用,意指编码所述基因的核酸序列经修饰使得由所述基因编码的活性多肽的表达减弱。例如,可通过框内移除包含编码多肽的催化活性中心的序列的序列的一部分来缺失基因。可选地,可改变核糖体结合位点使得核糖体不再翻译对应的RNA。此外,本领域技术人员能够使用如酶学教科书(例如Cornish-Bowden(1995),FundamentalsofEnzymeKinetics,PortlandPressLimited,1995)中所述的标准检测来常规地测量由活细胞表达的酶的活性。
脂肪酸的降解是通过一系列酶促催化反应完成的。首先,摄取脂肪酸并经由涉及至少一种外膜蛋白和一种具有脂肪酸-CoA连接酶活性的内膜相关蛋白(在大肠杆菌(E.col)i的情况下,分别被称为FadL和FadD/FadK)的转运/酰基活化机制将其穿过细胞膜转位。在细胞内部,待降解的脂肪酸会经受催化β-氧化途径的其它反应的酶。第一个细胞内步骤涉及通过酰基-CoA脱氢酶将酰基-CoA转化成烯酰基-CoA,在大肠杆菌的情况下,后者被称为FadE。酰基-CoA脱氢酶的活性可如现有技术中所述进行测定,例如通过分光光度法于340nm、在100mMMOPSpH7.4、0.2mM烯酰基-CoA、0.4mMNAD+中监测NADH的浓度。通过由烯酰基-CoA水合酶/3-羟酰基-CoA脱氢酶(在大肠杆菌中被称为FadB和FadJ)催化的水合与氧化,将所得的烯酰基-CoA经3-羟酰基-CoA转化成3-酮酰基-CoA。烯酰基-CoA水合酶/3-羟酰基-CoA脱氢酶的活性,更具体地讲产物NADH的形成,可如现有技术中所述(例如对FadE的概述)以分光光度法测定。最终,3-酮酰基-CoA硫解酶,大肠杆菌中的FadA和FadI催化3-酮酰基-CoA的裂解,以得到乙酰基-CoA和相比投入时少了两个碳原子的酰基-CoA。酮酰基-CoA硫解酶的活性可如现有技术中所述进行测定,例如在Antonenkov,V.,D..VanVeldhoven,P.,P.,Waelkens,E.,andMannaerts,G.P.(1997)Substratespecificitiesof3-oxoacyl-CoAthiolaseandsterolcarrierprotein2/3-oxoacyl-coathiolasepurifiedfromnormalratliverperoxisomes.Sterolcarrierprotein2/3-oxoacyl-CoAthiolaseisinvolvedinthemetabolismof2-methyl-branchedfattyacidsandbileacidintermediates.J.Biol.Chem.1997,272:26023-26031中所述。在优选的实施方案中,术语“具有减弱的脂肪酸降解能力的细胞”,如本文中所用,指代具有减弱的摄取和/或降解脂肪酸(优选具有至少八碳链的那些)的能力的细胞。细胞的脂肪酸降解能力可以各种方式减弱。在优选的实施方案中,相比其野生型,细胞具有减弱的涉及β-氧化途径的酶的活性。在优选的实施方案中,术语“涉及β-氧化途径的酶”,如本文中所用,指代与脂肪酸或其衍生物直接相互作用的酶,所述衍生物是经过β-氧化途径(影响脂肪酸向乙酰基-CoA和缩短的脂肪酸的CoA酯转化的系列反应)作为所述脂肪酸降解的一部分形成的,所述直接相互作用优选地通过识别作为底物的脂肪酸或其衍生物,并将其转化成作为β-氧化途径的一部分而形成的代谢物。例如,酰基-CoA脱氢酶是涉及β-氧化途径的酶,因为其与脂肪酸-CoA相互作用并将脂肪酸-CoA酯转化成烯酰基-CoA,而烯酰基-CoA是作为β-氧化的一部分而形成的代谢物。在优选的实施方案中,术语“涉及β-氧化途径的酶”,如本文中所用,包括来自酰基-CoA脱氢酶、烯酰基-CoA水合酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶和3-酮酰基-CoA硫解酶的任何多肽。随后,酰基-CoA合成酶可催化脂肪酸向脂肪酸CoA酯(即一种分子,其中羧基的官能团-OH被–S-CoA所取代)的转化,以优选地将所述脂肪酸引入β-氧化途径中。例如,大肠杆菌(登录号:BAA15609.1)中的多肽FadD和FadK为酰基-CoA脱氢酶。在优选的实施方案中,术语“酰基-CoA脱氢酶”,如本文中所用,是能够催化酰基-CoA向烯酰基-CoA转化(优选地作为β-氧化途径的一部分)的多肽。例如,大肠杆菌(登录号:BAA77891.2)中的多肽FadE为酰基-CoA脱氢酶。在优选的实施方案中,术语“2,4-二烯酰基-CoA还原酶”,如本文中所用,是能够催化2,4-二烯酰基CoA从不饱和脂肪酸向烯酰基-CoA转化(优选地作为β-氧化途径的一部分)的多肽。例如,大肠杆菌中的多肽FadH为2,4-二烯酰基-CoA还原酶。在优选的实施方案中,术语“烯酰基-CoA水合酶”,如本文中所用,也被称为3-羟酰基-CoA脱氢酶,指代能够通过水合与氧化而催化烯酰基-CoA向3-酮酰基-CoA转化(优选地作为β-氧化途径的一部分)的多肽。例如,大肠杆菌(登录号:BAE77457.1)中的多肽FadB和FadJ为烯酰基-CoA水合酶。在优选的实施方案中,术语“酮酰基-CoA硫解酶”,如本文中所用,指代能够催化裂解3-酮酰基-CoA而得到少了两个碳原子的酰基-CoA以及乙酰基-CoA的转化(优选地作为β-氧化途径的最终步骤)的多肽。例如,大肠杆菌(接入码:AP009048.1)中的多肽FadA和FadI为酮酰基-CoA硫解酶。
在一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而导致至少一种氨基酸N-酰基转移酶的活性提高,同时至少一种酰基-CoA合成酶的活性提高,以及同时FadL和/或AlkL的至少一种转运蛋白的活性提高。具体地讲,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而过表达甘氨酸N-酰基转移酶、酰基-CoA/ACP合成酶以及FadL和/或AlkL的转运蛋白。这些细胞能够生产酰基甘氨酸酯。在另一个实例中,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而:
-提高氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶的表达;并且
-降低选自以下的至少一种酶的活性:酰基-CoA脱氢酶FadE、多功能3-羟丁酸酰基-CoA差向异构酶、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰基-CoA异构酶、烯酰基-CoA水合酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶FadB、3-酮酰基-CoA硫解酶、电子转移黄素蛋白。
在还另一个实例中,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而导致:
-氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶以及FadL和/或AlkL的至少一种转运蛋白的表达提高;并且
-选自以下的至少一种酶的活性降低:酰基-CoA脱氢酶FadE、多功能3-羟丁酸酰基-CoA差向异构酶、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰基-CoA异构酶、烯酰基-CoA水合酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶FadB、3-酮酰基-CoA硫解酶、电子转移黄素蛋白。
具体地讲,酰基-CoA脱氢酶FadE(EC1.3.8.7、EC1.3.8.8或EC1.3.8.9)可催化反应:酰基-CoA+电子转移黄素蛋白=反-2,3-脱氢酰基-CoA+被还原的电子转移黄素蛋白;多功能3-羟丁酸酰基-CoA差向异构酶(EC5.1.2.3)、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰基-CoA异构酶(EC5.3.3.8)、烯酰基-CoA水合酶(EC4.2.1.17)和3-羟酰基-CoA脱氢酶(EC1.1.1.35)FadB可催化反应:(S)-3-羟丁酰基-CoA(R)-3-羟丁酰基-CoA、(3Z)-3-烯酰基-CoA(2E)-2-烯酰基-CoA、(3S)-3-羟酰基-CoA反-2-烯酰基-CoA+H2O、(S)-3-羟酰基-CoA+NAD+=3-氧酰基-CoA+NADH+H+;3-酮酰基-CoA硫解酶(EC2.3.1.16)可催化反应:酰基-CoA+乙酰基-CoACoA+3-氧酰基-CoA;电子转移黄素蛋白(EC1.5.5.1)可催化以下反应:被还原的电子转移黄素蛋白+泛醌电子转移黄素蛋白+泛醇。
更具体地讲,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而提高甘氨酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶、FadL和AlkL的转运蛋白的表达;并且降低酰基-CoA脱氢酶FadE、多功能3-羟丁酸酰基-CoA差向异构酶、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰基-CoA异构酶、烯酰基-CoA水合酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶FadB、3-酮酰基-CoA硫解酶、电子转移黄素蛋白的活性。
在一个实例中,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而:
-提高氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶的表达;并且
-降低选自以下的至少一种酶的活性:甘氨酸裂解系统H蛋白、甘氨酸裂解系统P蛋白、甘氨酸裂解系统L蛋白、甘氨酸裂解系统T蛋白、苏氨酸醛缩酶和丝氨酸羟甲基转移酶。
在另一个实例中,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而:
-提高氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶以及FadL和/或AlkL的至少一种转运蛋白的表达;并且
-降低选自以下的至少一种酶的活性:酰基-CoA脱氢酶FadE、多功能3-羟丁酸酰基-CoA差向异构酶、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰基-CoA异构酶、烯酰基-CoA水合酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶FadB、3-酮酰基-CoA硫解酶和电子转移黄素蛋白。
在还另一个实例中,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而:
-提高氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶以及FadL和/或AlkL的至少一种转运蛋白的表达;
-降低选自以下的至少一种酶的活性:酰基-CoA脱氢酶FadE、多功能3-羟丁酸酰基-CoA差向异构酶、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰基-CoA异构酶、烯酰基-CoA水合酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶FadB、3-酮酰基-CoA硫解酶和电子转移黄素蛋白;并且
-降低选自以下的至少一种酶的活性:甘氨酸裂解系统H蛋白、甘氨酸裂解系统P蛋白、甘氨酸裂解系统L蛋白、甘氨酸裂解系统T蛋白、苏氨酸醛缩酶和丝氨酸羟甲基转移酶。
