KR102357193B1 - 견고한 동적 대사 조절을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대규모로 유전자 조작된 미생물에서 화학물질의 신속한 생산을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 미생물 생산 균주의 신속한 최적화를 가능하게 하는 고-처리량 (high-throughput) 대사 공학 플랫폼을 제공한다. 현재 생체 내 (in vivo) 및 시험관 내 (in vitro) 바이오-생산 접근법 사이의 격차를 가교하는 상기 플랫폼은 활성 대사 네트워크의 동적 최소화에 의존한다.

Description

견고한 동적 대사 조절을 위한 조성물 및 방법
본원은 2017년 2월 21일 출원된 미국 가출원번호 62/461,436의 이익을 주장하며, 그 전문이 참조로써 본원에 포함된다.
본 발명은 DOD/DARPA, NAVY/ONR 및 NSF에 의해 각각 수여된 연방 승인 번호 HR0011-14-C-0075, 12043956 및 1445726 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.
본원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열목록을 포함하며, 그 전체가 참조로 포함된다. 2018년 2월 21일에 작성된 상기 ASCII 사본의 이름은 52240_702_601_SL.txt이며 크기는 81,697 바이트이다.
생물공학 기반의 발효 공정은 생물제제 및 소분자 요법에서부터 특수, 대량 및 상용 화학 물질, 심지어 차세대 바이오 연료까지 모든 것을 생산할 수 있도록 성공적으로 개발되었다. 이러한 공정은 발효 과학 및 합성 생물학, 대사 및 효소 공학 분야에서의 기술 개발로 인해 최근 몇 년간 급속한 발전이 이루어졌다. 이러한 실질적인 발전에도 불구하고, 합리적이고 직접적인 공학적 접근의 대다수의 성공적인 사례들은 많은 경우 그리고 빈번하게 시행착오의 긴 주기에 크게 의존적이다. 본 발명은 해당 문제의 복잡성 (및 관련 설계 공간의 크기)을 감소시키는 동시에, 환경 조건에 대한 대사 반응을 최소화하고, 조작된 균주의 견고성 및 확장성을 증가시키는 전략을 제공한다.
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본 발명은 부분적으로 미생물 생산 균주의 신속한 개발을 가능하게 하는 고-처리량 공학 플랫폼 (high-throughput engineering platform)을 제공한다.
일 관점에서, 본 발명은 생성물을 생성하기 위한 세포를 제공하며, 상기 세포는 대사 경로의 효소의 발현의 조절된 감소를 위한 이종의 폴리뉴클레오티드; 및 생성물의 생성을 위한 생산 효소의 발현의 조절된 증가를 매개하기 위한 이종의 생산 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 효소의 발현의 조절된 감소는 세포의 정지 상태(stationary phase) 유지를 유도하고; 상기 효소가 결여된 세포와 비교하여 환경 조건의 변화에 반응하여 상기 정지 상태 동안 생성물의 생산 속도는 적게 감소된다.
일부 실시 양태에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 대사 경로를 통한 플럭스를 감소시킨다. 일부 구체예에서, 상기 효소는 에노일-ACP/CoA 환원효소 (enoyl-ACP/CoA reductase), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase), 리포아미드 탈수소효소 (lipoamide dehydrogenase), 시트레이트 합성효소 (citrate synthase), 가용성 수소전이효소 (soluble transhydrogenase), 및 NADH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 생산 효소는 NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (NADPH-dependent alanine dehydrogenase), 알라닌 추출효소 (alanine exporter), 및 NADPH- 의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADPH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 환경 조건의 변화는 세포와 접촉하는 배양 배지에서 당의 농도를 증가시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 당은 포도당이다. 일부 구체예에서, 상기 환경 조건의 변화는 세포와 접촉하는 배양 배지에서 산소화 (oxygenation)을 증가시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 생성물은 3-하이드록시프로피온산 (3-hydroxypropionic acid)을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 생성물은 아미노산을 포함한다. 일부 관점에서, 상기 아미노산은 알라닌을 포함한다. 일부 관점에서, 상기 세포는 배양물(culture)에서 성장하고, 상기 배양물에 의한 알라닌 생산 속도(rate of production)는 최소 0.5 g/L/hour 이다. 일부 관점에서, 상기 알라닌 생산 속도는 최소 1.0 g/L/hour 이다. 일부 관점에서 상기 알라닌 생산 속도는 최소 1.5 g/L/hour 이다. 일부 관점에서, 상기 알라닌 생산 속도는 최소 1.6 g/L/hour 이다. 일부 관점에서, 상기 배양물은 최소 80 g/L의 알라닌을 생산한다. 일부 관점에서, 상기 배양물은 최소 100 g/L의 알라닌을 생산한다. 일부 관점에서, 상기 배양물은 최소 120 g/L의 알라닌을 생산한다. 일부 관점에서, 상기 배양물은 최소 140 g/L의 알라닌을 생산한다. 일부 관점에서, 상기 생산 폴리뉴클레오티드는 알라닌 추출효소를 인코딩한다. 일부 관점에서, 상기 알라닌 추출효소는 alaE 이다.
일부 구체예에서, 상기 생성물은 메발론산을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 배양물에서 성장하고, 상기 배양물에 의한 메발론산의 생산 속도는 최소 0.5 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 1.0 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 1.2 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 1.25 g/L/hour 이다. 일부 관점에서, 상기 세포는 배양물에서 성장하고, 배양뮬은 최소 50 g/L의 메발론산을 생산한다. 일부 구체예에서, 상기 배양물은 최소 70 g/L의 메발론산을 생산한다. 일부 구체예에서, 상기 배양물은 최소 90 g/L의 메발론산을 생산한다. 일부 구체예에서, 상기 배양물은 최소 95 g/L의 메발론산을 생산한다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 전사를 억제하기 위한 침묵 폴리뉴클레오티드; 및 상기 효소의 세포 분해를 매개하기 위한 분해 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다.
일부 관점에서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 침묵 폴리뉴클레오티드는 효소를 인코딩하는 유전자의 프로모터를 인식하는 gRNA 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 관점에서 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 CRISPR 효소를 인코딩하고, 상기 CRISPR 효소는 gRNAdp 결합될 때 프로모터 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 관점에서, 상기 CRISPR 효소는 촉매적으로 불활성이다. 일부 관점에서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 분해 폴리뉴클레오티드이고, 상기 분해 폴리뉴클레오티드는 분해 태그를 인코딩하는 서열을 포함하고, 상기 분해 태그는 효소의 분해를 매개한다. 일부 구체예에서, 이종 폴리뉴클레오티드의 발현은 세포에서 포스페이트 가용성에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 상기 생산 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 세포에서 포스페이트 가용성에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 E. coli이다.
또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다: 하나의 세포의 복수의 균주 (a plurality of strains of a cell)를 독립적으로 배양하는 단계로서, 상기 균주는 (i) 대사 경로의 효소의 발현의 조절된 감소를 매개하기 위한 이종의 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 상기 생성물의 생성을 위한 생산 효소의 발현의 조절된 증가를 매개하기 위한 이종의 생산 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 세포의 정지 상태(stationary phase)을 유도하고; 상기 복수의 균주의 각 균주는 상기 이종의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 이종의 생산 폴리뉴클레오티드 중 최소 하나의 서열에서 다른 균주와 상이한 것을 특징으로 하는 단계; 상기 복수의 균주를 정지 상태로 성장시키는 단계; 및 상기 정지 상태 동안 선택된 균주에 의해 생산되는 상기 생성물의 양에 기초하여 상기 복수의 균주에서 하나의 균주를 선택하는 단계.
일부 구체예에서, 상기 방법은 생성물의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 선택된 균주를 성장시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 선택된 균주는 생물반응기에서 성장된다. 일부 구체예에서, 상기 선택된 균주를 포함하는 배양 배지는 최소 500ml의 부피를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 배양 배지는 최소 1L의 부피를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 전사를 억제하기 위한 침묵 폴리뉴클레오티드 및 상기 효소의 세포 분해를 매개하기 위한 분해 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 복수의 균주 중 제1 및 제2 균주는 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 침묵 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 프로모터 서열을 인식하는 gRNA 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 gRNA 서열은 제1 및 제2 균주 간에 서로 상이하다. 일부 구체예에서, 상기 복수의 균주 중 상기 제1 및 제2 균주는 분해 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 분해 폴리뉴클레오티드는 제1 및 제2 균주 간에 서로 상이하다. 일부 구체예에서, 상기 효소는 에노일-ACP/CoA 환원효소 (enoyl-ACP/CoA reductase), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase), 리포아미드 탈수소효소 (lipoamide dehydrogenase), 시트레이트 합성효소 (citrate synthase), 가용성 수소전이효소 (soluble transhydrogenase), 및 NADH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 생산 효소는 NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (NADPH-dependent alanine dehydrogenase), 알라닌 추출효소 (alanine exporter), 및 NADPH- 의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADPH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 생성물은 메발론산, 3-하이드록시프로피온산 및 아미노산으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 생성물은 아미노산이고, 상기 아미노산은 알라닌이다. 일부 구체예에서, 상기 선택된 균주의 세포는 정지 상태 동안의 생성물의 생산 속도가 상기 이종의 폴리뉴클레오티드가 결여된 세포와 비교할 때 환경 조건의 변화에 반응하여 적게 감소된다. 일부 구체예에서, 상기 환경 조건의 변화는 상기 세포가 접촉하는 배양 배지의 당 농도의 변화를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 환경 조건의 변화는 상기 세포가 접촉하는 배양 배지의 산소화 (oxygenation)의 변화를 포함한다.
또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 세포 생성물을 생성하는 방법이 본원에 개시된다: (i) 대사 경로의 효소의 발현의 조절된 감소 (controlled reduction)를 매개 (mediating)하기 위한 이종의 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 상기 생성물의 생성을 위한 생산 효소의 발현의 조절된 증가 (controlled increase)를 매개 (mediating)하기 위한 이종의 생산 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이종의 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 세포의 정지 상태 (stationary phase)를 유도하고; 상기 정지 상태 동안 상기 생성물의 생산 속도는 상기 효소가 결여된 세포와 비교할 때, 환경 조건의 변화에 반응하여 적게 감소되는, 방법.
하나의 구체예에서, 상기 방법은 환경 조건을 변화시키는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 환경 조건은 배양 배지의 당 (sugar) 농도를 포함하고, 환경 조건의 변화는 상기 농도를 증가 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 당은 포도당이다. 일부 구체예에서, 상기 환경 조건은 배양 배지의 산소 농도를 포함하고, 환경 조건의 변화는 산소 농도를 증가 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 배양은 생물반응기에서 수행된다. 일부 구체예에서, 상기 배양 배지는 최소 500ml의 부피를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 배양 배지는 최소 1L의 부피를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 생성물은 3-하이드록시프로피온산을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 생성물은 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 아미노산을 알라닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌의 생산 속도는 최소 0.5 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌의 생산 속도는 최소 1.0 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌의 생산 속도는 최소 1.5 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌의 생산 속도는 최소 1.6 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 생산 폴리뉴클레오티드는 알라닌 추출효소를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌 추출효소는 alaE 이다.
일부 구체예에서, 상기 생성물은 메발론산 (mevalonic acid)을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 0.5 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 1.0 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 1.2 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 1.25 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 전사를 억제하기 위한 침묵 폴리뉴클레오티드 및 상기 효소의 세포 분해를 매개하기 위한 분해 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 침묵 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 프로모터 서열을 인식하는 gRNA 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 CRISPR 효소를 인코딩하고, 상기 CRISPR 효소는 gRNA에 결합될 때 상기 프로모터 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 CRISPR 효소는 촉매적으로 불활성이다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 분해 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 분해 폴리뉴클레오티드는 분해 태그를 인코딩하는 서열을 포함하며, 상기 분해 태그는 상기 효소의 분해를 매개한다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 세포에서 포스페이트 가용성에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 상기 생산 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 세포에서 포스페이트 가용성에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 E. coli 세포이다.
또 다른 관점에서, 알라닌 생산용 세포가 본원에서 개시되며, 상기 세포는 (i) 대사 경로의 효소의 발현의 조절된 감소를 위한 이종의 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 알라닌 추출효소를 포함하고, 여기서 상기 효소는 에노일-ACP/CoA 환원효소 (enoyl-ACP/CoA reductase), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase), 리포아미드 탈수소효소 (lipoamide dehydrogenase, lpd), 시트레이트 합성효소 (citrate synthase, gltA), 가용성 수소전이효소 (soluble transhydrogenase), 및 NADH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택되고, 상기 알라닌 추출효소는 야생형 세포에 비해 증가된 양으로 발현된다.
일부 구체예에서, 상기 알라닌 추출효소는 alaE 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 상기 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 세포의 정지 상태를 유도한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 상기 알라닌 생성을 위한 생산 효소의 발현의 조절된 증가를 위한 이종의 생산 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 생산 효소는 NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (NADPH-dependent alanine dehydrogenase) 및 NADPH- 의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADPH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 전사 억제를 매개하기 위한 침묵 뉴클레오티드 및 상기 효소의 세포 분해를 매개하기 위한 분해 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 침묵 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 프로모터 서열을 인식하는 gRNA 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 CRISPR 효소를 추가로 인코딩하고, 상기 CRISPR 효소는 gRNA에 결합될 때 상기 프로모터 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 CRISPR 효소는 촉매적으로 불활성이다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 분해 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 분해 폴리뉴클레오티드는 분해 태그를 인코딩하는 서열을 포함하며, 상기 분해 태그는 상기 효소의 분해를 매개한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 세포에서 포스페이트 가용성에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 상기 생산 폴리뉴클레오티는 상기 세포에서 포스페이트 가용성에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 E. coli 세포이다.
일부 구체예에서, 배양물은 상기 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 배양물에 의한 알라닌 생산 속도는 최소 0.5g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 배양물에 의한 알라닌 생산 속도는 최소 1.0g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 배양물에 의한 알라닌 생산 속도는 최소 1.5g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 배양물에 의한 알라닌 생산 속도는 최소 1.6g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 배양물은 최소 100 g/L의 알라닌을 생산한다. 일부 구체예에서, 상기 배양물은 최소 120 g/L의 알라닌을 생산한다. 일부 구체예에서, 상기 배양물은 최소 140 g/L의 알라닌을 생산한다.
일부 관점에서, (i) 대사 경로의 효소의 발현의 조절된 감소를 위한 이종의 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 알라닌 추출효소를 포함하는 세포를 배양 배지에서 성장시키는 단계를 포함하는 알라닌 생산 방법이 본원에 개시되며, 여기서 상기 효소는 에노일-ACP/CoA 환원효소 (enoyl-ACP/CoA reductase), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase), 리포아미드 탈수소효소 (lipoamide dehydrogenase), 시트레이트 합성효소 (citrate synthase), 가용성 수소전이효소 (soluble transhydrogenase), 및 NADH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택되고, 상기 알라닌 추출효소는 야생형 세포에 비해 증가된 양으로 발현된다.
일부 구체예에서, 상기 효소 발현의 조절된 감소는 상기 세포의 정지 상태를 유도한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 정지 상태 동안에 배양 배지의 당 농도 또는 산소화 정도를 감소시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 세포 생성물의 생산 속도는, 이종 폴리뉴클레오티드가 결여된 세포와 비교할 때, 해당 감소에 대한 반응에서 적게 감소된다. 일부 구체예에서, 상기 당은 포도당이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌 추출효소는 alaE 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 알라닌 생성을 위한 생산 효소의 발현에서 조절된 증가를 위한 이종의 생산 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 생산효소는, NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (NADPH-dependent alanine dehydrogenase), 및 NADPH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADPH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 전사 억제를 매개하기 위한 침묵 뉴클레오티드 및 상기 효소의 세포 분해를 매개하기 위한 분해 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 침묵 폴리뉴클레오티드는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 프로모터 서열을 인식하는 gRNA 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 CRISPR 효소를 인코딩하고, 상기 CRISPR 효소는 상기 gRNA에 결합될 때 프로모터 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 CRISPR 효소는 촉매적으로 불활성이다. 일부 구체예에서, 상기 이종의 폴리펩타이드는 분해 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 분해 폴리펩타이드는 분해 태그를 인코딩하는 서열을 포함하며, 상기 분해 태그는 상기 효소의 분해를 매개한다.
일부 구체예에서, 이종의 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 세포에서 포스페이트 가용성 (phosphate availability)에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 상기 생산 폴리뉴클레오티드는 상기 세포에서 포스페이트 가용성에 의해 조절된다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 E. coli 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌 생성 속도는 최소 0.5 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌 생성 속도는 최소 1.0 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌 생성 속도는 최소 1.5 g/L/hour 이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌 생성 속도는 최소 1.6 g/L/hour 이다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 실시예 및 첨부 도면을 설명하는 다음의 상세한 설명을 참조하여 달성될 것이다:
도 1A는 2-단계 발효 (2-stage fermentation)에서 동적 대사 조절의 개요를 도시한다.
도 1B는 균주 (strain) 및 생물공정 (bioprocess)의 최적화 (optimization)를 도시한다.
도 2A-D는 E. coli에서 2-단계 합성 대사 밸브 (Synthetic Metabolic Valves, SMVs)의 구현예를 도시한다.
도 3A-K는 E. coli에서 2-단계 동적 제어 (2-stage dynamic control)를 이용한 알라닌 생산의 예를 도시한다.
도 4A-F는 2-단계 및 성장 연관 접근법 (growth associated approaches) 사이의 예시적인 견고성 (robustness) 비교를 도시한다.
도 5A-J는 미세발효 및 1L 발효에서 "밸브" 및 성장 연관 알라닌 생산의 예시적인 비교를 도시한다.
도 6A-H는 E. coli 에서 2-단계 동적 제어를 이용한 메발로네이트 (mevalonate) 생산의 예를 도시한다.
도 7은 포스페이트 고갈 프로모터(phosphate depletion promoter) 특성의 예를 도시한다.
도 8은 절연된 포스페이트 고갈 프로모터 특성 (insulated phosphate depletion promoter characterization)의 예를 도시한다.
도 9는 절연된 구성 프로모터 특성 (insulated constitutive promoter characterization)의 예를 도시한다.
도 10은 2-단계 발효에서 최적의 3-HP 플럭스에 대한 대사 모델링 결과의 예를 도시한다.
도 11은 염색체 변형 (Chromosomal modification)의 예를 도시한다.
도 12는 1L FGM10 최소 배지 발효에서 출발 숙주 균주의 평균 최대 성장 속도의 예를 도시한다, n=2.
도 13A-E는 1L 표준 최소 배지 발효에서 출발 숙주 균주의 성장 상태 (growth phase) 동안 이용되는 포도당 분포의 예를 도시한다.
도 14는 pCASCADE-control 플라스미드 구축 방안을 도시한다.
도 15A-B는 pCASCADE 구축 방안을 도시한다.
도 16A-C는 미세발효 공정의 개요를 도시한다.
도 17은 DLF_0025 균주에서 상이한 절연된 포스페이트 프로모터를 사용한 L- 알라닌 생산을 위한 미세발효를 도시한다.
도 18은 gapN/gapA 균주에 의한 L-알라닌 생산을 위한 열 지도(Heatmap)를 도시한다.
도 19A-D는 견고성 (robustness)에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 20A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 21A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 22A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 23A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 24A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 25A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 26A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 27A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 28A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 29A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 30A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 31A-D는 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 32는 견고성에 대해 평가된 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산을 도시한다.
도 33A-B는 본원에서 평가된 모든 밸브 및 성장 연관 균주에 대한 1L 규모에서의 성장 프로파일을 도시한다.
도 34는 본원에서 평가된 메발로네이트 균주 1과 문헌으로부터 가장 높은 메발로네이트 역가를 갖는 균주에 대한 특이적 생산성 (specific Productivity, SP) 비교를 도시한다.
도 35는 MS 측정으로부터의 알라닌 표준 곡선을 도시한다. 삼중 표준 측정으로부터 질량 스펙 반응 (mass spec response )에 대한 평균 및 표준편차를 플로팅 하였다.
도 36A-B는 RI 측정으로부터의 포도당 및 에탄올 표준 곡선을 도시한다.
도 37은 TUV 측정으로부터의 3-하이드록시프로피온산 표준 곡선을 도시한다.
도 38A-D는 L-알라닌, D-알라닌, 메발론산 및 메발로노락톤(mevalonolactone)에 대한 TUV 표준 곡선을 도시한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각의 개별적인 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적인 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 본원에 포함된다.
정의 (Definitions)
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이 단수 형태의 "a", "an" 및 "the"는 명백히 다르게 지시되지 않는 한 복수의 대상(plural referents)을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "발현 벡터(expression vector)"에 대한 언급은 하나의 발현 벡터뿐만 아니라 동일하거나 (예를 들어, 동일한 오페론) 상이한 복수의 발현 벡터를 포함하고, "미생물(microorganism"에 대한 언급은 하나의 미생물뿐만 아니라 복수의 미생물을 포함하는 등과 같다.
본원에서 사용된 "감소된 효소 활성(reduced enzymatic activity)", "효소 활성 감소(reducing enzymatic activity)" 및 이와 유사한 표현은 미생물 세포의 또는 단리된 효소 (isolated enzyme)가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 천연형 효소 (its native enzyme)에서 측정된 것보다 낮은 수준의 활성을 나타내는 것을 의미한다. 즉, 해당 효소의 공지된 표준 조건 (known standard conditions ) 하에 지시된 기질의 지시된 생성물로의 효소적 전환은, 표준 특정 조건(standard specified condition) 하의 천연형 (비변형된) 효소에 의한 동일 생화학적 전환에 대한 효소 활성보다, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 또는 적어도 90 % 이상 적다(less). 이 용어는 또한 효소 활성의 제거를 포함할 수 있다. 감소된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 효소 활성 분석법(enzyme activity assays )은 효소 활성이 감소된 세포를 식별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., New York 2007을 참조할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이종의 DNA (heterologous DNA)", "이종 핵산 서열 (heterologous nucleic acid sequence)" 및 이와 유사한 표현은 다음 중 하나 이상에 해당하는 핵산 서열을 나타낸다: (a) 주어진 숙주 미생물 외부에 존재하는 (즉, 자연적으로 발견되지 않는) 핵산 서열; (b) 주어진 숙주 미생물에서 자연적으로 발견될 수 있으나, 부자연스러운 (예를 들어, 예상보다 많은) 양을 갖는 서열; 또는 (c) 자연적으로 상호 동일한 관계에서 발견되지 않는 두 개 이상의 서열을 포함하는 핵산 서열. 예를 들어, (c)와 관련하여, 재조합으로 생성된 이종 핵산 서열은 비천연 프로모터 구동 유전자 발현 (nonnative promoter driving gene expression) 과 같이, 새로운 기능적 핵산을 만들기 위해 정렬된 관련 없은 유전자들 (unrelated genes arranged)로부터 두 개 이상의 서열을 가질 것이다.
본원에 사용된 용어 "합성 대사 밸브(synthetic metabolic valve)" 및 이와 유사한 표현은 단백질 분해 (proteolysis), 유전자 침묵 (gene silencing) 또는 단백질 분해와 유전자 침묵의 조합을 조절 (control)하여 대사 플럭스 (metabolic fulx)를 변경 (alter)하는 것을 의미한다.
"이종 (heterologous)"이라는 용어는 당업계에서 일반적으로 사용되는 용어로 "외인성 (exogenous)"이라는 용어를 포함하는 것으로 의도된다. 이종 핵산 서열의 도입에 우선하는 숙주 미생물의 게놈과 관련하여, 상기 효소를 코딩하는 상기 핵산 서열은 이종이다 (이종 핵산 서열이 상기 게놈에 도입되는지 여부와 관계없이).
본원에서 사용된 용어 "유전자 파괴 (gene disruption)" 또는 이의 문법적으로 유사한 표현 (및 "효소 기능을 파괴하는 (to disrupt enzymatic function), "효소 기능의 파괴 (disruption of enzymatic function)" 등)은 그렇게 변형되지 않은 미생물 세포로부터 유래한 또는 미생물 내부의 폴리펩타이드 활성과 비교하여 감소된 폴리펩타이드 활성을 갖는 것과 같은 인코딩된 유전자 산물을 생성하는 미생물에 대한 유전자 변형을 의미한다. 유전자 변형은, 예를 들어, 전체 유전자의 결실, 전사 또는 번역에 필요한 조절 서열의 결실이나 다른 변형, 절단된 유전자 산물(예: 효소) 또는 인코딩된 유전자 산물의 활성을 감소 (활성이 검출 가능하지 않은 정도까지 감소시키는 것을 포함)시키는 다양한 돌연변이 전략 중 임의의 방법에 의한 유전자 일부의 결실일 수 있다. 파괴는 광범위하게 효소를 인코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함할 수 있고, 또한 다른 유형의 유전자 변형, 예를 들어 정지 코돈의 도입, 프레임 이동 (frame shift) 돌연변이, 유전자의 일부의 제거 또는 도입, 분해 신호의 도입, mRNA 전사 수준 및/또는 안정성에 영향을 주는 이들의 유전적 변형, 및 효소를 인코딩하는 유전자의 상부 프로모터 또는 억제자를 변경시키는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 바이오-생산 (bio-production) 또는 발효 (fermentation)는 호기성(aerobic), 미호기성(microaerobic) 또는 혐기성(anaerobic)일 수 있다.
유전자 산물, 예를 들어, 효소, 의 유전적 변형이 청구범위를 포함한 본원에서 언급될 때, 언급된 유전자 산물, 예를 들어, 효소, 를 정상적으로 인코딩하는 유전자의 핵산 서열 또는 상기 유전자를 포함하는 핵산 서열 중의 유전적 변형으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 용어 "대사 플럭스 (metabolic flux)" 및 이와 유사한 표현은 주어진 기질로부터 반응 속도, 반응 역가 및 반응 수율을 포함하는, 생성물 및/또는 부산물 형성에서의 변화를 초래하는 대사에서의 변화를 의미한다.
종(Species) 및 다른 계통발생학적(phylogenic) 확인은 미생물학 당업자에게 공지된 분류에 따른다.
효소는 당업자에게 잘 알려진 Universal Protein Resource (Uniprot) 식별번호에 따라 본원에 열거된다 (Uniprot은 UniProt Consortium에 의해 유지되고 이용 가능하다).
본원에 기술된 방법 및 단계가 특정 순서로 발생하는 특정 이벤트를 나타내는 경우, 당업자는 특정 단계의 순서가 변경될 수 있고, 그러한 변경이 본 발명의 변형 (variation)에 따른 것임을 인식할 것이다. 또한, 특정 단계는 순차적으로 수행될 수 있을 뿐 아니라, 가능한 경우 병렬 공정으로 동시에 수행될 수 있다.
약어의 의미는 다음과 같다: "C" 는 그 사용에서 명백한 바와 같이 섭씨 또는 섭씨온도를 의미하고, DCW는 건조 세포 중량을 의미하고, "s"는 초를, "min"는 분을, "h", "hr" 또는 "hrs"는 시간을 의미한다. "psi"는 평방 인치당 파운드를 의미하고, "nm"은 나노미터를 의미하고, "d"는 일을 의미한다. "μL" 또는 "uL" 또는 "ul" 는 마이크로 리터를 의미하고, "mL"는 밀리리터를 의미하며, "L"는 리터를 의미한다. "mm"는 밀리미터를 의미하며, "nm"는 나노미터를 의미한다. "mM" 은 밀리 몰농도을 의미하고 "μM" 또는 "uM"은 마이크로 몰농도를 의미하며, "M"은 몰 농도를 의미한다. "mmol"은 밀리몰을 의미하고 "μmol" 또는 "uMol"은 마이크로몰을 의미한다. "g"는 그램을 의미하고, "μg" 또는 "ug"는 마이크로 그램을 의미하며, "ng"은 나노그램을 의미한다. "PCR"은 중합 효소 연쇄 반응을 의미하고, "OD"는 광학밀도, "OD600"은 600nm의 광파장에서 측정된 광학밀도를 의미한다. "kDa"은 킬로달톤을 의미하고, "g"은 중력상수를 의미하며, "bp"는 염기쌍, "kbp"는 킬로 염기쌍을 의미한다. "% w/v"는 무게/부피 퍼센트, "% v/v"는 부피/부피 퍼센트를 의미한다. "IPTG"는 이소프로필-μ-D- 티오갈락토피라노시드를 의미한다. "aTc"는 무수테트라사이클린을 "RBS"는 리보좀 결합 부위를, "rpm"은 분당 회전수를 의미한다. "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피, "GC"는 가스 크로마토그래피를 의미한다.
개요 (Overview)
미생물 생산 균주의 신속한 최적화를 가능하게 하는 고-처리량 대사 공학 플랫폼(high-throughput metabolic engineering pla)이 본원에서 제공된다. 상기 플랫폼은, 현재 생체 내 (in vivo) 및 시험관 내 (in vitro) 바이오-생산 접근법 (bio-production approaches) 사이의 격차를 메우며, 활성 대사 네트워크의 동적 최소화에 의존한다. 동적 대사 네트워크 최소화는 필수적인 중심 대사에서 다수의 효소 활성을 감소시키는 단백질 분해의 조절 (controlled proteolysis) 및 CRISPR 간섭의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 표준화된 2-단계 바이오-공정의 맥락에서 최소화가 구현될 수 있다. 이러한 접근법은 복잡성이 크게 감소된 디자인 공간이 가능하게 하고, 환경 조건에 견고한 균주 뿐만 아니라 증가된 대사 플럭스와 생산 속도를 가능하게 한다. 고-처리량 소규모 스크린(high-throughput small-scale screens) 또는 "미세발효 (micro-fermentations)" 에서부터 완전히 기계화된 생물반응기 (fully instrumented bioreactors)까지 예측 가능한 확장성 (scalability)을 제공할 수 있다. 예측가능한 고-처리량 접근법(high-throughput approaches)은 합성 생물학의 비용 절감 및 처리량의 신속한 증가의 이점을 활용할 수 있는바, 대사 공학 프로그램에 중요할 수 있다. 본원에서 제공되는 실시예는 일반적인 산업 미생물인 E. coli에서의 이러한 접근법에 대한 원리에 대해 입증된 증거를 제공할 뿐만 아니라, 두 가지 중요한 산업적 화학 물질인 알라닌과 메발론산을 상업적으로 의미있는 속도, 역가 (147 g/L 및 97 g/L) 및 수율로 생산하는 E. coli 균주를 이용하여 신속한 최적화에 대한 이러한 접근법을 검증하였다.
본원은 또한, 고-처리량 방식 (high-throughput fashion)으로 화학 물질 생산 (chemical production)을 위해 미생물을 신속하게 최적화하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다.
본원은 또한, 개시된 플랫폼 및/또는 화학 물질 생산을 위한 방법과 함께 사용될 수 있는 미생물을 제공한다.
합성 대사 밸브 (Synthetic metabolic valves, SMVs )
본원은 조절된 유전자 침묵 (controlled gene silencing) 및 조절된 단백질 분해 (controlled proteolysis) 중 하나 이상의 조합을 포함하는 합성 대사 밸브 (SMVs)의 구축을 기술한다. 당업자는 유전자 침묵 및 조절된 단백질 분해의 몇 가지 방법론을 알고 있음을 이해하여야 한다.
SMV를 이용하는 플랫폼 미생물 균주의 개발은 생성물 형성으로부터 성장을 분리 (decouple)시킬 수 있다. 이들 균주는 변경되었을 때 미생물 성장에 부정적 영향을 가지는 것을 포함하여 대사 경로의 동적 조절을 가능하게 한다. 대사에 대한 동적 조절은 이에 한정되는 것은 아니나, 전사적 침묵 (transcriptional silencing) 또는 조절된 효소 단백질 분해 (controlled enzyme proteolysis)를 포함하는 방법론의 조합을 통해 달성된다. 이들 미생물 균주는 미생물이 성장하고 대사가 미생물 성장에 최적화되어 있는 첫 번째 단계 및 성장이 느려지거나 정지되고, 화학 물질 또는 연료와 같은 원하는 생성물의 생산을 강화하기 위한 대사로의 동적 변화가 만들어질 수 있는 하나 이상의 또 다른 단계의 적어도 두 단계를 포함하는 다단계 생물 공정에 이용된다. 배양물의 성장의 전이 (transition) 단계들 사이의 대사 플럭스의 조작은 인공 화학 유도제 (artificial chemical inducers) 또는 바람직하게는 주요 제한 양분 (level of key limiting nutrients)의 양 (level)을 조절함으로써 조절될 수 있다. 또한, 하나 이상의 화학 물질 또는 연료 생성물의 생합성을 위한 대사 경로를 제공하도록 유전적 변형 (genetic modification)이 이루어질 수 있다. 또한, 이에 한정되지는 않으나, 포도당, 수크로스, 자일로스, 아라비노스, 만노스, 락토오스와 같은 당, 오일, 이산화탄소, 일산화탄소, 메탄, 메탄올 및 포름알데히드를 포함하는 다양한 탄소 공급원료를 이용하도록 유전자 변형이 이루어질 수 있다.