具体地讲,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而提高甘氨酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶、FadL和AlkL的转运蛋白的表达;降低酰基-CoA脱氢酶FadE、多功能3-羟丁酸酰基-CoA差向异构酶、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰基-CoA异构酶、烯酰基-CoA水合酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶FadB、3-酮酰基-CoA硫解酶、电子转移黄素蛋白的活性;并且降低甘氨酸裂解系统H蛋白、甘氨酸裂解系统P蛋白、甘氨酸裂解系统L蛋白、甘氨酸裂解系统T蛋白、苏氨酸醛缩酶和丝氨酸羟甲基转移酶的活性。
更具体地讲,甘氨酸裂解系统H蛋白携带硫辛酸并与甘氨酸裂解系统蛋白P、L和T相互作用;甘氨酸裂解系统P蛋白(EC1.4.4.2)催化反应:甘氨选+[甘氨酸-裂解复合物H蛋白]-N(6)-硫辛酰基-L-赖氨酸[甘氨酸-裂解复合物H蛋白]-S-氨甲基-N(6)-二氢硫辛酰基-L-赖氨酸+CO2;甘氨酸裂解系统L蛋白(EC1.8.1.4)催化反应:蛋白质N6-(二氢硫辛酰基)赖氨酸+NAD+ 蛋白质N6-(硫辛酰基)赖氨酸+NADH+H+;甘氨酸裂解系统T蛋白(EC2.1.2.10)催化反应:[蛋白质]-S8-氨甲基二氢硫辛酰基赖氨酸+四氢叶酸[蛋白质]-二氢硫辛酰基赖氨酸+5,10-亚甲基四氢叶酸+NH3;苏氨酸醛缩酶(EC4.2.1.48)催化反应:L-苏氨酸甘氨酸+乙醛;丝氨酸羟甲基转移酶(EC2.1.2.1)催化反应:5,10-亚甲基四氢叶酸+甘氨酸+H2O+四氢叶酸+L-丝氨酸。
在一个实例中,相比野生型细胞,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而提高细胞中氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶和基因修饰的表达,所述基因修饰能够从至少一种碳水化合物生产至少一种脂肪酸。在下面的表1中提供了对酶或酶活性的非限制性基因修饰的列表。根据本发明的任何一个方面的细胞可包含生产脂肪酸并将脂肪酸转化成N-酰基氨基酸的基因修饰的组合。具体地讲,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而提高氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶的表达,并且包含表1中所列出的任何一种基因修饰。更具体地讲,细胞可经基因修饰而提高N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶、FadL和AlkL的转运蛋白的表达,并且包含表1中所列出的任何一种基因修饰。甚至更具体地讲,细胞可经基因修饰而提高N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶、FadL和AlkL的转运蛋白的表达;降低酰基-CoA脱氢酶FadE、多功能3-羟丁酸酰基-CoA差向异构酶、Δ3-顺-Δ2-反-烯酰基-CoA异构酶、烯酰基-CoA水合酶、3-羟酰基-CoA脱氢酶FadB、3-酮酰基-CoA硫解酶、电子转移黄素蛋白的活性;降低甘氨酸裂解系统H蛋白、甘氨酸裂解系统P蛋白、甘氨酸裂解系统L蛋白、甘氨酸裂解系统T蛋白、苏氨酸醛缩酶、丝氨酸羟甲基转移酶的活性;并且包含表1中所列出的任何一种基因修饰。
在一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞可经基因修饰而提高氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA/ACP合成酶的表达,并且降低选自以下的至少一种酶的表达:β-酮酰基-ACP合酶I、3-氧酰基-ACP合酶I、丙二酰基-CoA-ACP转酰酶、烯酰基ACP还原酶和β-酮酰基-ACP合酶III。具体地讲,根据本发明的任何一个方面的细胞中的基因修饰可包括提高氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA/ACP合成酶的表达以及降低β-酮酰基-ACP合酶I、3-氧酰基-ACP合酶I、丙二酰基-CoA-ACP转酰酶、烯酰基ACP还原酶和β-酮酰基-ACP合成酶III的表达。
可使用各种各样的细胞来实施本发明的教导。在优选的实施方案中,术语“细胞”,如本文中所用,指代任何永久性单细胞生物(包括细菌、古细菌、真菌、藻类等)。在优选的实施方案中,细胞为细菌细胞,更优选地是来自假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和埃希杆菌属(Escherichia)的细菌细胞,最优选地是大肠杆菌(Escherichiacoli)。在另一个优选的实施方案中,细胞为低等真核生物,更优选来自酵母属(Saccharomyces)、念球菌属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)的真菌,并且最优选地是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。微生物可以是分离的细胞,换言之,单一菌株的纯培养物,或可包含至少两种菌株的混合物。在生物技术上相关的细胞可以,例如从美国模式培养物保藏所(ATCC)或德国微生物与细胞培养物保藏所(DSMZ)商购获得。用于保持和修饰细胞的颗粒可得自现有技术,例如Sambrook/Fritsch/Maniatis(1989):Molecularcloning–ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourPress,2ndedition,Fuchs/Schlegel(2007),AllgemeineMikrobiologie,2008,GeorgThiemeVerlag。
尽管可使用野生型细胞实施本发明的教导,但优选地,所涉及的酶中的至少一种,特别是来自氨基酸N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶和酰基-CoA硫酯酶中的至少一种或全部,是重组的。在优选的实施方案中,如本文中所用的术语“重组的”,指代分子或由此类分子(优选多肽或核酸)所编码的物质并非天然存在的而是基因工程的结果,或指代包含重组分子的细胞。例如,如果核酸分子满足以下条件,则其是重组的:所述核酸分子包含启动子,所述启动子功能性连接到编码具有催化活性的多肽的序列,并且所述启动子已经过工程改造使得所述具有催化活性的多肽,相对于所述多肽在对应的包含原始的未经改变的核酸分子的野生型细胞中的水平,过表达。
无论实施本发明所需要的核酸分子、多肽,更具体地讲,酶是否是重组的,都并不一定暗示了其表达水平。然而,优选地过表达实施本发明所需要的一种或多种重组核酸分子、多肽或酶。在优选的实施方案中,术语“过表达”,如本文中所用,意指所编码或表达的相应的多肽,相比在相同条件下通常将存在于细胞中、没有进行过基因修饰以提高表达的情况(例如在相应的野生型细胞中),以更高的水平或以更高的活性表达。本领域技术人员熟悉许多实现过表达的方式。例如,可将待过表达的核酸分子或编码待过表达的多肽或酶的核酸分子置于强诱导型启动子(如lac启动子)的控制之下。现有技术描述了可用于此目的的标准质粒,例如以pET-3a为例的pET载体系统(可从Novagen商购获得)。核酸或多肽是否过表达可通过定量PCR反应(就核酸分子而言)、SDS聚丙烯酰胺电泳、Western印迹或比较活性测定(就多肽而言)的方式来确定。基因修饰可涉及转录、翻译和/或翻译后修饰,其导致在所选和/或规定的培养条件下,酶活性和/或选择性的变化。因此,在本发明的多个实例中,为了更有效率地起作用,微生物可包含一个或多个基因缺失。基因缺失可通过突变基因缺失方法和/或从对一种或多种这些酶具有减弱的表达或无表达的突变型菌株开始和/或本领域技术人员已知的其它方法而实现。
此外,实施本发明的教导所需要的任何酶,特别是来自N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶和酰基-CoA硫酯酶中的至少一种或全部,均可以是分离的酶。在任何情况下,优选地将实施本发明所需要的任何酶以活性状态并且在存在所有的辅因子、底物、辅助性和/或激活多肽或其活性必需的因子的情况下使用。在优选的实施方案中,术语“分离的”,如本文中所用,意指所关注的酶相对其天然存在于其中的细胞,得到富集。酶是否得到富集可通过SDS聚丙烯酰胺电泳和/或活性测定来确定。例如,通过肉眼检测经考马斯亮蓝染料(Coomassiebluedye)染色的聚丙烯酰胺凝胶来判断,所关注的酶占存在于制备物中的全部多肽的百分比可大于5%、10%、20%、50%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
如果使用表达氨基酸-N-酰基转移酶和酰基-CoA合成酶并且具有减弱的脂肪酸降解能力的细胞,那么优选地,该细胞能够制造蛋白原氨基酸和/或脂肪酸。在优选的实施方案中,术语“蛋白原氨基酸”,如本文中所用,指代选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸。蛋白原氨基酸和脂肪酸作为许多野生型细胞基础代谢的一部分在反应中合成,并且使用已经在生物化学教科书(例如JeremyMBerg,JohnLTymoczko,和LubertStryer,Biochemistry,第5版,W.H.Freeman,2002)中详细描述的酶。
在优选的实施方案中,用于实施本发明的教导的细胞表达酰基-CoA硫酯酶。在更优选的实施方案中,术语“酰基-CoA硫酯酶”,如本文中所用,指代能够水解酰基-CoA的酶。在优选的实施方案中,酰基-CoA硫酯酶包含来自以下的序列:SEQIDNO1、AEM72521.1和AAC49180.1或其变体,更优选SEQIDNO1或其变体。酰基-CoA硫酯酶的活性可使用现有技术中所述的各种测定法进行测定。简而言之,可通过分光光度法监测在412nm的吸光度来检测埃尔曼试剂的反应,埃尔曼试剂与游离巯基反应,而该游离巯基与当酰基-CoA水解时形成的CoASH相关。
在优选的实施方案中,术语“接触”,如本文中所用,意指在氨基酸、酰基CoA与氨基酸-N-酰基转移酶或本发明的细胞和/或实施本发明的教导所需要的任何其它试剂之间(优选在水溶液中)产生直接接触。例如,细胞、氨基酸和酰基CoA可能不处于由屏障(如无机膜)分隔开的不同隔室内。如果氨基酸或脂肪酸为可溶的并且可由细胞摄取或可扩散穿过生物膜,那么可简单地将其加入含本发明的细胞的水溶液中。假如其不够可溶,那么可在加入到水溶液中之前将其溶于合适的有机溶剂中。本领域技术人员能够通过加入合适的有机和/或极性溶剂来制备溶解度不足的氨基酸或脂肪酸的水溶液。此类溶剂优选地以包含液体有机溶剂的有机相的形式提供。在优选的实施方案中,当有机溶剂或相在25℃和标准大气压下为液体,则认为其是液体。在另一个优选的实施方案中,脂肪酸以脂肪酸酯(如相应的甲酯或乙酯)的形式提供。例如,可如EP11191520.3中所述将脂肪酸月桂酸溶于月桂酸甲酯中。根据本发明,可使化合物与催化剂在体外接触,即在一种差不多经富集的或甚至经纯化的状态下,或可使其原位接触,即将其作为细胞代谢的一部分而制造并随后于细胞内部反应。