이 접근법은 생산 상태 동안 대사 플럭스 및 생리학적 요구의 보다 간단한 모델을 허용하여, 성장하는 세포를 정지 상태의 바이오촉매로 전환시킨다. 이들 합성 대사 밸브는 필수 유전자들을 끄고, 다단계 발효 공정에서 생성물 형성으로의 탄소, 전자 및 에너지 플럭스를 전용한다 (redirect). 다음 중 하나 이상이 이들 합성 밸브를 가능하게 한다: 1) 전사 유전자 침묵 (transcriptional gene silencing) 또는 억제 (repression) 기술과 조합하여, 2) 유도성 효소 분해 (inducible enzyme degradation) 및 3) 정지 또는 비-분열 세포 상태 (stationary or non-dividing cellular state)를 유도하기 위한 양분 제한 (nutrient limitaion). SMV는 모든 경로 및 미생물 숙주에 일반화될 수 있다. 이들 합성 대사 밸브는 전체 세포 촉매를 통하여 생산할 수 있는 재생 가능한 화학 물질 및 연료 및 모든 생성물을 위한 유용한 신규하고 신속한 대사 공학 전략을 허용한다.
다양한 경우에서, 하나의 SMV는 하나의 유전자 (또는 이의 단백질 생산)의 조작 (manipulation)을 지칭할 수 있다. 상기 조작은 상기 유전자의 조절된 침묵 및/또는 이의 단백질 산물의 조절된 분해일 수 있다. 어떤 경우에서, SMVs의 조합은 수율, 속도 및/또는 견고성에서 개선된 생산으로 이어질 수 있고, 이는 두 개의 유전자 (또는 이들의 단백질 산물)의 조작을 포함한다. 일부 경우에서, 조작된 미생물은 하나 이상의 SMV를 포함한다. 일부 경우에서, 조작된 미생물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 SMVs를 포함한다.
바이오-생산을 위한 방법 및 시스템(Method and Systems for Bio-production)
생물제제 및 소분자 요법으로부터 특수, 대량 및 상용 화학 물질, 및 바이오 연료에 이르기까지 분자의 견고한 대규모 생산을 위한 방법과 시스템이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 방법과 시스템은 제한된 세트의 대사 효소를 포함하는 조작된 미생물 (engineered microorganism)을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 조작된 미생물은 감소된 양(level) 또는 활성을 갖는 적어도 하나의 대사 효소를 포함하다. 일부 구체예에서, 상기 조작된 미생물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 감소된 양 또는 활성을 갖는 효소를 포함한다. 본원에서 제공되는 방법과 시스템은 환경 조건에 대한 대사 반응을 감소시킬 수 있고, 소규모 (예를 들어, mgs) 생산에서 대규모 (예를 들어, kgs) 생산으로 용이하게 전환될 수 있다 (transfer). 본원에서 제공되는 방법과 시스템은 소규모 (예를 들어, mgs)에서 대규모 (예를 들어, kgs) 생산으로 전환하는 것과 관련된 시간 및 비용을 줄일 수 있다.
본 개시의 범위 내에는 유전자 변형 미생물이 있으며, 상기 미생물은 0.05 g/gDCW-hr 초과, 0.08g/gDCW-hr 초과, 0.lg/gDCW-hr 초과, 0.13g/gDCW-hr 초과, 0.15g/gDCW-hr 초과, 0.175g/gDCW-hr 초과, 0.2g/gDCW-hr 초과, 0.25g/gDCW-hr 초과, 0.3g/gDCW-hr 초과, 0.35g/gDCW-hr 초과, 0.4g/gDCW-hr 초과, 0.45g/gDCW-hr 초과, 또는 0.5g/gDCW-hr 초과의 속도로부터 선택되는 특정 속도로, 이에 한정되지는 않으나, 말로닐-CoA (malonyl-CoA), 피루베이트 (pyruvate), 옥살로아세테이트 (oxaloacetate), 에르티로스-4-포스페이트 (erthyrose-4-phosphate), 자일룰로스-5-포스페이트 (xylulose-5-phosphate), 알파-케토글루타레이트 (alpha-ketoglutarate) 및 시트레이트 (citrate)를 포함하는 임의의 주요 대사 중간체로부터 유래하는 생성물을 생산할 수 있다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 유전자 변형 미생물 (genetically modified microoragnism) 및 수성 배지 (aqueous medium)에서 탄소원을 포함하는 배양 시스템을 포함하며, 상기 유전자 변형 유기체는, 수성 배지의 부피가 예를 들어, 5 mL 초과, 100 mL 초과, 0.5 L 초과, 1L 초과, 2 L 초과, 10 L 초과, 250 L 초과, 1000L 초과, 10,000L 초과, 50,000 L 초과, 100,000 L 또는 200,000 L 초과하는 것에서 선택될 때, 및 수성 배지의 부피가 예를 들어 250L를 초과하고 스틸 용기(steel vessel)에 포함될 때, 예를 들어 0.05 gDCW/L 초과, 0.1 gDCW/L 초과, 1 gDCW/L 초과, 5 gDCW/L 초과, 10 gDCW/L 초과, 15 gDCW/L 초과, 또는 20 gDCW/L 초과로부터 선택되는 양으로 존재한다.
탄소원 (Carbon Source)
재조합 미생물과 함께 본원에서 사용되는 바이오-생산 배지는 성장 및 생산 단계 모두를 위해 적당한 탄소원 또는 기질을 포함하여야 한다. 적당한 기질은 이에 한정되지는 않으나, 포도당, 수크로스, 자일로스, 만노오스, 아라비노스, 오일, 이산화탄소, 일산화탄소, 메탄, 메탄올, 포름알데히드 및 글리세롤을 포함할 수 있다. 상기한 모든 탄소 기질 및 혼합물이 본 발명에서 탄소원으로 적합한 것으로 고려된다.
미생물(Microorganisms)
본원에 기술되고 청구된 특징은 본원의 기재로부터 선택되는 미생물, 또는 다른 적합한 미생물로부터 제공될 수 있으며, 이는 하나 이상의 자연적 (natural), 도입된 (introduced) 또는 강화된 (enhanced) 생성물 바이오-생산 경로를 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 미생물은 내인성 (endogenous) 생성물 생산 경로 (일부 구체예에서, 이는 강화될 수 있음)를 포함하는 반면, 다른 구체예에서는 내인성 생성물 생산 경로를 포함하지 않는다.
실시예는 특정 박테리아 및 진균 미생물에 대한 특정 변형 및 평가를 기술한다. 본 발명의 범위는 이들 종에 한정되는 것이 아니라, 일반적으로 광범위한 적합한 미생물에도 적용 가능한 것을 의도한다.
바이오-생산에 적합한 숙주 세포 또는 숙주 미생물은 원핵 또는 진핵일 수 있다. 적당한 숙주 세포 또는 숙주 미생물은 시트로박터 (Citrobacter), 엔테로박터 (Enterobacter), 클로스트리디움 (Clostridium), 클레브시엘라 (Klebsiella), 에어로박터 (Aerobacter), 락토바실러스 (Lactobacillus), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 자이코사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 피치아 (Pichia), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 뮤코 (Mucor), 토루롭시스 (Torulopsis), 메틸로박터 (Methylobacter), 에스케리치아 (Escherichia), 살모넬라 (Salmonella), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 및 슈도모나스 (Pseudomonas)와 같은 박테리아일 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포 (host cell) 또는 조작된 세포 (engineered cell) 는 E. coli 이다. 일부 구체예에서, 숙주 세포 또는 조작된 세포는 S. cerevisiae 이다.
어떤 관점에서, 생성물의 생합성을 위한 적어도 하나의 효소를 포함하는 생산 경로; 및 다수의 (multiple) 대사 경로를 통한 플럭스를 조절 가능하도록 감소 또는 제거하기 위한 다수의 (multiple) 합성 대사 밸브의 조합;을 포함하는 유전적으로 변형된 미생물이 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 각각의 다수의 합성 대사 밸브는, (i) 적어도 하나의 유전자에서 유전자 발현의 조절된 침묵 또는 (ii) 적어도 하나의 단백질에서 조절된 단백질 분해성 불활성화 (controlled proteolytic inactivation)를 위한, 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 생성물의 생합성 속도는 양분의 고갈에 따른 생산성 정지 상태 (productive stationary phase)에서 증가되며, 여기서 상기 양분의 고갈은 다중 합성 대사 밸브를 유도한다. 일부 경우에서, 상기 유전자 발현의 조절된 침묵은 RNA 간섭, CRISPR 간섭 또는 전사 억제에 의해 달성된다. 일부 경우에서, 상기 조절된 단백질 분해성 불활성화는 특정 펩타이드 태그 (specific peptide tag)에 의한 표적화된 분해 (targeted degradation) 또는 특이적 프로테아제에 의한 단백질 절단 (protein cleavage by a specific protease)에 의해 달성된다. 일부 경우에서, 상기 양분은 포스페이트 (phosphate), 질소 (nitrogen), 황 (sulfur), 마그네슘 (magnesium) 또는 이들의 조합이다.
어떤 관점에서, 피루베이트 (pyruvate), 아세토락테이트 (acetolactate), 아세틸-CoA (acetyl-CoA), 아세토아세틸-CoA (acetoacetyl-CoA) 또는 말로닐-CoA (malonyl-CoA)로부터 선택되는 어느 하나의 대사체 (metabolite)로부터의 생합성을 위한 적어도 하나의 효소를 포함하는 생산 경로 (production pathway); 및 다중 합성 대사 밸브의 조합 (a combination of multiple synthetic metabolic valve)을 포함하는 유전적으로 변형된 미생물을 본원에서 제공하며, 여기서 각각의 다중 합성 대사 밸브는, i) fabl, gltA, lpd, zwf 또는 udhA 유전자 중 어느 하나에 상응하는 유전자 발현의 조절된 침묵 또는 (ii) fabl, gltA, lpd, zwf 또는 udhA 유전자 중 상응하는 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질의 조절된 단백질 분해성 불활성화를 위하여, fabl, gltA, lpd, zwf 또는 udhA 유전자 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구체예에서, 생성물의 생합성 속도는 양분의 고갈에 따른 생산적인 정지 상태 (productive stationary phase)에서 증가되며, 상기 양분의 고갈은 다중 합성 대사 밸브를 유도한다. 일부 구체예에서, 상기 생성물은 알라닌 (alanine) 또는 이의 유도체이다. 일부 구체예에서, 상기 생성물은 메발로네이트 (mevalonate) 또는 이의 유도체이다. 일부 구체예에서, 상기 생성물은 말론산 (malonic acid) 또는 이의 유도체이다. 일부 구체예에서, 상기 양분은 포스페이트, 질소, 황, 마그네슘 또는 이들의 조합이다.
어떤 관점에서, 피루베이트로부터 알라닌을 생산하기 위한 생산 경로; 및 다중 합성 대사 밸브의 조합;을 포함하는 유전적으로 변형된 미생물이 본원에서 제공되며, 여기서 각각의 다중 합성 대사 밸브는, (i) fabl, gltA, lpd, zwf 또는 udhA 유전자 중 어느 하나에 상응하는 유전자 발현의 조절된 침묵 또는 (ii) fabl, gltA, lpd, zwf 또는 udhA 유전자 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질의 조절된 단백질 분해성 불활성화를 위하여, fabl, gltA, lpd, zwf 또는 udhA 유전자 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구체예에서, 알라닌의 생합성 속도는 양분의 고갈에 따른 생산성 정지 상태 (productive stationary phase )에서 증가되며, 상기 양분의 고갈은 다중 합성 대사 밸브를 유도한다. 일부 구체예에서, 상기 양분은 포스페이트, 질소, 황, 마그네슘 또는 이들의 조합이다.
일부 경우에서, 유전적으로 변형된 미생물은 이종의 세포 (heterologous cell)이다. 일부 경우에서, 생성물을 생성하기 위한 이종의 세포가 본원에서 제공된다. 일부 경우에서, 이종의 세포는 대사 경로에서 작용하는 밸브 효소의 발현의 조절된 감소를 매개하기 위한 조작된 밸브 폴리뉴클레오티드 (engineered valve polynucleotide)를 포함한다. 어떤 경우에서, 밸브 효소의 발현의 조절된 감소는 대사 경로를 통한 플럭스를 감소시키고, 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 이종의 세포의 정지 상태를 유도한다. 일부 경우에서, 이종의 세포는 생성물의 생성을 위한 생산 효소의 발현의 조절된 증가를 매개하기 위한 조작된 생산 폴리뉴클레오티드 (engineered production polynucleotide)를 추가로 포함한다. 일부 상환에서, 이종의 세포는 대사 경로에 작용하는 밸브 효소의 발현의 조절된 감소를 매개하기 위한 조작된 밸브 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 정지 상태 동안 생성물의 생산 속도는, 밸브 효소의 발현의 조절된 감소가 결여되어 있는 세포와 비교할 때, 환경 조건의 변화에 반응하여 적게 감소한다.
일부 경우에서, 생성물을 생성하기 위한 이종의 세포가 본원에서 제공되며, 상기 세포는 대사 경로에 작용하는 밸브 효소의 발현의 조절된 감소를 매개하기 위한 조작된 밸브 폴리뉴클레오티드 및 상기 생성물의 생성을 위한 생산 효소의 발현의 조절된 증가를 매개하기 위한 조작된 생산 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 대사 경로를 통한 플럭스를 감소시키고, 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 세포의 정지 상태를 유도하며, 상기 정지 상태 동안 상기 생성물의 생산 속도는 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소가 결여되어 있는 세포와 비교할 때 환경 조건의 변화에 반응하여 적게 감소된다.
일부 경우에서, 밸브 효소의 활성 또는 감소된 발현을 포함하는 세포가 본원에서 제공되며, 상기 밸브 효소는 에노일-ACP/CoA 환원효소 (enoyl-ACP/CoA reductase, fabI), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase, zwf), 리포아미드 탈수소효소 (lipoamide dehydrogenase, lpd), 시트레이트 합성효소 (citrate synthase, gltA), 가용성 수소전이효소 (soluble transhydrogenase, udhA), NADH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapA), 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 효소를 포함한다.
일부 경우에서, 생산 효소를 포함하는 세포가 본원에서 제공되며, 상기 생산 효소는 NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (NADPH-dependent alanine dehydrogenase, ald), 알라닌 추출효소 (alanine exporter, alaE), NADPH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADPH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapN) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 효소를 포함한다.
환경 조건 (Environmental Conditions)
환경 조건은 배지 및 배양 조건을 포함할 수 있다. 생산에 영향을 주는 환경 요인은 온도, pH, 산도 (acidity), 에탄올, 아황산염 (sulfite), 양분의 가용성(availability of nutrients) 일 수 있다.
본원에 개시된 유형 중 어느 하나로부터 선택된 것과 같은 적절한 탄소원에 추가하여, 바이오-생산 배지는 본원의 개시 하에 화학 물질 생성물 바이오-생산에 필요한 효소적 경로의 촉진 및 배양물의 성장에 적합한, 당업자에게 알려진 적절한 미네랄, 염, 보조인자, 완충액 및 다른 구성성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 관점은 본 발명의 유전자 변형 미생물 및 선택적으로 보충물을 포함하는 배지 (media) 및 배양 조건 (culture condition)에 관한 것이다.
전형적으로 세포는 적절한 배지에서 약 25℃ 내지 약 40℃ 범위의 온도에서 성장하고, 호열성 미생물 (thermophilic microorganism) 의 경우 70℃까지에서 성장한다. 적절한 성장 배지는 당업계에 잘 특성화되고 공지되어 있다.
바이오-생산을 위한 적절한 pH 범위는 pH 2.0 내지 pH 10.0이고, 초기 조건에서 전형적인 pH 범위는 pH 6.0 내지 pH 8.0이다. 그러나 특정 구체예를 위한 실제 배양 조건은 이들 pH 범위에 한정되는 것은 아니다.
바이오-생산은 교반과 함께 또는 교반 없이 호기성, 미세호기성 또는 혐기성 조건에서 수행될 수 있다.
일부 경우에서, 환경 조건의 변화는 세포와 접촉하는 배양 배지의 당 농도의 변화를 포함한다. 일부 경우에서, 배양 배지의 당 농도의 변화는 당 농도의 증가이다. 일부 경우에서, 당 농도의 변화는 당 농도의 감소이다. 일부 상황에서, 당 농도의 증가는 배양 배지에서 원래 당 농도와 비교하여 1%에서 2%, 2%에서 3%, 3%에서 4%, 4%에서 5%, 5%에서 10%, 10%에서 15%, 15%에서 20%, 20%에서 30%, 30%에서 40%, 40%에서 50%, 50%에서 60%, 60%에서 70%, 70%에서 80%, 80%에서 90%, 또는 90%에서 100%로 더 많은 당이다. 일부 상황에서, 당 농도의 감소는 배양 배지에서 원래 당 농도와 비교하여 1%에서 2%, 2%에서 3%, 3%에서 4%, 4%에서 5%, 5%에서 10%, 10%에서 15%, 15%에서 20%, 20%에서 30%, 30%에서 40%, 40%에서 50%, 50%에서 60%, 60%에서 70%, 70%에서 80%, 80%에서 90%, 또는 90%에서 100%로 더 적은 당이다.
일부 경우에서, 환경 조건의 변화는 세포와 접촉하는 배양 배지의 산소화 (oxygenation)의 변화를 포함한다. 일부 경우에서, 배양 배지의 산소화의 변화는 산호화의 증가이다. 일부 경우에서, 배양 배지의 산소화의 변화는 산소화의 감소이다. 일부 상황에서, 산소화의 증가는 배양 배지에 첨가된 원래 산소 양보다 1%에서 2%, 2%에서 3%, 3%에서 4%, 4%에서 5%, 5%에서 10%, 10%에서 15%, 15%에서 20%, 20%에서 30%, 30%에서 40%, 40%에서 50%, 50%에서 60%, 60%에서 70%, 70%에서 80%, 80%에서 90%, 또는 90%에서 100% 산소를 더(more) 추가하는 것이다. 일부 상황에서, 산소화의 감소는 배양 배지에 첨가된 원래 산소의 양보다 1%에서 2%, 2%에서 3%, 3%에서 4%, 4%에서 5%, 5%에서 10%, 10%에서 15%, 15%에서 20%, 20%에서 30%, 30%에서 40%, 40%에서 50%, 50%에서 60%, 60%에서 70%, 70%에서 80%, 80%에서 90%, 또는 90%에서 100% 산소를 덜(less) 추가하는 것이다.
바이오-생산 반응기 및 시스템 (Bio-production Reactors and Systems)
본 발명에 따른 방법 및/또는 조성물을 이용하는 발효 시스템도 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
본원에 기술 및/또는 참조되는 임의의 재조합 미생물은 산업용 바이오-생산 시스템에 도입될 수 있으며, 상기 미생물은 상업적으로 실행 가능한 작업에서 탄소원을 생성물로 전환한다. 상기 바이오-생산 시스템은 재조합 미생물을 성장시키고, 기질 분자의 일부를 선택된 화학 물질 생성물 (chemical product)로 적절히 전환시키는데 적절한 시간 동안 적절한 온도 범위 (및 만약 반응이 호기성 또는 미세호기성인 경우 용존 산소 농도 범위)에서 생물 공정기를 유지하기 위하여, 적합한 바이오-생산 배지와 탄소원 기질을 포함하는, 생물반응기 용기 내로 재조합 미생물을 도입하는 것을 포함한다. 바이오-생산은 교반 또는 교반 없이 호기성, 미세호기성, 또는 혐기성 조건에서 수행될 수 있다. 산업적 바이오-생산 시스템 및 그 작동은 화학 공학 및 생물 공정 공학 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 바이오-생산 배지에서 생산되는 생성물의 양은 일반적으로 당업계에 알려진 수많은 방법에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어, 예를 들어 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 가스 크로마토 그래피 (GC) 또는 GC/질량 분광법 (MS)을 사용하여 결정될 수 있다.
유전적 변형, 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 (Genetic Modifications, Nucleotide Sequences, and Amino Acid Sequences)
본 개시 내용의 구체예들은 숙주 미생물 내로 발현 벡터의 도입의 결과일 수 있으며, 상기 발현 벡터는 숙주 미생물에서 정상적으로 발견되거나 또는 발견되지 않는 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
숙주 세포를 유전적으로 변형시키는 능력은 임의의 유전적으로 변형된 (재조합) 미생물의 생산에 필수적이다. 유전자 전달 기술의 방법은 전기천공법, 컨쥬게이션, 형질도입 또는 자연 형질전환 (natural transformation)에 의할 수 있다. 광범위한 숙주 컨쥬게이션하는 플라스미드 (host conjugative plamids) 및 약물 내성 마커를 이용할 수 있다. 클로닝 벡터는 상기 숙주에서 기능할 수 있는 항생제 내성 마커의 성질에 기초하여 숙주 유기체에 맞게 재단된다. 또한, 본원에서 개시된 바와 같이, 유전적으로 변형된 (재조합) 미생물은 그 게놈 DNA의 변형을 포함하여, 플라스미드 도입을 통한 방법 이외의 변형을 포함할 수 있다.
보다 일반적으로, 핵산 구조체는 조절 서열과 호환되는 조건 하에, E. coli와 같은 미생물에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 (몇 개의) 조절 서열 (control sequence)과 작동가능하게 연결된 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하여 제조될 수 있다. 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩타이드의 발현을 제공하기 위해 조작될 수 있다. 벡터 내로 삽입에 선행하여 폴리뉴클레오티드 서열을 조작하는 것은 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필수적일 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하는 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 기술은 당업계에 잘 확립되어 있다.
상기 조절 서열은 본원의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 숙주 세포에 의해 인식되는 핵산 서열인 적절한 프로모터 서열일 수 있다. 상기 프로모터 서열은 상기 폴리펩타이드의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로모터 서열은 돌연변이, 절단 (truncated) 및 하이브리드 프로모터를 포함하는 선택된 숙주 세포의 전사 활성을 보여주는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 숙주 세포에 동종 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자로부터 얻어질 수 있다. 재조합 DNA 프로모터 서열을 변형하고 이용하는 기술은 당업계에 잘 확립되어 있다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 유전자 조작 (genetic manipulations)은 각각의 경로 중 어느 하나에서 확인된 효소 활성이나 효소의 조절 (regulation)을 통한 궁극적인 효소 활성을 변화시키는 것을 포함하는 다양한 유전자 조작을 포함하는 것으로 설명될 수 있다. 이러한 유전적 변형은 전사 (transcription), 번역 (translation), 번역 후 변형 (post-translational modification)에 관한 것일 수 있고, 이는 생성물을 생산하는데 관계되는 효소의 돌연변이 및/또는 카피수의 증가와 같은 핵산 서열의 제공 및/또는 선택 및/또는 식별된 배양 조건 하에서 효소 활성 및/또는 선택성의 변화를 초래한다. 이러한 유전적 변형을 달성하기 위한 특정 방법론 및 접근법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
다양한 구체예에서, 보다 효율적으로 기능하기 위해, 미생물은 하나 이상의 유전자 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, E. coli 에서 락테이트 탈수소효소 (lactate dehydrogenase, IdhA), 포스페이트 아세틸전이효소 (phosphate acetyltransferase, pta), 피루베이트 산화효소 (pyruvate oxidase, poxB), 피루베이트포메이트 분해효소 (pyruvateformate lyase, pflB), 메틸글리옥살 합성효소 (methylglyoxal synthase, mgsA), 아세테이트 키나아제 (acetate kinase, adckA), 알코올 탈수소효소 (alcohol dehydrogenase, adhE), clpXP 프로테아제 특이성 강화 인자 (clpXP protease specificity enhancing factor, sspB), ATP-의존성 Lon 프로테아제 (ATP dependent Lon protease, Ion), 외부막 프로테아제 (outer membrane protease, ompT), arcA 전사 이중 조절자 (arcA transcriptional dual regulator, arcA), 및 iclR 전사 조절자 (iclR transcriptional regulator, iclR)를 인코딩하는 유전자들의 결실 (deleted)을 포함하여 손상 (disrupted)될 수 있다. 결실을 포함하는 이러한 유전자 손상은 한정적인 것으로 의도되지 않으며, 다양한 구체예에서 다양한 조합으로 구현될 수 있다. 유전자 결실은 외래 DNA를 숙주 염색체로 병합시키는 방법과 같이 당업계에 알려진 수많은 전략에 의해 달성될 수 있다.
다양한 구체예에서, 보다 효율적으로 기능하기 위해, 미생물은 조절된 단백질 분해, 발현 침묵 또는 조절된 단백질 분해 및 발현 침묵 모두의 조합으로 표적화된 효소로 구성되는, 하나 이상의 합성 대사 밸브를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 미생물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 합성 대사 밸브를 포함할 수 있다. 예를 들어, E. coli 에서 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 하나의 효소 또는 수많은 유전자에 의해 인코딩되는 수많은 효소의 조합은 대사를 변경하고 생성물 형성을 개선하기 위한 합성 대사 밸브로 설계될 수 있다. E. coli 에서 대표적인 유전자는 fabl, zwf, gltA, ppc, udhA, Ipd, sucD, aceA, pfkA, Ion, rpoS, tktA 또는 tktB를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 추가적인 미생물 종에서 이들 유전자 및/또는 다른 유전자의 상동체 (homologues)를 확인하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있음을 이해하여야 한다.
본원에서 제공되는 모든 핵산과 아미노산 서열에 대해, 이들 서열의 보존적으로 변형된 변이가 포함되고, 다양한 구체예로서 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해되어야 한다. 보존적으로 변현된 변이뿐만 아니라 보다 광범위하게 변이된 서열을 있는, 기능적으로 동등한 핵산 및 아미노산 서열 (기능적 변이)과 이를 포함하는 미생물은, 상기 서열 및/또는 미생물을 포함하는 방법 및 시스템과 함께, 당업자의 기술 범위 내에 있으며, 이들은 또한 본 발명의 다양한 구체예의 범위 내에 있다.
따라서, 상기 다양한 섹션에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 일부 조성물, 방법 및 시스템은 플럭스를 재분배 (redistribute)하기 위한 합성 대사 밸브와 조합하여 중심 중간대사체 (critical intermediate)로부터 원하는 생성물을 제조하기 위한 생산 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물을 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 관점들은 또한 선택된 생성물로 선택된 탄소원을 전환하는데 있어 미생물의 전체적 효과를 향상시키기 위한 다중 유전자 변형을 제공하는 것에 관한 것이다. 실시예에서와 같이, 특정 조합은 보다 기본적인 유전자 변형 조합에서 나아가 실질적으로 특이적 생산성 (specific productivity), 대량 생산성 (volumetric productivity), 역가 (titer) 및 수율 (yield )의 증가를 보여준다. 앞서 기술한 유전자 변형 이외에도 다양한 구체예에서, 생성물의 생산에 소비되는 보조인자 NADPH 및/또는 NADH의 풀 (pool)과 가용성 (availability)을 증가시키기 위한, 합성 대사 밸브를 포함하는 유전자 변형이 제공된다.
보다 일반적으로, 아세테이트 (acetate), 아세토인 (acetoin), 아세톤 (acetone), 아크릴 (acrylic), 말레이트 (malate), 지방산 에틸 에스테르 (fatty acid ethyl esters), 이소프레노이드 (isoprenoids), 글리세롤 (glycerol), 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol), 에틸렌 (ethylene), 프로필렌 (propylene), 부틸렌 (butylene), 이소부틸렌 (isobutylene), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 비닐 아세테이트 (vinyl acetate), 기타 아세테이트 (other acetates), 1,4-부탄디올 (1,4-butanediol), 2,3-부탄디올 (2,3-butanediol), 부탄올 (butanol), 이소부탄올 (isobutanol), sec-부탄올 (sec-butanol), 부티레이트 (butyrate), 이소부티레이트 (isobutyrate), 2-OH-이소부티레이트 (2-OH-isobutryate), 3-OH-부티레이트 (3-OH -butyrate), 에탄올 (ethanol), 이소프로판올 (isopropanol), D-락테이트 (D-lactate), L-락테이트 (L-lactate), 피루베이트 (pyruvate), 이타코네이트 (itaconate), 레불리네이트 (levulinate), 글루카레이트 (glucarate), 글루타레이트 (glutarate), 카프로락탐 (caprolactam), 아디프산 (adipic acid), 프로판올 (propanol), 이소프로판올 (isopropanol), 퓨젤 알코올 (fusel alcohols), 및 1,2-프로판디올 (1,2-propanediol), 1,3-프로판디올 (1,3-propanediol), 포르메이트 (formate), 퓨마르산 (fumaric acid), 프로피온산 (propionic acid), 숙신산 (succinic acid), 발레르산 (valeric acid), 말레산 (maleic acid) 및 폴리-하이드록시부티레이트 (poly-hydroxybutyrate)로 구성된 군에서 선택되는 원하는 발효 산물 이외의 발효 산물의 세포 생산을 감소시키기 위해, 유전자 변형을 위해 선택된 미생물의 특정 대사 경로에 따라, 유전자 변형의 임의의 서브그룹이 만들어질 수 있다. 유전자 결실은 본원에 일반적으로 개시된 바와 같이 만들어질 수 있고, 원하는 산물 이외의 선택된 발효 산물의 세포 생산을 원하는 바에 따라 감소시키기 위하여 다른 접근법이 또한 사용될 수 있다. VI.A 유전자 침묵
특히, 본 발명은 조절된 다단계 발효 공정에서 대사 플럭스에 대한 조절을 가능하게 하는 조절된 유전자 침묵의 사용을 기술한다. 조절된 유전자 침묵에 대해, 이에 한정되는 것은 아니나. mRNA 침묵 (mRNA silencing) 또는 RNA 간섭 (RNA interference), 전사 억제자 및 CRISPR 간섭을 통한 침묵 (silencing via transcriptional repressors and CRISPR interference) 을 포함하여, 당업계에 공지된 몇 가지 방법이 있다.
일부 경우에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 상기 밸브 효소를 인코딩하는 유전자의 전사를 억제하기 위한 침묵 뉴클레오티드; 상기 밸브 효소의 세포 분해를 매개하기 위한 분해 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 경우에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 침묵 폴리뉴클레오티드는 상기 밸브 효소를 인코딩하는 유전자의 프로모터를 인식하는 gRNA 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다.
일부 경우에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 CRISPR 효소를 추가로 인코딩하고, 상기 CRISPR 효소는 상기 gRNA에 결합될 때 상기 프로모터 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에서, CRISPR 효소는 촉매적으로 불활성이다.
일부 경우에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 분해 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 분해 폴리뉴클레오티드는 분해 태그를 인코딩하는 서열을 포함하며, 상기 분해 태그는 상기 밸브 효소의 분해를 매개한다. 일부 경우에서, 밸브 폴리뉴클레오티드의 발현은 세포에서 포스페이트 가용성에 의해 조절된다. 일부 경우에서, 상기 세포는 E. coli 세포이다.
조절된 단백질 분해 (Controlled Proteolysis)
특히, 본 발명은 조절된 다단계 발효 공정에서 대사 플럭스에 대한 조절을 가능하게 하는 조절된 단백질 분해 (controlled protein degradation or proteolysis)의 사용을 기술한다. 조절된 단백질 분해와 관련하여, 이에 한정되는 것은 아니나, 특정 프로테아제에 의한 표적화 된 단백질 절단 (targeted protein cleavage) 및 특정 펩타이드 태그 (specific peptide tags)에 의한 분해를 위한 단백질의 조절된 표적화를 포함하여, 당업계에서 알려진 몇 가지 방법이 있다. 조절된 단백질 분해를 위하여 E. coli clpXP 프로테아제 사용을 위한 시스템이 사용될 수 있다. 이 방법론은 DAS4 (또는 DAS + 4) 태그와 같은 특정 C- 말단 펩타이드 태그를 추가하는 것에 의존한다. 이 태그를 갖는 단백질은 특이성을 향상시키는 샤페론 sspB가 발현될 때까지 clpXP 프로테아제에 의해 분해되지 않는다. sspB는 clpXP 프로테아제에 의한 DAS4 태그 단백질의 분해를 유도한다. 추가로 다수의 부위 특이적 프로테아제 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다. 단백질은 주어진 프로테아제 특이적 표적 부위를 함유하도록 조작된 후 프로테아제의 조절된 발현에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 단백질 불활성화 또는 분해로 이어지는 것을 기대할 수 있다. 예를 들어, clpS 의존성 clpAP 분해를 가능하게 하기 위해 N-말단 서열을 관심의 단백질에 첨가할 수 있다. 또한, 이 서열은 추가적인 N- 말단 서열에 의해 추가로 가려질 (masking) 수 있으며, 이는 ULP 가수 분해 효소에 의해 조절되면서 절단될 수 있다. 이것은 가수분해효소 발현에 의존하여 조절된 N-룰 분해 (controlled N-rule degradation)를 허용한다. 따라서, N- 말단 또는 C- 말단에서 조절된 단백질 분해를 위해 단백질을 태그하는 것이 가능하다.
N-말단 대 C-말단 태그 중 어느 것을 사용할 것인지에 대한 선호 (preference)는 어느 하나의 태그가 분해의 조절된 개시에 앞서 단백질 기능에 영향을 미치는지에 따라 크게 좌우될 것이다. 본 발명은 E. coli 에서 제어된 다단계 발효 공정에서 대사 플럭스에 대한 제어를 가능하게 하는 제어된 단백질 분해의 사용을 기술한다. 넓은 범위의 그람 양성균 뿐만 아니라 그람 음성균, 효모 (yeast) 및 고세균 (archaea)을 포함하는, 다른 미생물 숙주에서 조절된 단백질 분해를 위한 당업계에 공지된 몇 가지 방법이 있다. 특히, 조절된 단백질 분해를 위한 시스템은 천연 미생물 숙주로부터 전달되어 비천연 숙주 (non-native host)에서 사용될 수 있다.
합성 대사 밸브 조절 (Synthetic Metabolic Valve Control)
특히, 본원은 다단계 발효 공정에서 대사 플럭스를 조절하기 위한 합성 대사 밸브의 사용을 기술한다. 다단계 발효에서 단계들 사이의 이행(transition)에서 사용될 수 있는 발현을 유도하는 수없는 방법론이 당업계에 공지되어 있다. 이는 테트라사이클린(tetracycline), 무수테트라사이클린(anhydrotetracycline), 락토오스(lactose), IPTG(isopropyl-beta-D-l-thiogalactopyranoside), 아라비노스(arabinose), 라피노오스(raffinose), 트립토판(tryptophan) 및 수많은 다른 것들을 포함하는 인공 화학 유도제 (artificial chemical inducers)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이들 잘 알려진 유도제의 사용을 유전자 발현 침묵의 조절 및/또는 조절된 단백질 분해에 연결하는 시스템은 유전자 변형 미생물 시스템에 통합되어 다단계 발효 공정에서 성장과 생산 상태 사이의 전이를 조절할 수 있다.
또한, 성장 동안 소비되는 하나 이상의 제한 양분의 고갈에 의해 다단계 발효에서 성장과 생산 사이의 전이 (transition)를 조절 (control)하는 것이 바람직할 수 있다. 제한 양분은 포스페이트, 질소, 황 및 마그네슘을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 양분 제한에 반응하는 자연적인 유전자 발현 시스템은 유전자 발현 침묵의 조절 (control) 및/또는 조절된 단백질 분해를 다단계 발효 공정에서 성장과 생산 상태 사이의 전이에 작동 가능하게 연결하는데 사용할 수 있다.
생성물(Products)
일부 구체예에서, 본원은 생성물을 생산하기 위한 세포 또는 미생물을 제공한다. 일부 경우에서, 상기 생성물은 3-하이드록시프로피온산을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 생성물은 아미노산을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 아미노산을 알라닌을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 알라닌은 L-알라닌이다. 일부 경우에서, 상기 알라닌은 D-알라닌이다. 일부 경우에서, 알라닌 생산 속도는 최소 0.1 g/L/hr, 0.2 g/L/hr, 0.3 g/L/hr, 0.4 g/L/hr, 0.5 g/L/hr, 0.6 g/L/hr, 0.7 g/L/hr, 0.8 g/L/hr, 0.9 g/L/hr, 1.0 g/L/hr, 1.1 g/L/hr, 1.2 g/L/hr, 1.3 g/L/hr, 1.4 g/L/hr, 1.5 g/L/hr, 1.6 g/L/hr, 1.7 g/L/hr, 1.8 g/L/hr, 1.9 g/L/hr, 2.0 g/L/hr, 2.5 g/L/hr, 3.0 g/L/hr, 3.5 g/L/hr, 4.0 g/L/hr, 4.5 g/L/hr, 5.0 g/L/hr, 5.5 g/L/hr, 6.0 g/L/hr, 7.0 g/L/hr, 8.0 g/L/hr, 9.0 g/L/hr, 또는 10 g/L/hr 이다.
일부 경우에서, 24시간 후 알라닌 역가(titers)는 0 내지 0.5 g/L, 0.5 g/L 내지 1 g/L, 1 g/L 내지 1.5 g/L, 1.5 g/L 내지 2 g/L, 2 g/L 내지 2.5 g/L, 2.5 g/L 내지 3 g/L, 3 g/L 내지 3.5 g/L, 3.5 g/L 내지 4 g/L, 4 g/L 내지 4.5 g/L, 4.5 g/L 내지 5 g/L, 또는 5 g/L 내지 10 g/L 일 수 있다. SMV가 제공하는 알라닌 생산의 동적 범위는 생산 경로 효소의 발현 수준만 변경하는 것 (프로모터를 변경함으로써)에 비해 최대 4배까지 증가될 수 있다. 일부 경우에서, SMV가 제공하는 알라닌 생산의 동적 범위는 생산 경로 효소의 발현 수준을 단독으로 변경함으로써 제공되는 것에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배까지 증가 될 수 있다.
일부 경우에서, 미생물의 생산 폴리뉴클레오티드는 알라닌 추출효소를 인코딩한다. 일부 경우에서, 상기 알라닌 추출효소는 alaE이다.
일부 경우에서, 상기 생성물은 메발론산을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 0.1 g/L/hr, 0.2 g/L/hr, 0.3 g/L/hr, 0.4 g/L/hr, 0.5 g/L/hr, 0.6 g/L/hr, 0.7 g/L/hr, 0.8 g/L/hr, 0.9 g/L/hr, 1.0 g/L/hr, 1.1 g/L/hr, 1.2 g/L/hr, 1.3 g/L/hr, 1.4 g/L/hr, 1.5 g/L/hr, 1.6 g/L/hr, 1.7 g/L/hr, 1.8 g/L/hr, 1.9 g/L/hr, 2.0 g/L/hr, 2.5 g/L/hr, 3.0 g/L/hr, 3.5 g/L/hr, 4.0 g/L/hr, 4.5 g/L/hr, 5.0 g/L/hr, 5.5 g/L/hr, 6.0 g/L/hr, 7.0 g/L/hr, 8.0 g/L/hr, 9.0 g/L/hr, 또는 10 g/L/hr 이다.
방법
본원은 조작된 미생물 (engineered microorganism)에서 생성물을 대량 생산하는 방법을 제공한다. 본원은 또한, 고-처리량 방식으로 대량 (large-sclae)의 생성물을 생산하기 위한 미생물을 조작하는 (engineering) 방법을 제공한다.
일부 경우에서, 본원은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 하나의 세포의 복수의 균주 (a plurality of strains of a cell)를 배양하는 단계로서, 상기 복수의 균주의 각 균주는 (i) 대사 경로에서 작용하는 밸브 효소의 발현의 조절된 감소를 매개하기 위한 조작된 (engineered) 밸브 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 상기 생성물의 생성을 위한 생산 효소의 발현의 조절된 증가를 매개하기 위한 조작된 (engineered) 생산 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 대사 경로를 통한 플럭스를 감소시키고, 상기 복수의 균주의 각 균주는 상기 조작된 밸브 폴리뉴클레오티드 또는 상기 조작된 생산 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 서열에서 다른 균주와 상이한 것을 특징으로 하는 단계; 상기 복수의 균주의 각각에서 생성되는 상기 생성물의 양을 측정하는 단계; 및 상기 생성물의 상기 양에 기초하여 균주를 선택하는 단계. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 선택된 균주를 생물 반응기에서 성장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 선택된 균주를 포함하는 배양 배지는 최소 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml, 800 ml, 900 ml, 또는 1000 ml의 부피를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 배양 배지는 최소 1L의 부피를 갖는다.
일부 구체예에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 상기 밸브 효소를 인코딩하는 유전자의 전사를 억제하기 위한 침묵 폴리뉴클레오티드; 상기 밸브 효소의 세포 분해를 매개하기 위한 분해 폴리뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 복수(plurality)의 균주 중 제1 및 제2 균주는 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 침묵 폴리뉴클레오티드는 상기 밸브 효소를 인코딩하는 유전자의 프로모터를 인식하는 gRNA 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, gRNA 서열은 상기 제1 및 제2 균주 간에 상이하다. 일부 구체예에서, 상기 gRNA에 의해 인식되는 프로모터는 상기 제1 및 제2 균주 간에 상이하다. 일부 구체예에서, 제1 균주는 상기 침묵 폴리뉴클레오티드 및 상기 분해 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 균주는 상기 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함하지만 상기 분해 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 생성물의 양은 상기 제1 균주보다 상기 제2 균주에서 더 많다. 일부 구체예에서, 상기 생성물의 양은 상기 제2 균주보다 상기 제1 균주에서 많다. 일부 구체예에서, 밸브 효소는 에노일-ACP/CoA 환원효소 (enoyl-ACP/CoA reductase, fabI), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase, zwf), 리포아미드 탈수소효소 (lipoamide dehydrogenase, lpd), 시트레이트 합성효소 (citrate synthase, gltA), 가용성 수소전이효소 (soluble transhydrogenase, udhA), NADH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapA) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 효소를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 생산 효소는 NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (NADPH-dependent alanine dehydrogenase, ald), 알라닌 추출효소 (alanine exporter, alaE), NADPH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NADPH-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapN) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 효소를 포함한다.
일부 구체예에서, 생성물은 메발론산, 3-하이드록시프로피온산, 아미노산 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 아미노산은 알라닌이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌은 L-알라닌이다. 일부 구체예에서, 상기 알라닌은 D-알라닌이다.
일부 구체예에서, 상기 정지 상태 동안의 생성물의 생산 속도는 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소가 결여된 세포와 비교할 때, 환경 조건의 변화에 반응하여 적게 감소된다.
일부 구체예에서, 환경 조건의 변화는 상기 세포가 접촉하는 배양 배지의 당 농도의 변화를 포함한다.
일부 구체예에서, 환경 조건의 변화는 상기 세포가 접촉하는 배양 배지의 산소화(oxygenation)의 변화를 포함한다.
일부 경우에서, 본원은 다음 단계를 포함하는 세포 생성물을 생성하는 방법을 제공한다: (i) 대사 경로에서 작용하는 밸브 효소의 발현의 조절된 감소를 매개하기 위한 조작된 (engineered) 밸브 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 상기 생성물의 생성을 위한 생산 효소의 발현의 조절된 증가를 매개하기 위한 조작된 (engineered) 생산 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이종의 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 대사 경로를 통한 플럭스를 감소시키고, 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소는 상기 세포의 정지 상태(stationary phase)를 유도하며; 상기 정지 상태 동안 상기 생성물의 생산 속도는 상기 밸브 효소의 발현의 조절된 감소가 결여된 세포와 비교할 때, 환경 조건의 변화에 반응하여 적게 감소되는, 방법. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 환경 조건을 변화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 환경 조건은 상기 배양 배지의 당(sugar)의 농도를 포함하고, 상기 환경 조건의 변화는 상기 당 농도를 증가 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 당은 포도당 (glucose), 수크로스 (sucrose), 락토스 (lactose), 말토오스 (maltose), 자일로스 (xylose), 만니톨 (mannitol) 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에서, 상기 당은 포도당이다. 일부 경우에서, 상기 환경 조건은 상기 배양 배지의 산소 농도를 포함하고, 상기 환경 조건의 변화는 상기 산소 농도를 증가 또는 감소시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 배양은 생물 반응기(bioreactor)에서 수행된다.
일부 경우에서 상기 배양 배지는 최소 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml, 800 ml, 900 ml, 또는 1000 ml의 부피를 갖는다. 일부 경우에서, 상기 배양 배지는 최소 1L의 부피를 갖는다. 일부 경우에서, 상기 생성물은 3-하이드록시프로피온산을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 생성물은 아미노산을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 아미노산은 알라닌을 포함한다.
일부 경우에서, 상기 알라닌의 생산 속도는 최소 0.1 g/L/hr, 0.2 g/L/hr, 0.3 g/L/hr, 0.4 g/L/hr, 0.5 g/L/hr, 0.6 g/L/hr, 0.7 g/L/hr, 0.8 g/L/hr, 0.9 g/L/hr, 1.0 g/L/hr, 1.1 g/L/hr, 1.2 g/L/hr, 1.3 g/L/hr, 1.4 g/L/hr, 1.5 g/L/hr, 1.6 g/L/hr, 1.7 g/L/hr, 1.8 g/L/hr, 1.9 g/L/hr, 2.0 g/L/hr, 2.5 g/L/hr, 3.0 g/L/hr, 3.5 g/L/hr, 4.0 g/L/hr, 4.5 g/L/hr, 5.0 g/L/hr, 5.5 g/L/hr, 6.0 g/L/hr, 7.0 g/L/hr, 8.0 g/L/hr, 9.0 g/L/hr, 또는 10 g/L/hr 이다. 일부 경우에서, 상기 생산 폴리뉴클레오티드는 알라닌 추출효소(alanine exporter)를 인코드한다. 일부 경우에서, 상기 알라닌 추출효소는 alaE 이다. 일부 경우에서, 상기 배양은 20 시간, 30 시간, 40 시간, 50 시간, 60 시간, 70 시간, 80 시간, 90 시간, 또는 100 시간 미만 동안 진행된다. 일부 경우에서, 상기 배양은 10 시간, 15 시간, 20 시간, 25 시간, 30 시간, 35 시간, 40 시간, 또는 45 시간 미만 동안 진행된다. 일부 경우에서, 상기 배양은 30시간 미만 동안 진행된다.
일부 경우에서, 상기 생성물은 메발론산을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 메발론산의 생산 속도는 최소 0.1 g/L/hr, 0.2 g/L/hr, 0.3 g/L/hr, 0.4 g/L/hr, 0.5 g/L/hr, 0.6 g/L/hr, 0.7 g/L/hr, 0.8 g/L/hr, 0.9 g/L/hr, 1.0 g/L/hr, 1.1 g/L/hr, 1.2 g/L/hr, 1.3 g/L/hr, 1.4 g/L/hr, 1.5 g/L/hr, 1.6 g/L/hr, 1.7 g/L/hr, 1.8 g/L/hr, 1.9 g/L/hr, 2.0 g/L/hr, 2.5 g/L/hr, 3.0 g/L/hr, 3.5 g/L/hr, 4.0 g/L/hr, 4.5 g/L/hr, 5.0 g/L/hr, 5.5 g/L/hr, 6.0 g/L/hr, 7.0 g/L/hr, 8.0 g/L/hr, 9.0 g/L/hr, 또는 10 g/L/hr 이다. 일부 경우에서, 상기 배양은 20 시간, 30 시간, 40 시간, 50 시간, 60 시간, 70 시간, 80 시간, 90 시간, 또는 100 시간 미만 동안 진행된다. 일부 경우에서, 상기 배양은 80 시간 미만 동안 진행된다.
일부 구체예에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 상기 밸브 효소를 인코딩하는 유전자의 전사를 억제하기 위한 침묵 폴리뉴클레오티드; 상기 밸브 효소의 세포 분해를 매개하기 위한 분해 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 침묵 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 침묵 폴리뉴클레오티드는 상기 밸브 효소를 인코딩하는 유전자의 프로모터를 인식하는 gRNA를 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 일부 경우에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 추가로 CRISPR 효소를 인코딩하는데, 상기 CRISPR 효소는 상기 gRNA에 결합될 때 상기 프로모터 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에서, CRISPR 효소는 촉매적으로 불활성이다. 일부 경우에서, 밸브 폴리뉴클레오티드는 분해 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 분해 폴리뉴클레오티드는 분해 태그를 인코딩하는 서열을 포함하며, 상기 분해 태그는 상기 밸브 효소의 분해를 매개한다. 일부 경우에서, 상기 밸브 폴리뉴클레오티드의 발현은 포스페이트에 의해 조절된다. 일부 경우에서, 상기 생산 폴리뉴클레오티드의 발현은 포스페이트에 의해 조절된다. 일부 경우에서, 상기 세포는 E. coli 세포이다.
바이오-생산의 최적화(Optimization of Bio-production)
생명 공학 기반 발효 공정은 생물 제제 및 소분자 치료제부터 특수, 벌크 및 범용 화학 물질, 심지어 차세대 바이오 연료까지 모든 것을 생산하도록 성공적으로 개발되어 왔다1-3. 이들 공정은 수많은 기술 개발로 인해 최근 몇 년간 급속한 발전을 이루었다4, 5. 합성 생물학을 사용하여 새로운 분자를 생산하는 것이 더 쉽지는 않았다. 이러한 발전에도 불구하고, 개념 증명 (proof of concept, POC)에서 상업적으로 의미 있는 수준으로 분자를 가져 오는데 주요한 과제가 남아 있다. 균주 최적화 또는 "mg"에서 "kg"으로의 허들을 극복하는 것은 바이오 공정의 성공적인 사용화를 위한 주요 장벽으로 남아 있다. POC 시연 후, 성공적인 바이오공정 개발은 일상적으로 미생물 균주 및 발효 최적화 모두에서 긴 절차의 반복(lengthy iterations)을 요구한다6 -8 (도 1B). 이러한 최적화 노력은 종종 관심 대상이 되는 생성물 또는 숙주 균주에 특이적이다. 합성 생물학의 처리량이 대사 공학의 처리량을 능가하는데 (outpace), 이는 부분적으로 고처리량 방식으로 조작된 미생물 균주의 의미있고 표준화된 최적화를 수행하기 위한 광범위하게 유용한 수단이 부족하기 때문이다9.
균주 최적화 및 기존 POC 수준에서 진보하기 위한 수많은 과제가 있으며, 이 중 잠재적 설계 공간의 크기와 복잡성 (size and complexity of the potential design space)의 문제가 있다. 전기 회로 모델에 적합한10 -12 단순 유전자 회로와 달리, 대사 네트워크는 고도로 상호 연결되어 있다. 각 대사물 및/또는 효소는 끊임없이 다른 것들과 상호작용할 수 있다. 이러한 조합의 복잡성으로 인해 잠재적인 설계 공간이 크게 증가하게 되고, 이는 표준화된 설계 원리 (보충 자료, 표 1)의 개발에 요구되는 체계적인 실험들로는 다루기가 쉽지 않다. 새로운 고처리량 DNA 어셈블리 및 미생물 균주 구축 방법으로 이어지는 DNA를 읽고 쓰는데 있어서 극적인 발전과 비용 절감이 이루어졌지만, 이러한 큰 설계 공간에 접근하는 과제는 여전히 남아 있다13 -16. 균주 공학을 포함하는 새로운 합성 생물학 기술이 종종 쉽게 스크리닝되고 선택된 표현형으로 입증되는 것은 놀라운 일이 아니다13, 17-19. 이들 대부분은 한정된 세트의 경로 특이적 효소를 최적화하는데 초점을 두는데 한정되어 있다.
이러한 과제의 복잡성을 극복하기 위한 한가지 접근 방법은, 한정된 세트의 대사 효소를 포함하는 바이오-생산(bio-production)을 위한 시험관 내 (in vitro) 시스템을 사용하는 것이다. 그러나 이러한 접근법은 보조인자(cofactor) 재활용 및 에너지 생성을 포함하여 생체 내 시스템의 주요 장점을 복제 (replicate) 하는데 어려움이 있었다20 , 21. 이 복잡성을 처리하는 또 다른 접근 방법은 균주를 평가하기 위한 더 빠른 스크리닝 방법을 개발하는 것이다22. 그러나 처리량 증가만으로 잠재적인 설계 공간의 전체 복잡성을 평가할 수는 없다. 또한, 고 처리량(high-throuput) 연구에서 얻은 결과는 종종 동일한 미생물에서조차도 다른 환경으로 전환(translate)되지 않는다. 20, 23, 24 소규모 스크리닝은 대규모 생산 프로세스로 쉽게 전환(translate)되지 않아, 균주 최적화 상에서 공정 최적화를 반복하게 한다(도 1B). 이는, 대사가 고도로 조절되고 때로는 환경 조건의 변화에 극적으로 반응할 수 있기 때문이다. 25 , 20, 26-28 환경적 견고성 (environmental robustness)의 부족은 전형적으로 발효 기반 공정 규모 확장을 어렵게 만드는 한 가지 요인이다. 이러한 이슈 때문에 처리량이 평이하게 개선된 스케일 다운된 특수 복합 미세-반응기 시스템(sepcialized complex micro-reactor system)이 개발되었다20 , 29-31.
"mgs"에서 "kgs"로 전환 (transition)하는 시간과 비용을 크게 감소시키기 위하여, 광범위하게 적용 가능하고 신속하며 견고한 접근 방법이 여전히 필요하다. 이상적으로는, 다수의 생성물과 생산 숙주에서 처리가능한(amenable) 접근 방법이어야 한다. 실제로 확장 가능하고 표준화된 발효 공정의 사용을 가능하게 하는 일반화 가능한 고-처리량 균주 최적화 접근 방법의 개발이 본원에서 제공된다. 도 1B, 패널 b의 개요와 같이, 이 접근 방법은 활성 대사 네트워크의 동적 최소화를 포함하고32, 이는 생체 내 생합성의 이점을 유지하는 동시에 시험관 내 접근 밥법에서 일반적인 더 작은 설계 공간의 이점이 결합된 것이다20. 우리는 생산에 요구되는 최소 대사 네트워크를 분리하고 집중할 수 있다. 합성 대사 밸브 (SMV)의 조합을 활용하여32 , 33 (도 2A-D), 우리는 표준화된 2-단계 발효 공정에서 대사 네트워크를 동적으로 최소화하고 대사 플럭스를 전용(redirect)할 수 있다20.
이 접근 방법은 관련 설계 공간의 크기와 문제의 복잡성을 감소시켜 최적화를 크게 가속화한다. 다양한 구체예로서, 동적 대사 네트워크 최소화는 생산 경로 변형만으로 달성할 수 있는 것을 넘어서 (beyond) 경로 플럭스를 개선할 수 있음을 본원에서 입증하였다 (도 3A-K 및 6 A-H). 동시에, 본 발명자들은 동적 네트워크 최소화가 환경 조건에 대한 대사 반응을 감소시키고, 이는 조작된 균주의 견고성과 확장성을 증가시킨다는 것을 입증하였다 (도 3A-K 및 5A-J).
실시예
E. coli 에서의 2-단계 합성 대사 밸브
우리는 먼저 2-단계 공정에서 단백질 수준의 동적 감소가 가능한 E. coli 에서의 개선된 합성 대사 밸브 (SMVs)를 개발하였다. 이들 SMV는 주요 대사 효소의 수준을 감소시키거나 (또는 주요 대사 효소의 활성을 감소시키기 위해) 사용될 수 있고, 조절된 단백질 분해 또는 CRISPR-기반 유전자 침묵 또는 단백질 분해 및 침묵의 조합에 의존한다 (도 2A-D)32-35. 세포 성장 및 동적 대사 조절은 환경적 촉발자 (environmental trigger)로서 포스페이트 고갈 (phosphate depletion)을 사용하여 구현될 수 있다. 포스페이트는 최소 배지의 가장 값비싼 구성요소 중 하나로서, 촉발자의 이상적 후보가 될 수 있다. 또한, 포스페이트 고갈에 의해 E. coli 에서 유도된 정지 상태는 해당과정의 활용 (glycolytic uptake)을 유지할 뿐만 아니라 단백질 발현을 증가시킨다31 , 36. 포스페이트에 반응하는 수많은 프로모터 시스템은 E. coli 뿐만 아니라 S. cerevisiae 을 포함한 다른 미생물에서도 잘 알려져 있다37. 포스페이트 반응성 프로모터 변이체를 평가하고 (보충 자료, 섹션 1), 이를 2-단계 조절에 사용하였다.
두 방법 모두 이미 입증된 바와 같이63 , 33, SMV는 E. coli 에서 유도된 유전자 침묵을 위해 천연의 Type I-E Cascade CRISPR을 사용하여 구현되는 반면34 , 38, 조절된 단백질 분해는 표적 단백질의 C-말단에 데그론 태그 (degron tags)를 도입함으로써 유도되었다(도 2A). 이들 시스템은 최소 부산물 형성 및 높은 바이오매스 수율 및 성장 속도를 위해 초기 설계된 숙주 균주 (E. coli strain DLF_0025, 보충 자료, 섹션 3)에 도입되었다24 , 27, 28, 39. 이러한 접근 방법을 사용하여, 도 2A-D에 나타낸 바와 같이, 예를 들어 포스페이트가 고갈된 최소 배지에서 GFPuv를 "ON" 시키고, mCherry 형광 단백질을 "OFF" 시켜, 단백질 수준이 2-단계 공정에서 조절될 수 있다. 유전자 침묵과 단백질 분해의 조합은 단백질 분해율을 최대화시킬 수 있다(도 2C-D). 붕괴율(decay rates)에 대한 유전자 침묵 및 단백질 분해의 특이적 영향(specific impact)은 숙주, 표적 유전자/효소, 및 이의 특이적 자연적 변환율 (specific natural turnover rates) 및 발현 수준에 따라 달라질 수 있을 것이다40, 41.
대사 네트워크 최소화에 따른 플럭스 개선
2-단계 공정에서 단백질 양(level)의 동적 조절의 성공적인 입증으로, 본 발명자들은 주요 중심 대사 효소의 단독 또는 조합의 조절된 감소를 통한 E. coli 에서의 대사 플럭스의 동적 조절을 조사해 보고자 하였다. 네트워크에서 열역학적으로 선호되는 "충실한(committed)" 반응을 통한 플럭스를 감소시키면 네트워크 대사물 풀(metabolite pools)이 증가되고 (보충 자료, 섹션 5), 그 결과, 경로 플럭스가 변화할 것으로 예상되었다. 중심 대사 경로에서 주요 충실한 단계에서 효소들을 확인하여 초기 SMV 표적으로 선택하고, 알라닌을 초기 시험 생성물로 선택하였다(도 3A-K). NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (ald*)42를 포함하는 알라닌 생산을 위한 한 세트의 균주가 구축되었다. 중심 대사 효소에서 SMV의 다수의 조합을 갖는 변이 (variants)가, 단백질 분해 또는 유전자 침묵 또는 이들의 조합을 유도하는 변형에 의해, 제작되었다. (보충 자료, 섹션 3). 2-단계 공정에서 평가된 SMV를 갖는 균주 세트는 "밸브" 균주로 식별된다. 알라닌 "밸브" 균주 (총 ~ 500 개 균주) 패널의 알라닌 생산을 표준화된 2-단계 96-웰 플레이트 기반 미세발효법으로 평가하였다 (보충 자료, 섹션 7). 24시간 생산 후 알라닌 역가는 도 3B-C에 나타내었다. 간단히 말하면, 24시간 후 알라닌 역가는 ~ 0 g/L 내지 ~4.7 g/L의 범위였으며, 예상한 바와 같이 SMV의 수와 조합과 관련하여 유의하게 변하였다; 대부분의 SMV 조합은 SMV가 없이 알라닌 경로만 단독으로 있는 대조군과 비교하여 향상된 성능을 보여주었다. 일부 경우에서, 24 시간 후 알라닌 역가는 0 내지 0.5g/L, 0.5g/L 내지 1g/L, 1g/L 내지 1.5g/L, 1.5g/L 내지 2g/L, 2g/L 내지 2.5g/L, 2.5g/L 내지 3g/L, 3g/L 내지 3.5g/L, 3.5g/L 내지 4g/L, 4g/L 내지 4.5g/L, 4.5 g/L 내지 5 g/L, 또는 5 g/L 내지 10 g/L 일 수 있다. SMV가 제공하는 알라닌 생산의 동적 범위는 생산 경로 효소의 발현 수준만 변경하는 것 (프로모터를 변경함으로써)에 비해 최대 4배 증가될 수 있다 (보충 자료, 섹션 7). 일부 경우에서, SMV가 제공하는 알라닌 생산의 동적 범위는 생산 경로 효소의 발현 수준을 단독으로 변경함으로써 제공되는 것에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배까지 증가할 수 있다. 중요하게도, 단백질 분해 또는 침묵의 단독 및/또는 조합의 사용은 생산에 상당한 영향을 미쳤으며, 이는 각 효소에 대해 SMV를 사용한 활성의 미세 조정이 중요하다는 것을 나타낸다. 미세발효에서 가장 우수한 균주 중 하나는 10 gdcw/L의 바이오매스로 최소배지, 2 단계, 1L 발효에서 평가한 결과 (그림 3F), 48 시간 후, 0.8 g/g의 수율로 80g/L 100% L- 알라닌을 생산하였다. 이 균주에서 알라닌 추출효소 (E. coli alaE 유전자에 의해 인코딩 됨43)를 추가로 과발현시킨 결과, 27 시간 후, ~1 g/g의 수율로 147 g/L 100% L- 알라닌을 생산하였다 (도 3G).
미세발효 견고성(Micro-fermentation Robustness)
중심 가설은 생산 단계에서 대사를 제한함으로써 균주 성능 (performance)을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 환경 (공정) 조건에 대해 더 견고할 수 있다는 것이었다. 간단히 말해, 탄소 흐름은 최소화된 대사 네트워크를 통해 제한되어, 더 이상 환경에 대한 세포 반응을 통해 적응 (apapt)할 수 없다. 이 가설을 시험하고자, 상이한 "미세발효" 공정 조건하에서 균주를 평가하였다. 포도당 농도와 산소 전달률 (기존 발효에서 균주 성능에 영향을 미치는 주요 공정 변수26)을 변화시키고 (도 3D, 보충 자료, 섹션 8), 알라닌 생산을 측정하였다. 환경 견고성을 정량화하기 위한 견고성 점수 (RS)가 개발되었다. RS 점수가 클수록 더 견고한 균주를 나타낸다. 상대 표준 편차 (RSD)는 견고성에 대한 하나의 지표이지만, 본 발명자들은 모든 공정 조건에서 균주가 갖는 최대 편차(Max Dev)가 통합된, 견고성의 보다 엄격한 측정을 통합하고자 하였다 (RS, 식 (1)).
Figure 112019094014945-pct00001
48개의 알라닌 "밸브" 균주의 서브세트에 대한 견고성 점수를 도 3E에 나타내었다. 이 결과는 보충 자료, 섹션 8에 정리되어 있다. 견고성에 대해 RS> 0.6의 컷오프를 사용하는 Chi2 분석을 사용하여 공정 견고성에 통계적으로 기여하는 주요 SMV를 식별하였다. fabI의 단백질 분해는 견고성 (Chi2 = 13.85, Pvalue <0.001)의 주요 기여자 (primay contibutor)로, 따라서 fabI의 단백질 분해를 갖는 "밸브" 균주가 추가 연구에 사용되었다. 또한, gltA의 단백질 분해 및/또는 fabI 및 gltA의 단백질 분해 조합을 갖는 "밸브" 균주도 또한, 비록 큰 P 값을 나타내었으나, 견고성의 주요 기여자로 밝혀졌다.
기존 성장 연관 균주와 비교한 2-단계 "밸브" 균주 (2-Stage "Valve" Strains Compared to Traditional Growth Associated Strains)
SMV가 가능하게 하는 2 단계 접근 방벙을 기존의 성장 연관 공정과 비교하고자, 본 발명자들은 알라닌의 성장 관련 생산을 가능하게 하는 알라닌 탈수소효소(ald*)를 구성적으로 발현하는(constitutively express), 5개 균주를 구축하였다. 이들 성장 연관 균주는 ald* 발현44 (보충 자료, 섹션 2)을 유도하는데 사용되는 프로모터 강도가 상이하였지만, 동일한 공통의 비-밸브 (no-valve) 대조군 숙주 균주를 이용하였다. 도 5는 마이크로 타이터 (도 5A-D) 및 1L (도 5E-J) 규모에서 기존 발효의 "성장 연관(GA)" 균주와 2-단계 공정에서의 "밸브" 균주를 직접 비교한 결과이다. 미세발효에서, 2 단계 "밸브" 균주는 역가 및 공정 견고성과 관련하여 GA 균주보다 성능이 우수하다. 미세발효 분석에서 가장 견고한(또한, 가장 높은 생산 수준을 갖는) GA 균주와 견고한 "밸브" 균주를 다양한 공정 조건의 1L 발효에서비교하였다. "밸브" 균주는 미세발효 결과와 일치하게 평가된 모든 공정 조건에서 일관된 성능을 보여주었으나(도 5E), GA 균주는 공정에 따라 성능이 현저하게 변화하였다. 본 발명자들은 "밸브" 균주에 대해 "미세" 및 1L 규모 발효에서 관찰된 증가된 환경적 견고성이 예측 가능한 스케일 업으로 이어질 수 있을 것이라고 가정하고, 고-처리량 미세발효에서 개선된 성능을 보여준 균주는 제어된 생물 반응기 (conrolled bioreactor)에서도 성능이 안정적으로 향상될 것을 기대하였다. 해당 시스템의 확장성을 평가하기 위하여 미세발효에서 통계적으로 차별화된 성능을 갖는 "밸브" 알라닌 균주 (P-값 <0.001)를 표준화된 2 단계 1L 발효에서 평가하고 모든 GA 균주와 비교하였다. "미세발효"에서 관찰된 통계적으로 상이한 성능은 2 단계 "밸브" 균주에 대해 1L 발효까지 예측 가능하게 확장되었다. 이는 미세발효와 1L 성능 사이의 상관 관계가 관찰되지 않은 GA 균주의 결과와 대조적이다 (도 5G-H).