术语“水溶液”包括任何含水的溶液,优选地主要以水为溶剂,其可用于使本发明的细胞,至少暂时地,保持在具有代谢活性的和/或活力的状态,并且包含(如果有此必要)任何另外的底物。本领域技术人员熟悉许多水溶液的制备物,其通常被称为培养液,可用于保持本发明的细胞,例如LB培养液(就大肠杆菌而言)。将基本培养液(即具有相当简单的组成的培养液,相比复合培养液,其仅包含使细胞保持在具有代谢活性和/或活力的状态所必需的最基本的一组盐和营养物质)用作水溶液有利于避免不需要的副产物对产物不必要的污染。例如,M9培养液可被用作基本培养液。
本发明的特别长处在于其不仅可将饱和脂肪酸,还可将不饱和脂肪酸转化成酰基氨基酸。假如所寻求的终产物相比在步骤b)之后得到的需要包含更高产率的饱和酰基残基,则可能通过氢化在步骤b)之后得到的酰基氨基酸的酰基残基来对此方法进行补充。在这种情况下,根据本发明的第五个方面的本发明的组合物(其包含具有不饱和酰基残基的酰基氨基酸的混合物)构成可被转化成最终产物(即具有饱和酰基残基的酰基氨基酸的混合物)的强制性中间产物。氢化可根据各种现有技术方法实施,例如在US5734070中所述的那些。简而言之,可将待氢化的化合物在存在氢和合适催化剂(例如以氧化硅为载体的镍催化剂)的情况下于100℃温育。
待转化成酰基氨基酸的脂肪酸可由根据本发明的细胞生产。在一个实例中,生产酰基氨基酸的同一细胞能够生产其生产的酰基氨基酸所源于的脂肪酸。具体地讲,细胞可经基因修饰而能够生产脂肪酸。在一个实例中,基因修饰可降低特定的酶活性并且这可通过基因破坏或基因修饰完成。基因修饰还可以提高特定的酶活性。具体地讲,基因修饰可将所选定的脂肪酸或由脂肪酸衍生的化学产物的微生物合成提高至高于对照或野生型细胞的速率。此对照或野生型细胞可能缺乏此基因修饰以生产所选定的化学产物。
具体地讲,细胞包含至少一种基因突变使得细胞能够生产至少一种脂肪酸。具体地讲,基因突变可通过依赖于丙二酰基-CoA且不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径使得细胞能够生产至少一种脂肪酸。更具体地讲,在该细胞中,相对于野生型细胞,在依赖于丙二酰基-CoA且不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径中的酶活性有所提高。细胞可经基因修饰而在微生物的依赖于丙二酰基-CoA、不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径(“MDMIFAA”)中得到提高的酶活性。在本文中,此途径还被称为依赖于丙二酰基-CoA但不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径。在细胞的依赖于丙二酰基-CoA、不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径中的此类提高可通过提高基因或途径(其包含乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA合酶(或延长酶)、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和/或3-羟酰基-CoA脱水酶)的活性或表达并同时降低乙酰乙酰基-CoA硫解酶的表达或活性来实现。或者,提高在微生物的依赖于丙二酰基-CoA、不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径中的活性可通过提高基因或途径(其包含乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA硫解酶、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和/或3-羟酰基-CoA脱水酶)的表达并同时降低乙酰乙酰基-CoA硫解酶的表达或活性来实现。
在下面的表1中提供了并在US20140051136中说明了对酶或酶活性的非限制性基因修饰的列表,所述基因修饰可导致细胞生产脂肪酸和/或其酰基辅酶A并且可被视为根据本发明的任何一个方面的至少一种基因突变。
在一个实例中,可引入编码这些多肽的温度敏感形式的核酸序列以替换天然酶,并且当在高温下(在此温度下,由于蛋白质结构的改变或彻底变性,这些不耐热的多肽变得部分或完全失活)培养此类经基因修饰的微生物时,观察到了化学产物的增加。例如,在大肠杆菌中,这些温度敏感突变型基因除了别的以外,可包括fabIts(S241F)、fabBts(A329V)或fabDts(W257Q)。在大多数这些实例中,基因修饰可提高丙二酰基-CoA的利用率,使得丙二酰基-CoA经天然途径向脂肪酸的转化、总生物质减少,并导致更大比例的碳源经依赖于丙二酰基-CoA且不依赖丙二酰基-ACP的途径向化学产物(包括脂肪酸或脂肪酸衍生产物)的转化。在一些实例中,也可进行另外的基因修饰以提高丙二酰基-CoA的产量。
在另一个实例中,所述酶,烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(ECNo.1.3.1.9,也被称为烯酰基-ACP还原酶),是从丙二酰基-CoA进行的脂肪酸生物合成中的关键酶。在大肠杆菌中,此酶,FabI,由基因fabI编码(RichardJ.Heath等人,1995)。在一个实例中,在根据本发明的任何一个方面的细胞中,丙酮酸氧化酶基因(Chang等人,1983、Abdel-Ahmid等人,2001)的表达水平可被降低或功能性缺失。丙酮酸氧化酶基因可编码,例如,EC1.2.3.3的酶。具体地讲,丙酮酸氧化酶基因可以是poxB基因。在一个实例中,乳酸脱氢酶基因(Mat-Jan等人,Bunch等人,1997)的表达水平可被降低或功能性缺失。在一些实例中,乳酸脱氢酶基因编码,例如,EC1.1.1.27的酶。乳酸脱氢酶基因可以是NAD关联的发酵D-乳酸脱氢酶基因。具体地讲,乳酸脱氢酶基因是ldhA基因。
在一个实例中,可提高细胞中脂肪酸表达的基因突变可以是在细胞的至少一种抗反馈酶中,其导致该抗反馈酶的表达提高。具体地讲,所述酶可以是泛酸激酶、丙酮酸脱氢酶等。在大肠杆菌中,这些抗反馈突变型基因可包括coaA(R106A)和/或lpd(E354K)。
在另外的实例中,细胞的依赖于丙二酰基-CoA但不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径的提高可通过减弱乙酰乙酰基-CoA硫解酶活性和/或触发因子活性和/或涉及细胞分裂的分子伴侣的活性来进行。在一个实例中,细胞可包含tig基因中的基因突变。
在一个实例中,细胞中的基因突变可导致NADPH依赖型转氢酶途径中的酶活性相对于野生型细胞有所提高。此结果可通过引入编码多肽的异源核酸序列实现,所述多肽编码核苷酸转氢酶活性。在另一个实例中,通过本领域已知的任何方法,细胞中的基因突变可导致脂肪酰基-CoA合成酶和/或连接酶活性的表达降低。在还另一个实例中,细胞中的基因突变可导致具有乙酰基-CoA羧化酶活性的酶的过表达。
在一个实例中,细胞可通过引入编码具有氰化酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而具有提高的细胞内碳酸氢盐水平。更具体地讲,根据细胞的任何一个方面的基因突变可导致脂肪酰基-CoA硫酯酶活性水平的提高和/或降低。此结果可通过提高链长特异的脂肪酰基-CoA硫酯酶活性水平并降低脂肪酰基-CoA硫酯酶对不期望的脂肪酸链长的活性,从而提高所需脂肪酸产物的链长特异性。在一个实例中,脂肪酸或脂肪酸衍生产物的链长特异性的提高可通过单独地或组合地提高链长特异的酮酰基-CoA硫解酶、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶或3-羟酰基-CoA脱水酶的活性而实现。
根据本发明的任何一个方面的细胞中的基因突变可导致选自上面提及的酶的列表中的仅一种酶的表达提高或降低,或导致上面提及的酶的组合的表达提高或降低。
在另一个实例中,细胞中的基因突变可以是在选自以下的至少一种酶中:乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA合酶(或延长酶)、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶、3-羟酰基-CoA脱水酶和乙酰乙酰基-CoA硫解酶。更具体地讲,细胞中的基因突变可导致乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA合酶(或延长酶)、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和3-羟酰基-CoA脱水酶的组合表达提高,任选地,乙酰乙酰基-CoA硫解酶的表达或活性降低。具体地讲,烯酰基-CoA还原酶和/或酮酰基-CoA还原酶可利用辅因子NADH和/或NADPH。
具体地讲,根据本发明的任何一个方面的细胞中的基因修饰可包括表1中所列的任何酶与下列酶的组合:乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA合酶(或延长酶)、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和/或3-羟酰基-CoA脱水酶以及乙酰乙酰基-CoA硫解酶,其中乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA合酶(或延长酶)、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和3-羟酰基-CoA脱水酶的表达或活性提高,而乙酰乙酰基-CoA硫解酶的活性降低。
在还另一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞中的依赖于丙二酰基-CoA、不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径可通过提高基因或途径(其包含乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA硫解酶、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和/或3-羟酰基-CoA脱水酶)的表达并同时降低乙酰乙酰基-CoA硫解酶的表达或活性来实现。
具体地讲,根据本发明的任何一个方面的细胞中的基因修饰可包括表1中所列的任何酶与下列酶的组合:乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA硫解酶、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和/或3-羟酰基-CoA脱水酶,同时乙酰乙酰基-CoA硫解酶的表达或活性降低。
在一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞可包含基因修饰,所述基因修饰存在于表1中所列的任何酶与下列酶的组合中:乙酰基-CoA羧化酶、丙二酰基-CoA:ACP转酰酶(FabD)、β-酮酰基-ACP合酶III、β-酮酰基-ACP合酶I(FabB)、β-酮酰基-ACP合成酶II(FabF)、3-氧酰基-ACP-合酶I和烯酰基ACP还原酶。
更具体地讲,基因突变可导致选自以下的至少一种酶的表达相对于野生型细胞有所提高:乙酰基-CoA羧化酶、丙二酰基-CoA:ACP转酰酶(FabD)、β-酮酰基-ACP合酶III、β-酮酰基-ACP合酶I(FabB)、β-酮酰基-ACP合酶II(FabF)、3-氧酰基-ACP-合成酶I和烯酰基ACP还原酶。具体地讲,基因突变可导致根据本发明的任何一个方面的细胞中的不止一种酶的表达提高,其借助于依赖于丙二酰基-CoA且不依赖丙二酰基-ACP的脂肪酰基-CoA代谢途径中的酶活性在所述细胞中相对于野生型细胞的提高,使得所述细胞能够生产脂肪酸和/或其酰基辅酶A。