생성물 유연성(Product Flexibility )
알라닌 균주의 1L 완전 기계화된 발효 (fully instrumented fermentations)에서의 성공적이고 예측 가능한 스케일-업에 이어, 본 발명자들은 추가적인 생성물인 메발론산에 대한 기술 플랫폼을 검증해 보고자 하였다. 이를 위하여, 메발론산 생합성을 위한 추가적인 동적 생산 경로가 구축되었다 (도 6A). 메발론산 생산을 위해, 이기능성 아세틸-CoA 아세틸 전이효소 (bifunctional acetyl-CoA acetyltransferase), NADPH 의존적 HMG-CoA 환원효소 (NADPH dependent HMG-CoA reductase) 및 HMG-CoA 합성효소 (HMG-CoA synthase)를 각각 인코딩하는 E. faecalis mvaE 및 mvaS 유전자로 구성된, 3가지 효소 기능을 인코딩하는 2-유전자 생산 경로 플라스미드 세트를 구축하였다. 더 높은 활성을 갖는 mvaS 유전자 돌연변이체인 mvaS (A110G)가 사용되었다45 , 46. 대조군 균주에서 메발로네이트 생산에 대한 생산 플라스미드가 먼저 평가되었다(도 6B). 이어서, 가장 생산적인 플라스미드를 다양하게 조작된 "밸브" 균주에 도입하고 미세발효로 평가하였다 (도 6C). 이후 확장성을 확인하기 위하여, 통계적으로 차별화된 균주의 서브세트를 1L 발효에서 평가하였고, 이는 알라닌에서와 같이 예측 가능한 것으로 나타났다. 일부 경우에서, 성능 좋은 균주는 0.46 g/g (이론적 수율의 84 %)의 수율로, 78시간의 생산에서 97 g/L의 의미있는 역가 및 수율로 생산하였다 (도 6E). 이 메발로네이트 균주의 특이적 생산성은 이전에 보고된 최고의 결과보다 4배 이상 높다(보충 자료, 섹션 9)47.
논의 (Discussion)
역사적으로 소분자 생산을 대사적으로 엔지니어링하는 가장 성공적인 노력 중 일부는 혐기성 대사의 힘을 이용하여 생성물 형성과 성장을 결합한 것이다. 이를 통해 에탄올, 숙신산, 락테이트, 이소부탄올을 포함하여 많은 생성물을 생산할 수 있는 산업적 균주의 고전적인 설계와 선별이 가능하였다. 그리고 이는 진화 및 선택의 힘을 활용하여 조작된 네트워크에서 최적의 대사 플럭스에 도달하도록 하였다 48, 49 . ENREF 12. 성장 연관 생산이 혐기성 대사와 밀접하게 관련되어 있지는 않지만, 성장 연관은 합성 생물학을 사용하여 만들 수 있는 다양한 분자의 수와 다양성을 크게 제한한다. 일반적이고 강력하며 접근 가능한 비-성장 연관 플랫폼은 다양한 생성물의 최적화 및 확장을 크게 단순화할 것이다.
생산성 개선을 위한 환경적 촉발자에 대한 자연적인 대사 반응에 의존하는 대부분의 기존 2-단계 공정과 달리, 본 발명자들은 적극적으로 필수 대사 네트워크를 최소화하고 대사물을 관심 있는 생성물로 전용(redirect)하는 다음 단계를 밟았다. 이 작업에서 표적이 된 많은 필수 중심 대사 경로는 전통적으로 엔지니어링 전략의 한계를 벗어난 것인데, 이는 필수 효소를 결손하는 것은 전통적인 발효에서 성장 및 성장 연관 생산과 양립할 수 없는 것이기 때문이다. 동적으로 최소화된 대사 네트워크는 또한 환경 변수에 대한 견고성을 향상시켜 처리량이 많은 소규모 연구를 더 큰 규모의 장치화된 발효(instrumented fermentations)로 충실히 변환할 수 있게 하였다. 현재 이 분야의 패러다임은 개선된 공정 제어를 위해 소규모의 맞춤 설계된 미세반응기를 개발하여 관련 균주 평가의 처리량을 개선하는 것이다. 이와 대조적으로, 본 접근 방법은 공정 변화에 덜 민감하도록 미생물 대사를 엔지니어링 하는 것을 포함하고, 처리량이 많은 실험을 단순화하는 새로운 방향으로의 진전이다.
견고성을 넘어, 본 발명자들은 최소 대사 네트워크에 필수적인 효소의 변형의 조합이, 특히 생산 경로 발현 수준을 단독으로 변경하는 것과 비교할 때, 생산성을 크게 개선시킬 수 있음을 입증하였다. 이와 같은 성과의 큰 변화는 주요 중심 대사 노드(key central metabolic nodes)의 제한된 서브세트의 변화에 의한 것으로, 이로써 대사물 수준을 변경되도록 하였다. 효소 수준을 동적으로 제어하는 이전의 접근법과 비교하여 본 발명자들은 유전자 침묵과 단백질 분해의 조합으로 단백질 수준의 미세 조정 (fine tuning) 에 대한 개선된 잠재력을 보여주었다50. 정지 상태 세포는 세포 분열로 기존 단백질을 희석할 수 없으므로, 이러한 이중 접근 방법은 의미가 있다. 임의의 주어진 효소 양의 특이적 조절은, 물론 자연적인 전환 메커니즘 (natural turnover mechanism)에도 의존할 것이다. 언뜻 보면, 유전자 침묵과 단백질 분해를 함께 조합하는 것이 항상 개선된 성과를 나타내는 것은 아니라는 점에서 놀라운 점이 있다. 즉 "더 많은 것이 항상 더 좋은 것은 아니다". 이러한 결과를 설명하기 위해서는 향후 추가적인 노력이 필요할 수 있고, 이는 더 큰 네트워크에서 최소 플럭스를 유지하기 위한 요구 때문일 수 있고, 또는 최소 네트워크의 부분이 아니지만 네트워크 활성에 영향을 미치는 주요 조절 대사물 수준에서의 변화의 결과일 수 있다.
앞서 설명된 바와 같은 접근 방법은 대부분의 바이오-생산 공정에 공통적인 많은 문제를 해결할 수 있으나, 많은 생산 특이적 과제는 남아 있다. 생성물 또는 경로 대사물의 독성은 역가 또는 생산 속도를 제한할 수 있다. 낮은 역가에서 최적일 수 있는 최소의 네트워크가 높은 역가에서 최적이 아닐 수 있다. 또한, 개선된 효소의 엔지니어링은 종종 많은 "mg"에서 "kg" 프로젝트에 도전이 된다.
이 접근 방법은 다른 미생물 숙주로 적용(adapt)에 따른 실현 가능성(feasibility)이 기대된다. 새로운 숙주에 대한 주요 요건은 신속하고 강력한 성장 상태(growth phase), 단백질 수준을 공학적으로 동적 제어할 수 있는 가능성 및 대사적으로 활성을 갖는 정지 상태(stationary phase)를 포함한다. 예를 들면, Ralstonia species, Yarrowia species51, 52등에서 질소 제한과 같이, 수많은 미생물에서 생산적인 정지 상태 대사를 위한 양분 촉발자 (nutrient triggers)36가 잘 특성화되어 있다. 이러한 요건이 자연적으로 충족되어 있지 않더라도, S. cerevisiae 또는 다른 미생물과 같은 숙주로의 엔지니어링이 가능하며, 고유한 과제(unique challenges)와 해당 해결방안을 가지는 각각의 잠재적 숙주가 활용될 수 있다.
보다 복잡한 생산 경로를 갖는 분자에 이 플랫폼을 적용하기 위한 추가적인 노력이 필요할 수 있다. 이 접근법은 POC 수준을 넘어 보다 산업적인 수준의 속도, 역가 및 수율에서 문제를 다루기 시작하는 대사 공학자 및 합성 생물학자에게 신속한 최적화를 위한 손쉬운 경로를 제공할 수 있다.
방법 (Methods)
시약 및 배지
달리 기재되지 않는 한, 모든 물질 및 시약은 가능한 최고 등급을 사용하였으며, Sigma (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. C13 표지된 알라닌(2,3-13C2, 99%) (Item # CLM-2734-PK)은 Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Tewksbury, MA)로부터 구입하였다. 일반 균주 및 플라스미드 전파(propagation) 및 구축에는 Luria Broth를 사용하였다. 작용 항생제 농도는 다음과 같다: 암피실린 (100 μg/mL), 카나마이신 (35 μg/mL), 클로람페니콜 (35 μg/mL), 스펙티노마이신 (100 μg/mL), 제오신 (50 μg/mL), 젠타마이신 (10 μg/mL), 블라스티시딘 ( 100 μg/mL), 퓨로마이신 (150 μg/mL), 테트라사이클린 (5 μg/mL). 저염의 Luria 배지 (Lennox 제형)를 사용하여 제오신, 블라스티시딘 및 퓨로마이신 내성 클론을 선별하였다. 또한, 퓨로마이신 선별을 위해, 포스페이트 완충액 (pH = 8.0)을 LB Lennox에 50mM의 최종 농도로 첨가하였다. 원액(stock solutions)을 포함하는 배지 제형은 보충 자료, 섹션 7에 기재되어 있다.
E. coli 균주 구축
균주 구축 및 확인에 사용된 올리고뉴클레오티드 및 합성 선형 DNA(Gblocks™)는 모두 보충 자료, 섹션 3에 기재되어 있고, 이들은 Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA)에서 입수하였다. 균주 BW25113은 Yale Genetic Stock Center (CGSC http://cgsc.biology.yale.edu/)에서 입수하였다. 균주 BWapldf는 George Chen (Tsinghua University)이 제공해 주었다62. 염색체 변형은 항생제 저항 카세트를 포함하는 C- 말단 DAS + 4 태그의 경우 직접적인 항생제 카세트 통합(direct antibiotic cassette integration) 또는 Li et al의 프로토콜64을 엄격히 준수하는 scarless tet-sacB 선별 및 카운터선별을 통한 표준 재조합 방법63을 사용하여 이루어졌다. 재조합 플라스미드 pSIM5 및 tet-sacB 선별/카운터선별 마커 카세트는 Donald Court (NCI, https://redrecombineering.ncifcrf.gov/court-lab.html)가 제공하였다. 간단하게, tet-sacB 선별/카운터선별 마커 카세트는 제조자의 지침에 따라 Econotaq (Lucigen Middleton, WI)를 사용하여 ~ 50 bp 플랭킹 상동성 서열을 공급하는 적절한 올리고를 사용하여 94 ℃에서 초기 10분 변성에 이어, 94℃, 15초, 52℃에서 15초, 및 72℃에서 5분의 35회 사이클로 증폭되었다. tet-sacB 카세트의 "curing" 또는 직접 통합(항생 마커가 존재하는 경우)에 사용된 카세트는 IDT로부터 gBlocks으로 얻었다. sspB 유전자 결실의 경우, 카나마이신 내성으로 대체된 오픈 리딩 프레임 결실은 Keio Collection 균주 JW3197-165로부터 증폭되어, 표준 방법을 사용하여 적절한 백그라운드 균주로 이동되었다. 카나마이신 내성 카세트는 pCP20 플라스미드를 사용하여 회복되고, frt scar를 남겼다63 , 65. 전체 지역을 플랭킹하거나 DAS+4 태그의 경우 해당 삽입의 올리고 5'과 하나의 인터날(internal)을 저항 카세트로 삽입하는 것으로, 염색체 변형은 PCR 증폭과 페어링된 올리고뉴클레오티드를 이용한 시퀀싱으로 확인되었다.
E. coli 플라스미드 구축
CASCADE 가이드 배열의 설계와 구축에 사용된 프라이머는 보충 자료, 섹션 6에 나타내었다. 유전자 침묵 가이드 배열(array)은 일련의 pCASCADE 플라스미드로부터 발현되었다. pCASCADE-control 플라스미드는 pcrRNA.Tet73의 pTet 프로모터를 절연된 낮은 포스페이트 유도 ugpB 프로모터 (insulated low phosphate induced ugpB promoter)74와 교체(swap)하여 준비하였다. 모든 유전자에 대한 프로모터 서열은 EcoCyc 데이터베이스 (https://ecocyc.org/)에서 얻었다. CASCADE 가이드 배열을 설계하기 위해, 관심 있는 프로모터의 -35 또는 -10 박스 근처의 CASCADE PAM 사이트를 식별하고, PAM 사이트의 3' 말단에서 30bp를 가이드 서열로 선택하였으며, 제조자의 프로토콜에서 Q5 PCR 반응에 5% v/v DMSO를 첨가하도록 변형하여 Q5 site-directed mutagenesis (NEB, MA)로 pCASCADE에 클로닝하였다. PCR 사이클은 다음과 같다: 증폭은 98 ℃에서 30 초 동안 초기 변성 단계를 진행하고, 98℃에서 10초, 72℃에서 30초 및 72℃에서 1.5 분(연장 속도는 30초/kb)으로 25 사이클을 진행하고, 72℃에서 2 분 동안 최종 연장하였다. 2㎕의 PCR 혼합물을 10㎕ KLD 반응에 사용하였고, 이는 실온에서 1시간 동안 진행시킨 후, 1㎕ KLD 혼합물을 전기 천공법(electroporation)에 사용하였다.
pCASCADE 가이드 배열 플라스미드는 각각의 더 작은 가이드 플라스미드의 상보적 반쪽을 PCR에 의해 순차적으로 증폭시킨 후 후속 DNA 어셈블리에 의해 제조되었다. pCASCADE-control 벡터가 주형으로 사용되었다. 2개 이상의 가이드가 배열된 pCASCADE 플라스미드는 Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, MA)를 사용하여 제조되었다. PCR 사이클은 다음과 같았다 : 증폭은 98℃에서 30 초 동안 초기 변성 단계를 거친 후, 98℃에서 10초, 66℃에서 30초 및 72℃에서 45초(연장 속도는 30 초 / kb)로 35 사이클을 진행하고, 이어서 72℃에서 2분 동안 최종 연장하였다. PCR 산물을 겔-추출법으로 정제하고, 20㎕ 초순수(ultrapure water)를 사용하여 50 ㎕ PCR 반응 정제를 용리시켰다. 1 μL의 각 용리된 PCR 산물을 10 μL의 Gibson Assembly (NEB, MA)에 사용하였는데, 이는 50℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 완료 하였다. 1μL 깁슨 어셈블리 믹스를 전기천공법에 사용하였다.
생산 경로 효소는 낮은 포스페이트 유도성 프로모터를 갖는 고-카피 플라스미드에서 발현되었다. IDT 웹 사이트의 Codon Optimization Tool을 사용하여 생산 경로 유전자 서열을 코돈 최적화하였고, 각 경로에 대한 인산화된 G-blocks ™은 IDT로부터 설계 및 구매되었다. 플라스미드는 제조사의 프로토콜 (NEB, MA)에 따라 NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix를 사용하여 조립되었다. pSMART-HC-Kan (Lucigen, WI)을 모든 경로 플라스미드 백본으로 사용하였다. 모든 플라스미드 서열은 DNA 시퀀싱 (Eton Bioscience, NC)에 의해 확인되었고 Addgene에 기탁되었다.
E. coli BioLector
각각의 균주의 단일 콜로니를 적절한 항생제를 포함하는 5mL LB에 접종하고, 37℃, 220 rpm에서 9시간 동안 또는 OD600이> 2에 도달할 때까지 배양하였다. 배양액 500㎕를 적절한 항생제를 포함하는 10mL SM10 배지에 접종하고, 사각 진탕 플라스크 (CAT # : 25-212, Genesee Scientific, Inc. San Diego, CA)에서 37℃, 220rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 세포를 원심 분리에 의해 펠렛화하고 배양 밀도를 FGM3 배지를 사용하여 OD600 = 5로 표준화하였다. 고 질량 이동 FlowerPlate (CAT # : MTP-48-B, m2p-labs, 독일)을 사용하여 Biolector (m2p labs, Baesweiler, 독일)에서 성장 및 형광을 측정하였다. 40㎕의 OD 표준화된 배양물을 적절한 항생제를 포함하는 760㎕의 FGM3 배지에 접종하였다. Biolector 설정은 다음과 같다 : RFP gain = 100, GFP gain = 20, Biomass gain = 20, 진탕 속도 = 1300rpm, 온도 = 37℃, 습도 = 85%. 모든 균주에 대해 3회 분석하였다.
E. coli 미세발효
플라스미드를 제조자의 프로토콜에 따라 ECM 630 High Throughput Electroporation System (Harvard Apparatus, Inc. Holliston, MA)을 사용하거나 개별 전기 천공 큐벳을 사용하여 전기천공법에 의해 숙주 균주로 형질 전환시켰다. 동일한 부피의 멸균 20% 글리세롤을 첨가하여 각 형질전환 플레이트에 대해 글리세롤 스톡을 제조하고, 3㎕를 적절한 항생제를 포함하는 150㎕ SM10 ++ 배지에서 밤샘 배양을 위해 접종하는데 사용하였다. 플레이트를 샌드위치 커버(Model # CR1596 obtained from EnzyScreen, Haarlam, The Netherlands)로 덮어주었다. 이들 커버는 배양 중 최소한의 증발 손실을 보장(ensure)하기 위함이다. 달리 언급되지 않는 한, 96 웰 플레이트를 37℃에서 16시간 동안 400rpm으로 배양하였고, 진탕기 궤도는 25mm였다. 이 궤도와 최소 진탕 속도의 조합은 필요한 물질 전달 계수(mass transfer coefficient)를 얻고 적절한 배양 산소화(oxygenation)를 위해 요구된다.
16시간 성장 후, 세포를 원심분리로 펠렛화하고 과량의 배지를 제거한 후 세포를 150μL의 FGM3 세척 용액에 재현탁시켰다. 이어서 세포를 다시 한번 펠렛화하고 다시 여분의 배지를 제거한 후, 펠렛을 적절한 항생제를 함유하는 50μL FGM3 포스페이트가 없는 배지에 재현탁시켰다. 표준 플랫 바텀 96 웰 플레이트를 사용하여 OD600을 측정하기 위하여 재현탁된 배양액 5μL를 195μL의 물에 첨가하였다. 생산에 대한 OD600을 표준 96 웰 플레이트에 적절한 항생제를 함유 한 FGM3 포스페이트가 없는 배지 총 부피 150μL을 사용하여 OD600 = 1로 정규화하였다. 플레이트를 샌드위치 커버 (Model # CR1596 obtained from EnzyScreen, Haarlam, The Netherlands)로 덮고, 96 웰 플레이트 배양물을 37℃, 400rpm에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간의 생산 후, 각 웰로부터 모든 샘플을 원심분리에 의해 펠렛화하고, 후속 분석 측정을 위하여 상청액을 수집하였다. 각 균주에 대해 3회 미세발효를 수행하였다.
성장 연관 알라닌 미세발효를 위해, 글리세롤 원액 제조 및 SM10++ 에서의 16시간 밤샘 배양이 상기한 바와 같이 수행되었다. SM10 ++ 배지에서 16시간 동안 성장시킨 후, 5㎕의 밤샘 배양물을 적절한 항생제와 40 mM 포스페이트를 포함하는 150 ㎕ FGM3에 접종하였다. 플레이트를 샌드위치 커버 (Model # CR1596 obtained from EnzyScreen, Haarlam, The Netherlands)로 덮고, 96 웰 플레이트 배양물을 37℃, 400rpm에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24 시간의 생산 후, OD600을 기록하였으며, 이어서 각 웰로부터의 모든 샘플을 원심 분리에 의해 펠렛화하고, 후속 분석 측정을 위하여 상청액을 수집하였다. 각 균주에 대해 3회 미세발효를 수행하였다.
미세발효 견고성 평가는 보충 자료, 섹션 8에 기재된 바와 같이 수행되었다.
1L 발효 종(fermentation seed)
형질전환 플레이트로부터 단일 콜로니를 적절한 항생제를 포함하는 5mL LB에 접종하고 37℃, 220rpm에서 16시간 동안 배양하였다. 적절한 항생제를 포함하는 50mL SM10 배지에 500㎕의 LB 배양물을 접종하고, 사각 진탕 플라스크 (CAT # : 25-214, Genesee Scientific, Inc. San Diego, CA)에서 220rpm 진탕속도로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. OD600이 대략 3 내지 10 사이일 때, 배양물을 4000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 수확하고, 상청액을 제거한 후, 세포 배양물을 SM10 배지를 사용하여 OD600 = 10으로 정규화하였다. 1L 발효 종의 경우, 6mL의 표준화 된 OD600 = 10 배양물을 1.5mL의 50% 글리세롤에 첨가하고, 크라이오바이알(cryovial)에 담아 -80 ℃에서 저장 하였다.
1L 발효
공기, 산소 및 질소 가스용으로 구성된 3개의 가스 연결 질량 유량 제어기(gas connection mass flow controllers)를 포함하는 Infors-HT Multifors (Laurel, MD, USA) 병렬 생물반응기 시스템을 사용하여 1L 발효를 수행하였다. 사용된 용기는 총 부피가 1400mL이고 작업 부피가 최대 1L였다. 온라인 pH 및 pO2 모니터링 및 제어는 Hamilton 프로브로 수행되었다. 오프 가스 분석은 다중화된 Blue-in-One BlueSens 가스 분석기 (BlueSens. Northbrook, IL, USA)를 사용하여 수행되었다. 배양 밀도는 Optek 225 mm OD 프로브 (Optek, Germantown, WI, USA)를 사용하여 지속적으로 모니터링되었다. 시스템으로 IrisV6.0 command and control software를 사용하고, Seg-flow automated sampling system (Flownamics, Rodeo, CA, USA)에 통합되었으며, 이는 FISP 무-세포 샘플링 프로브, Segmod 4800 및 FlowFraction 96 well plate fraction collector를 포함한다.
~10 gcdw /L 바이오매스를 갖는 표준화된 2 단계 공정의 경우, 탱크는 최종 E. coli 바이오매스 농도 ~10 gcdw/L에 적용하기 충분한 포스페이트가 함유된 800mL의 FGM10 배지로 채워졌다. 적절한 항생제가 첨가되었다. 냉동된 종 바이알 (seed vials)을 얼음에서 해동시키고 7.5 mL의 종 배양물(seed culture)을 탱크에 접종하였다. 접종 후, 5M 수산화암모늄 및 1M 염산을 사용하여 탱크를 37℃ 및 pH 6.8로 제어하였다. 10M 수산화암모늄을 도 3G 발효에 사용하였다. 원하는 용존 산소 설정점을 유지하기 위해 다음 산소 제어 방식을 사용하였다. 첫 번째 가스 유량은 최소 0.3 L/분에서 0.8 L/분으로 공기 유량을 증가시키고, 이어 더 많은 공기유입이 필요한 경우, 교반을 최소 300 rpm에서 최대 1000 rpm으로 증가시켰다. 마지막으로 설정점을 달성하기 위해 더 많은 산소가 필요한 경우 통합 질량 유량 제어기를 사용하여 산소를 보충하였다. 출발 포도당 농도는 25 g/L이었다. 교반이 800 rpm에 도달하면, 일정한 농축 멸균 여과된 포도당 양분(500g/L)이 특정 속도, 즉 2g/h로 탱크에 첨가되었다. 견고성 연구를 위해 공급 속도 또는 용존 산소 함량을 변경해야 하는 경우, 세포가 정지 상태(stationary phase)에 진입한 후에 변화가 이루어졌다. 발효는 정지 상태로 진입한 후 최대 50 시간 동안 연장되었으며 샘플은 3시간마다 자동으로 회수되었다. 후속 분석 측정을 위해 샘플을 저장하였다.
성장 연관 발효 공정의 경우, 탱크를 40mM 포스페이트가 포함된 800mL의 FGM10 배지로 채우고, 포스페이트가 충분하게 포함되어 성장 연관 발효 공정에서 포스페이트 고갈이 발생하지 않도록 하였다. 적절한 항생제가 첨가되었다. 냉동된 종 바이알(seed vials)을 얼음에서 해동시키고 7.5 mL의 종 배양물(seed culture)을 탱크에 접종하였다. 접종 후, 5M 수산화암모늄 및 1M 염산을 사용하여 탱크를 37℃ 및 pH 6.8로 제어하였다. 원하는 용존 산소 설정점을 유지하기 위해 다음 산소 제어 방식을 사용하였다. 첫 번째 가스 유량은 최소 0.3 L/분에서 0.8 L/분으로 공기 유량을 증가시키고, 이어 더 많은 공기유입이 필요한 경우, 교반을 최소 300 rpm에서 최대 1000 rpm으로 증가시켰다. 마지막으로 설정점을 달성하기 위해 더 많은 산소가 필요한 경우 통합 질량 유량 제어기를 사용하여 산소를 보충하였다. 출발 포도당 농도는 25 g/L이었다. 교반이 800 rpm에 도달하면, 일정한 농축 멸균 여과된 포도당 양분(500g/L)이 특정 속도, 즉 2g/h로 탱크에 첨가되었다. 유입 속도 및 용존 산소 농도는 초기에 원하는 값으로 설정되었고 발효 공정 내내 유지되었다. 발효는 최대 50시간 동안 지속되었고 샘플은 3시간마다 자동으로 회수되었다. 후속 분석 측정을 위해 샘플을 저장하였다.
분석 방법
정량된 모든 화합물에 대한 샘플 표준 곡선은 보충 자료, 섹션 10에 나타내었다.
포도당 및 에탄올 정량: Waters 2414 Refractive Index (RI) detector (Waters Corp., Milford, MA. USA)와 통합된 Acquity H-Class UPLC를 사용하는, UPLC-RI 방법이 포도당과 에탄올 농도의 동시 정량을 위해 개발되었다. 크로마토 그래피 분리(chromatographic separation)는 65℃에서 Bio-Rad Fast Acid Analysis HPLC Column (100 x 7.8 mm, 9 μm particle size; CAT#: #1250100, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)를 사용하여 수행되었다. 용리액으로서 5mM 황산을 사용하였다. 등용매 용출(isocratic elution)은 다음과 같이 진행되었다: 0-0.1분, 유속이 0.4mL/분에서 0.42mL/분으로 증가, 0.1-12분, 유속이 0.48mL/분. 샘플 주입량은 10μL이었다. UPLC 분석법 개발은 분석물의 표준 수용성 원액 (standard aqueous stock solution)을 사용하여 진행되었다. MassLynx v4.1 소프트웨어를 사용하여 피크 통합 및 추가 분석을 수행하였다. 포도당에 사용된 선형범위(linear range)는 1-10 g/L이고, 에탄올에 사용된 선형범위(linear range)는 1-20 g/L이다. 정확한 선형 범위 내에 포함되도록 필요에 따라 샘플을 희석시켰다. 초순수(ultrapure water)를 사용하여 희석을 수행하였다.
알라닌 정량: 알라닌을 위한 역상 UPLC-MS/MS 방법이 개발되었다. 크로마토 그래피 분리는 70℃에서 Restek Ultra AQ C18 column (150 mm × 2.1 i.d., 3 μm; CAT#: 9178362, Restek Corporation, Bellefonte, PA)를 사용하여 수행되었다. 하기 용리액이 사용되었다: 용매 A : H2O, 0.2% 포름산 및 0.05% 암모늄 (v/v); 용매 B : MeOH, 0.2% 포름산 및 0.05% 암모늄 (v/v). 구배 용리 (gradient elution)는 다음과 같이 진행되었다: 0-0.1분 5% B 등용매, 유속을 0.65mL/분에서 0.75mL/분으로 증가; 0.1-0.3 분, 0.75mL/분으로 5%에서 95%로 B 선형 구배; 0.3-0.9 분, 0.75mL/분으로 95% B 등용매; 0.9-1.2분, 0.75mL/분으로 95%에서 5%로 B의 선형 구배; 1.2-1.3분, 0.75mL/분으로 5% B 등용매. 샘플 주입량은 5μL였다. UPLC 분석법 개발은 분석물의 표준 수용성 원액을 사용하여 진행되었다. Xevo ™ TQD 질량 분석기 (Waters Corp., Milford, MA. USA)와 통합된 Acquity H-Class UPLC를 사용하여 분리를 수행하였다. MRM 전이(transition)를 포함한 MS/MS 파라미터는 각 분석물에 따라 조정되었고, 이를 표 22에 나타내었다. 알라닌(2,3-13C2, 99%)을 5mg/L 농도로 알라닌에 대한 내부 표준으로 사용하였다. MassLynx v4.1 소프트웨어를 사용하여 피크 통합 및 추가 분석을 수행하였다. 알라닌의 선형 범위는 1-100 mg/L이었다. 정확한 선형 범위 내에 있도록 필요에 따라 샘플을 희석시켰다. 초순수를 사용하여 희석을 수행하고, 5 mg/L의 C13 알라닌 (2,3-13C2, 99%)와 함께, 용매 A를 사용하여 최종 10배 희석을 수행하였다.
메발론산 정량: 메발론산 및 메발로노락톤의 동시 정량을 위해 역상 UPLC-TUV 방법이 개발되었다. 크로마토 그래피 분리는 30℃에서 Restek Ultra AQ C18 column (150 mm × 2.1 i.d., 3 μm; CAT#: 9178362, Restek Corporation, Bellefonte, PA)를 사용하여 수행되었다. 용리액으로서 20mM 인산 (phosphoric acid)을 사용하였다. 등용매 용리는 다음과 같이 진행하였다: 0-3분, 1mL/분으로 등용매. 샘플 주입량은 10μL이었다. 210nm에서 흡광도를 모니터링 하였다. UPLC 분석법 개발은 분석물의 표준 수용성 원액을 사용하여 진행되었다. Acquity H-Class UPLC (Waters Corp., Milford, MA)를 사용하여 분리를 수행하였다. MassLynx v4.1 소프트웨어를 사용하여 피크 통합 및 추가 분석을 수행하였다. 메발론산 및 메발로노락톤의 선형 범위는 0.01-0.1 g/L이었다. 정확한 선형 범위 내에 있도록 필요에 따라 샘플을 희석시켰다. 20mM 인산에 희석된 메발론산은 자발적으로 메발로노락톤으로 전환되므로80, 발효 샘플에서 메발론산 및 메발로노락톤 모두의 정량이 필요하다. 메발론산 및 메발로노락톤 표준물은 매번 새로이 준비하여 바로 UPLC에 사용하였다. 초순수를 사용하여 희석을 수행하고, 20mM 인산을 사용하여 최종 10배 희석을 수행하였다.
알라닌 입체 이성질체 정량: L-/D-알라닌의 동시 정량 및 구별을 위한 역상 UPLC-TUV 방법이 개발되었다. 크로마토그래피 분리는 50℃에서 Chirex 3126 (D)-penicillamine column (150 x 4.6 mm, 5 μm; Phenomenex Inc., Torrance, CA)를 사용하여 수행되었다. 2 mM 구리 황산염이 용리액으로 사용되었다. 등용매 용리는 다음과 같이 진행되었다: 0-10분, 0.75 mL/분. 샘플 주입량은 10μL이었다. 254 nm에서 흡광도를 모니터링 하였다. UPLC 분석법 개발은 분석물의 표준 수용성 원액을 사용하여 진행되었다. Acquity H-Class UPLC (Waters Corp., Milford, MA)를 사용하여 분리를 수행하였다. MassLynx v4.1 소프트웨어를 사용하여 피크 통합 및 추가 분석을 수행하였다. L-/D-알라닌의 선형 범위는 0.1-1 g/L이었다. 정확한 선형 범위 내에 있도록 필요에 따라 샘플을 희석시켰다. 초순수를 사용하여 희석을 수행하였다.
보충 자료
대사 네트워크의 조합 복잡성
조합 # 전체 E. coli 유전자 네트워크 감소된 중심 대사 네트워크
실험 수
1 4500 ~45 (해당작용, TCA, PPP 및 ETC 유전자들만 해당)
2 1.0 X 106 990
3 1.5 X 1010 14,190
4 1.7 X 1013 148,995
5 1.5 X 1016 1.2 X 106
섹션 1: 포스페이트 프로모터 (Phosphate promoters)
포스페이트 프로모터 서열은 PhoB 조절 프로모터 (https://ecocyc.org/, 표 2)에 대한 EcoCyc 데이터베이스81로부터 얻었다. 본 발명자들은 포스페이트 고갈에 반응하는 것으로 이미 확인된 종래의 프로모터들의 상대적 강도를 평가하는 것에서 나아가, 포스페이트가 풍부한 조건에서의 상대적 누출(relative leakiness)을 평가하였다. 이를 위하여 형광 리포터 플라스미드 세트를 구축하였다. 본 발명자들은 pSMART-HC-Kan (Lucigen, WI) 백본에서 12개의 포스페이트 의존적 프로모터 세트 하부에 자외선 여기 GFPuv 유전자(ultraviolet excitable GFPuv gene)를 클로닝하였다. 이들 리포터 균주는 m2p-labs Biolector™에서 2-단계 미세발효 공정으로 평가되었다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. ugpB 유전자 프로모터는 발현 카세트가 염색체로 통합될 때 고수준의 엄격하게 제어된 발현을 위해 또는 가이드 배열의 유도성 발현을 위해 종종 선택되었다.
다른 서열 컨텍스트에서 일관된 성능을 유지하는데 도움을 주기 위하여, 포스페이트 프로모터 서브세트의 5' 및 3' 말단에 절연체(insulator)82를 첨가하였다(표 3). 판독-통과 전사(read-through transcription)를 감소시키기 위하여, 각각의 절연된 프로모터의 5' 말단에 독특한 종결자(unique terminator)를 첨가하였다. 종결자 서열은 http://parts.igem.org/Terminators/Catalog로부터 가져왔다. 절연된 포스페이트 프모모터는 m2p-labs Biolector™에서 GFPuv 발현을 사용하여 유사하게 특성화되었다(도 8).
평가된 포스페이트 유도성 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위는 밑줄로 표시되고, 유전자(GFPuv)의 시작 코돈은 녹색으로 표시됨
Promoter
Name 		Sequence SEQ ID NO
ugpBp TCTTTCTGACACCTTACTATCTTACAAATGTAACAAAAAAGTTATTTTTCTGTAATTCGAGCATGTCATGTTACCCCGCGAGCATAAAACGCGTGTGTAGGAGGATAATCTATG 1
yibDp GTGCGTAATTGTGCTGATCTCTTATATAGCTGCTCTCATTATCTCTCTACCCTGAAGTGACTCTCTCACCTGTAAAAATAATATCTCACAGGCTTAATAGTTTCTTAATACAAAGCCTGTAAAACGTCAGGATAACTTCTGTGTAGGAGGATAATCTATG 2
phoAp CGATTACGTAAAGAAGTTATTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTAGTGTAGGAGGATAATCTATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACATG 3
phoBp GCCACGGAAATCAATAACCTGAAGATATGTGCGACGAGCTTTTCATAAATCTGTCATAAATCTGACGCATAATGACGTCGCATTAATGATCGCAACCTATTTATTGTGTAGGAGGATAATCTATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACATG 4
amnp AGACAGTCAACGCGCTTGATAGCCTGGCGAAGATCATCCGATCTTCGCCTTACACTTTTGTTTCACATTTCTGTGACATACTATCGGATGTGCGGTAATTGTATAGGAGGATAATCTATG 5
ydfHp GCTATGCCGGACTGAATGTCCACCGTCAGTAATTTTTATACCCGGCGTAACTGCCGGGTTATTGCTTGTCACAAAAAAGTGGTAGACTCATGCAGTTAACTCACTGTGTAGGAGGATAATCTATG 6
mipAp CATCCATAAATTTTGCATAATTAATGTAAAGACCAGGCTCGCCAGTAACGCTAAATTCATTTGGCTGTAAGCGCGGTGTCATCCGCGTCAGGAAAATTAAACAGTTACTTTAAAAAATGAAAACGTAAAAAGGTTGGGTTTCGATGTATTGACGGGTAAACTTTGTCGCCCGCTAAACATTTGTTTGTGTAGGAGGATAATCTATG 7
phoHp AATCCTGCTGAAAGCACACAGCTTTTTTCATCACTGTCATCACTCTGTCATCTTTCCAGTAGAAACTAATGTCACTGAAATGGTGTTTTATAGTTAAATATAAGTAAATATATTGTTGCAATAAATGCGAGATCTGTTGTACTTATTAAGTAGCAGCGGAAGTTCGTGTAGGAGGATAATCTAT 8
yhjCp CTACAGAGATGACGTGTAGAAAATAGTTACCGATATAAATAGTTACAGCTAAACGCCTGAAATTACATGTCGAGGGCACTATTTAAAACAATTTTGAGGATTTCCTTATATTGGTGGTTAGTACGCATGCAATTAAAAATGAAATTCCGCGACCACAAGCCAAAATAACAAACGGCAAGGAGACAAAAATAAGCACAAATAGCCAACACGTCCTCTGTTCACTTTAAAGGGAATCGCTGAAAAATACGCTCTGTTTAAGGGGATTCACCTTTCTCAGAAAGCTATTCCGCCCTTTTCCTGCTGAGAAATCGCCACATTCGGCATGACAACATTGTGAAAGTGTAGGAGGATAATCTATG 9
phoUp ACCGAACTGAAGCAGGATTACACCGTGGTGATCGTCACCCACAACATGCAGCAGGCTGCGCGTTGTTCCGACCACACGGCGTTTATGTACCTGGGCGAATTGATTGAGTTCAGCAACACGGACGATCTGTTCACCAGTGTAGGAGGATAATCTATG 10
pstSp AAGACTTTATCTCTCTGTCATAAAACTGTCATATTCCTTACATATAACTGTCACCTGTTTGTCCTATTTTGCTTCTCGTAGCCAACAAACAATGCTTTATGAGTGTAGGAGGATAATCTATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACATG 11
phoEp AGCATGGCGTTTTGTTGCGCGGGATCAGCAAGCCTAGCGGCAGTTGTTTACGCTTTTATTACAGATTTAATAAATTACCACATTTTAAGAATATTATTAATCTGTAATATATCTTTAACAATCTCAGGTTAAAAACTTTCCTGTTTTCAACGGGACTCTCCCGCTGGTGTAGGAGGATAATCTATG 12
절연된 프로모터 서열. 절연체 서열은 이탤리체로 표시함. -35 및 -10 박스는 굵은 밑줄로 하이라이트함.
절연된 프로모터 서열 서열번호
BBa_B0015_IN_yibDp CCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATACACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACGTGCGTAATTGTGCTGATCTCTTATATAGCTGCTCTCATTATCTCTCTACCCTGAA GTGACT CTCTCACCTGTAAAAATAATATCTCACAGGCT TAATA GTTTCTTAATACAAAGCCTGTAAAACGTCAGGATAACTTCTATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 13
BBa_B1002_IN_phoBp CGCAAAAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTTTCGCACGTCTCCATCGCTTGCCCAAGTTGTGAAGCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACGCCACGGAAATCAATAACCTGAAGATATGTGCGACGAGCTT TTCATA AATCTGTCATAAATCTGACG CATAAT GACGTCGCATTAATGATCGCAACCTATTTATTATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 14
BBa_B1004_IN_mipAp CGCCGAAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTGCCGCACGTCTCCATCGCTTGCCCAAGTTGTGAAGCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACCATCCATAAATTTTGCATAATTAATGTAAAGACCAGGCTCGCCAGTAACGCTAAATTCATTTGGCTGTAAGCGCGGTGTCATCCGCGTCAGGAAAATTAAACAGTTACTTTAAAAAATGAAAACGTAAA AAGGTT GGGTTTCGATGTATTGACGG GTAAAC TTTGTCGCCCGCTAAACATTTGTTTATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 15
BBa_B1006_IN_phoUp AAAAAAAAACCCCGCCCCTGACAGGGCGGGGTTTTTTTTACGTCTCCATCGCTTGCCCAAGTTGTGAAGCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACACCGAACTGAAGCAGGATTACACCGTGGTGATCGTCACCCACAACATGCAGCAGGCTGCGCGTTGTTCCGACCACA CGGCGT TTATGTACCTGGGCGAATT GATTGA GTTCAGCAACACGGACGATCTGTTCACCAATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 16
BBa_B1010_IN_phoHp CGCCGCAAACCCCGCCCCTGACAGGGCGGGGTTTCGCCGCACGTCTCCATCGCTTGCCCAAGTTGTGAAGCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACAATCCTGCTGAAAGCACACAGCTTTTTTCATCACTGTCATCACT CTGTCA TCTTTCCAGTAGAAAC TAATGT CACTGAAATGGTGTTTTATAGTTAAATATAAGTAAATATATTGTTGCAATAAATGCGAGATCTGTTGTACTTATTAAGTAGCAGCGGAAGTTCATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 17
섹션 2: 구성 프로모터 (Constitutive Promoters)
proA, proB, proC, proD 프로모터 82 및 HCEp 프로모터 83를 포함하는 다양한 강도의 구성 절연된 프로모터(constitutive insulated promoters) 세트를 Davis et al.로부터 직접 얻어, 구성적 발현을 위해 사용하였다. 절연체(insulator)를 HCEp 프로모터 5' 및 3'에 추가하였다. 절연된 포스페이트 프로모터와 유사하게, 독특한 종결자(unique terminator)가 구성 프로모터의 5' 말단에 추가되었다. 이들은 성장 연관 생산 균주에서 구성 경로 발현을 유도하고 구성 이종 유전자 발현이 적절한 경우 균주 변이를 만들기 위해 사용되었다. 이들 프로모터 서열은 하기 표 4에 제공되고, 프로모터는 GFPuv 발현을 이용하여 특성화되었다(도 9).
구성 프로모터 서열
프로모터 서열 서열번호
BBa_B1004_proA
 CGCCGAAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTGCCGCACGTCTCCATCGCTTGCCCAAGTTGTGAAGCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACTTTACGGGCATGCATAAGGCTCGTAGGCTATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 18
BBa_B1006_proB AAAAAAAAACCCCGCCCCTGACAGGGCGGGGTTTTTTTTACGTCTCCATCGCTTGCCCAAGTTGTGAAGCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACTTTACGGGCATGCATAAGGCTCGTAATATATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 19
BBa_B1010_proC
 CGCCGCAAACCCCGCCCCTGACAGGGCGGGGTTTCGCCGCACGTCTCCATCGCTTGCCCAAGTTGTGAAGCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACTTTACGGGCATGCATAAGGCTCGTATGATATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 20
BBa_B1002_proD
 CGCAAAAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTTTCGCACGTCTCCATCGCTTGCCCAAGTTGTGAAGCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACTTTACGGGCATGCATAAGGCTCGTATAATATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 21
BBa_B0015_IN_HCEp CCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATACACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCCCTAGGTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACCTCCTTCACAGATTCCCAATCTCTTGTTAAATAACGAAAAAGCATCAATTAAAACCCATGTCTTTCTATATTCCAGCAATGTTTTATAGGGGACATATTGATGAAGATGGGTATCACCTTAGTGAATTGCTATAAGCTGCTCTTTTTTGTTCGTGATATACTGATAAATTGAATTTTCACACTTCATATTCAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTT 22
섹션 3: 염색체 변형 숙주 균주 (Chromosomally Modified Host Strains)
도 11은 각각의 염색체 변형을 나타낸다. 본 연구에서 사용 및/또는 구축된 균주는 표 5에 나열하였다. 표 6 및 7에는 균주 구축 및/또는 확인에 사용된 올리고뉴클레오티드 및 합성 DNA 서열을 나열하였다. 도 12 및 도 13A-E는 1L 발효에서 대조균 균주의 성장 동안 성장 속도(growth rates) 및 포도당 분포(glucose distribution)를 보여준다.
염색체 변형 균주 목록
균주 유전형 출처
BW25113 (wt) F-, λ, Δ(araD-araB)567, lacZ4787(del)(::rrnB-3) , rph-1,(Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514 CGSC
JW3197-1 BW25113, sspB756(del)::kan 53
Bwapldf aBW25113, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpflB, ΔldhA, ΔadhE 39
DLF_0001 BWapldf, ΔiclR, ΔarcA this study
DLF_0002 BWapldf, ΔiclR, ΔarcA, ΔsspB::frt this study
DLF_0025 DLF_0002, Δcas3::tm-ugpb-sspB-pro-casA(N2S) this study
DLF_0028 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR this study
DLF_0031 DLF_0025, lpd-DAS+4-gentR this study
DLF_0038 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, udhA-DAS+4-bsdR this study
DLF_0039 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, gltA-DAS+4-zeoR this study
DLF_0040 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, zwf-DAS+4-bsdR this study
DLF_0041 DLF_0025, lpd-DAS+4-gentR, gltA-DAS+4-zeoR this study
DLF_0042 DLF_0025, lpd-DAS+4-gentR, udhA-DAS+4-bsdR this study
DLF_0043 DLF_0025, gltA-DAS+4-zeoR this study
DLF_0044 DLF_0025, gltA-DAS+4-zeoR, zwf-DAS+4-bsdR this study
DLF_0045 DLF_0025, gltA-DAS+4-zeoR, udhA-DAS+4-bsdR this study
DLF_0046 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, gltA-DAS+4-zeoR, zwf-DAS+4-bsdR this study
DLF_0047 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, gltA-DAS+4::zeoR, udhA-DAS+4-bsdR this study
DLF_0048 DLF_0025, lpd-DAS+4-gentR, gltA-DAS+4-zeoR, zwf-DAS+4-bsdR this study
DLF_0049 DLF_0025, lpd-DAS+4-gentR, gltA-DAS+4-zeoR, udhA-DAS+4-bsdR this study
DLF_0165 DLF_0025, lpd-DAS+4-gentR, zwf-DAS+4-bsdR this study
DLF_0763 DLF_0025, udhA-DAS+4-bsdR this study
DLF_01002 DLF_0025, zwf-DAS+4-bsdR this study
DLF_01517 DLF_0012, Δcas3::pro-casA(N2S) this study
DLF_01530 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, udhA-DAS+4-bsdR, zeoR-proDp-gapN-zeoR this study
DLF_01531 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, udhA-DAS+4-bsdR, gltA-DAS+4-purR this study
DLF_01532 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, udhA-DAS+4-bsdR, gapA-DAS+4-zeoR-proDp-gapN this study
DLF_01533 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, udhA-DAS+4-bsdR, gapA-DAS+4-zeoR-proDp-gapN, gltA-DAS+4-purR this study
DLF_01536 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, udhA-DAS+4-bsdR, zeoR-proDp-gapN, gltA-DAS+4-purR this study
DLF_01537 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, udhA-DAS+4-bsdR, gapA-DAS+4-zeoR this study
DLF_01538 DLF_0025, fabI-DAS+4-gentR, gltA-DAS+4-zeoR, udhA-DAS+4-bsdR, gapA-DAS+4-zeoR this study
균주 구축에 사용된 올리고뉴클레오티드
올리고 서열 서열번호
ilcR_tetA_F TAACAATAAAAATGAAAATGATTTCCACGATACAGAAAAAAGAGACTGTCATCCTAATTTTTGTTGACACTCTATC 23
ilcR_sacB_R TGCCACTCAGGTATGATGGGCAGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAGATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC 24
iclR_500up CCGACAGGGATTCCATCTG 25
iclR_500dn TATGACGACCATTTTGTCTACAGTTC 26
arcA_tetA_F GGACTTTTGTACTTCCTGTTTCGATTTAGTTGGCAATTTAGGTAGCAAACTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATC 27
arcA_sacB_R ATAAAAACGGCGCTAAAAAGCGCCGTTTTTTTTGACGGTGGTAAAGCCGAATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC 28
arcA_500up CCTGACTGTACTAACGGTTGAG 29
arcA_500dn TGACTTTTATGGCGTTCTTTGTTTTTG 30
sspB_kan_F CTGGTACACGCTGATGAACACC 31
sspB_kan_R CTGGTCATTGCCATTTGTGCC 32
sspB_conf_F GAATCAGAGCGTTCCGACCC 33
sspB_conf_R GTACGCAGTTTGCCAACGTG 34
cas3_tetA_F AATAGCCCGCTGATATCATCGATAATACTAAAAAAACAGGGAGGCTATTATCCTAATTTTTGTTGACACTCTATC 35
cas3_sacB_R TACAGGGATCCAGTTATCAATAAGCAAATTCATTTGTTCTCCTTCATATGATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC 36
cas3_conf_F CAAGACATGTGTATATCACTGTAATTC 37
cas3_500dn GCGATTGCAGATTTATGATTTGG 38
fabI_conf_F GCAAAATGCTGGCTCATTG 39
gapA_conf_F GAACTGAATGGCAAACTGACTG 40
gapA_500dn TGGGGATGATCGACCACA 41
gltA_conf_F TATCATCCTGAAAGCGATGG 42
lpd_conf_F ATCTCACCGTGTGATCGG 43
udhA_conf_F CAAAAGAGATTCTGGGTATTCACT 44
zwf_conf_F CTGCTGGAAACCATGCG 45
zwf_500dn AGAGCATGTCGTTATAGGAGGTGAT 46
ampR_intR AGTACTCAACCAAGTCATTCTG 47
bsdR_intR GAGCATGGTGATCTTCTCAGT 48
gentR_intR GCGATGAATGTCTTACTACGGA 49
purR_intR GTCGCTGGGTAATCTGCAA 50
tetA_intR ATCAACGCATATAGCGCTAGCAG 51
zeoR_intR ACTGAAGCCCAGACGATC 52
균주 구축에 사용된 합성 DNA
tetA - sacB 카세트 서열번호
TCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCATTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGAATAGTTCGACAAAGATCGCATTGGTAATTACGTTACTCGATGCCATGGGGATTGGCCTTATCATGCCAGTCTTGCCAACGTTATTACGTGAATTTATTGCTTCGGAAGATATCGCTAACCACTTTGGCGTATTGCTTGCACTTTATGCGTTAATGCAGGTTATCTTTGCTCCTTGGCTTGGAAAAATGTCTGACCGATTTGGTCGGCGCCCAGTGCTGTTGTTGTCATTAATAGGCGCATCGCTGGATTACTTATTGCTGGCTTTTTCAAGTGCGCTTTGGATGCTGTATTTAGGCCGTTTGCTTTCAGGGATCACAGGAGCTACTGGGGCTGTCGCGGCATCGGTCATTGCCGATACCACCTCAGCTTCTCAACGCGTGAAGTGGTTCGGTTGGTTAGGGGCAAGTTTTGGGCTTGGTTTAATAGCGGGGCCTATTATTGGTGGTTTTGCAGGAGAGATTTCACCGCATAGTCCCTTTTTTATCGCTGCGTTGCTAAATATTGTCACTTTCCTTGTGGTTATGTTTTGGTTCCGTGAAACCAAAAATACACGTGATAATACAGATACCGAAGTAGGGGTTGAGACGCAATCGAATTCGGTATACATCACTTTATTTAAAACGATGCCCATTTTGTTGATTATTTATTTTTCAGCGCAATTGATAGGCCAAATTCCCGCAACGGTGTGGGTGCTATTTACCGAAAATCGTTTTGGATGGAATAGCATGATGGTTGGCTTTTCATTAGCGGGTCTTGGTCTTTTACACTCAGTATTCCAAGCCTTTGTGGCAGGAAGAATAGCCACTAAATGGGGCGAAAAAACGGCAGTACTGCTCGGATTTATTGCAGATAGTAGTGCATTTGCCTTTTTAGCGTTTATATCTGAAGGTTGGTTAGTTTTCCCTGTTTTAATTTTATTGGCTGGTGGTGGGATCGCTTTACCTGCATTACAGGGAGTGATGTCTATCCAAACAAAGAGTCATCAGCAAGGTGCTTTACAGGGATTATTGGTGAGCCTTACCAATGCAACCGGTGTTATTGGCCCATTACTGTTTGCTGTTATTTATAATCATTCACTACCAATTTGGGATGGCTGGATTTGGATTATTGGTTTAGCGTTTTACTGTATTATTATCCTGCTATCGATGACCTTCATGTTAACCCCTCAAGCTCAGGGGAGTAAACAGGAGACAAGTGCTTAGTTATTTCGTCACCAAATGATGTTATTCCGCGAAATATAATGACCCTCTTGATAACCCAAGAGCATCACATATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTGAAATGAGATATTATGATATTTTCTGAATTGTGATTAAAAAGGCAACTTTATGCCCATGCAACAGAAACTATAAAAAATACAGAGAATGAAAAGAAACAGATAGATTTTTTAGTTCTTTAGGCCCGTAGTCTGCAAATCCTTTTATGATTTTCTATCAAACAAAAGAGGAAAATAGACCAGTTGCAATCCAAACGAGAGTCTAATAGAATGAGGTCGAAAAGTAAATCGCGCGGGTTTGTTACTGATAAAGCAGGCAAGACCTAAAATGTGTAAAGGGCAAAGTGTATACTTTGGCGTCACCCCTTACATATTTTAGGTCTTTTTTTATTGTGCGTAACTAACTTGCCATCTTCAAACAGGAGGGCTGGAAGAAGCAGACCGCTAACACAGTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAGGCGCAACTCAAGCGTTTGCGAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGGAAACATACGGCATTTCCCATATTACACGCCATGATATGCTGCAAATCCCTGAACAGCAAAAAAATGAAAAATATCAAGTTCCTGAGTTCGATTCGTCCACAATTAAAAATATCTCTTCTGCAAAAGGCCTGGACGTTTGGGACAGCTGGCCATTACAAAACGCTGACGGCACTGTCGCAAACTATCACGGCTACCACATCGTCTTTGCATTAGCCGGAGATCCTAAAAATGCGGATGACACATCGATTTACATGTTCTATCAAAAAGTCGGCGAAACTTCTATTGACAGCTGGAAAAACGCTGGCCGCGTCTTTAAAGACAGCGACAAATTCGATGCAAATGATTCTATCCTAAAAGACCAAACACAAGAATGGTCAGGTTCAGCCACATTTACATCTGACGGAAAAATCCGTTTATTCTACACTGATTTCTCCGGTAAACATTACGGCAAACAAACACTGACAACTGCACAAGTTAACGTATCAGCATCAGACAGCTCTTTGAACATCAACGGTGTAGAGGATTATAAATCAATCTTTGACGGTGACGGAAAAACGTATCAAAATGTACAGCAGTTCATCGATGAAGGCAACTACAGCTCAGGCGACAACCATACGCTGAGAGATCCTCACTACGTAGAAGATAAAGGCCACAAATACTTAGTATTTGAAGCAAACACTGGAACTGAAGATGGCTACCAAGGCGAAGAATCTTTATTTAACAAAGCATACTATGGCAAAAGCACATCATTCTTCCGTCAAGAAAGTCAAAAACTTCTGCAAAGCGATAAAAAACGCACGGCTGAGTTAGCAAACGGCGCTCTCGGTATGATTGAGCTAAACGATGATTACACACTGAAAAAAGTGATGAAACCGCTGATTGCATCTAACACAGTAACAGATGAAATTGAACGCGCGAACGTCTTTAAAATGAACGGCAAATGGTACCTGTTCACTGACTCCCGCGGATCAAAAATGACGATTGACGGCATTACGTCTAACGATATTTACATGCTTGGTTATGTTTCTAATTCTTTAACTGGCCCATACAAGCCGCTGAACAAAACTGGCCTTGTGTTAAAAATGGATCTTGATCCTAACGATGTAACCTTTACTTACTCACACTTCGCTGTACCTCAAGCGAAAGGAAACAATGTCGTGATTACAAGCTATATGACAAACAGAGGATTCTACGCAGACAAACAATCAACGTTTGCGCCAAGCTTCCTGCTGAACATCAAAGGCAAGAAAACATCTGTTGTCAAAGACAGCATCCTTGAACAAGGACAATTAACAGTTAACAAATAAAAACGCAAAAGAAAATGCCGATATTGACTACCGGAAGCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGATTCAGGCTGTCTATGTGTGACTGTTGAGCTGTAACAAGTTGTCTCAGGTGTTCAATTTCATGTTCTAGTTGCTTTGTTTTACTGGTTTCACCTGTTCTATTAGGTGTTACATGCTGTTCATCTGTTACATTGTCGATCTGTTCATGGTGAACAGCTTTAAATGCACCAAAAACTCGTAAAAGCTCTGATGTATCTATCTTTTTTACACCGTTTTCATCTGTGCATATGGACAGTTTTCCCTTTGAT 53
△ iclR -cure
AAATGATTTCCACGATACAGAAAAAAGAGACTGTCATGGGCAGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAG 54
△ arcA -cure
CTGTTTCGATTTAGTTGGCAATTTAGGTAGCAAACTCGGCTTTACCACCGTCAAAAAAAACGGCGCTTTT 55
△ cas3 -pro- casA
CAAGACATGTGTATATCACTGTAATTCGATATTTATGAGCAGCATCGAAAAATAGCCCGCTGATATCATCGATAATACTAAAAAAACAGGGAGGCTATTACCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATATCTTTCTGACACCTTACTATCTTACAAATGTAACAAAAAAGTTATTTTTCTGTAATTCGAGCATGTCATGTTACCCCGCGAGCATAAAACGCGTGTGTAGGAGGATAATCTTTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCCATATGAAGGAGAACAAATGAATTTGCTTATTGATAACTGGATCCCTGTACGCCCGCGAAACGGGGGGAAAGTCCAAATCATAAATCTGCAATCGCTATAC 56
△ cas3 :: ugBp - sspB -pro- casA
CAAGACATGTGTATATCACTGTAATTCGATATTTATGAGCAGCATCGAAAAATAGCCCGCTGATATCATCGATAATACTAAAAAAACAGGGAGGCTATTACCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATATCTTTCTGACACCTTACTATCTTACAAATGTAACAAAAAAGTTATTTTTCTGTAATTCGAGCATGTCATGTTACCCCGCGAGCATAAAACGCGTGTGTAGGAGGATAATCTATGGATTTGTCACAGCTAACACCACGTCGTCCCTATCTGCTGCGTGCATTCTATGAGTGGTTGCTGGATAACCAGCTCACGCCGCACCTGGTGGTGGATGTGACGCTCCCTGGCGTGCAGGTTCCTATGGAATATGCGCGTGACGGGCAAATCGTACTCAACATTGCGCCGCGTGCTGTCGGCAATCTGGAACTGGCGAATGATGAGGTGCGCTTTAACGCGCGCTTTGGTGGCATTCCGCGTCAGGTTTCTGTGCCGCTGGCTGCCGTGCTGGCTATCTACGCCCGTGAAAATGGCGCAGGCACGATGTTTGAGCCTGAAGCTGCCTACGATGAAGATACCAGCATCATGAATGATGAAGAGGCATCGGCAGACAACGAAACCGTTATGTCGGTTATTGATGGCGACAAGCCAGATCACGATGATGACACTCATCCTGACGATGAACCTCCGCAGCCACCACGCGGTGGTCGACCGGCATTACGCGTTGTGAAGTAATTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCCATATGAAGGAGAACAAATGAATTTGCTTATTGATAACTGGATCCCTGTACGCCCGCGAAACGGGGGGAAAGTCCAAATCATAAATCTGCAATCGCTATAC 57
fabI -DAS+4- gentR
CTATTGAAGATGTGGGTAACTCTGCGGCATTCCTGTGCTCCGATCTCTCTGCCGGTATCTCCGGTGAAGTGGTCCACGTTGACGGCGGTTTCAGCATTGCTGCAATGAACGAACTCGAACTGAAAGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTAATAGGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGAATCCATGTGGGAGTTTATTCTTGACACAGATATTTATGATATAATAACTGAGTAAGCTTAACATAAGGAGGAAAAACATATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGGCTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGACTCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCCCAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCTCCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTCCTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAAGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGTTCTGTTGGTAAAGATGGGCGGCGTTCTGCCGCCCGTTATCTCTGTTATACCTTTCTGATATTTGTTATCGCCGATCCGTCTTTCTCCCCTTCCCGCCTTGCGTCAGG 58
gapA-DAS+4-zeoR-proDp-gapN
TCTCCAAAGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTGATTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCAACTTTAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGACTAAGCAATATAAGAATTACGTAAATGGGGAGTGGAAGCTTTCGGAGAATGAAATTAAGATCTATGAACCAGCCAGTGGGGCGGAATTGGGGTCAGTCCCGGCAATGTCCACTGAAGAAGTTGACTATGTCTACGCCTCGGCCAAAAAAGCGCAGCCAGCATGGCGCTCGCTTTCCTATATTGAGCGTGCGGCTTATTTGCACAAAGTCGCAGACATCCTGATGCGTGACAAGGAGAAAATTGGAGCGGTATTGTCCAAGGAAGTAGCGAAAGGCTACAAATCCGCAGTATCGGAGGTCGTCCGCACCGCCGAGATTATTAATTATGCGGCCGAAGAAGGGCTTCGCATGGAGGGTGAGGTCTTGGAGGGCGGCAGTTTTGAGGCGGCATCCAAGAAAAAAATCGCTGTCGTCCGTCGCGAGCCGGTGGGACTTGTGCTTGCTATTAGTCCGTTCAATTACCCCGTGAATCTGGCCGGCTCCAAGATTGCCCCTGCACTGATCGCGGGCAATGTAATCGCTTTTAAACCACCGACCCAAGGATCGATTAGTGGACTTCTTTTAGCGGAGGCGTTTGCGGAGGCAGGTCTTCCAGCCGGCGTATTCAATACCATCACGGGGCGTGGAAGTGAAATCGGGGATTACATCGTGGAGCACCAGGCAGTAAATTTCATCAACTTCACGGGTTCCACGGGGATCGGGGAGCGTATCGGTAAGATGGCTGGGATGCGTCCGATCATGTTGGAACTTGGCGGCAAGGATAGTGCGATTGTGCTGGAAGACGCAGACTTGGAATTGACAGCTAAAAACATTATCGCTGGAGCCTTCGGGTATAGTGGTCAACGTTGCACGGCAGTTAAGCGCGTTCTTGTTATGGAAAGTGTCGCGGATGAATTGGTCGAGAAGATTCGCGAGAAAGTGTTAGCTCTTACGATTGGAAATCCAGAGGACGATGCTGACATCACTCCATTGATCGACACGAAATCCGCGGATTACGTCGAGGGGCTGATCAACGACGCGAACGATAAGGGAGCAGCGGCTTTGACCGAGATCAAACGCGAGGGGAACCTGATCTGCCCGATTCTTTTTGACAAAGTCACAACTGACATGCGCTTGGCATGGGAAGAACCCTTCGGCCCAGTCTTGCCTATTATCCGCGTTACTAGCGTAGAGGAAGCAATTGAAATTTCCAATAAATCCGAATATGGGTTGCAAGCGAGTATCTTTACTAACGATTTTCCACGTGCCTTTGGTATTGCGGAACAGTTAGAAGTCGGGACAGTTCACATCAACAACAAGACGCAGCGCGGGACAGATAACTTCCCCTTTTTGGGAGCAAAGAAGTCTGGGGCTGGAATCCAAGGGGTGAAATACTCCATCGAAGCCATGACGACGGTGAAGAGCGTTGTTTTTGACATCAAGTAAAACATAAGGAGGAAAAACAGATGGCGAAACTGACCTCGGCGGTTCCGGTTCTGACGGCACGTGATGTGGCGGGCGCGGTTGAATTTTGGACGGATCGTCTGGGCTTCAGTCGTGATTTTGTGGAAGATGACTTCGCAGGCGTGGTTCGCGATGACGTCACCCTGTTTATTTCCGCAGTTCAGGATCAAGTCGTGCCGGACAACACGCTGGCTTGGGTGTGGGTTCGTGGCCTGGATGAACTGTATGCGGAATGGAGCGAAGTTGTCTCTACCAATTTCCGTGACGCGAGCGGTCCGGCCATGACGGAAATCGGCGAACAGCCGTGGGGTCGCGAATTTGCTCTGCGTGACCCGGCTGGCAACTGTGTCCATTTCGTGGCTGAAGAACAAGATTGAGTTGAGATGACACTGTGATCTAAAAAGAGCGACTTCGGTCGCTCTTTTTTTTACCTGA 59
gapA - zeoR - proDp - gapN
ACGAAACCGGTTACTCCAACAAAGTTCTGGACCTGATCGCTCACATCTCCAAATGATTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCAACTTTAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGACTAAGCAATATAAGAATTACGTAAATGGGGAGTGGAAGCTTTCGGAGAATGAAATTAAGATCTATGAACCAGCCAGTGGGGCGGAATTGGGGTCAGTCCCGGCAATGTCCACTGAAGAAGTTGACTATGTCTACGCCTCGGCCAAAAAAGCGCAGCCAGCATGGCGCTCGCTTTCCTATATTGAGCGTGCGGCTTATTTGCACAAAGTCGCAGACATCCTGATGCGTGACAAGGAGAAAATTGGAGCGGTATTGTCCAAGGAAGTAGCGAAAGGCTACAAATCCGCAGTATCGGAGGTCGTCCGCACCGCCGAGATTATTAATTATGCGGCCGAAGAAGGGCTTCGCATGGAGGGTGAGGTCTTGGAGGGCGGCAGTTTTGAGGCGGCATCCAAGAAAAAAATCGCTGTCGTCCGTCGCGAGCCGGTGGGACTTGTGCTTGCTATTAGTCCGTTCAATTACCCCGTGAATCTGGCCGGCTCCAAGATTGCCCCTGCACTGATCGCGGGCAATGTAATCGCTTTTAAACCACCGACCCAAGGATCGATTAGTGGACTTCTTTTAGCGGAGGCGTTTGCGGAGGCAGGTCTTCCAGCCGGCGTATTCAATACCATCACGGGGCGTGGAAGTGAAATCGGGGATTACATCGTGGAGCACCAGGCAGTAAATTTCATCAACTTCACGGGTTCCACGGGGATCGGGGAGCGTATCGGTAAGATGGCTGGGATGCGTCCGATCATGTTGGAACTTGGCGGCAAGGATAGTGCGATTGTGCTGGAAGACGCAGACTTGGAATTGACAGCTAAAAACATTATCGCTGGAGCCTTCGGGTATAGTGGTCAACGTTGCACGGCAGTTAAGCGCGTTCTTGTTATGGAAAGTGTCGCGGATGAATTGGTCGAGAAGATTCGCGAGAAAGTGTTAGCTCTTACGATTGGAAATCCAGAGGACGATGCTGACATCACTCCATTGATCGACACGAAATCCGCGGATTACGTCGAGGGGCTGATCAACGACGCGAACGATAAGGGAGCAGCGGCTTTGACCGAGATCAAACGCGAGGGGAACCTGATCTGCCCGATTCTTTTTGACAAAGTCACAACTGACATGCGCTTGGCATGGGAAGAACCCTTCGGCCCAGTCTTGCCTATTATCCGCGTTACTAGCGTAGAGGAAGCAATTGAAATTTCCAATAAATCCGAATATGGGTTGCAAGCGAGTATCTTTACTAACGATTTTCCACGTGCCTTTGGTATTGCGGAACAGTTAGAAGTCGGGACAGTTCACATCAACAACAAGACGCAGCGCGGGACAGATAACTTCCCCTTTTTGGGAGCAAAGAAGTCTGGGGCTGGAATCCAAGGGGTGAAATACTCCATCGAAGCCATGACGACGGTGAAGAGCGTTGTTTTTGACATCAAGTAAAACATAAGGAGGAAAAACAGATGGCGAAACTGACCTCGGCGGTTCCGGTTCTGACGGCACGTGATGTGGCGGGCGCGGTTGAATTTTGGACGGATCGTCTGGGCTTCAGTCGTGATTTTGTGGAAGATGACTTCGCAGGCGTGGTTCGCGATGACGTCACCCTGTTTATTTCCGCAGTTCAGGATCAAGTCGTGCCGGACAACACGCTGGCTTGGGTGTGGGTTCGTGGCCTGGATGAACTGTATGCGGAATGGAGCGAAGTTGTCTCTACCAATTTCCGTGACGCGAGCGGTCCGGCCATGACGGAAATCGGCGAACAGCCGTGGGGTCGCGAATTTGCTCTGCGTGACCCGGCTGGCAACTGTGTCCATTTCGTGGCTGAAGAACAAGATTGAGTTGAGATGACACTGTGATCTAAAAAGAGCGACTTCGGTCGCTCTTTTTTTTACCTGA 60
gapA -DAS+4- zeoR
TCTACCGATTTCAACGGCGAAGTTTGCACTTCCGTGTTCGATGCTAAAGCTGGTATCGCTCTGAACGACAACTTCGTGAAACTGGTATCCTGGTACGACAACGAAACCGGTTACTCCAACAAAGTTCTGGACCTGATCGCTCACATCTCCAAAGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTGATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAATGGCGAAACTGACCTCGGCGGTTCCGGTTCTGACGGCACGTGATGTGGCGGGCGCGGTTGAATTTTGGACGGATCGTCTGGGCTTCAGTCGTGATTTTGTGGAAGATGACTTCGCAGGCGTGGTTCGCGATGACGTCACCCTGTTTATTTCCGCAGTTCAGGATCAAGTCGTGCCGGACAACACGCTGGCTTGGGTGTGGGTTCGTGGCCTGGATGAACTGTATGCGGAATGGAGCGAAGTTGTCTCTACCAATTTCCGTGACGCGAGCGGTCCGGCCATGACGGAAATCGGCGAACAGCCGTGGGGTCGCGAATTTGCTCTGCGTGACCCGGCTGGCAACTGTGTCCATTTCGTGGCTGAAGAACAAGATTGAGTTGAGATGACACTGTGATCTAAAAAGAGCGACTTCGGTCGCTCTTTTTTTTACCTGATAAAATGAAGTTAAAGGACTGCGTCATGATTAAGAAAATTTTTGCCCTTCCGGTCATCGAACAAATCTCCCCTGTCCTCTCCCGTCGTAAACTGGATGAACTGGACCTCATTGTGGTCGATCATCCCCAGGTAAAAGCCTCT 61
gltA -DAS+4- ampR
GTATTCCGTCTTCCATGTTCACCGTCATTTTCGCAATGGCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCACAGTGACGGTATGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGACTTTAAAAGCGATATCAAGCGTGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTAATAGTCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTACAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACTAATGGTTGATTGCTAAGTTGTAAATATTTTAACCCGCCGTTCATATGGCGGGTTGATTTTTATATGCCTAAACACAAAAAATTGTAAAAATAAAATCCATTAACAGACCTATATAGATATTTAAAAAGAATAGAACAGCTCAAATTATCAGCAACCCAATACTTTCAATTAAAAACTTCATGGTAGTCGCATTTATAACCCTATGAAA 62
gltA -DAS+4- purR
ACCGTCATTTTCGCAATGGCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCACAGTGACGGTATGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGACTTTAAAAGCGATATCAAGCGTGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTAATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGACTGAATACAAGCCCACGGTACGCTTGGCGACGCGCGACGATGTTCCCCGCGCTGTTCGTACATTAGCTGCGGCCTTTGCAGATTACCCAGCGACGCGCCATACGGTCGATCCGGACCGCCATATCGAGCGTGTCACAGAATTGCAGGAACTTTTCTTAACTCGCGTGGGCCTTGACATCGGAAAGGTCTGGGTGGCTGACGATGGCGCTGCAGTGGCTGTTTGGACCACTCCGGAGAGTGTAGAGGCTGGTGCAGTGTTCGCCGAAATTGGTCCTCGTATGGCCGAATTAAGTGGAAGTCGTCTGGCAGCCCAACAACAAATGGAAGGGTTGCTTGCGCCCCACCGTCCGAAAGAACCCGCGTGGTTCCTTGCCACCGTTGGAGTAAGCCCAGATCACCAGGGGAAGGGTTTAGGATCTGCCGTAGTTTTACCAGGTGTGGAGGCAGCAGAACGTGCGGGAGTTCCGGCCTTCCTTGAGACGTCGGCGCCGCGCAATTTACCGTTTTACGAACGTCTTGGATTCACCGTTACGGCGGACGTGGAGGTGCCGGAGGGACCCCGTACTTGGTGTATGACTCGTAAACCGGGAGCCTGATAATGGTTGATTGCTAAGTTGTAAATATTTTAACCCGCCGTTCATATGGCGGGTTGATTTTTATATGCCTAAACACAAAAAATTGTAAAAATAAAATCCATTAACAGACCTATATAGATATTTAAAAAGAATAGAACAGCTCAAATTATCAGCAACCCA 63