在一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞中可能存在β-酮酰基-ACP合酶和3-氧酰基-ACP-合酶表达的提高。在另一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞中可能存在β-酮酰基-ACP合酶和丙二酰基-CoA-ACP转酰酶表达的提高。在还另一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞中可能存在β-酮酰基-ACP合酶和烯酰基ACP还原酶表达的提高。在一个实例中,根据本发明的任何一个方面的细胞中可能存在β-酮酰基-ACP合酶、丙二酰基-CoA-ACP转酰酶和烯酰基ACP还原酶表达的提高。在所有实例中,均可能存在烯酰基ACP还原酶和/或酰基-CoA硫酯酶表达的提高。
短语“提高的酶活性”,如本文中所用,应理解为提高的细胞内活性。基本上,酶活性的提高可以通过使用强启动子或采用编码对应的具有提高的活性的酶的基因或等位基因,并且任选地通过组合这些措施,以增加编码所述酶的基因序列的拷贝数而实现。根据本发明的任何一个方面所用的经基因修饰的细胞是,例如,使用含有所需基因、该基因或其部分的等位基因的载体以及实现该基因表达的载体,通过转化、转导、接合或这些方法的组合而生产出来的。具体地讲,异源表达是通过将基因或等位基因整合进细胞的染色体中或在染色体外复制的载体中而实现的。
在一个实例中,根据本发明的细胞中的基因修饰可包括以上任何酶与在选自以下的至少一种酶中的基因修饰的组合:β-酮酰基-ACP合酶I、3-氧酰基-ACP合酶I、丙二酰基-CoA-ACP转酰酶、烯酰基ACP还原酶和β-酮酰基-ACP合酶III。具体地讲,根据本发明的任何一个方面的细胞中的基因修饰可包括表1中所列的任何酶与下列酶的组合:β-酮酰基-ACP合酶I、3-氧酰基-ACP-合酶I、丙二酰基-CoA-ACP转酰酶、烯酰基ACP还原酶和β-酮酰基-ACP合酶III的表达。
表1:用于生产脂肪酸的微生物的细胞中基因修饰的实例。
根据本发明的任何一个方面,相比野生型细胞,细胞可经基因修饰而提高至少一种转运蛋白的表达。转运蛋白可以是FadL和/或AlkL。在一个实例中,细胞可经基因修饰而过表达FadL和AlkL基因两者。
相对于野生型细胞,细胞还可经基因修饰而提高选自下列的至少一种酶的表达:乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA合酶(或延长酶)、酮酰基-CoA硫解酶、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和3-羟酰基-CoA脱水酶,并任选地降低乙酰乙酰基-CoA硫解酶的表达,其中所述细胞具有减弱的脂肪酸降解能力。
因此,本发明的细胞和方法可包括:提供经基因修饰的微生物,所述微生物既包含生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物的途径,还包含经修饰的多核苷酸,所述多核苷酸编码丙二酰基-ACP依赖型脂肪酸合酶系统的酶,所述酶表现出减弱的活性,使得相比于缺少此类修饰的类似的(对照)微生物,其对丙二酰基-CoA的利用转向所述生产途径。这些方法涉及在提供有营养培养液的容器中,使用此类经基因修饰的微生物生产化学产物。本文所述的对其它酶(如乙酰基-CoA羧化酶和/或NADPH依赖型转氢酶)的其它基因修饰可能存在于一些此类实例中。经证明,提供额外的编码表现出这些酶活性的多肽的多核苷酸拷贝会提高脂肪酸或脂肪酸衍生产物的产量。提高这些相应的酶活性的其它方式是本领域已知的,并且可应用于本发明的各种实例。
同样,不加限制地,一些制造脂肪酸的多阶段方法实施方案中的第一步可以下述为例:向容器(如培养或生物反应器容器)中提供营养培养液(如本领域技术人员已知的基本培养液)和经基因修饰的微生物的接种物,以便提供一批此类微生物(如细菌,并且更具体地讲,肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员,如大肠杆菌),其中所述经基因修饰的微生物包含将丙二酰基-CoA转化成脂肪酸的代谢途径。在容器中培养此接种物,使得细胞密度增加至适于达到脂肪酸或脂肪酸衍生产物的生产水平的细胞密度,所述生产水平满足整体生产率指标(将所述方法的下一步考虑在内)。在各种可供选择的实施方案中,可将一批这些经基因修饰的微生物在第一制备容器中培养至第一细胞密度,并随后转移至经标注的容器中以便提供所选定的细胞密度。许多的多容器培养策略是本领域技术人员所已知的。任何此类实施方案提供了根据本方法的第一标注步骤所选定的细胞密度。
同样不加限制地,后续步骤可以两种方法为例,这两种方法也可在各种实施方案中组合实施。第一种方法为经基因修饰的微生物提供了基因修饰,使得能够控制其烯酰基-ACP还原酶的酶活性。作为一个实例,可进行基因修饰以用温度敏感的突变型烯酰基-ACP还原酶(例如,大肠杆菌中的fabITS)取代天然的烯酰基-ACP还原酶。前者在温度高于30℃时可表现出减弱的酶活性,但在30℃时酶活性正常,使得将培养温度升至,例如34℃、35℃、36℃、37℃或甚至42℃,会减弱烯酰基-ACP还原酶的酶活性。相比在30℃时,丙二酰基-CoA向脂肪酸的转化不受低效率的烯酰基-ACP还原酶的影响,在此情况下,更多的丙二酰基-CoA被转化成脂肪酸或脂肪酸衍生产物或另一种化学产物。
细胞可包含其它可用于生产脂肪酸和/或氨基酸的基因修饰。例如,可提供利用蔗糖的能力,而这将拓宽可用于生产脂肪酸或脂肪酸衍生产物或其它化学产物的原料的范围。常用的实验室和工业用大肠杆菌菌株(如本文中所述的菌株)不能利用蔗糖作为惟一碳源。由于蔗糖和含蔗糖的原料(如糖蜜)很丰富并且经常用作微生物发酵生产的原料,所以可在具有本文中所提供的其它特征的菌株中增加适当的基因修饰以允许摄取和使用蔗糖。各种的蔗糖摄取和代谢系统是本领域已知的(例如,美国专利No.6,960,455)。
还可提供基因修饰以增加用于分解更复杂的碳源(如纤维素类生物质或其产物)的功能,从而摄取和/或利用此类碳源。例如,已经研究和表征了众多的纤维素酶和基于纤维素酶的纤维素降解系统(Beguin,P和Aubert,J-P(1994)FEMSMicrobial.Rev.13:25-58;Ohima,K.等人,(1997)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.14:365414)。
在一些实例中,基因修饰增大了辅因子NADPH的库和可用性,并且/或因此,还可提供NADPH/NADP+比率。例如,在大肠杆菌中,这可以通过提高一个或多个下列基因的活性(如通过基因修饰):pgi(以突变的形式)、pntAB(过表达的)、gapA:gapN(置换/取代),以及破环或修饰可溶性转氢酶(如sthA)和/或基因修饰zwf、gnd以及edd中的一个或多个来实现。
可向不具有此类功能或具有低于所需水平的此类功能的物种提供任何此类基因修饰。更一般地说,并且取决于选定用于基因修饰的微生物的具体代谢途径,可进行任何亚群的基因修饰以降低选自以下的发酵产物的细胞产量:乙酸、乙偶姻、丙酮、丙烯酸、苹果酸、苯甲酰基-CoA、脂肪酸乙酯、类异戊二烯、甘油、乙二醇、乙烯、丙烯、丁烯、异丁烯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、其它乙酸酯、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、丁酸、异丁酸、2-羟基-异丁酸、3-羟基-异丁酸、乙醇、异丙醇、D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、衣康酸、乙酰丙酸、葡糖二酸、戊二酸、己内酰胺、己二酸、正丙醇、异丙醇、高级醇和1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甲酸、富马酸、丙酸、琥珀酸、戊酸以及马来酸。可以如本文所整体公开的那样产生基因缺失,并且其它方法也可用于实现所需降低的所选发酵产物的细胞产量。
通过以下图示和非限制性实例进一步说明了本发明,从中可以了解本发明的另外的实施方案、方面以及优点。
图1描绘了大肠杆菌W3110ΔfadEpJ294{Ptac}[synUcTE]/pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)_fadD_Ec]发酵48h样品的总离子层析图。
图2描绘了大肠杆菌W3110ΔfadEpJ294{Ptac}[synUcTE]/pCDF{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)_fadD_Ec]发酵48h样品的总离子层析图。
图3描绘了大肠杆菌W3110ΔfadEpJ294{Ptac}[synUcTE]/pCDFDuet-1发酵48h样品的总离子层析图(阴性对照)。
图4描绘了采用大肠杆菌菌株W3110ΔfadEpCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]生产月桂酰甘氨酸。
图5描绘了采用大肠杆菌菌株W3110ΔfadEΔgcvTHPpCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]生产月桂酰甘氨酸。
图6为显示了在实施例16中所测试的多种生物体中GLYAT2的序列同一性百分比的树状图。
实施例
SEQIDNO:
贯穿本申请,使用了一系列SEQIDNO。这些均示于下表2中。
SEQ ID NO: | 注释 |
1 | 加州月桂(Umbellularia californica)synUcTE (一种酰基-CoA硫酯酶)基因(经密码子优化) |
2 | tac 启动子 |
3 | 载体pJ294[Ptac-synUcTE],参见实施例1 |
4 | 智人(Homo sapiens)基因hGLYAT2(一种氨基酸N-酰基转移酶) |
5 | 智人(Homo sapiens)基因hGLYAT3(另一种氨基酸N-酰基转移酶) |
6 | 大肠杆菌(Escherichia coli)fadD(一种酰基-CoA合成酶)21 --> |
7 | 载体pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec],参见实施例2 |
8 | 载体pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec],参见实施例2 |
9 | 载体pCDF{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)-fadD_Ec],参见实施例2 |
10 | alkL(一种有助于疏水性酰基的跨细胞膜转运的输入子(importer))基因,参见实施例3 |
11 | Lacuv5 启动子,参见实施例3 |
12 | 载体pCDF[alkLmod1],参见实施例3 |
13 | 载体pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1],参见实施例3 |
14 | 载体pET-28b,参见实施例10 |
15 | 载体pET-28b{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)],参见实施例10 |
16 | pET-28b{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)],参见实施例10 |
表2:实施例中所用的序列。
实施例1
生成加州月桂(Umbellulariacalifornica)基因synUcTE的表达载体