gltA -DAS+4- zeoR
GTATTCCGTCTTCCATGTTCACCGTCATTTTCGCAATGGCACGTACCGTTGGCTGGATCGCCCACTGGAGCGAAATGCACAGTGACGGTATGAAGATTGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACAGGATATGAAAAACGCGACTTTAAAAGCGATATCAAGCGTGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTAATAGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACTCACTATAGGAGGGCCATCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTTGTGGCAGAGGAGCAGGACTGAGGATAAGTAATGGTTGATTGCTAAGTTGTAAATATTTTAACCCGCCGTTCATATGGCGGGTTGATTTTTATATGCCTAAACACAAAAAATTGTAAAAATAAAATCCATTAACAGACCTATATAGATATTTAAAAAGAATAGAACAGCTCAAATTATCAGCAACCCAATACTTTCAATTAAAAACTTCATGGTAGTCGCATTTATAACCCTATGAAA 64
lpd -DAS+4- gentR
GCGGCGAGCTGCTGGGTGAAATCGGCCTGGCAATCGAAATGGGTTGTGATGCTGAAGACATCGCACTGACCATCCACGCGCACCCGACTCTGCACGAGTCTGTGGGCCTGGCGGCAGAAGTGTTCGAAGGTAGCATTACCGACCTGCCGAACCCGAAAGCGAAGAAGAAGGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTAATAGCGAATCCATGTGGGAGTTTATTCTTGACACAGATATTTATGATATAATAACTGAGTAAGCTTAACATAAGGAGGAAAAACATATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGGCTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGCCGGACTCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCCCAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCTCCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTCCTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAATTTTTCGTTTGCCGGAACATCCGGCAATTAAAAAAGCGGCTAACCACGCCGCTTTTTTTACGTCTGCAATTTACCTTTCCAGTCTTCTTGCTCCACGTTCAGAGAGACGTTCGCATACTGCTGACCGTTGCTCGTTATTCAGCCTGACAGTATGGTTACTGTC 65
udhA -DAS+4- bsdR
TCTGGGTATTCACTGCTTTGGCGAGCGCGCTGCCGAAATTATTCATATCGGTCAGGCGATTATGGAACAGAAAGGTGGCGGCAACACTATTGAGTACTTCGTCAACACCACCTTTAACTACCCGACGATGGCGGAAGCCTATCGGGTAGCTGCGTTAAACGGTTTAAACCGCCTGTTTGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTAATAGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACTCACTATAGGAGGGCCATCATGAAGACCTTCAACATCTCTCAGCAGGATCTGGAGCTGGTGGAGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACAAGCACCATGTCGGGGCGGCCATCAGGACCAAGACTGGGGAGATCATCTCTGCTGTCCACATTGAGGCCTACATTGGCAGGGTCACTGTCTGTGCTGAAGCCATTGCCATTGGGTCTGCTGTGAGCAACGGGCAGAAGGACTTTGACACCATTGTGGCTGTCAGGCACCCCTACTCTGATGAGGTGGACAGATCCATCAGGGTGGTCAGCCCCTGTGGCATGTGCAGAGAGCTCATCTCTGACTATGCTCCTGACTGCTTTGTGCTCATTGAGATGAATGGCAAGCTGGTCAAAACCACCATTGAGGAACTCATCCCCCTCAAGTACACCAGGAACTAAAGTAAAACTTTATCGAAATGGCCATCCATTCTTGCGCGGATGGCCTCTGCCAGCTGCTCATAGCGGCTGCGCAGCGGTGAGCCAGGACGATAAACCAGGCCAATAGTGCGGCGTGGTTCCGGCTTAATGCACGG 66
zwf -DAS+4- bsdR
GAAGTGGAAGAAGCCTGGAAATGGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCGATGGACAATGATGCGCCGAAACCGTATCAGGCCGGAACCTGGGGACCCGTTGCCTCGGTGGCGATGATTACCCGTGATGGTCGTTCCTGGAATGAGTTTGAGGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTAATAGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACTCACTATAGGAGGGCCATCATGAAGACCTTCAACATCTCTCAGCAGGATCTGGAGCTGGTGGAGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACAAGCACCATGTCGGGGCGGCCATCAGGACCAAGACTGGGGAGATCATCTCTGCTGTCCACATTGAGGCCTACATTGGCAGGGTCACTGTCTGTGCTGAAGCCATTGCCATTGGGTCTGCTGTGAGCAACGGGCAGAAGGACTTTGACACCATTGTGGCTGTCAGGCACCCCTACTCTGATGAGGTGGACAGATCCATCAGGGTGGTCAGCCCCTGTGGCATGTGCAGAGAGCTCATCTCTGACTATGCTCCTGACTGCTTTGTGCTCATTGAGATGAATGGCAAGCTGGTCAAAACCACCATTGAGGAACTCATCCCCCTCAAGTACACCAGGAACTAAAGTAATATCTGCGCTTATCCTTTATGGTTATTTTACCGGTAACATGATCTTGCGCAGATTGTAGAACAATTTTTACACTTTCAGGCCTCGTGCGGATTCACCCACGAGGCTTTTTTTATTACACTGACTGAAACGTTTTTGCCCTATGAGCTCCGGTTACAGGCGTTTCAGTCATAAATCCTCTGAATGAAACGCGTTGTGAATC 67
dadX -DAS+4- purR
GCGTGCGCACCATGACGGTGGGGACCGTCTCGATGGATATGCTAGCGGTCGATTTAACGCCTTGCCCGCAGGCGGGTATTGGTACGCCGGTTGAGCTGTGGGGCAAGGAGATCAAAATTGATGATGTCGCCGCCGCTGCCGGAACGGTGGGCTATGAGTTGATGTGCGCGCTGGCGCTACGCGTCCCGGTTGTGACGGTGGCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCTTAATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGACTGAATACAAGCCCACGGTACGCTTGGCGACGCGCGACGATGTTCCCCGCGCTGTTCGTACATTAGCTGCGGCCTTTGCAGATTACCCAGCGACGCGCCATACGGTCGATCCGGACCGCCATATCGAGCGTGTCACAGAATTGCAGGAACTTTTCTTAACTCGCGTGGGCCTTGACATCGGAAAGGTCTGGGTGGCTGACGATGGCGCTGCAGTGGCTGTTTGGACCACTCCGGAGAGTGTAGAGGCTGGTGCAGTGTTCGCCGAAATTGGTCCTCGTATGGCCGAATTAAGTGGAAGTCGTCTGGCAGCCCAACAACAAATGGAAGGGTTGCTTGCGCCCCACCGTCCGAAAGAACCCGCGTGGTTCCTTGCCACCGTTGGAGTAAGCCCAGATCACCAGGGGAAGGGTTTAGGATCTGCCGTAGTTTTACCAGGTGTGGAGGCAGCAGAACGTGCGGGAGTTCCGGCCTTCCTTGAGACGTCGGCGCCGCGCAATTTACCGTTTTACGAACGTCTTGGATTCACCGTTACGGCGGACGTGGAGGTGCCGGAGGGACCCCGTACTTGGTGTATGACTCGTAAACCGGGAGCCTGATAACTTGTTGTAAGCCGGATCGGAGGCAACGTCTTCTGGGTGCAAAAAAATCATCCATCCGGCTGGTCAGCAACTGTAGTTGTTAATGTGACAGAGCCATTGCCCATGATAGTGTCCATTAAAAGGATGGACACTATTTCCCCGGAACCTGAACTCACCGCACAGGCGTTCTACATAAAACGCTTACGCTTCATTGTTGACTC 68
섹션 4: 단백질 수준에 대한 동적 조절 (Dynamic Control over Protein Levels)
형광 단백질 및 침묵 가이드를 발현하는 플라스미드를 표 8에 나열된 상응하는 숙주 균주로 형질전환시켰다. 균주는 바이오매스 수준 뿐만 아니라 mCherry 수준 및 GFPuv를 포함하는 형광을 동시에 측정하는 m2p-labs Biolector™에서 3회 평가하였다.
단백질 수준에 대한 동적 조절(Dynamic Control)을 위해 사용된 균주
미생물 합성 대사 밸브 플라스미드 숙주 균주



E. coli 		RFP-control pCDF-mcherry1+pSMART-IN:yibDp-GFPuv DLF_0002
단백질 분해(Proteolysis) pCDF-mcherry2+pSMART-IN:yibDp-GFPuv DLF_0025
침묵(Silencing) pCDF-mcherry1+pCASCADE-proD+pSMART-IN:yibDp-GFPuv DLF_01517
단백질 분해(Proteolysis) + 침묵(Silencing) pCDF-mcherry2+pCASCADE-proD+pSMART-IN:yibDp-GFPuv DLF_0025
OD600 판독값(readings)은 하기 식을 사용하여 보정되었으며, 여기서 OD600은 오프라인 측정값을 나타내고, OD600*는 바이오렉터(Biolector) 바이오매스 판독 값을 나타내며, t0은 시작점을 나타내고, tf는 최종점을 나타낸다.
Figure 112019094014945-pct00002
섹션 5: 대사 조절(Metabolic Control)
평형 반응 근처(Near Equilibrium Reactions)
평형 반응 근처에서 대사물 풀에 대한 밸브의 영향을 예시로서 G6P 노드를 사용하여 설명한다. 약어: Gluc, 포도당; G6P, 글루코스-6-포스페이트, F6P, 프룩토-6-포스페이트; 6PGl, 6-포스페이트-글루코노락톤.
밸브를 갖지 않는 G6P 노드 ( G6P node without Valves)
Figure 112019094014945-pct00003
Figure 112019094014945-pct00004
Figure 112019094014945-pct00005
Figure 112019094014945-pct00006
Figure 112019094014945-pct00007
Figure 112019094014945-pct00008
Figure 112019094014945-pct00009
Figure 112019094014945-pct00010
Figure 112019094014945-pct00011
Figure 112019094014945-pct00012
Figure 112019094014945-pct00013
밸브를 갖는 G6P 노드 ( G6P node with Valves)
zwf 밸브가 작동할 때, J3
Figure 112019094014945-pct00014
0.
Figure 112019094014945-pct00015
Figure 112019094014945-pct00016
Figure 112019094014945-pct00017
Figure 112019094014945-pct00018
Figure 112019094014945-pct00019
Figure 112019094014945-pct00020
Figure 112019094014945-pct00021
밸브의 영향
Figure 112019094014945-pct00022
Figure 112019094014945-pct00023
Figure 112019094014945-pct00024
Figure 112019094014945-pct00025
네트워크로부터 평형 근처의 열역학적으로 선호되는 반응(thermodynamically favored reactions)을 제거하면 대사물 풀(metabolite pools)이 증가할 것이다.
섹션 6: 유전자 침묵 배열 및 경로 발현 구축(Gene Silencing Arrays & Pathway Expression Constructs)
CASCADE 가이드 및 가이드 배열(arrays)의 설계 및 구축은 아래의 도 14 및도 15A-B에 도시되어 있다. pCASCADE-control 플라스미드는 pcrRNA.Tet88의 pTet 프로모터를 절연된 낮은 포스페이트 유도 ugpB 프로모터로 교체함으로써 제조되었다82. 2개의 프로모터가 gltA 유전자의 조절을 담당하였고, sgRNA가 두 프로모터 모두에 대해 설계되어 가이드 gltA1(G1) 및 gltA2(G2)가 제조되었다89. 4개의 프로모터가 gapA 유전자 조절을 담당하였고, sgRNA는 첫번째 프로모터를 위해 설계되었는데, 이는 성장의 지수 상태(exponential phase) 동안, gapA mRNA는 주로 고효율 gapA P1 프로모터에서 개시되고, 다른 3개의 gapA 프로모터와 비교하여 정지 상태(stationary phase) 동안 높은 상태로 유지되기 때문이다90. lpd 유전자의 상류(upstream)에 다수의 프로모터가 lpd 조절 (https://ecocyc.org/gene?orgid=ECOLI&id=EG10543#tab=showAll)에 관여하므로, lpd에 대해서만 독특하고 효과적인 sgRNA의 설계는 불가능하였다. fabI, udhA 및 zwf에 대한 프로모터 서열은 EcoCyc 데이터베이스 (https://ecocyc.org/)에서 확보하였다. CASCADE 가이드 배열을 설계하기 위해, 관심 있는 프로모터의 -35 또는 -10 박스 근처의 CASCADE PAM 사이트를 식별하고, PAM 부위의 3'말단에서 30 bp를 가이드 서열로 선택하고, 제조자의 프로토콜에서 5 % v/v DMSO를 Q5 PCR 반응에 첨가하도록 변형하여, Q5 부위-지정 돌연변이법(NEB, MA)을 사용하여 pCASCADE 플라스미드에 클로닝하였다. pCASCADE-control 벡터를 주형으로 사용하였다. 2개 이상의 가이드의 배열을 갖는 pCASCADE 플라스미드를 도 15A-B에 도시된 바와 같이 제조하였다. pCASCADE 가이드 배열 플라스미드는 PCR에 의해 각각의 더 작은 가이드 플라스미드의 상보적 반쪽을 순차적으로 증폭시킨 이후, DNA 어셈블리하여 제조되었다. 표 9는 sgRNA 가이드 서열 및 이들을 구축하는데 사용된 프라이머를 나타낸다. 모든 pCASCADE 침묵 플라스미드는 하기 표 10에 나열되어 있으며, Addgene에서 구입할 수 있다.
sgRNA 가이드 서열 및 이들을 구축하는데 사용한 프라이머 목록. 스페이서는 이탤릭체로 표기함
sgRNA / 프라이머 명 서열 서열번호 주형
fabI TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 69
fabI-FOR GTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAAAAAACCCC 70 pCASCADE control
fabI-REV GGTTATTATAATCAACGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAGGTGGTACCAGATC 71
gapAP1 TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTTTACAGGCAACCTTTTATTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 72
gapAP1-FOR CAGGCAACCTTTTATTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAAAAAACCCC 73 pCASCADE control
gapAP1-REV TAAAATTACAAAAACCGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAGGTGGTACCAGATC 74
gltA1 TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 75
gltA1-FOR GCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAAAAAACCCC 76 pCASCADE control
gltA1-REV ATTATATGCTTTTCGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAGGTGGTACCAGATCT 77
gltA2 TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 78
gltA2-FOR GGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAAAAAACCCC 79 pCASCADE control
gltA2-REV GAATGAATTGGTCAATACGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAGGTGGTACCAGATCT 80
proD TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAGTGGTTGCTGGATAACTTTACGGGCATGCTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 81
proD-FOR AACTTTACGGGCATGCTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAAAAAACCCC 82 pCASCADE control
proD-REV ATCCAGCAACCACTCGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAGGTGGTACCAGATCT 83
udhA TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 84
udhA-FOR TTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAAAAAACCCC 85 pCASCADE control
udhA-REV GCAACAGAATGGTAACGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAGGTGGTACCAGATC 86
zwf TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 87
zwf-FOR CAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAAAAAACCCC 88 pCASCADE control
zwf-REV TACTGCTTTTACGAGCGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAGGTGGTACCAGATC 89
FG1 TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 90
gltA1-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCG 91 pCASCADE-gltA1
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 92
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 93 pCASCADE-fabI
fabI-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATACGAACAGATAAACGGTTATTATAATC 94
FG2 TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 95
gltA2-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTC 96 pCASCADE-gltA2
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 97
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 98 pCASCADE-fabI
fabI-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATACGAACAGATAAACGGTTATTATAATC 99
FU TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 100
udhA-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTG 101 pCASCADE-udhA
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 102
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 103
pCASCADE-fabI
fabI-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATACGAACAGATAAACGGTTATTATAATC 104
FZ TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 105
zwf-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAG 106 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 107
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 108 pCASCADE-fabI
fabI-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATACGAACAGATAAACGGTTATTATAATC 109
G1G2 TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 110
gltA2-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTC 111 pCASCADE-gltA2
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 112
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 113 pCASCADE-gltA1
gltA1-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTTCATAACTTTTAC 114
G1U TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 115
udhA-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTG 116 pCASCADE-udhA
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 117
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 118 pCASCADE-gltA1
gltA1-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTTCATAACTTTTAC 119
G1Z TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 120
zwf-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAG 121 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 122
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 123 pCASCADE-gltA1
gltA1-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTTCATAACTTTTAC 124
G2U TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 125
udhA-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTG 126 pCASCADE-udhA
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 127
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 128 pCASCADE-gltA2
gltA2-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTAATAACTGTC 129
G2Z TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 130
zwf-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAG 131 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 132
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 133 pCASCADE-gltA2
gltA2-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTAATAACTGTC 134
UZ TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 135
zwf-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAG 136 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 137
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 138 pCASCADE-udhA
udhA-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATTCTTATACATAAAAGC 139
FG1G2 TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 140
gltA2-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTC 141 pCASCADE-gltA2
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 142
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 143 pCASCADE-FG1
gltA1-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTTCATAACTTTTAC 144
G1G2A TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGCAACCTTTTATTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 145
gapAP1-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGC 146 pCASCADE-gapAP1
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 147
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 148 pCASCADE-G1G2
gltA2-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTAATAACTGTC 149
G1G2U TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 150
udhA-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTG 151 pCASCADE-udhA
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 152
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 153 pCASCADE-G1G2
gltA2-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTAATAACTGTC 154
G1G2Z TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 155
zwf-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAG 156 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 157
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 158 pCASCADE-G1G2
gltA2-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTAATAACTGTC 159
FG1G2A TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGCAACCTTTTATTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 160
gapAP1-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGC 161 pCASCADE-gapAP1
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 162
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 163 pCASCADE-FG1G2
gltA2-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTAATAACTGTC 164
FG1G2U TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 165
gltA2-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTC 166 pCASCADE-udhA
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 167
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 168 pCASCADE-FG1G2
gltA1-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTTCATAACTTTTAC 169
FG1G2Z TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 170
gltA2-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTC 171 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 172
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 173 pCASCADE-FG1G2
gltA1-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGAACTTCATAACTTTTAC 174
G1G2UA TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGCAACCTTTTATTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 175
gapAP1-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGC 176 pCASCADE-gapAP1
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 177
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 178 pCASCADE-G1G2U
udhA-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATTCTTATACATAAAAGC 179
G1G2UZ TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 180
zwf-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAG 181 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 182
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 183 pCASCADE-G1G2U
udhA-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATTCTTATACATAAAAGC 184
FG1G2UA TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGCAACCTTTTATTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 185
gapAP1-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGC 186 pCASCADE-gapAP1
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 187
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 188 pCASCADE-FG1G2U
udhA-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATTCTTATACATAAAAGC 189
FG1G2UZ TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 190
zwf-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAG 191 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 192
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 193 pCASCADE-FG1G2U
udhA-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATTCTTATACATAAAAGC 194
FG1G2UZA TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTGATTATAATAACCGTTTATCTGTTCGTATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAAGCATATAATGCGTAAAAGTTATGAAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTATTGACCAATTCATTCGGGACAGTTATTAGTTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGCAACCTTTTATTCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 195
gapAP1-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGGTTTTTGTAATTT　TACAGGC 196 pCASCADE-gapAP1
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 197
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 198 pCASCADE-FG1G2UZ
zwf-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATCTTACGGTGCACTGTAC 199
UZ TCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTTACCATTCTGTTGCTTTTATGTATAAGAATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAGCAGTACAGTGCACCGTAAGATCGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCG 200
zwf-FOR GCGCCAGCGGGGATAAACCGCTCGTAAAAG 201 pCASCADE-zwf
pCASCADE-REV CTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGG 202
pCASCADE-FOR CCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG 203 pCASCADE-udhA
udhA-REV CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCGATTCTTATACATAAAAGC 204
본 연구에서 사용된 플라스미드 목록
본 연구에서 사용된 플라스미드
플라스미드 목적 출처
pSIM5 Recombineering and Strain Construction Court Lab 54
pCP20 FRT kanamycin cassette curing Court Lab 54
pSMART-HC-Kan 백본 벡터 Lucigen
pcrRNA.Tet pCASCADE-control 백본 Beisel Lab 34
본 연구에서 구축된 플라스미드
플라스미드 플라스미드 명 Addgene ID
pSMART-Ala2 pSMART-HCKan-IN:yibDp-ald* 71326
pSMART-Ala3 pSMART-HCKan-IN:phoBp-ald* 71327
pSMART-Ala4 pSMART-HCKan-IN:phoHp-ald* 71328
pSMART-Ala5 pSMART-HCKan-IN:mipAp-ald* 71329
pSMART-Ala11 pSMART-HCKan-proA-ald* 87172
pSMART-Ala12 pSMART-HCKan-proC-ald* 87173
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섹션 7: 2 -단계 미세발효 (2-Stage Micro- fermentations )
E. coli 배지 원액
● 10X 농축된 암모늄-시트레이트 30(Ammonium-Citrate 30) 염 (1L), 30g의 (NH4)2SO4 와 1.5g의 시트르산을 물에서 교반하며 혼합하고, 10M NaOH를 사용하여 pH를 7.5로 맞춤. 오토클레이브 및 실온(RT) 보관.
● 10X 농축된 암모늄-시트레이트 90(Ammonium-Citrate 90) 염 (1L), 90g의 (NH4)2SO4 와 2.5g의 시트르산을 물에서 교반하며 혼합하고, 10M NaOH를 사용하여 pH를 7.5로 맞춤. 오토클레이브 및 실온(RT) 보관.
● 1M 칼륨 3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산 (Potassium 3-(N-morpholino) propanesulfonic Acid, MOPS), 50% KOH로 pH 7.4로 맞춤. 여과(0.2 um) 멸균 및 상온 보관.
● 0.5M 인산 칼륨 완충액(potassium phosphate buffer)m pH 6.8, 248.5mL 의 1.0M K2HPO4 및 251.5 mL 의 1.0M KH2PO4를 혼합하고 최종 부피를 초순수(ultra pure water)로 1000ml로 조정함. 여과(0.2 um) 멸균 및 상온 보관.
● 2M MgSO4 및 10 mM CaSO4 용액. 여과(0.2 um) 멸균 및 상온 보관.
● 티아민-HCl(thiamine-HCl)의 50g/L 용액. 여과(0.2 um) 멸균 및 4℃ 보관.
● 포도당 500g/L 용액. 열과 함께 교반하여 용해시킨 후 냉각하고, 여과(0.2 um) 멸균 및 상온 보관.
● 100g/L 효모 추출물, 오토 클레이브 및 RT에 보관.
● 100g/L 카사미노산(casamino acid), 오토 클레이브 및 RT에 보관.
● 500X 미량 금속 원액(Trace Metal Stock): 10mL의 농축 H2SO4를 포함하는 1000mL의 물에 미량 영양소(micronutrients) 용액을 준비함. 0.6g CoSO4·7H2O, 5.0 g CuSO4·5H2O, 0.6g ZnSO4·7H2O, 0.2g Na2MoO4·2H2O, 0.1g H3BO3, 및 0.3g MnSO4·H2O. 오토 클레이브 및 RT의 어두운 곳에서 보관.
● 물에 40mM 황산 제2철 수화물(ferric sulfate heptahydrate)의 신선한 용액을 준비하고 매번 배지를 준비하기 전에 여과 멸균(0.2μm)함
배지 조성
침전을 최소화하기 위해 기재된 순서대로 하기 표에 기초한 원액(stock solutions)을 무균상태로 혼합함으로써 최종 배지를 제조한 후, 여과 멸균한다(0.2 um 필터 사용).
종 배양 배지(Seed Media), pH 6.8
성분 단위 SM10 SM10++
(NH4)2SO4 g/L 9 9
Citric Acid g/L 0.25 0.25
Potassium Phosphate mM 5 5
CoSO4 ·7H2O g/L 0.0048 0.0048
CuSO4 ·5H2O g/L 0.04 0.04
ZnSO4 ·7H2O g/L 0.0048 0.0048
Na2MoO4 ·2H2O g/L 0.0016 0.0016
H3BO3 g/L 0.0008 0.0008
MnSO4 ·H2O g/L 0.0024 0.0024
FeSO4 ·7H2O g/L 0.044 0.044
MgSO4 mM 2.5 2.5
CaSO4 mM 0.06 0.06
Glucose g/L 45 45
MOPS mM 200 200
Thiamine-HCl g/L 0.01 0.01
Yeast Extract g/L 1 2.5
Casamino Acids g/L 0 2.5
생산/세척 배지, pH 6.8
성분 단위 FGM3 FGM3 No Phosphate FGM3 Wash FGM3+40 mM phosphate FGM10
(NH4)2SO4 g/L 3 3 3 3 9
Citric Acid g/L 0.15 0.15 0.15 0.15 0.25
Potassium Phosphate mM 1.8 0 0 40 5
CoSO4 ·7H2O g/L 0.0024 0.0024 0 0.0024 0.0048
CuSO4 ·5H2O g/L 0.02 0.02 0.00 0.02 0.04
ZnSO4 ·7H2O g/L 0.0024 0.0024 0 0.0024 0.0048
Na2MoO4 ·2H2O g/L 0.0008 0.0008 0 0.0008 0.0016
H3BO3 g/L 0.0004 0.0004 0 0.0004 0.0008
MnSO4 ·H2O g/L 0.0012 0.0012 0 0.0012 0.0024
FeSO4 ·7H2O g/L 0.022 0.022 0 0.022 0.044
MgSO4 mM 2 2 0 2 2.5
CaSO4 mM 0.05 0.05 0 0.05 0.06
Glucose g/L 45 25 0 45 25
MOPS mM 200 200 0 200 0
Thiamine-HCl g/L 0.01 0.01 0 0.01 0.01
미세발효
미세발효 공정의 개요는 도 16A-C에 도시되어 있다. 균주를 96 웰 플레이트미세발효하여 24 시간의 생산 단계 동안 생산성을 평가하였다. 여기서 세포는 초기에 중기-로그 상태(mid-log phase)로 성장시켜 수확(harvest)한 후, 세척하고 재현탁하였으며, OD600=1에서 포스페이트-프리 생산 배지로 정규화하였다. 미세발효의 성공은 다음을 요구하였다: (1) 지수 상태(exponential phase)에서 모든 균주를 수확함으로써 균주를 싱크 (sync)시키고, (2) 낮은 바이오매스 수준을 이용하기 때문에, 배치(batch) 당을 낮게 유지시키며 상당한 잠재적 생성물 축적이 가능하게 하여야 하며, (3) 적절한 혼합 및 통기(aeration)를 공급하는 방법으로 증발 손실(evaporative losses)을 최소화한다. 마지막 요구 사항을 해결하기 위해 EnzyScreen™ 에서 판매되는 마이크로플레이트 샌드위치 커버 및 클램프를 사용하였으며, 400rpm에서 작동하는 표준 25mm 궤도 진탕기에서 높은 수준의 혼합 및 통기가 가능하게 하여 증발 손실을 현저히 감소시켰다92 -93. 상이한 절연된 프로모터를 사용한 알라닌 생산에 대한 미세발효 결과는 도 17에 나타내었다. gapA 및 gapN 유전자 변형(gene alterations)으로 평가된 균주에 대한 미세발효 결과는 도 18에 나타내었다.
섹션 8: 미세발효 견고성 평가 (Micro-fermentation robustness evaluation)
이전에 보고되고 (http://www.enzyscreen.com/oxygen_transfer_rates.htm)92, 93, 표 14에 기재된 바와 같이, 미세발효 산소 견고성 연구 동안, 생산 배양 부피(production culture volume)는 원하는 산소 전달 속도 (oxygen transfer rate, OTR) 값이 달성되도록 변화시켰다. 생산 단계 동안 배치(batch) 포도당 수준을 변경하여 포도당에 대한 견고성을 평가하였다. 미세발효 규모에서 견고성 실험에 사용된 균주는 표 15에 나타내었다. 미세발효 견고성 연구 결과는 도 19A-D, 도 20A-D, 도 21A-D, 도 22A-D, 도 23A-D, 도 24A-D, 도 25A-D, 도 26A-D, 도 27A-D, 도 28A-D, 도 29A-D, 도 30A-D, 도 31A-D 및 도 32에서 볼 수 있다 .