为了生成编码加州月桂(Umbellulariacalifornica)酰基CoA-硫酯酶的加州月桂synUcTE基因(SEQIDNO:1)的表达载体,此基因经密码子优化用于在大肠杆菌中表达。该基因与tac启动子(SEQIDNO:2)一起合成,并且同时,在启动子的上游引入一个裂解位点以及在终止子的下游引入一个裂解位点。此合成DNA片段PtacsynUcTE经过限制性核酸内切酶BamHI和NotI酶切,并连接到经过相应剪切的载体pJ294(DNA2.0Inc.,MenloPark,CA,USA)中。完成的大肠杆菌表达载体被称为pJ294[Ptac-synUcTE](SEQIDNO:3)。
实施例2
生成大肠杆菌(Escherichiacoli)fadD与智人(Homosapiens)基因hGLYAT3和hGLYAT2的共表达载体
为了生成编码人类甘氨酸-N-酰基转移酶的智人基因hGLYAT2(SEQIDNO:4)或hGYLAT3(SEQIDNO:5)与编码大肠杆菌酰基-CoA合成酶的大肠杆菌fadD(SEQIDNO:6)的共表达载体,对基因hGLYAT2和hGLYAT3进行了密码子优化以用于在大肠杆菌中表达并合成。合成的DNA片段经过限制性核酸内切酶SacII和Eco47III酶切,并连接到经过相应剪切的移除了aftA1基因的载体pCDF[atfA1_Ab(co_Ec)-fadD_Ec](SEQIDNO:7)中。在此过程中被另外移除的序列区段于基因合成期间共合成。此载体为pCDF衍生物,其已包含合成的tac启动子(SEQIDNO:2)和大肠杆菌fadD基因。将所得的表达载体命名为pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec](SEQIDNO:8)和pCDF{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)-fadD_Ec](SEQIDNO:9)。
实施例3
生成智人(Homosapiens)hGLYAT2、大肠杆菌(Escherichiacoli)fadD和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)alkL基因的共表达载体
为了生成hGLYAT2基因与经修饰的恶臭假单胞菌alkL基因(其编码AlkL,一种有助于将疏水性底物输入细胞内的外膜蛋白),借助序列特异性寡核苷酸从质粒pCDF[alkLmod1](SEQIDNO:12)将alkL基因(SEQIDNO:10)与lacuv5启动子(SEQIDNO:11)一同扩增。PCR产物经过限制性核酸内切酶BamHI和NsiI切割,并连接到经过相应切割的载体pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec](SEQIDNO:8)中。通过限制性酶切分析检查靶基因的正确插入,并通过DNA测序验证所引入基因的真实性。将所得的表达载体命名为pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1](SEQIDNO:13)。
在PCR中使用了下列参数:1x:预变性,98℃,3:00min;35x变性,98℃,0:10min;退火,65℃,0:20min;延伸,72℃,0:17min;1x:最终延伸,72℃,10min。根据制造商手册使用了来自NewEnglandBiolabs(Frankfurt)的PhusionTMHigh-FidelityMasterMix用于扩增。在1%TAE琼脂糖凝胶上对50μL的PCR反应产物进行了分析。PCR程序、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙锭染色和确定PCR片段大小均以本领域技术人员已知的方式进行。
实施例4
生成具有fadE基因缺失的大肠杆菌菌株,该菌株过表达加州月桂synUcTE、大肠杆菌fadD以及智人hGLYAT2和hGLYAT3基因
为了生成共表达加州月桂synUcTE以及大肠杆菌fadD和智人hGLYAT2或智人hGLYAT3基因的大肠杆菌菌株,使用质粒pJ294{Ptac}[synUcTE]和pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)_fadD_Ec]或pCDF{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)_fadD_Ec]通过电穿孔转化菌株大肠杆菌W3110ΔfadE,并涂布在补充有大观霉素(100μg/mL)和氨苄西林(100μg/mL)的LB琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性酶切分析检查转化株是否存在正确的质粒。由此生成了菌株大肠杆菌W3110ΔfadEpJ294{Ptac}[synUcTE]/pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)_fadD_Ec]和大肠杆菌W3110ΔfadEpJ294{Ptac}[synUcTE]/pCDF{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)_fadD_Ec]。
实施例5
生成具有fadE基因缺失的大肠杆菌菌株,该菌株过表达大肠杆菌fadD以及智人hGLYAT2或hGLYAT3基因
为了生成过表达大肠杆菌fadD基因以及智人hGLYAT2或hGLYAT3基因的大肠杆菌菌株,生成了大肠杆菌菌株W3110?fadE的电感受态细胞。使用质粒pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]转化大肠杆菌W3110?fadE,并涂布在补充有大观霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性酶切分析检查转化株是否存在正确的质粒。由此生成的菌株被命名为大肠杆菌W3110?fadEpCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]。
实施例6
由具有fadE基因缺失的大肠杆菌菌株生产脂肪酸/氨基酸加合物,该菌株过表达synUcTE和fadD基因以及hGLYAT2或hGLYAT3
使用了实施例4中生成的菌株以研究其生产脂肪酸/氨基酸加合物的能力,过程如下:
从-80℃甘油培养物开始,首先将待研究的菌株涂布在补充有100μg/mL氨苄西林和100μg/mL大观霉素的LB琼脂平板上,并于37℃温育过夜。在每种情况下从单个菌落开始,然后使菌株在补充有100μg/mL氨苄西林和100μg/mL大观霉素的MillerLuria-Bertani培养液(Merck,Darmstadt)中生长为5mL预培养物。进一步的培养步骤在M9培养液中进行。该培养液由38mM磷酸氢二钠二水合物、22mM磷酸二氢钾、8.6mM氯化钠、37mM氯化铵、2%(w/v)葡萄糖、2mM七水硫酸镁(所有化学品均来自Merck,Darmstadt)和0.1%(v/v)微量元素溶液构成,使用25%强度的氢氧化铵溶液调整至pH7.4。所加入的微量元素溶液由9.7mM氯化锰(II)四水合物、6.5mM七水硫酸锌、2.5mM钠-EDTA(依地酸III)、4.9mM硼酸、1mM二水钼酸钠、32mM二水氯化钙、64mM七水硫酸亚铁(II)和0.9mM二水氯化铜(II)构成,溶于1M盐酸(所有化学品均来自Merck,Darmstadt)中,在被加入到M9培养液中之前进行过滤灭菌。将20mL补充有100μg/mL大观霉素和100μg/mL氨苄西林的M9培养液注入到100-mL挡板锥形烧瓶中,并用0.5mL预培养物接种。将烧瓶在37℃和200rpm下,于振荡培养箱中培养。在8小时培养时间后,将50mL补充有100μg/mL大观霉素和100μg/mL氨苄西林的M9培养液注入到250mL挡板锥形烧瓶中,并用10mL培养物接种以达到0.2的光密度(600nm)。将烧瓶在37℃和200rpm下,于振荡培养箱中培养。当光密度(600nm)达到0.7至0.8时,通过加入1mMIPTG诱导基因表达。将菌株在30℃和200rpm下进一步培养48小时。在诱导的同时,向一些培养物中加入1g/L甘氨酸。在培养期间,取样,并分析存在的脂肪酸/氨基酸加合物。结果示于图1和2中。已可能证实大肠杆菌菌株W3110ΔfadEpJ294{Ptac}[synUcTE]/pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)_fadD_Ec]和大肠杆菌菌株W3110ΔfadEpJ294{Ptac}[synUcTE]/pCDF{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)_fadD_Ec]均能够从葡萄糖形成各种脂肪酸/氨基酸加合物,例如月桂酰基谷氨酸。相比之下,在缺乏这些质粒的细胞(作为阴性对照)中不存在此类加合物(图3)。似乎轻微的序列变异,例如区分hGLYAT2与hGLYAT3的氨基酸置换,不会损害细胞制造脂肪酸/酰基氨基酸加合物的能力,如表3中所示。
表3:在48h培养时间后定量测定脂肪酸甘氨酸。
实施例7
通过HPLC/MS对产物进行层析定量
通过HPLCESI/MS对发酵样品中的N-月桂酰基甘氨酸、N-肉豆蔻酰基甘氨酸和N-棕榈酰基甘氨酸进行定量并且检测其它酰基氨基酸。在“单离子监测”模式(SIM)中,使用具有外部校准的酸(约0.1-50mg/l)对三种靶标化合物进行定量。并行地,在质量范围m/z=100-1000上进行扫描以便识别出另外的酰基氨基酸。
用于测定脂肪酸甘氨酸的样品的制备如下:将800μL溶剂(丙酮)和200μL样品移取至2mL反应容器中。将混合物在Retsch磨机中以30Hz摇动1分钟,并随后以大约13,000rpm离心5分钟。用移液管将澄清上清液移除并用稀释剂(80%乙腈/20%水+0.1%甲酸)将其适当稀释后进行分析。将所用的校准基准同样地溶解并稀释于此稀释剂中。
采用了下列设备:
·SurveyorHPLC系统(ThermoScientific,Waltham,Massachusetts,USA),其由MS泵、AutosamplerPlus和PDADetectorPlus构成
·具有HESIII源的质谱仪TSQVantage(ThermoScientific,Waltham,Massachusetts,USA)
·HPLC柱:100x2mmPursuitXRSUltraC8;2.8μm(Agilent,SantaClara,California,USA)。
化学品:
·来自Millipore系统的水
·用于HPLC的乙腈(MerckAG,Darmstadt,Germany)
·甲酸,p.a.级(Merck,Darmstadt,Germany)
·N-丙醇Lichrosolv(Merck,Darmstadt,Germany)
·N-月桂酰基甘氨酸99%(Chem-ImpexInternational,WoodDale,IL,USA)
·N-肉豆蔻酰基甘氨酸>98%(SantaCruzBiotechnology,Texas,USA)
·N-棕榈酰基甘氨酸>99%(出处未知)。
使用上述HPLC柱进行HPLC分离。注射体积为2μL,柱温为40℃,流速为0.3mL/min。流动相由洗脱液A(0.1%强度(v/v)含水甲酸)和洗脱液B(75%乙腈/25%正丙醇(v/v),含0.1%(v/v)甲酸)组成。使用了下列梯度分布:
表4:实施例7中所用的梯度概况。
在正离子化模式下,采用下列ESI源参数进行HPLC/MS分析:
喷雾电压:3500V
汽化器温度:50℃
鞘层气压:40
辅助气压:10
毛细管温度:250℃
喷雾器距离:环C。
通过“单离子监测”(SIM),采用表5中所示的下列参数对三种被分析物进行检测和定量。
表5:实施例7的SIM中所用的参数。
实施例8
由具有fadE基因缺失的大肠杆菌菌株生产脂肪酸氨基酸加合物,该菌株在并行的发酵系统中过表达synUcTE和fadD基因以及hGLYAT2或hGLYAT3
实施例4中生成的菌株被用于研究其从葡萄糖生产脂肪酸氨基酸加合物的能力。出于此目的,将菌株既在摇瓶中培养也在补料分批发酵中培养。在来自DASGIP、具有8个生物反应器的并行发酵系统中进行发酵。
如实施例6中所述的那样制备生产细胞。
使用配备了顶部搅拌器和叶轮桨叶的1L反应器进行发酵。在线测量pH和pO2用于过程监测。OTR/CTR测量结果用于估计尤其是代谢活性和细胞适应度。
如DASGIP技术说明中所规定的,使用pH4.0和pH7.0的标准溶液,通过两点式校准对pH电极进行校准。如技术说明中所规定的,反应器设置有必要的感应器和连接,并且装配了搅拌轴。然后在反应器中装入300mL水并于121℃高压消毒20分钟以确保无菌。将pO2电极连接至测量放大器并极化过夜(至少6h)。之后,在干净的实验台上移除水并代之以M9培养液(pH7.4),所述M9培养液由KH2PO43.0g/l、Na2HPO46.79g/l、NaCl0.5g/l、NH4Cl2.0g/l、2mL无菌1MMgSO4*7H2O溶液和1mL/l过滤灭菌的微量元素原液(由HCl(37%)36.50g/L、MnCl2*4H2O1.91g/L、ZnSO4*7H2O1.87g/L、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/L、H3BO30.30g/L、Na2MoO4*2H2O0.25g/L、CaCl2*2H2O4.70g/L、FeSO4*7H2O17.80g/L、CuCl2*2H2O0.15g/L构成)所构成,其含有15g/L葡萄糖作为碳源(按30mL/L的计量添加无菌料液,所述料液由500g/L葡萄糖、1.3%(w/v)MgSO4*7H2O构成)并补充有100mg/L大观霉素和3mL/lDOW1500。
之后,使用一点式校准将pO2电极校准至100%(搅拌器:400rpm/通气:10sl/h空气),并且如技术说明中所规定的,通过“就地清洁”来清洁进料、校正剂和诱导剂线路。为此,首先用70%乙醇冲洗管道,然后用1MNaOH冲洗,之后用无菌的充分软化水冲洗,并最后,填满相应的培养液。
使用实施例4的大肠杆菌菌株,首先用低温培养物在补充有100mg/l大观霉素的LB琼脂平板上进行稀释划线,并将平板在37℃温育大约16h。然后用单个菌落对补充有100mg/l大观霉素的LB培养液(10mL,在100-mL挡板烧瓶中)进行接种,并使培养物在37℃和200rpm下生长过夜大约16h。之后,将此培养物用于第二预培养阶段,其在50mLM9培养液中的初始OD为0.2,所述M9培养液由KH2PO43.0g/l、Na2HPO46.79g/l、NaCl0.5g/l、NH4Cl2.0g/l、2mL无菌1MMgSO4*7H2O溶液和1mL/l过滤灭菌的微量元素原液(由HCl(37%)36.50g/L、MnCl2*4H2O1.91g/L、ZnSO4*7H2O1.87g/L、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/L、H3BO30.30g/L、Na2MoO4*2H2O0.25g/L、CaCl2*2H2O4.70g/L、FeSO4*7H2O17.80g/L、CuCl2*2H2O0.15g/L构成)所构成,其补充有20g/L葡萄糖作为碳源(按40mL/L的计量添加无菌料液,所述料液由500g/L葡萄糖构成),将第二预培养物连同上述抗生素转移至500mL挡板烧瓶中并在37℃/200rpm下温育8-12h。
为了以0.1的光密度给反应器接种,测量了第二预培养阶段的OD600并计算了接种所需的培养物的量。借助于5-mL注射器透过隔膜将所需的培养物的量置于加热并通气的反应器中。
使用了表6a-c中所示的标准程序:
a)
b)
c)
脚本 | |
触发器触发 | 31 % DO (1/60h) |
IPTG诱导 | 进料开始后2 h |
进料触发 | 50 % DO |
进料速率 | 3 [mL/h] |
表6:使用实施例8中的加热并通气的反应器的标准程序。
使用12.5%强度的氨水将pH单方面地调节至pH7.0。在生长期和生物转化期间,经由搅拌器速度和通气速率将培养物中溶解的氧气(pO2或DO)调节到至少30%。在接种后,DO从100%降至30%,并在余下的发酵过程中保持稳定。
发酵以补料分批方式进行,以5g/l*h葡萄糖进料(由500g/l葡萄糖、1.3%(w/v)MgSO4*7H2O构成)开始进料作为进料期的起点,通过象征间歇期终点的DO峰触发。从进料开始起,将温度从37℃降至30℃。进料开始后2h,用1mMIPTG诱导表达。
在发酵开始后47h和64h取样,以对月桂酰基甘氨酸、肉豆寇酰基甘氨酸和棕榈酰基甘氨酸进行定量。这些样品经制备用于分析,并如实施例7中所述的那样进行分析。
已可能证实菌株大肠杆菌W3110ΔfadEpJ294{Ptac}[synUcTE]/pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)_fadD_Ec]能够从葡萄糖形成月桂酰基甘氨酸。结果示于表7和8中。
表7:在47和64h发酵时间后对脂肪酸甘氨酸的定量。
表8:在47和64小时发酵时间后脂肪酸的产量。(n.d.:无法确定)。
实施例9
在补料分批发酵中对实施例5的菌株进行发酵以研究连接月桂酸与甘氨酸而得到月桂酰基甘氨酸的能力。此发酵在来自DASGIP、具有8个生物反应器的并行发酵系统中进行。
实验设定如实施例8中所述,不同的是:进料为100g/l甘氨酸(在软化水中)和100g/l月桂酸(在月桂酸甲酯中),而非葡萄糖。在发酵开始后23h和42h取样,以对发酵样品中的月桂酰基甘氨酸、肉豆寇酰基甘氨酸和棕榈酰基甘氨酸进行定量。这些样品经制备用于分析,并如实施例7中所述的那样进行分析。结果示于表9和10中。
已可能证实菌株大肠杆菌W3110ΔfadEpCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)_fadD_Ec]{Plavuv5}[alkLmod1]能够连接月桂酸和甘氨酸并生产月桂酰基甘氨酸。
表9:在进料月桂酸和甘氨酸发酵23和42小时后月桂酰基甘氨酸的产量。
表10:在不进料月桂酸和甘氨酸发酵23和42小时后月桂酰基甘氨酸的产量(阴性对照)。
实施例10
生成在大肠杆菌菌株中表达智人基因hGLYAT3和hGLYAT2的载体,所述大肠杆菌菌株通过丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA生产脂肪酸
为了生成在下表13(来自WO2014026162A1的表3.2)中所列的生产脂肪酸的菌株中表达智人基因hGLYAT2(SEQIDNO:4)或hGYLAT3(SEQIDNO:5)的载体,首先扩增基因hGLYAT2和hGYLAT3。借助序列特异性寡核苷酸从质粒pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1](SEQIDNO:13)扩增基因hGLYAT2并从质粒pCDF{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)-fadD_Ec](SEQIDNo:9)扩增hGYLAT3基因。PCR产物经过限制性核酸内切酶NotI和SacI切割,并连接到经过相应切割的载体pET-28b(SEQIDNO:14)。通过限制性酶切分析检查靶基因的正确插入,并通过DNA测序验证所引入基因的真实性。将所得的表达载体命名为pET-28b{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)](SEQIDNo:15)和pET-28b{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)](SEQIDNo:16)。
实施例11
在摇瓶实验中由过表达hGLYAT2或hGLYAT3的菌株通过丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA生产脂肪酸氨基酸加合物
根据实施例10生产的载体随后被用于使用本领域已知的任何转化方法生成来自下表11(OPXBiotechnologiesInc.,USA)的微生物菌株。具体地讲,使用了WO2014026162A1的第IV部分中所提供的方法。
所生成的菌株被用于研究其从葡萄糖生产脂肪酸,特别是氨基酸加合物的能力。出于此目的,使用载体pET-28b{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)](SEQIDNO:15)和pET-28b{Ptac}[hGLYAT3(co_Ec)](SEQIDNO:16)转化菌株并在摇瓶中培养(WO2014026162A1的第IV部分的C小节)。使用包含空载体pET-28b的菌株BXF_031(OPXBiotechnologiesInc.,USA)作为对照。
进行一式三份的评价。简而言之,在50mL包含适当抗生素的TerrificBroth中制成过夜启动培养物,并在30℃.温育16-24小时,同时以225rpm摇动。将这些培养物用于在SM11基本培养液中为各个菌株接种150mL培养物(OD600达到0.8),以5%TB培养遗留物作为起始接种物,并外加抗生素。1LSM11培养液由下列物质组成:2mLFM10微量矿物原液、2.26mL1MMgSO4、30g葡萄糖、200mMMOPS(pH7.4)、1g/L酵母提取物、1.25mLVM1维生素混合物、0.329gK2HPO4、0.173gKH2PO4、3g(NH4)2SO4、0.15g柠檬酸(无水);FM10微量矿物原液由下列物质组成:1mL浓缩HCl、4.9gCaCl2*2H2O、0.97gFeCl3*6H2O、0.04gCoCl2*6H2O、0.27gCuCl2*2H2O、0.02gZnCl2、0.024gNa2MoO4*2H2O、0.007gH3BO3、0.036gMnCl2*4H2O,加入适量DI水至100mL;VM1维生素混合溶液由下列物质组成:5g硫胺素、5.4g泛酸、6.0g烟酸、0.06g,加入适量DI水至1000mL。在(WO2014026162A1的第IV部分的A小节)中提供了本实施例中所用的培养液的所有成分。
将培养物在30℃.温育2小时,同时以225rpm摇动。2小时后,用SM11(不含磷酸的SM11培养液)洗涤细胞。将细胞离心两次(4,000rpm,15min),滗析出上清液,将团块重悬浮于150mLSM11(不含磷酸的SM11培养液)中。将培养物用于在SM11(无磷酸)中为各个菌株接种3×50mL。使培养物在30℃.生长大约2h,2h后OD600达到1.0-1.5并将温度调至37℃.,并在72小时的过程中定期取样用于产物测定。
如实施例7中所述,通过HPLC-ESI/MS对发酵样品中的N-月桂酰基甘氨酸、N-肉豆蔻酰基甘氨酸和N-棕榈酰基甘氨酸进行定量并且检测其它酰基氨基酸。
表11:在实施例10和11中用于引入基因hGLYAT2或hGLYAT3的微生物菌株的列表。在WO2014026162A1(OPXBiotechnologiesInc.,USA)的表3.2中提供了生产方法和菌株序列。
实施例12
生成用于在大肠杆菌W3110ΔfadE中缺失gcvTHP操纵子的载体
为了生成用于缺失大肠杆菌W3110的gcvTHP操纵子的载体,所述操纵子编码甘氨酸裂解系统(gcvT:甘氨酸裂解复合体的氨基甲基转移酶、四氢叶酸依赖型亚基(T蛋白质);gcvH:甘氨酸裂解复合体硫辛酰蛋白;gcvP:甘氨酸裂解复合体的甘氨酸脱羧酶、PLP依赖型亚基(蛋白质P)),通过PCR扩增了gcvTHP操纵子的上游和下游各大约500bp。使用寡核苷酸o-MO-40(SEQIDNo:22)和o-MO-41(SEQIDNo:23)扩增了gcvTHP的上游区域。使用寡核苷酸o-MO-42(SEQIDNo:24)和o-MO-43(SEQIDNo:25)扩增了gcvTHP的下游区域。PCR程序在以上实施例3中有述。