상이한 OTR 값에 대한 배양 조건
25mm orbit shaker
Max OTR 교반 속도 채운 부피(Fill Volume)
( mmol /L-hr) (rpm) (㎕)
25 400 100
20 400 150
15 400 200
미세발효 견고성 평가에 사용한 균주 목록 및 이들의 RS 점수
균주 # 침묵 단백질 분해 플라스미드 RS
1 gltA1 FU pSMART-Ala2 89.6
2 gltA1 F pSMART-Ala2 89.5
3 gltA1 GU pSMART-Ala2 89.4
4 FG1G2 None pSMART-Ala2 89.3
5 G1G2 GU pSMART-Ala2 88.8
6 FG1G2 G pSMART-Ala2 88.2
7 G1G2 F pSMART-Ala2 83.4
8 gltA2 FGU pSMART-Ala2 83.4
9 gltA1 FGU pSMART-Ala2 83.1
10 G1G2 FGU pSMART-Ala2 82.3
11 gltA2 U pSMART-Ala2 82.2
12 gltA2 F pSMART-Ala2 80.6
13 FG1G2 FG pSMART-Ala2 80.5
14 None G pSMART-Ala2 79.9
15 gltA2 GU pSMART-Ala2 77.9
16 fabI FGU pSMART-Ala2 75.7
17 None FG pSMART-Ala2 75.4
18 G1G2 FU pSMART-Ala2 75.3
19 None FGU pSMART-Ala2 73.4
20 None FU pSMART-Ala2 73.3
21 gltA1 U pSMART-Ala2 72.9
22 fabI FG pSMART-Ala2 69.1
23 FG1G2 FU pSMART-Ala2 67.6
24 gltA2 FU pSMART-Ala2 67.5
25 None F pSMART-Ala2 65.6
26 gltA2 FG pSMART-Ala2 62.1
27 FG1G2 F pSMART-Ala2 61.1
28 fabI GU pSMART-Ala2 59.9
29 fabI F pSMART-Ala2 59.6
30 gltA1 FG pSMART-Ala2 58.1
31 gltA1 None pSMART-Ala2 57.1
32 None None pSMART-Ala2 55.5
33 G1G2 None pSMART-Ala2 54.1
34 fabI U pSMART-Ala2 53.9
35 gltA2 G pSMART-Ala2 52.8
36 fabI None pSMART-Ala2 50.3
37 fabI FU pSMART-Ala2 48.4
38 gltA2 None pSMART-Ala2 47.8
39 FG1G2 FGU pSMART-Ala2 44.6
40 None GU pSMART-Ala2 42.9
41 None U pSMART-Ala2 39.3
42 fabI G pSMART-Ala2 39.2
43 gltA1 G pSMART-Ala2 34.7
44 G1G2 FG pSMART-Ala2 32.8
45 FG1G2 U pSMART-Ala2 29.4
46 FG1G2 GU pSMART-Ala2 24.3
47 G1G2 G pSMART-Ala2 24.1
48 G1G2 U pSMART-Ala2 -25.3
49 None None pSMART-Ala13 55.7
50 None None pSMART-Ala12 -31.5
51 None None pSMART-Ala15 -103.2
52 None None pSMART-Ala11 -114.1
53 None None pSMART-Ala14 -441.5
섹션 9: 표준화된 2-단계 발효 (Standardized 2-Stage Fermentation)
표준화된 포스페이트 제한된 2-단계 발효 공정을 모든 밸브 균주의 평가에 사용하였다. 이 공정은 다른 생성물을 만드는 균주에서도 균주간 변동성(strain to strain variability)을 최소화하여 고도의 재현 가능한 성장 상태를 산출한다. 상이한 균주에 의한 상이한 양분 공급 속도(feed rates) 및 기본 이용률(base utilization)의 차이로 인해 생산 단계 동안에 더 유의한 변동성(significant variablity)이 관찰되었다. 도 33A는 본 연구에서 수행된 1L 발효에서 10 \g·cdw/L 바이오매스 수준을 갖는 모든 밸브 균주의 성장 곡선을 제공한다. 이러한 일관성은 도 33B에 주어진 성장 연관 생산 균주의 보다 가변적인 성장과 대조된다.
메발론산 확장성(scalability)에 사용된 균주
균주 # 침묵 단백질 분해 플라스미드
1 FG1G2 FU pSMART-Mev2
2 G2Z FGUA pSMART-Mev2
3 FG1G2A FUN pSMART-Mev2
4 UZ FGUA pSMART-Mev2
섹션 10: 분석 방법 (Analytical Methods)
UPLC-MS/MS 파라미터
Analyte Retention Time (min) ESI Mode MRM Transition(s) Cone Voltage Collision Energy
알라닌 0.5 + 89.95→44.08 15 9
C13-알라닌 0.5 + 91.95→46.08 15 9
도면의 상세한 설명(Detailed description of figures)
도 1A: 2-단계 발효에서 동적 대사 조절의 개요. 대사 공학은 공급 원료를 원하는 생성물로 전환하여, 원하는 생성물로의 대사 경로를 숙주의 기존 대사 네트워크로 최적화하는 것을 포함함. 채워진 원(filled circles)은 대사물(metabolites)을 나타내고 선(lines)은 효소 반응을 나타냄. 대사 공학의 전통적인 최적화는, 종종 세 가지 주요 단계를 포함하는데, (a) 바람직하지 않은 부산물로 이어지는 경로를 포함한 경쟁적인 비-필수 대사 경로의 제거 및 및 공급 원료 분자를 생성물로 전환시키는 경로에서 효소의 과발현 (더 두꺼운 선으로 표시됨) 및 (b) 잠재적으로 생산을 추가로 증가시키기 위하여 필수 대사에서의 효소를 약화(오렌지색 선으로 표시). 이 과정을 반복하여 원하는 생성물에 대한 수율을 최적화함 (pie charts). 대조적으로, 동적 대사 네트워크 최소화는 일반적으로 사용되는 2 단계 발효 공정의 잠재력을 완전히 해제(fully unlock)하기 위해 사용될 수 있음(c-d). 이 과정의 첫 단계에서 (c) 바이오 매스 성장과 수율이 최적화되고, 두 번째 단계에서 (d) 생성물 형성이 최적화되는데, 이는, (e) 바이오 매스 양이 축적되며 제한 양분(이 경우에는, 무기 포스페이트)을 소비하고, 양분이 고갈될 때 생산적인 정지 상태로 진입하도록 하는 2-단계 공정에 적합함. CRISPRi 기반 유전자 침묵 및/또는 조절된 단백질 분해를 이용하는 합성 대사 밸브를 사용함으로써, 생산 단계로 전환할 때 관련 대사 네트워크를 크게 줄일 수 있으며(f와 g), (f) 침묵 가이드의 배열 (array)이 유도되고, CASCADE 복합체에 의해 개별 가이드로 처리되며, 다중의 관심 유전자 (GOI)를 표적하여 침묵시키는 데 사용될 수 있음. (g) C-말단 DAD+4 lags가 염색체 변형을 통해 관심 효소 (EOI)에 첨가되면, 이들은 유도성 sspB 샤페론의 존재 하에 clpXP 프로테아제에 의해 유도적으로 분해될 수 있음. (h) 유도성 단백질 분해 및 CRISPRi 침묵을 갖는 2 단계 동적 조절을 사용하여 E. coli에서 단백질 수준에 대한 동적 조절함. 세포가 성장함에 따라 포스페이트가 고갈되고, 세포는 mCherry를 "trun off"하고 GFPuv를 "tun on" 함. 음영처리된 영역은 평균으로부터 하나의 표준 편차를 나타냄, n=3. 단백질 분해(proteolysis) 및 유전자 침묵(gene silencing) 단독 또는 조합의 (i) mCherry 분해에 대한 상대적 영향(relative impact) 및 (ii) 붕괴율(decary rates).
도 1B: 균주 및 생물 공정의 최적화. (a) 대사 공학에서 균주 및 공정 최적화에 대한 기존의 접근 방식은 종종 경쟁적인 비-필수 대사 경로의 제거 및 경로 효소의 과발현을 포함함(채워진 원(filled circles): 대사물, 선(lines): 효소 반응, 녹색: 생산 경로). (a-i) 균주 변이체가 스크리닝 규모에서 평가됨 (마이크로타이터 플레이트, 쉐이크 플라스크 등), (a-ii) 최상의 균주들이 더 큰 규모의 장치화된 생물 반응기(instrumendted bioreactor)에서 평가됨. 환경 (공정) 변수의 often-critical 최적화 (a-vii)를 포함하여 수많은 설계-구축-테스트-주기(design-build-test cycles (a-vi-vii))가 생산 균주 및 공정 모두를 최적화하기 위하여 반복적으로 사용됨. (a-iii) 최고 성능의 균주 및 연관된 최적화된 공정 조건이 산업적으로 관련된 수준으로 규모화됨. (b) 2-단계 동적 대사 조절을 이용한 신속한 균주 및 생물공정 최적화. 세포 내 대사 네트워크는 생성물 형성에 필수적인 단계만으로 동적 최소화됨. 이는 표준화된 2-단계 생물공정(c)에서 달성되며, 여기서 바이오매스를 축적하는 성장 단계는 최소한의 대사 네트워크만을 갖는 생산 단계로 이어짐. 대량양분 (macronutrient)의 제한은 성장에서 생산으로 세포 대사를 "전환(switch)"하는데 사용될 수 있음. 이러한 접근은 더 작은 서브 세트의 잠재적인 균주 변이를 스크리닝하게 한다(b-i). 대사 네트워크 최소화는 관련 대사물 양과 그에 따른 생성물 양을 증가시키도록 도와주고(d), 또한 공정 견고성을 강화시키며(e), 그 결과 균주 및 공정의 확장성도 강화시킨다(f). 스크리닝으로 식별된 최고의 생산자는 예측가능하게 그리고 신속하게 더 큰 장치화된 생물반응기(larger instrumented bioreactor)로 규모화되며(b-ii), 이후 산업적 관련 수준까지 규모화됨(b-iii). 필요한 경우, 설계-구축-테스트-주기(design-build-test cycles) (b-iv)가 개선을 돕기 위하여 통합됨. 모든 규모에서 생성물 독립적이고, 표준화된 공정이 균주 평가에 사용되므로, 집중적인 공정 최적화의 필요성이 제거됨.
도 2A-D: E. coli 에서 2-단계 합성 대사 밸브 (Synthetic Metabolic Valves, SMVs)의 구현. 도 2A는 CRISPRi 기반의 유전자 침묵 및/또는 조절된 단백질 분해를 이용하여 SMV가 구축되었음을 나타냄. (상단) 침묵(Silencing): 유도성 침묵 가이드 RNA의 배열은 (i) 천연의 E. coli CRISPR/Cascade machinery가 발현될 때, 다수의 관심 유전자(multiple genes of interest (GOI))의 발현을 침묵시키기 위하여 사용될 수 있고, 이는 가이드 배열(guide arrays)을 개별적인 가이드(individual guides)로 처리(process)할 수 있다 (ii). (하단) 단백질 분해(Proteolysis): C- 말단 DAS + 4 태그가 (염색체 변형을 통해) 관심 효소에 첨가될 때, 이들은 sspB 샤페론의 조절된 유도에 따라 (iii), clpXP 프로테아제에 의해 분해될 수 있다 (iv). 도 2B는 유도성 단백질 분해 및 CRISPRi 침묵을 이용한 E. coli에서의 단백질 수준에 대한 동적 조절(control)을 나타냄. 세포가 성장함에 따라 포스페이트가 고갈되고, 세포는 mCherry를 "turn OFF"하고, GFPuv를 "turn ON"한다. 음영된 영역은 상대 형광 단위(r.f.u)의 평균으로부터 하나의 표준 편차를 나타냄. 도 2C는 단백질 분해 및 유전자 침묵 단독 및 조합에 따른 mCherry 분해에 대한 상대적인 영향을 나타냄. n.f.u. 정규화 된 형광 단위 (최대 형광으로 정규화 됨). 도 2D는 단백질 분해 및 유전자 침묵 단독 및 조합에 따른 관찰된 mCherry 형광 붕괴율 (시간당)에 대한 상대적인 영향을 나타냄.
도 3A-K: E. coli 에서 2-단계 동적 제어를 이용한 알라닌 생산. 도 3A는 균주 변이 디자인을 나타냄. 중심 대사에서의 1차 경로는 해당과정(Glycolysis), 펜토오스 포스페이트 경로(Pentose Phosphate Pathway), 시트르산 회로(the Citric Acid Cycle (TCA)), 지방산 생합성(Fatty Acid Biosynthesis), 및 가용성 수소전이 효소(Soluble Transhydrogenase)를 포함하여 도시됨. 중심 대사를 통해 플럭스를 감소시키기 위해 "turned OFF" 되는 주요 밸브 후보 효소/유전자는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase (zwf-"Z")), 리포아미드 탈수소효소(lipoamide dehydrogenase (lpd-"L")), 시트레이트 합성효소(citrate synthase (gltA-"G")), 에노일-ACP 환원효소(enoyl-ACP reductase (fabI-"F")) 및 가용성 수소전이효소 (soluble transhydrogenase (udhA-"U"))를 포함할 수 있음. 중요하게도, fabI의 동적 제거는 말로닐-CoA 플럭스 뿐만 아니라 세포 내 말로닐-CoA 풀을 증가시키는 것으로 이미 입증된 바 있음55. 동적으로 "turned ON"되는 효소는 관심 생성물, 본 발명에서는 알라닌을 생산하기 위한 대사 경로를 포함할 수 있음. 특이적 경로 효소는 NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (ald *) 및 알라닌 추출효소 (alaE)를 포함함. 또한, 알라닌 생산경로가 보조인자로서 NADPH를 이용함에 따라, S. mutans로부터의 gapN 유전자에 의해 인코딩되는 NADPH-의존성 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소56가 단독으로 또는 천연의(native) gapA-“A” 유전자(NADH 의존성 글리세르알데히드 탈수소효소)를 턴오프(trun-off) 되는 것과 함께, 턴온(turn-on) 됨. 약어: PTS - 포도당 인산전이효소 수송 시스템(glucose phosphotransferase transport system), P - 포스페이트(phosphate), BP - 비스포스페이트(bisphosphate), OAA - 옥살로아세테이트(oxaloacetate), DHAP - 디하이드록시아세톤 포스페이트(dihydroxyacetone phosphate), GA3P - 글리세르알데하이드-3-포스페이트(glyceraldehyde-3-phosphate), 1,3-BPG - 1,3-비스포스포글리세레이트(1,3 bisphosphoglycerate), 3-PG - 3-포스포글리세레이트(3-phosphoglycerate), 2-PG - 2-포스포글리세레이트(2-phosphoglycerate), PEP - 포스포페놀피루베이트( phosphoenolpyruvate), MSA - 말로네이트 세미알데하이드(malonate semialdehyde), ACP - 아실 운반 단백질(acyl carrier protein), Ru - 리불로스(ribulose), Xu - 자일루로스(xylulose), E - 에르티리오스(erthryose), Ri - 리보오스(ribose), S - 세도헵튤로오스(sedoheptulose). 유전자 침묵(gene silencing) 단독, 단백질 분해(proteolysis) 단독, 또는 이 둘의 조합을 통해, 밸브 유전자/효소의 모든 조합의 동적 제어를 위해 균주를 SMV로 조작함. 이들 균주를 표준화된 미세발효에서 알라닌 생성에 대해 평가함. 도 3B는 2-단계 미세발효에서 검사된 모든 밸브 균주의 평균 알라닌 역가(검정색)에 대한 랭크 순서에 따른 플롯을 나타내며, 회색 영역은 표준 편차를 나타냄. 대조군 균주에서의 알라닌 생산은 빨간색으로 나타냄. 도 3C는 상이한 단백질 분해 및 침묵 조합에 반응한 2-단계 생산에서, 0g/L (보라색) 내지 5g/L (적색)의 평균 알라닌 역가를 나타냄. 도 3D는 단일 "밸브" 알라닌 균주 (gltA1의 침묵("G1"), fabI 및 udhA의 단백질 분해("FU"))에 대해 평가된 상이한 산소 전달 속도 (OTR) 및 포도당 농도에 반응하는 평균 알라닌 역가를 나타냄. 이 표면의 결과는 균주-특이적 견고성 점수 (strain-specific robustness score, RS)를 계산하기 위해 사용되었고 (텍스트 참조), 이 균주는 가장 높은 RS 점수를 가짐. 도 3E는 다수의 공정 조건에 걸쳐 평가된 48개의 "밸브" 균주의 서브 세트에 대한 견고성 점수의 히트 맵을 나타냄. 도 3F는 최고의 생산 균주 중 하나 (fabI-gltA1-gltA2의 침묵("FG1G2"), fabI, gltA 및 udhA의 단백질 분해 ( "FGU"))를 미세발효에서 1L 생물 반응기로 스케일-업 한 결과로, 이는 48 시간 생산 후 80g/L의 역가, 0.8 g/g의 수율을 나타냄. 도 3G는 이 균주에서 alaE 알라닌 추출효소의 과발현에 따른 현저히 증가된 생산성을 보여주며, 27시간에서 147 g/L의 생산 및 ~1 g/g의 수율에 도달하였음(자세한 내용은 보충 자료, 섹션 3을 참조). 도 3H는 미세발효에서 견고성 평가를 위해 선택된 균주를 나타냄. 도 3I는 가장 강력한 "밸브" 알라닌 균주 (Silencing_gltAl, Proteolysis_FU)에 대한 견고성 및 역가를 나타냄. 하부 표면은 평가된 모든 공정 조건의 평균으로 정규화된 알라닌 역가에 대한 히트 맵을 나타내고, 상부 표면은 모든 공정 조건 하에서 알라닌 역가를 나타내며, 동일한 색상 스케일 (g/L의 알라닌 역가)이 두 패널에 사용되었음. 도 3J는 선택된 균주에 대한 RS3 점수를 나타냄. 도 3K는 평가된 모든 조건에 대한 공정 재현성 히트 맵을 나타냄. 도 3J 및 도 3K에서 동일한 그레이스케일(grayscale)이 사용됨.
도 4A-F: 2-단계 및 성장 연관 접근법 사이의 견고성 비교. 도 4A는 평가된 모든 알라닌 균주에 대한 RS3 점수 순위를 나타냄. 적색 막대는 밸브 알라닌 균주, 청색 막대는 성장 연관 (GA) 알라닌 균주를 나타냄. 도 4B는 단백질 분해 "F" 밸브 (proteolysis “F” valve)를 갖는 "밸브" 알라닌 균주 및 성장 연관 알라닌 균주에 대한 평균 RS3 점수를 나타냄. 도 4C는 평가된 모든 조건의 미세발효에서 대표적인 "밸브" 알라닌 (Proteolysis_FGU, Silencing_gltA1) 및 성장 연관 알라닌 균주에 대한 최대 역가 플롯을 나타냄. 도 4D는 평가된 모든 조건 하에서 성장 연관 알라닌 균주에 대한 공정 재현성을 나타냄. 도 4E는 대표적인 견고한 "밸브" 알라닌 (Proteolysis_FGU, Silencing_gltA1)에 대한 견고성 및 역가를 나타냄. 도 4F는 GA2 균주에 대한 견고성 및 역가를 나타냄. 하부 표면은 평가된 모든 공정 조건의 평균으로 정규화된 알라닌 역가에 대한 히트 맵을 나타내고, 상부 표면은 모든 공정 조건 하에서 알라닌 역가를 나타내며, 동일한 색상 스케일 (g/L의 알라닌 역가)이 두 패널에 사용되었음.
도 5A-J: 미세발효(도 5A-D) 및 1L 발효(도 5E-J)에서 "밸브" 및 성장 연관 알라닌 생산의 비교. 견고성 분석(robustness analysis)에 사용된 모든 균주의 평균 알라닌 역가(도 5A) 및 견고성 점수(도 5B). 선택된 "밸브" (도 5C) 및 성장 연관 (도 5D) 알라닌 균주에 대한 상이한 OTR 및 포도당 농도에 대한 평균 알라닌 역가. 도 5B에서 별표 (asterisk)로 표시된 균주가 본 분석에 사용됨. 이 두 균주는 1L 성능 비교를 위해 선택됨. 도 5E 및 도 5F는 평균 특이적 생산성 (SP, g/gdcw-h), 평균 포도당 섭취율 (GUR, g/gcdw-h), 최대 역가 (g/L) 및 최대 수율(g/g)을 포함하는, 평가된 1L 성능 지표를 나타냄. 도 5G 및 5H는 μL에서 1L까지의 확장성을 나타냄. 1L 데이터는 50시간의 생산 시간 내에서 최대 역가로 표준화됨. 포도당 고갈을 피하기 위하여 성장 연관 균주에 적절한 양분이 공급됨. 도 5I와 도 5J는 각각 도 5G와 도 5H에서 사용된 모든 균주에 대한 1L 생산 프로파일을 나타내며, 어두운 기호(darker symbols)는 성장 곡선을 나타내고, 밝은 기호(lighter symbols)는 생산 곡선을 나타내고, 기호 모양은 도 5G 또는 도 5H에서 동일한 균주를 나타냄.
도 6A-H: E. coli 에서 2-단계 동적 제어를 이용한 메발로네이트 생산. 도 6A는 메발로네이트 생산을 위한 대사 경로 및 SMV를 도시함. 도 6B는 대조군 균주에서 다양한 프로모터 조합을 갖는 몇몇 생산 경로 플라스미드 변이를 사용한 메발로네이트 생산을 도시함. 도 6C는 단백질 분해 및 침묵 SMV (proteolytic and silencing SMVs) 조합과 함께, 도 6B로부터 최고의 생산 경로를 사용하여, 메발로네이트를 생산하는 "밸브" 균주의 서브세트에 대한 미세발효 결과를 도시함. 도 6D는 1L 스케일에서 평가된 메발로네이트 균주의 서브세트에 대한 uL의 1L로의 확장성을 도시함. uL 데이터에서 n=3, 1L 데이터에서 n=1. 50시간의 생산 시간 내의 최대 역가가 상관관계(correlation)에 사용됨. 도 6E는 1L 생물반응기에서 도 6D(fabI-gltA1-gltA2 ("FG1G2")의 침묵, fabl 및 udhA ("FU")의 단백질 분해)로부터 최고의 메발로네이트 균주의 생산을 도시함. 78시간의 생산에서 97 g/L의 역가가 관찰됨. 생산 단계 (production stage) 동안의 수율은 0.46 g/g (이론적 수율의 84%)에 도달함. (자세한 내용은 보충 자료, 섹선 9 참조). 도 6F는 3-HP를 생산하는 균주의 서브세트에 대한 미세발효 결과를 도시함. 도 6G는 1L 스케일에서 평가된 3-HP 균주의 서브세트에 대한 uL로부터 1L로의 확장성을 도시함 (보충 자료, 표 S21 및 표22). 도 6H는 1L 시스템에서 최고의 3-HP 균주에 대한 생산 성능을 도시함, 사각형, 3-HP/메발론산 역가; 원: OD600. 최고 생산자(the highest producers)에서 생산 단계 동안의 수율은 메발론산에 대해 0.46 g/g, 3-HP에 대해 0.63 g/g에 도달함.
도 7: 포스페이트 고갈 프로모터 (phosphate depletion promoter) 특성. 종래 알려진 12개의 포스페이트 조절 프로모터 (phosphate regulated promoter)의 발현 수준을 평가하기 위하여 한 세트의 GFP 리포터 벡터를 구축함. 포스페이트에 대해 제한된 최소 배지를 사용하였을 때 표준화된 프로토콜을 사용하여 Biolector™ 에서 균주의 GFP 발현을 지속적으로 평가함. 바이오매스 수준이 최고점에 도달하였을 때(명확성을 위해 표시하지 않음), GFP 발현이 시작됨. 중요하게, 본 프로모터 세트는 광범위한 발현 수준을 가능하게 함.
도 8: 절연된 포스페이트 고갈 프로모터 특성(insulated phosphate depletion promoter). FGM3 배지에서 5개의 절연된 포스페이트 조절 프로모터의 발현 수준을 평가하기 위해 한 세트의 GFP 리포터 벡터를 구축함. 포스페이트에 대해 제한된 최소 배지를 사용하였을 때 표준화된 프로토콜을 사용하여 Biolector™ 에서 균주의 GFP 발현을 지속적으로 평가함. 바이오매스 수준이 최고점에 도달하였을 때(명확성을 위해 표시하지 않음), GFP 발현이 시작됨. 중요하게, 본 프로모터 세트는 광범위한 발현 수준을 가능하게 함.
도 9: 절연된 구성 프로모터 특성(insulated constitutive promoter). 40 mM 포스페이트를 포함하는 FGM3 배지에서 5개의 절연된 구성 프로모터의 발현 수준을 평가하기 위하여 한 세트의 GFP 리포터 벡터를 구축함. 음영된 영역은 표준편차를 나타냄, n=3. Biolector™에서 균주들의 지속적인 GFP 발현을 평가함. GFP 발현은 오직 proA, proB 및 proD 프로모터에서만 관찰됨.
도 10: 2 -단계 발효에서 최적의 3-HP 플럭스에 대한 대사 모델링 결과. 좌측: 바이오매스 생산이 목적 함수로 사용된 성장 단계 동안의 최적화된 플럭스. 우측: 3-HP 생산이 목적 함수로 사용된 3-HP 생산 단계 동안 최적화된 플럭스 (바이오매스 생산은 0으로 설정됨). 플럭스는 100ml의 포도당이 사용되었을 때 주어진 반응을 통한 플럭스의 상대적 비율 또는 몰로 표시됨.
도 11: 염색체 변형.
도 12: 1L FGM10 최소 배지 발효에서 출발 숙주 균주의 평균 최대 성장 속도, n=2.
도 13A-E: 1L 표준 최소 배지 발효에서 출발 숙주 균주의 성장기 동안 이용되는 포도당 분포. DLF_0025에 대한 지수기 중기 (mid exponential) 및 최종 성장 (final growth) 기간의 결과를 나타내었으며, "생산"이 지수기 중후기 (mid-late exponential phase)에서 시작됨. 결과는 2회의 발효의 평균임. 도 13A, BW25113; 도 13B, BWapldf; 도 13C, DLF_0001; 도 13D, 지수기 중기에서의 DLF_0025; 도 13E, 성장기 말기에서의 DLF_0025. 단위는 그램 포도당임.
도 14: pCASCADE-control 플라스미드 구축 방안.
도 15A-B: pCASCADE 구축 방안. 도 15A, single sgRNA 클로닝, 도 15B, double sgRNA
도 16A-C: 미세발효 공정의 개요. (A) 고 처리량 미세발효 (high throughput micro-fermentation) 공정에 대한 개요. 냉동실 원액 (또는 콜로니가 사용될 수 있음)이 96웰 플레이트에 SM10++로 접종됨. 배양은 16시간 동안 밤샘 성장시키고, 원심 분리에 의해 수확하며, 포스페이트가 없는 배지로 세척한 후 표적 바이오매스 수준에서 포스페이트가 없는 배지에 재현탁함. (OD600nm=1.0). EnzyScreen™ 커버 및 클램프가 증발을 줄이고 높은 산소 전달 속도를 가능하게 하기 위해 사용됨. 이 프로토콜은 Tecan Evo liquid handler로 구현됨. (B) 96웰 플레이트 배양에서 대표적인 밤샘 성장, 밤샘 배양에 대한 OD600 분포를 플로팅함. (C) Tecan Evo liquid handler를 사용한 정규화(normalization) 후 대표적인 OD600 분포.
도 17: DLF_0025 균주에서 상이한 절연된 포스페이트 프로모터를 사용한 L- 알라닌 생산을 위한 미세발효.
도 18: gapN/gapA 균주에 의한 L-알라닌 생산을 위한 열 지도(Heatmap).
도 19A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 20A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 21A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 22A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 23A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 24A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 25A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 26A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 27A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 28A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 29A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 30A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 31A-D: 견고성에 대해 평가된 4개의 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 32: 견고성에 대해 평가된 균주에서의 미세발효에서 상이한 OTR 및 포도당 농도에 따른 알라닌 생산.
도 33A-B: 본원에서 평가된 모든 밸브 (도 33A) 및 성장 (도 33B) 연관 균주에 대한 1L 규모에서의 성장 프로파일. 지체 시간 (lag time)의 변동을 설명하기 위해 성장 곡선을 싱크(sync) 시킴. 밸브 균주 성장 곡선을 동일한 지수기 중간점 (mid-exponential point)로 싱크(sync) 시킴. 성장 연관 균주의 성장 곡선은 동일 상향점 (take-off point)로 싱크(sync) 시킴.
도 34: 본원에서 평가된 메발로네이트 균주 1과 문헌으로부터 가장 높은 메발로네이트 역가를 갖는 균주에 대한 특이적 생산성(specific Productivity, SP) 비교.
도 35: MS 측정으로부터의 알라닌 표준 곡선. 삼중 표준 측정으로부터 질량 스펙 반응(mass spec response )에 대한 평균 및 표준편차를 플로팅함.
도 36A-B: RI 측정으로부터의 포도당 (도 36A) 및 에탄올 (도 36B) 표준 곡선. 삼중 표준 측정으로부터 피크 지역(peak area)에 대한 평균 및 표준편차를 플로팅함.
도 37: TUV 측정으로부터의 3-하이드록시프로피온산 표준 곡선. 이중 표준 측정으로부터 피크 지역(peak area)에 대한 평균 및 표준편차를 플로팅함.
도 38A-D: L-알라닌 (도 38A), D-알라닌 (도 38B), 메발론산 (도 38C) 및 메발로노락톤(mevalonolactone) (도 38D) 에 대한 TUV 표준 곡선. 삼중 표준 측정으로부터 피크 지역(peak area)에 대한 평균 및 표준편차를 플로팅함.