在每种情况下,可以扩增具有预期大小的PCR片段(PCR1,553bp,(SEQIDNo:26);PCR2,547bp,SEQIDNo:27)。通过琼脂糖凝胶使PCR样品分开,并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Hilden)分离DNA片段。将纯化的PCR片段克隆到载体pKO3(SEQIDNo:28)中,并使用Geneart?无缝克隆和组装试剂盒(LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA)以BamHI切割。将组装好的产物转化到化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(NewEnglandBiolabs,Frankfurt)中。PCR纯化、体外克隆和转化的程序根据制造商手册进行。通过限制性酶切分析检查靶基因的正确插入,并通过DNA测序验证所引入DNA片段的真实性。将所得的敲除载体命名为pKO3ΔgcvTHP(SEQIDNo:29)。
在pKO3ΔgcvTHP的帮助下,使用Link等人,1997中所述的方法构建菌株大肠杆菌W3110ΔfadEΔgcvTHP。缺失了gcvTHP之后的DNA序列为SEQIDNo:30。使用质粒pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1](SEQIDNo:13,实施例3)通过电穿孔转化大肠杆菌菌株W3110ΔfadEΔgcvTHP,并涂布在补充有大观霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性酶切分析检查转化株是否存在正确的质粒。将所得的菌株命名为大肠杆菌W3110ΔfadEΔgcvTHPpCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]。
实施例13
由具有fadE或fadE/gcvTHP基因缺失的大肠杆菌菌株生产月桂酰基甘氨酸,该菌株过表达hGLYAT2、fadD和alkL基因
在实施例1中生成的菌株被用于研究其相比没有gcvTHP缺失的参照菌株生产更多月桂酰基甘氨酸的能力。
从-80℃甘油培养物开始,首先将待研究的菌株涂布在补充有100μg/mL大观霉素的LB琼脂平板上,并于37℃温育过夜。在每种情况下从单个菌落开始,然后使菌株在补充有100μg/mL大观霉素的MillerLB培养液(Merck,Darmstadt)中生长为5mL预培养物。进一步的培养步骤在M9-FIT培养液中进行。此培养液由38mM磷酸氢二钠二水合物、22mM磷酸二氢钾、8.6mM氯化钠、37mM氯化铵、2mM七水硫酸镁(所有化学品均来自Merck,Darmstadt)、5%(w/v)麦芽糖糊精溶液(右旋糖当量13.0-17.0,SigmaAldrich,Taufkirchen)、1%(w/v)来自黑曲霉(Aspergillusniger)的淀粉糖苷酶(Sigma-Aldrich,Taufkirchen)、1滴Delamex180(Bussetti&Co,Wien)和0.1%(v/v)微量元素溶液构成,用25%强度的氢氧化铵溶液调节至pH7.4。所加入的微量元素溶液由9.7mM氯化锰(II)四水合物、6.5mM七水硫酸锌、2.5mM钠-EDTA(依地酸III)、4.9mM硼酸、1mM二水钼酸钠、32mM二水氯化钙、64mM七水硫酸亚铁(II)和0.9mM二水氯化铜(II)构成,溶于1M盐酸(所有化学品均来自Merck,Darmstadt)中,在被加入到M9培养液中之前进行过滤灭菌。将20mL补充有100μg/mL大观霉素的M9培养液注入到100-mL挡板锥形烧瓶中,并用0.5mL预培养物接种。将烧瓶在37℃和200rpm下,于振荡培养箱中培养。在8小时培养时间后,将50mL补充有100μg/mL大观霉素的M9培养液注入到250mL挡板锥形烧瓶中,并用10mL培养物接种以达到0.1的光密度(600nm)。将烧瓶在37℃和200rpm下,于振荡培养箱中培养。当光密度(600nm)达到0.6至0.8时,通过加入1mMIPTG诱导基因表达。将菌株在37℃和200rpm下进一步培养48小时。在诱导后1-3h,向培养物中加入6g/L甘氨酸和6g/L月桂酸(溶于月桂酸甲酯中)。培养0h和24h后,取样,并分析存在的月桂酰基甘氨酸、月桂酸和甘氨酸。结果示于图4和5中。已可能证实大肠杆菌菌株W3110ΔfadEpCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]和大肠杆菌菌株W3110ΔfadEΔgcvTHPpCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]均能够形成月桂酰基甘氨酸。但在新菌株背景ΔfadEΔgcvTHP中,合成了更高量的月桂酰基甘氨酸并检测到更高量的甘氨酸。似乎更少的甘氨酸在ΔgcvTHP背景中代谢并可被用于合成月桂酰基甘氨酸。
实施例14
生成用于在大肠杆菌W3110ΔfadE中缺失glyA基因的载体
为了生成用于缺失glyA基因的载体,所述glyA基因编码大肠杆菌W3110的甘氨酸羟甲基转移酶的组分,通过PCR扩增了glyA基因的上游和下游各大约500bp。使用寡核苷酸o-MO-44(SEQIDNo:31)和o-MO-45(SEQIDNo:32)扩增了glyA的上游区域。使用寡核苷酸o-MO-46(SEQIDNo:33)和o-MO-47(SEQIDNo:34)扩增了glyA的下游区域。
在每种情况下,可以扩增具有预期大小的PCR片段(PCR1,546bp,(SEQIDNo:35);PCR2,520bp,SEQIDNo:36)。通过琼脂糖凝胶电泳使PCR样品分开,并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Hilden)提取DNA片段。通过交叉PCR组装经纯化的PCR片段。将生成的片段纯化并根据制造商手册亚克隆到克隆载体pCR?-BluntIITOPO(Lifetechnologies)中。为了将片段克隆到靶标质粒中,使用寡核苷酸o-MO-52(SEQIDNo:37)和o-MO-53(SEQIDNo:38)将其连同侧翼BamHI限制性内切位点一起扩增。将经纯化的、BamHI切割的PCR3片段(SEQIDNo:39)连接至经过相应切割的载体pKO3(SEQIDNo:28)中。将组装好的产物转化到化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(NewEnglandBiolabs,Frankfurt)中。PCR纯化、体外克隆和转化的程序根据制造商手册进行。通过限制性酶切分析检查靶基因的正确插入,并通过DNA测序验证所引入基因的真实性。将所得的敲除载体命名为pKO3ΔglyA(SEQIDNo:40)。
在pKO3ΔglyA的帮助下,使用Link等人,1997中所述的方法构建菌株大肠杆菌W3110ΔfadEΔglyA。SEQIDNo:41是缺失glyA之后的DNA序列。使用质粒pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1](SEQIDNo:13,来自实施例3)通过电穿孔转化大肠杆菌菌株W3110ΔfadEΔgcvTHP,并涂布在补充有大观霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性酶切分析检查转化株是否存在正确的质粒。将所得的菌株命名为大肠杆菌W3110ΔfadEΔglyApCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]。
实施例15
生成用于在大肠杆菌W3110ΔfadE中缺失ltaE基因的载体
为了生成用于缺失ltaE基因的载体,所述ltaE基因编码大肠杆菌W3110的L-别-苏氨酸醛缩酶,如上所述通过PCR扩增了ltaE的上游和下游各大约500bp。使用寡核苷酸ltaE-UP_fw(SEQIDNo:42)和ltAE-UP-XhoI_rev(SEQIDNo:43)扩增了ltaE的上游区域。使用寡核苷酸ltaE-DOWN_fw(SEQIDNo:44)和ltaE-DOWN_rev(SEQIDNo:45)扩增了ltaE的下游区域。
在每种情况下,可以扩增具有预期大小的PCR片段(PCR4,550bp,(SEQIDNo:46);PCR5,536bp,SEQIDNo:47)。通过琼脂糖凝胶使PCR样品分开,并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Hilden)提取DNA片段。通过交叉PCR组装经纯化的PCR片段。将生成的片段纯化并根据制造商手册克隆到克隆载体pCR?-BluntIITOPO(Lifetechnologies)中。为了将片段克隆到靶标质粒中,使用寡核苷酸o-MO-54(SEQIDNo:48)和o-MO-55(SEQIDNo:49)将其连同侧翼BamHI限制性内切位点一起扩增。将经纯化的、BamHI切割的PCR6片段(SEQIDNo:50)连接至相应切割的载体pKO3(SEQIDNo:28)中。将组装好的产物转化到化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(NewEnglandBiolabs,Frankfurt)中。PCR纯化、体外克隆和转化的程序根据制造商手册进行。通过限制性酶切分析检查靶基因的正确插入,并通过DNA测序验证所引入基因的真实性。将所得的敲除载体命名为pKO3ΔltaE(SEQIDNo:51)。
在pKO3ΔltaE的帮助下,使用Link等人,1997中所述的方法构建菌株大肠杆菌W3110ΔfadEΔltaE(LinkAJ,PhillipsD,ChurchGM.J.Bacteriol.1997.179(20)。缺失ltaE之后的DNA序列在SEQIDNo:52中有述)。使用质粒pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1](SEQIDNo:13,来自实施例3)通过电穿孔转化大肠杆菌菌株W3110ΔfadEΔltaE,并涂布在补充有大观霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上。通过质粒制备和分析型限制性酶切分析检查转化株是否存在正确的质粒。将所得的菌株命名为大肠杆菌W3110ΔfadEΔltaEpCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]。
实施例16
基于LC-ESI/MS2对月桂酸进行定量
通过LC-ESI/MS2在外部校准月桂酸(0.1–50mg/L)的基础上并通过使用内标d3-LS对发酵样品中的月桂酸进行定量。
使用了下列仪器:
·具有自动取样机(G1367E)、二元泵(G1312B)和热静态柱(G1316A)的HPLC系统1260(Agilent;B?blingen);
·具有ESI源的质谱仪TripelQuad6410(Agilent;B?blingen);
·HPLC柱:KinetexC18,100x2.1mm,粒径:2.6μm,孔径100?(Phenomenex;Aschaffenburg)
·柱前:KrudKatcherUltraHPLC串联过滤器;0.5μm滤层深度和0.004mm内径(Phenomenex;Aschaffenburg)。
通过将1900μL溶剂(80%(v/v)ACN、20%双蒸H2O(v/v)、+0.1%甲酸)和100μL样品移取至2mL反应容器中来制备样品。将混合物涡旋约10秒,并随后以约13000rpm离心5min。使用移液器移除澄清上清液并在用稀释剂(80%(v/v)ACN、20%双蒸H2O(v/v)、+0.1%甲酸)适当稀释后进行分析。在每种情况下,将100μLISTD加入到900μL样品(10μL/样品体积90μL)中。
使用上述柱和柱前进行HPLC分离。注射体积为1.0μL,柱温50℃,流速为0.6mL/min.,流动相由洗脱液A(0.1%强度(v/v)含水甲酸)和洗脱液B(含0.1%(v/v)甲酸的乙腈)组成。使用了表14中所示的梯度:
表12:实施例16中所用的洗脱液A和B的浓度。
在正模式下,采用下列ESI源参数进行ESI-MS2分析:
·气体温度320℃
·气体流速11L/min
·喷雾器压力50psi
·毛细管电压4000V。
采用下列MRM参数对月桂酸进行检测和定量。
表13:用于检测和定量月桂酸的MRM参数。
实施例17
检测甘氨酸
使用Agilent1200HPLC系统通过邻苯二甲醛(OPA)衍生化和UV/VIS检测对甘氨酸进行检测。
将200μL均一发酵液样品与1800μL30%(v/v)1-丙醇混合,涡旋10s并随后以13,000xg离心5min。移除上清液并将其用于使用下列参数的HPLC分析:
流动相:洗脱液A
2.5mL乙酸/1L蒸馏水,使用NaOH调整pH6.0
洗脱液B
甲醇
柱:Luna5μC8100A(100x4.6mm);Phenomenex
柱箱温度:40℃
流速:1.0mL/min
梯度:时间%B流速最大压力
0.030.01.0400
1.030.01.0400
17.090.01.0400
19.590.01.0400
19.630.01.0400
20.530.01.0400
运行时间:22min
检测器:DAD
334nm
光谱
存储:全部
范围:200-400nm
步长2nm
FLD(激发330nm;发射450nm,PMT增益13)
衍生化:随注射程序自动地:
注射程序
#Command
1DRAW4.5μLfromVial1*,def.speed,def.offset
2DRAW1.5μLfromsample,def.speed,def.offset
3DRAW0.5μLfromair,def.speed
4NEEDLEwashinflushPort.15.0sec
5DRAW4.5μLfromVial1,def.speed,def.offset
6MIX11.0μLinseat,def.speed,1times
7WAIT1.00min
8INJECT
9WAIT0.50min
10VALVEbypass
11Draw100.0μLfromVial2*,def.speed,def.offset
12Eject100.0μLfromVial2,def.speed,def.offset
13Valvemainpass
*小瓶1含有OPA试剂(见下);小瓶2含有水。
制备OPA试剂
将100mg邻苯二甲醛溶于1mL甲醇中并随后加入0.4mM硼酸盐缓冲液(pH10.4)以得到10mL。随后,加入50μL巯基乙醇并将试剂保存在4℃。在使用前加入另外10μL巯基乙醇。
制备硼酸盐缓冲液(0.4mMH3BO4):
将38.1gNa2B4O7*10H2O(0.1mol)溶于1L蒸馏水中并用4MNaOH将pH调节至10。随后,加入1mL25%Brij35(v/v)。
保留时间:甘氨酸:7.153min。
实施例18
生成用于表达hGLYAT2同系物的载体
为了生成用于表达不同生物体的N-酰基转移酶的载体,合成了存在于NCBI数据库中的、与HGLYAT2具有同源性的变体并针对大肠杆菌进行了密码子优化。这些有:白颊长臂猿(Nomascusleucogenys)的甘氨酸N-酰基转移酶样蛋白2同工型1(Nl,XP_003275392.1,SEQIDNo:53)、亚马逊松鼠猴(Saimiriboliviensis)的甘氨酸N-酰基转移酶样蛋白2(Sb,XP_003920208.1,SEQIDNo:54)、家猫(Feliscatus)的甘氨酸-N-酰基转移酶样2(Fc,XP_003993512.1,SEQIDNo:55)、牛(Bostaurus)的甘氨酸N-酰基转移酶样蛋白2(Bt,NP_001178259.1,SEQIDNo:56)和小家鼠(Musmusculus)的甘氨酸N-酰基转移酶(Mm,NP_666047.1,SEQIDNo:57)。
pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]的hGLYAT2基因(实施例3的SEQIDNo:13)如下由变体所替换:合成的DNA片段经过限制性核酸内切酶BamHI和AsiSI酶切,并连接到经过相应剪切的pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]。
通过限制性酶切分析检查靶基因的正确插入,并通过DNA测序验证所引入基因的真实性。将所得的表达载体命名为:
pCDF{Ptac}[GLYAT_Nl(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]
pCDF{Ptac}[GLYAT_Sb(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]
pCDF{Ptac}[GLYAT_Fc(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]
pCDF{Ptac}[GLYAT_Bt(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]
pCDF{Ptac}[GLYAT_Mm(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]。
实施例19
由具有fadE基因缺失的大肠杆菌菌株生产月桂酰基甘氨酸,该菌株过表达hGLYAT变体、fadD和alkL基因
运用实施例12中所述的方案,将实施例18中生成的菌株用于研究其相比表达hGLYAT2的参照菌株生产月桂酰基甘氨酸的能力,所述参照菌株包含质粒pCDF{Ptac}[hGLYAT2(co_Ec)-fadD_Ec]{Placuv5}[alkLmod1]。
在诱导后1-3h,向培养物中加入6g/L甘氨酸和6g/L月桂酸(溶于月桂酸甲酯中)。在48h的培养时间后,将摇瓶的整个发酵液用丙酮提取(比率1:2)。进一步的样品处理在实施例7中有述。取样,并分析存在的月桂酰基甘氨酸、月桂酸和甘氨酸。结果示于表14中。
除无质粒对照外的所有菌株均生产月桂酰基甘氨酸,其量在0.44至2109.8mg/L之间。
表14:在48h的培养时间后,定量测定包含不同质粒的大肠杆菌W3110ΔfadE菌株中的月桂酰基甘氨酸。各菌株均用6g/L甘氨酸和6g/L月桂酸饲喂。
Claims (20)
1.细胞,其表达氨基酸-N-酰基转移酶和酰基-CoA合成酶,所述氨基酸-N-酰基转移酶优选为重组的,所述酰基-CoA合成酶优选为重组的,其中所述细胞具有减弱的脂肪酸降解能力。
2.根据权利要求1的细胞,其中相比野生型细胞,由于至少一种酶的活性降低,使得所述脂肪酸降解能力减弱,所述至少一种酶选自酰基-CoA脱氢酶、2,4-二烯酰基-CoA还原酶、烯酰基-CoA水合酶和3-酮酰基-CoA硫解酶,优选酰基-CoA脱氢酶。
3.根据权利要求1至2中任一项的细胞,其中所述氨基酸-N-酰基转移酶为人类氨基酸-N-酰基转移酶,优选SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或其变体。
4.根据权利要求1至3中任一项的细胞,其中所述细胞为细菌细胞,优选肠细菌细胞,更优选大肠杆菌。
5.根据权利要求1至4中任一项的细胞,其中所述细胞能够制造蛋白原氨基酸和/或脂肪酸。
6.根据权利要求5的细胞,其中所述细胞包含选自以下的至少一种酶:β-酮酰基-ACP合成酶I、3-氧酰基-ACP合成酶I、丙二酰基-CoA-ACP转酰酶、烯酰基ACP还原酶和β-酮酰基-ACP合成酶III,所述至少一种酶能够制造蛋白原氨基酸和/或脂肪酸。
7.根据前述权利要求中任一项的细胞,其中所述细胞表达酰基-CoA硫酯酶,所述酰基-CoA硫酯酶优选为重组的并且更优选地为SEQIDNO:1或其变体。
8.根据前述权利要求中任一项的细胞,其中所述酰基-CoA合成酶为SEQIDNO:6或其变体。
9.根据前述权利要求中任一项的细胞,其中相比野生型细胞,所述细胞经基因修饰以提高至少一种转运蛋白的表达,其中所述转运蛋白选自FadL和AlkL。
10.细胞,其表达氨基酸-N-酰基转移酶、酰基-CoA合成酶和选自以下的至少一种酶:乙酰乙酰基-CoA合酶、酮酰基-CoA合酶(或延长酶)、酮酰基-CoA硫解酶、烯酰基-CoA还原酶、酮酰基-CoA还原酶和3-羟酰基-CoA脱水酶,并相对于野生型细胞任选地降低乙酰乙酰基-CoA硫解酶的表达,其中所述细胞具有减弱的脂肪酸降解能力。
11.生产酰基氨基酸的方法,其包括步骤:
b)使氨基酸与酰基CoA在存在氨基酸-N-酰基转移酶的情况下接触,所述氨基酸-N-酰基转移酶优选为分离的和/或重组的,
其中所述氨基酸-N-酰基转移酶优选为人类氨基酸-N-酰基转移酶,更优选为SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或其变体,并且
其中所述酰基-CoA合成酶优选为SEQIDNO:6或其变体;
或培养根据权利要求1至10中任一项的细胞。
12.根据权利要求14的方法,除步骤b)外还包括步骤:
a)使用酰基-CoA合成酶将脂肪酸转化成酰基CoA,所述酰基-CoA合成酶优选为分离的和/或重组的,
以及/或
c)氢化。
13.根据权利要求11或12中任一项的方法,其中将选自氨基酸-N-酰基转移酶和酰基-CoA合成酶中的至少一种酶,优选所有酶,以表达所述一种或多种酶的细胞的形式提供。
14.根据权利要求13的方法,其中表达所述一种或多种酶的细胞为根据权利要求1至10中任一项的细胞。
15.反应混合物,其包含:
氨基酸-N-酰基转移酶,其优选为分离的和/或重组的;
酰基-CoA合成酶,其优选为分离的和/或重组的;
氨基酸和
酰基-CoA,或是脂肪酸和酰基-CoA合成酶,
其中所述氨基酸-N-酰基转移酶优选为人类氨基酸-N-酰基转移酶,更优选为SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或其变体,并且
其中所述酰基-CoA合成酶优选为SEQIDNO:6或其变体。
16.根据权利要求15的反应混合物,其中将选自氨基酸-N-酰基转移酶和酰基-CoA合成酶中的至少一种酶,优选所有酶,以细胞的形式提供,优选根据权利要求1至10中任一项的细胞。
17.根据权利要求11至16中任一项的方法或反应混合物,其中所述氨基酸为蛋白原氨基酸,优选自甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和丙氨酸,并且更优选地为甘氨酸。
18.组合物,其包含:
第一酰基氨基酸,其由具有8至16个碳原子的饱和酰基与甘氨酸组成,
第二酰基氨基酸,其由具有10至18个碳原子的不饱和酰基与甘氨酸组成,
和任选地,第三酰基氨基酸,其由具有12个碳原子的饱和或不饱和酰基与选自谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸和天冬酰胺的氨基酸组成。
19.根据权利要求18的组合物,其中所述第一酰基氨基酸由具有12个碳原子的饱和酰基(优选月桂基)与甘氨酸组成。
20.根据权利要求18至19中任一项的组合物,其中所述第二酰基氨基酸由具有12或14个碳原子的不饱和酰基与甘氨酸组成。
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