본 발명의 바람직한 실시예가 본원에 도시되고 설명되었으나, 이러한 실시예가 단지 예시적으로 제공되는 것임은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 다수의 변형, 변경, 치환이 당업자에게 일어날 것이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 다음의 청구범위로 본 발명의 범위를 정의하고자 하고, 청구범위의 범위 내에서 방법 및 구조, 이들의 등가물이 다음의 청구범위에 의해 보호받고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> DUKE UNIVERSITY <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ROBUST DYNAMIC METABOLIC CONTROL <130> Pi19-B236 <140> <141> <150> 62/461,436 <151> 2017-02-21 <160> 204 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 tctttctgac accttactat cttacaaatg taacaaaaaa gttatttttc tgtaattcga 60 gcatgtcatg ttaccccgcg agcataaaac gcgtgtgtag gaggataatc tatg 114 <210> 2 <211> 160 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 gtgcgtaatt gtgctgatct cttatatagc tgctctcatt atctctctac cctgaagtga 60 ctctctcacc tgtaaaaata atatctcaca ggcttaatag tttcttaata caaagcctgt 120 aaaacgtcag gataacttct gtgtaggagg ataatctatg 160 <210> 3 <211> 174 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 cgattacgta aagaagttat tgaagcatcc tcgtcagtaa aaagttaatc ttttcaacag 60 ctgtcataaa gttgtcacgg ccgagactta tagtcgcttt gtttttattt tttaatgtat 120 ttgtagtgta ggaggataat ctatggctag caaaggagaa gaacttttca catg 174 <210> 4 <211> 154 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 gccacggaaa tcaataacct gaagatatgt gcgacgagct tttcataaat ctgtcataaa 60 tctgacgcat aatgacgtcg cattaatgat cgcaacctat ttattgtgta ggaggataat 120 ctatggctag caaaggagaa gaacttttca catg 154 <210> 5 <211> 120 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 agacagtcaa cgcgcttgat agcctggcga agatcatccg atcttcgcct tacacttttg 60 tttcacattt ctgtgacata ctatcggatg tgcggtaatt gtataggagg ataatctatg 120 <210> 6 <211> 125 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 gctatgccgg actgaatgtc caccgtcagt aatttttata cccggcgtaa ctgccgggtt 60 attgcttgtc acaaaaaagt ggtagactca tgcagttaac tcactgtgta ggaggataat 120 ctatg 125 <210> 7 <211> 206 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 catccataaa ttttgcataa ttaatgtaaa gaccaggctc gccagtaacg ctaaattcat 60 ttggctgtaa gcgcggtgtc atccgcgtca ggaaaattaa acagttactt taaaaaatga 120 aaacgtaaaa aggttgggtt tcgatgtatt gacgggtaaa ctttgtcgcc cgctaaacat 180 ttgtttgtgt aggaggataa tctatg 206 <210> 8 <211> 184 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 aatcctgctg aaagcacaca gcttttttca tcactgtcat cactctgtca tctttccagt 60 agaaactaat gtcactgaaa tggtgtttta tagttaaata taagtaaata tattgttgca 120 ataaatgcga gatctgttgt acttattaag tagcagcgga agttcgtgta ggaggataat 180 ctat 184 <210> 9 <211> 359 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 ctacagagat gacgtgtaga aaatagttac cgatataaat agttacagct aaacgcctga 60 aattacatgt cgagggcact atttaaaaca attttgagga tttccttata ttggtggtta 120 gtacgcatgc aattaaaaat gaaattccgc gaccacaagc caaaataaca aacggcaagg 180 agacaaaaat aagcacaaat agccaacacg tcctctgttc actttaaagg gaatcgctga 240 aaaatacgct ctgtttaagg ggattcacct ttctcagaaa gctattccgc ccttttcctg 300 ctgagaaatc gccacattcg gcatgacaac attgtgaaag tgtaggagga taatctatg 359 <210> 10 <211> 156 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 accgaactga agcaggatta caccgtggtg atcgtcaccc acaacatgca gcaggctgcg 60 cgttgttccg accacacggc gtttatgtac ctgggcgaat tgattgagtt cagcaacacg 120 gacgatctgt tcaccagtgt aggaggataa tctatg 156 <210> 11 <211> 151 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 11 aagactttat ctctctgtca taaaactgtc atattcctta catataactg tcacctgttt 60 gtcctatttt gcttctcgta gccaacaaac aatgctttat gagtgtagga ggataatcta 120 tggctagcaa aggagaagaa cttttcacat g 151 <210> 12 <211> 186 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 12 agcatggcgt tttgttgcgc gggatcagca agcctagcgg cagttgttta cgcttttatt 60 acagatttaa taaattacca cattttaaga atattattaa tctgtaatat atctttaaca 120 atctcaggtt aaaaactttc ctgttttcaa cgggactctc ccgctggtgt aggaggataa 180 tctatg 186 <210> 13 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60 gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120 gcgtttatac acagctaaca ccacgtcgtc cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt 180 tgctggataa cgtgcgtaat tgtgctgatc tcttatatag ctgctctcat tatctctcta 240 ccctgaagtg actctctcac ctgtaaaaat aatatctcac aggcttaata gtttcttaat 300 acaaagcctg taaaacgtca ggataacttc tatattcagg gagaccacaa cggtttccct 360 ctacaaataa ttttgtttaa cttt 384 <210> 14 <211> 284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 cgcaaaaaac cccgcttcgg cggggttttt tcgcacgtct ccatcgcttg cccaagttgt 60 gaagcacagc taacaccacg tcgtccctat ctgctgccct aggtctatga gtggttgctg 120 gataacgcca cggaaatcaa taacctgaag atatgtgcga cgagcttttc ataaatctgt 180 cataaatctg acgcataatg acgtcgcatt aatgatcgca acctatttat tatattcagg 240 gagaccacaa cggtttccct ctacaaataa ttttgtttaa cttt 284 <210> 15 <211> 365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 cgccgaaaac cccgcttcgg cggggttttg ccgcacgtct ccatcgcttg cccaagttgt 60 gaagcacagc taacaccacg tcgtccctat ctgctgccct aggtctatga gtggttgctg 120 gataaccatc cataaatttt gcataattaa tgtaaagacc aggctcgcca gtaacgctaa 180 attcatttgg ctgtaagcgc ggtgtcatcc gcgtcaggaa aattaaacag ttactttaaa 240 aaatgaaaac gtaaaaaggt tgggtttcga tgtattgacg ggtaaacttt gtcgcccgct 300 aaacatttgt ttatattcag ggagaccaca acggtttccc tctacaaata attttgttta 360 acttt 365 <210> 16 <211> 320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 aaaaaaaaac cccgcccctg acagggcggg gtttttttta cgtctccatc gcttgcccaa 60 gttgtgaagc acagctaaca ccacgtcgtc cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt 120 tgctggataa caccgaactg aagcaggatt acaccgtggt gatcgtcacc cacaacatgc 180 agcaggctgc gcgttgttcc gaccacacgg cgtttatgta cctgggcgaa ttgattgagt 240 tcagcaacac ggacgatctg ttcaccaata ttcagggaga ccacaacggt ttccctctac 300 aaataatttt gtttaacttt 320 <210> 17 <211> 350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 cgccgcaaac cccgcccctg acagggcggg gtttcgccgc acgtctccat cgcttgccca 60 agttgtgaag cacagctaac accacgtcgt ccctatctgc tgccctaggt ctatgagtgg 120 ttgctggata acaatcctgc tgaaagcaca cagctttttt catcactgtc atcactctgt 180 catctttcca gtagaaacta atgtcactga aatggtgttt tatagttaaa tataagtaaa 240 tatattgttg caataaatgc gagatctgtt gtacttatta agtagcagcg gaagttcata 300 ttcagggaga ccacaacggt ttccctctac aaataatttt gtttaacttt 350 <210> 18 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 cgccgaaaac cccgcttcgg cggggttttg ccgcacgtct ccatcgcttg cccaagttgt 60 gaagcacagc taacaccacg tcgtccctat ctgctgccct aggtctatga gtggttgctg 120 gataacttta cgggcatgca taaggctcgt aggctatatt cagggagacc acaacggttt 180 ccctctacaa ataattttgt ttaacttt 208 <210> 19 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 aaaaaaaaac cccgcccctg acagggcggg gtttttttta cgtctccatc gcttgcccaa 60 gttgtgaagc acagctaaca ccacgtcgtc cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt 120 tgctggataa ctttacgggc atgcataagg ctcgtaatat atattcaggg agaccacaac 180 ggtttccctc tacaaataat tttgtttaac ttt 213 <210> 20 <211> 214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 cgccgcaaac cccgcccctg acagggcggg gtttcgccgc acgtctccat cgcttgccca 60 agttgtgaag cacagctaac accacgtcgt ccctatctgc tgccctaggt ctatgagtgg 120 ttgctggata actttacggg catgcataag gctcgtatga tatattcagg gagaccacaa 180 cggtttccct ctacaaataa ttttgtttaa cttt 214 <210> 21 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 cgcaaaaaac cccgcttcgg cggggttttt tcgcacgtct ccatcgcttg cccaagttgt 60 gaagcacagc taacaccacg tcgtccctat ctgctgccct aggtctatga gtggttgctg 120 gataacttta cgggcatgca taaggctcgt ataatatatt cagggagacc acaacggttt 180 ccctctacaa ataattttgt ttaacttt 208 <210> 22 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60 gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120 gcgtttatac acagctaaca ccacgtcgtc cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt 180 tgctggataa cctccttcac agattcccaa tctcttgtta aataacgaaa aagcatcaat 240 taaaacccat gtctttctat attccagcaa tgttttatag gggacatatt gatgaagatg 300 ggtatcacct tagtgaattg ctataagctg ctcttttttg ttcgtgatat actgataaat 360 tgaattttca cacttcatat tcagggagac cacaacggtt tccctctaca aataattttg 420 tttaacttt 429 <210> 23 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 taacaataaa aatgaaaatg atttccacga tacagaaaaa agagactgtc atcctaattt 60 ttgttgacac tctatc 76 <210> 24 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 tgccactcag gtatgatggg cagaatattg cctctgcccg ccagaaaaag atcaaaggga 60 aaactgtcca tatgc 75 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ccgacaggga ttccatctg 19 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 tatgacgacc attttgtcta cagttc 26 <210> 27 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 ggacttttgt acttcctgtt tcgatttagt tggcaattta ggtagcaaac tcctaatttt 60 tgttgacact ctatc 75 <210> 28 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 ataaaaacgg cgctaaaaag cgccgttttt tttgacggtg gtaaagccga atcaaaggga 60 aaactgtcca tatgc 75 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 cctgactgta ctaacggttg ag 22 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 tgacttttat ggcgttcttt gtttttg 27 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 ctggtacacg ctgatgaaca cc 22 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 ctggtcattg ccatttgtgc c 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 gaatcagagc gttccgaccc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 gtacgcagtt tgccaacgtg 20 <210> 35 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 aatagcccgc tgatatcatc gataatacta aaaaaacagg gaggctatta tcctaatttt 60 tgttgacact ctatc 75 <210> 36 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 tacagggatc cagttatcaa taagcaaatt catttgttct ccttcatatg atcaaaggga 60 aaactgtcca tatgc 75 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 caagacatgt gtatatcact gtaattc 27 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gcgattgcag atttatgatt tgg 23 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 gcaaaatgct ggctcattg 19 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 gaactgaatg gcaaactgac tg 22 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 tggggatgat cgaccaca 18 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 tatcatcctg aaagcgatgg 20 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 atctcaccgt gtgatcgg 18 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 caaaagagat tctgggtatt cact 24 <210> 45 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 ctgctggaaa ccatgcg 17 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 agagcatgtc gttataggag gtgat 25 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 agtactcaac caagtcattc tg 22 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 gagcatggtg atcttctcag t 21 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 gcgatgaatg tcttactacg ga 22 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 gtcgctgggt aatctgcaa 19 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 atcaacgcat atagcgctag cag 23 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 actgaagccc agacgatc 18 <210> 53 <211> 3527 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 tcctaatttt tgttgacact ctatcattga tagagttatt ttaccactcc ctatcagtga 60 tagagaaaag tgaaatgaat agttcgacaa agatcgcatt ggtaattacg ttactcgatg 120 ccatggggat tggccttatc atgccagtct tgccaacgtt attacgtgaa tttattgctt 180 cggaagatat cgctaaccac tttggcgtat tgcttgcact ttatgcgtta atgcaggtta 240 tctttgctcc ttggcttgga aaaatgtctg accgatttgg tcggcgccca gtgctgttgt 300 tgtcattaat aggcgcatcg ctggattact tattgctggc tttttcaagt gcgctttgga 360 tgctgtattt aggccgtttg ctttcaggga tcacaggagc tactggggct gtcgcggcat 420 cggtcattgc cgataccacc tcagcttctc aacgcgtgaa gtggttcggt tggttagggg 480 caagttttgg gcttggttta atagcggggc ctattattgg tggttttgca ggagagattt 540 caccgcatag tccctttttt atcgctgcgt tgctaaatat tgtcactttc cttgtggtta 600 tgttttggtt ccgtgaaacc aaaaatacac gtgataatac agataccgaa gtaggggttg 660 agacgcaatc gaattcggta tacatcactt tatttaaaac gatgcccatt ttgttgatta 720 tttatttttc agcgcaattg ataggccaaa ttcccgcaac ggtgtgggtg ctatttaccg 780 aaaatcgttt tggatggaat agcatgatgg ttggcttttc attagcgggt cttggtcttt 840 tacactcagt attccaagcc tttgtggcag gaagaatagc cactaaatgg ggcgaaaaaa 900 cggcagtact gctcggattt attgcagata gtagtgcatt tgccttttta gcgtttatat 960 ctgaaggttg gttagttttc cctgttttaa ttttattggc tggtggtggg atcgctttac 1020 ctgcattaca gggagtgatg tctatccaaa caaagagtca tcagcaaggt gctttacagg 1080 gattattggt gagccttacc aatgcaaccg gtgttattgg cccattactg tttgctgtta 1140 tttataatca ttcactacca atttgggatg gctggatttg gattattggt ttagcgtttt 1200 actgtattat tatcctgcta tcgatgacct tcatgttaac ccctcaagct caggggagta 1260 aacaggagac aagtgcttag ttatttcgtc accaaatgat gttattccgc gaaatataat 1320 gaccctcttg ataacccaag agcatcacat atacctgccg ttcactatta tttagtgaaa 1380 tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc aactttatgc ccatgcaaca 1440 gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag attttttagt tctttaggcc 1500 cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa agaggaaaat agaccagttg 1560 caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta aatcgcgcgg gtttgttact 1620 gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt gtatactttg gcgtcacccc 1680 ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact tgccatcttc aaacaggagg 1740 gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg agacatgaac gatgaacatc 1800 aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta ccgcactgct ggcaggaggc 1860 gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat ataaggaaac atacggcatt 1920 tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac agcaaaaaaa tgaaaaatat 1980 caagttcctg agttcgattc gtccacaatt aaaaatatct cttctgcaaa aggcctggac 2040 gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg tcgcaaacta tcacggctac 2100 cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg 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<400> 55 ctgtttcgat ttagttggca atttaggtag caaactcggc tttaccaccg tcaaaaaaaa 60 cggcgctttt 70 <210> 56 <211> 476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 56 caagacatgt gtatatcact gtaattcgat atttatgagc agcatcgaaa aatagcccgc 60 tgatatcatc gataatacta aaaaaacagg gaggctatta ccaggcatca aataaaacga 120 aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 180 tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct gcgtttatat ctttctgaca 240 ccttactatc ttacaaatgt aacaaaaaag ttatttttct gtaattcgag catgtcatgt 300 taccccgcga gcataaaacg cgtgtgtagg aggataatct ttgacggcta gctcagtcct 360 aggtacagtg ctagccatat gaaggagaac aaatgaattt gcttattgat aactggatcc 420 ctgtacgccc gcgaaacggg gggaaagtcc aaatcataaa tctgcaatcg ctatac 476 <210> 57 <211> 974 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 caagacatgt gtatatcact gtaattcgat atttatgagc agcatcgaaa aatagcccgc 60 tgatatcatc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 gcggcgagct gctgggtgaa atcggcctgg caatcgaaat gggttgtgat gctgaagaca 60 tcgcactgac catccacgcg cacccgactc tgcacgagtc tgtgggcctg gcggcagaag 120 tgttcgaagg tagcattacc gacctgccga acccgaaagc gaagaagaag gcggccaacg 180 atgaaaacta ttctgaaaac tatgcggatg cgtcttaata gcgaatccat gtgggagttt 240 attcttgaca cagatattta tgatataata actgagtaag cttaacataa ggaggaaaaa 300 catatgttac gcagcagcaa cgatgttacg cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta 360 ggtggctcaa gtatgggcat cattcgcaca tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc 420 atgcgggctg ctcttgatct tttcggtcgt gagttcggag acgtagccac ctactcccaa 480 catcagccgg actccgatta cctcgggaac ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt 540 gctgccttcg accaagaagc ggttgttggc gctctcgcgg cttacgttct gcccaagttt 600 gagcagccgc gtagtgagat ctatatctat gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg 660 cagggcattg ccaccgcgct catcaatctc ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct 720 tatgtgatct acgtgcaagc agattacggt gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag 780 ttgggcatac gggaagaagt gatgcacttt 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caggcacccc tactctgatg aggtggacag atccatcagg gtggtcagcc cctgtggcat 600 gtgcagagag ctcatctctg actatgctcc tgactgcttt gtgctcattg agatgaatgg 660 caagctggtc aaaaccacca ttgaggaact catccccctc aagtacacca ggaactaaag 720 taaaacttta tcgaaatggc catccattct tgcgcggatg gcctctgcca gctgctcata 780 gcggctgcgc agcggtgagc caggacgata aaccaggcca atagtgcggc gtggttccgg 840 cttaatgcac gg 852 <210> 67 <211> 898 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 60 gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 120 acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gaggcggcca acgatgaaaa ctattctgaa 180 aactatgcgg atgcgtctta atagttgaca attaatcatc ggcatagtat atcggcatag 240 tataatacga ctcactatag gagggccatc atgaagacct tcaacatctc tcagcaggat 300 ctggagctgg tggaggtcgc cactgagaag atcaccatgc tctatgagga caacaagcac 360 catgtcgggg cggccatcag gaccaagact ggggagatca tctctgctgt ccacattgag 420 gcctacattg gcagggtcac tgtctgtgct gaagccattg ccattgggtc tgctgtgagc 480 aacgggcaga aggactttga caccattgtg gctgtcaggc acccctactc tgatgaggtg 540 gacagatcca tcagggtggt cagcccctgt ggcatgtgca gagagctcat ctctgactat 600 gctcctgact gctttgtgct cattgagatg aatggcaagc tggtcaaaac caccattgag 660 gaactcatcc ccctcaagta caccaggaac taaagtaata tctgcgctta tcctttatgg 720 ttattttacc ggtaacatga tcttgcgcag attgtagaac aatttttaca ctttcaggcc 780 tcgtgcggat tcacccacga ggcttttttt attacactga ctgaaacgtt tttgccctat 840 gagctccggt tacaggcgtt tcagtcataa atcctctgaa tgaaacgcgt tgtgaatc 898 <210> 68 <211> 1181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 68 gcgtgcgcac catgacggtg gggaccgtct cgatggatat gctagcggtc gatttaacgc 60 cttgcccgca ggcgggtatt ggtacgccgg ttgagctgtg gggcaaggag atcaaaattg 120 atgatgtcgc cgccgctgcc ggaacggtgg gctatgagtt gatgtgcgcg ctggcgctac 180 gcgtcccggt tgtgacggtg gcggccaacg atgaaaacta ttctgaaaac tatgcggatg 240 cgtcttaatc ctgacggatg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 caggcaacct tttattcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgaaaa aaaaacccc 59 <210> 74 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 taaaattaca aaaaccggtt tatccccgct ggcgcgggga actcgaggtg gtaccagatc 60 <210> 75 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 93 <210> 76 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 gcgtaaaagt tatgaagttc gagttccccg cgccagcggg gataaaccga aaaaaaaacc 60 cc 62 <210> 77 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 attatatgct tttcggttta tccccgctgg cgcggggaac tcgaggtggt 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Sequence: Synthetic primer <400> 82 aactttacgg gcatgctcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgaaa aaaaaacccc 60 <210> 83 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 atccagcaac cactcggttt atccccgctg gcgcggggaa ctcgaggtgg taccagatct 60 <210> 84 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttaccattc tgttgctttt atgtataaga 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cg 92 <210> 85 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 ttttatgtat aagaatcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgaaaa aaaaacccc 59 <210> 86 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 gcaacagaat ggtaacggtt tatccccgct ggcgcgggga actcgaggtg gtaccagatc 60 <210> 87 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Synthetic primer <400> 91 gcgccagcgg ggataaaccg aaaagcatat aatgcg 36 <210> 92 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 93 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 94 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59 <210> 95 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgtattgacc aattcattcg ggacagttat 120 tagttcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccg 155 <210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37 <210> 97 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 97 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 98 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 98 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 99 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 99 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59 <210> 100 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 100 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgttaccatt ctgttgcttt tatgtataag 120 aatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153 <210> 101 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 101 gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34 <210> 102 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 102 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 103 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 103 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 104 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 104 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59 <210> 105 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgctcgtaaa agcagtacag tgcaccgtaa 120 gatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153 <210> 106 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 106 gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30 <210> 107 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 107 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 108 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 108 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 109 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 109 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atacgaacag ataaacggtt attataatc 59 <210> 110 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 110 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120 ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccg 156 <210> 111 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 111 gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37 <210> 112 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 112 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 113 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 114 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 114 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47 <210> 115 <211> 154 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 115 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgttaccat tctgttgctt ttatgtataa 120 gaatcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accg 154 <210> 116 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 116 gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34 <210> 117 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 117 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 118 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 118 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 119 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 119 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47 <210> 120 <211> 154 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 120 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgctcgtaa aagcagtaca gtgcaccgta 120 agatcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accg 154 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 121 gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30 <210> 122 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 122 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 123 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 123 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 124 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 124 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47 <210> 125 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 125 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gtattgacca attcattcgg gacagttatt 60 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgttacca ttctgttgct tttatgtata 120 agaatcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccg 155 <210> 126 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 126 gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34 <210> 127 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 127 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 128 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 128 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 129 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 129 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44 <210> 130 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 130 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gtattgacca attcattcgg gacagttatt 60 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgctcgta aaagcagtac agtgcaccgt 120 aagatcgagt tccccgcgcc agcggggata aaccg 155 <210> 131 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 131 gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30 <210> 132 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 132 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 133 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 133 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 134 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 134 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44 <210> 135 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 135 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttaccattc tgttgctttt atgtataaga 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgctcgtaaa agcagtacag tgcaccgtaa 120 gatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153 <210> 136 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 136 gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30 <210> 137 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 137 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 138 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 138 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 139 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 139 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48 <210> 140 <211> 217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 140 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180 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gggacagtta 120 ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccggttt ttgtaatttt acaggcaacc 180 ttttattcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccg 217 <210> 146 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 146 gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40 <210> 147 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 147 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 148 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 148 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 149 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 149 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44 <210> 150 <211> 217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 150 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120 ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgttac cattctgttg cttttatgta 180 taagaatcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccg 217 <210> 151 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 151 gcgccagcgg ggataaaccg ttaccattct gttg 34 <210> 152 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 152 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 153 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 153 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 154 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 154 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44 <210> 155 <211> 217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 155 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120 ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgctcg taaaagcagt acagtgcacc 180 gtaagatcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccg 217 <210> 156 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 156 gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30 <210> 157 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 157 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 158 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 158 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 159 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 159 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44 <210> 160 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 160 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180 attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccggtt tttgtaattt tacaggcaac 240 cttttattcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278 <210> 161 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 161 gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40 <210> 162 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 162 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 163 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 163 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 164 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 164 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aactaataac tgtc 44 <210> 165 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 165 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180 attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240 ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278 <210> 166 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 166 gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37 <210> 167 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 167 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 168 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 168 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 169 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 169 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47 <210> 170 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 170 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180 attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgctc gtaaaagcag tacagtgcac 240 cgtaagatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278 <210> 171 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 171 gcgccagcgg ggataaaccg tattgaccaa ttcattc 37 <210> 172 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 172 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 173 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 173 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 174 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 174 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg aacttcataa cttttac 47 <210> 175 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 175 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120 ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgttac cattctgttg cttttatgta 180 taagaatcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccggtt tttgtaattt tacaggcaac 240 cttttattcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278 <210> 176 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 176 gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40 <210> 177 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 177 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 178 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 178 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 179 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 179 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48 <210> 180 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 180 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gaaaagcata taatgcgtaa aagttatgaa 60 gttcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccgtattgac caattcattc gggacagtta 120 ttagttcgag ttccccgcgc cagcggggat aaaccgttac cattctgttg cttttatgta 180 taagaatcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgctc gtaaaagcag tacagtgcac 240 cgtaagatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccg 278 <210> 181 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 181 gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30 <210> 182 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 182 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 183 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 183 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 184 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 184 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48 <210> 185 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 185 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180 attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240 ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccggt ttttgtaatt ttacaggcaa 300 ccttttattc gagttccccg cgccagcggg gataaaccg 339 <210> 186 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 186 gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40 <210> 187 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 187 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 188 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 188 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 189 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 189 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48 <210> 190 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 190 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180 attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240 ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccgct cgtaaaagca gtacagtgca 300 ccgtaagatc gagttccccg cgccagcggg gataaaccg 339 <210> 191 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 191 gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30 <210> 192 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 192 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 193 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 193 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 194 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 194 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48 <210> 195 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 195 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttgattata ataaccgttt atctgttcgt 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgaaaagcat ataatgcgta aaagttatga 120 agttcgagtt ccccgcgcca gcggggataa accgtattga ccaattcatt cgggacagtt 180 attagttcga gttccccgcg ccagcgggga taaaccgtta ccattctgtt gcttttatgt 240 ataagaatcg agttccccgc gccagcgggg ataaaccgct cgtaaaagca gtacagtgca 300 ccgtaagatc gagttccccg cgccagcggg gataaaccgg tttttgtaat tttacaggca 360 accttttatt cgagttcccc gcgccagcgg ggataaaccg 400 <210> 196 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 196 gcgccagcgg ggataaaccg gtttttgtaa ttttacaggc 40 <210> 197 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 197 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 198 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 198 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 199 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 199 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg atcttacggt gcactgtac 49 <210> 200 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 200 tcgagttccc cgcgccagcg gggataaacc gttaccattc tgttgctttt atgtataaga 60 atcgagttcc ccgcgccagc ggggataaac cgctcgtaaa agcagtacag tgcaccgtaa 120 gatcgagttc cccgcgccag cggggataaa ccg 153 <210> 201 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 201 gcgccagcgg ggataaaccg ctcgtaaaag 30 <210> 202 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 202 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccgg 28 <210> 203 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 203 ccggatgagc attcatcagg cgggcaag 28 <210> 204 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 204 cggtttatcc ccgctggcgc ggggaactcg attcttatac ataaaagc 48

Claims (86)

  1. 다음 단계를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물로부터 생성물을 생산하기 위한 다단계 발효 생물공정:
    (Ⅰ) 생성물 형성에 필수적인 단계만으로 동적 최소화된 대사 네트워크를 통해 탄소 흐름이 제한되어 미생물이 생성물을 생산하기 위해 환경 조건에 대한 세포 반응을 통해 적응할 수 없도록 유전적으로 변형된 미생물을 제공하는 단계;
    (Ⅱ) 배지에서, 상기 유전적으로 변형된 미생물을 성장기 (growth phase)로 성장시키는 단계;
    여기서, 상기 유전적으로 변형된 미생물은
    i. 생성물의 생합성을 위한 생산 효소를 하나 이상 포함하는 생산 경로; 및
    ii. 유전적으로 변형된 미생물 내의 다수의 대사 경로를 통해 대사 플럭스 (metabolic fulx)를 감소 또는 제거하기 위한 하나 이상의 합성 대사 밸브 (synthetic metabolic valve; SMV)를 포함하고,
    여기서, 상기 합성 대사 밸브는
    a) 효소를 인코딩하는 유전자의 유전자 발현을 침묵시키는 하나 이상의 유전자 침묵 (gene silencing)의 조절, 또는
    b) 효소의 분해를 조절하는 하나 이상의 단백질 분해 (proteolysis)의 조절을 포함하며;
    (Ⅲ) 상기 성장된 유전적으로 변형된 미생물을 생산 정지기 (productive stationary phase)로 이행 (transition)시키는 단계;
    여기서, 상기 생산 정지기에서는, 생성물의 생합성을 위한 생산 효소를 포함하는 생산 경로 또는 합성 대사 밸브가 결여된 미생물과 비교하여, 상기 유전적으로 변형된 미생물은 성장이 느려지거나 정지되고 생성물 생산이 향상되며,
    상기 합성 대사 밸브를 유도하여 상기 생산 정지기로 이행되는 것을 특징으로 함; 및
    (Ⅳ) 상기 미생물로부터 생성물을 생산하는 단계;
    여기서, 상기 정지기 동안의 생성물의 생산 속도는 상기 합성 대사 밸브가 결여된 세포와 비교할 때, 환경 조건의 변화에 반응하여 적게 감소되는 것을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생성물은 아미노산 (amino acid), 아세테이트 (acetate), 아세토인 (acetoin), 아세톤 (acetone), 아크릴 (acrylic), 말레이트 (malate), 지방산 에틸 에스터 (fatty acid ethyl esters), 이소프레노이드 (isoprenoids), 글리세롤 (glycerol), 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol), 에틸렌 (ethylene), 프로필렌 (propylene), 부틸렌 (butylene), 이소부틸렌 (isobutylene), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 비닐 아세테이트 (vinyl acetate), 1,4-부탄디올 (1,4-butanediol), 2,3-부탄디올 (2,3-butanediol), 부탄올 (butanol), 이소부탄올 (isobutanol), sec-부탄올 (sec-butanol), 부티레이트 (butyrate), 이소부티레이트 (isobutyrate), 2-OH-이소부티레이트 (2-OH-isobutryate), 3-OH-부티레이트 (3-OH-butyrate), 에탄올 (ethanol), 이소프로판올 (isopropanol), D-락테이트 (D-lactate), L-락테이트 (L-lactate), 피루베이트 (pyruvate), 이타코네이트 (itaconate), 레불리네이트 (levulinate), 글루카레이트 (glucarate), 글루타레이트 (glutarate), 카프로락탐 (caprolactam), 아디프산 (adipic acid), 프로판올 (propanol), 이소프로판올 (isopropanol), 융합 알코올 (fused alcohols) 및 1,2-프로판디올 (1,2-propanediol), 1,3-프로판디올 (1,3-propanediol), 포르메이트 (formate), 푸마르산 (fumaric acid), 프로피온산 (propionic acid), 숙신산 (succinic acid), 발레르산 (valeric acid), 말레산 (maleic acid) 및 폴리-하이드록시부티레이트 (poly-hydroxybutyrate)로 구성된 군에서 선택되는 다단계 발효 생물공정.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 침묵 (gene silencing)에 의해 침묵되는 효소 및 상기 단백질 분해 (proteolysis)에 의해 분해의 대상이 되는 효소는 fabI, gltA, lpd, zwf 및 udhA로 구성되는 군에서 선택되는 유전자에 의해 각각 인코딩되거나;
    상기 유전자 침묵은 가이드 RNA 유전자의 배열(array)을 포함하는 CASCADE 플라스미드 발현 및 유전자 발현에 대한 CRISPR 간섭을 특징으로 하거나;
    상기 단백질 분해는 N-말단 또는 C-말단 태그에 작동가능하게 연결된 프로테아제 (protease)의 발현에 의해 조절되는(controlled) 것을 특징으로 하는 다단계 발효 생물공정.
  4. 제1항에 있어서, 생성물을 생산하기 위해 유전적으로 변형된 미생물을 제공하는 단계는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 다단계 발효 생물공정:
    (ㄱ) 복수의 구별되는 유전적으로 변형된 미생물을 제공하는 단계로, 각 유전적으로 변형된 미생물은 그 내부에
    i. 생성물 생합성을 위한 생산 효소를 하나 이상 포함하는 생산 경로; 및
    ii. 유전적으로 변형된 미생물 내의 다수의 대사 경로를 통해 대사 플럭스를 감소 또는 제거하기 위한 하나 이상의 합성 대사 밸브의 조합을 포함하되,
    여기서, 상기 합성 대사 밸브는
    a) 효소를 인코딩하는 유전자의 유전자 발현을 침묵시키는 유전자 침묵 (gene silencing)의 조절, 또는
    b) 효소의 분해를 조절하는 단백질 분해 (proteolysis)의 조절을 포함하고,
    상기 복수의 유전적으로 변형된 미생물 각각은 그 내부의 생산 효소, 유전자 침묵에 의해 침묵되는 효소 또는 단백질 분해에 의해 분해의 대상이 되는 효소가 서로 상이함;
    (ㄴ) 배양 배지에서, 다수의 유전적으로 변형된 미생물을 성장기 (growth phase)로 각각 독립적으로 성장시키는 단계;
    (ㄷ) 상기 성장된 다수의 유전자적으로 변형된 미생물 중 적어도 하나를 생산 정지기 (productive stationary phase)로 이행 (transition)시키는 단계;
    여기서, 상기 생산 정지기에서는, 생성물의 생합성을 위한 생산 효소를 하나 이상 포함하는 생산 경로 또는 합성 대사 밸브가 결여된 미생물과 비교하여, 상기 유전적으로 변형된 미생물은 성장이 느려지거나 정지되고, 생성물 생산이 향상되며,
    상기 합성 대사 밸브를 유도하여 상기 생산 정지기로 이행되는 것을 특징으로 함;
    (ㄹ) 다수의 유전적으로 변형된 미생물 각각의 생산기 (production phase)에서 생산되는 생성물의 양을 측정하는 단계; 및
    (ㅁ) 생산된 생성물의 양에 기초하여 하나의 유전적으로 변형된 미생물을 선택하는 단계.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생성물은 알라닌이고;
    상기 생산 효소 또는 상기 생산 효소를 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 서열 (control sequence) 유전자의 프로모터 서열은 상기 유전적으로 변형된 미생물이 유래된 종과 이종 (heterologous)이며;
    상기 생산 효소는 NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (ald), 알라닌 추출효소 (alaE), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (gapN) 또는 이들의 조합 중 하나인, 다단계 발효 생물공정.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생성물은 메발로네이트 (mevalonate) 또는 3-하이드록시프로피온산 (3-hydroxypropionic acid)이고;
    상기 생산 효소 또는 상기 생산 효소를 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 서열 (control sequence) 유전자의 프로모터 서열은 상기 유전적으로 변형된 미생물이 유래된 종과 이종 (heterologous)이며;
    상기 생산 효소는 아세틸-CoA 아세틸전이효소 (acetyl-CoA acetyltransferase), NADPH 의존적 HMG-CoA 환원효소 (NADPH dependent HMG-CoA reductase), HMG-CoA 합성효소 (HMG-CoA synthase) 또는 이들의 조합 중 하나인, 다단계 발효 생물공정.
  7. i. 생성물의 생합성을 위한 생산 효소를 하나 이상 포함하는 생산 경로; 및
    ii. 유전적으로 변형된 미생물 내의 다수의 대사 경로를 통해 대사 플럭스 (metabolic fulx)를 감소 또는 제거할 수 있는 하나 이상의 합성 대사 밸브 (synthetic metabolic valve; SMV);를 포함하는, 유전적으로 변형된 미생물 균주로,
    상기 합성 대사 밸브는,
    a) 효소를 인코딩하는 유전자의 유전자 발현을 침묵시키는 하나 이상의 유전자 침묵 (gene silencing)의 조절; 또는
    b) 효소의 분해를 조절하는 하나 이상의 단백질 분해 (proteolysis)의 조절을 포함하며,
    여기서, 상기 유전적으로 변형된 미생물은 성장이 느려지거나 정지되고, 상기 합성 대사 밸브의 유도에 의해 생성물 생산이 향상되며,
    상기 유전자 침묵에 의해 침묵되는 효소 및 상기 단백질 분해에 의해 분해의 대상이 되는 효소는 fabI, gltA, lpd, zwf 및 udhA로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 의해 각각 인코딩되는,
    유전적으로 변형된 미생물 균주.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생성물은 알라닌이고,
    상기 생산 경로의 효소는 NADPH-의존성 알라닌 탈수소효소 (ald), 알라닌 추출효소 (alaE), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (gapN) 또는 이들의 조합 중 하나이며;
    상기 합성 대사 밸브는 fabI, gltA1 또는 gltA2 유전자 발현의 침묵 및 fabI 또는 udhA 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 단백질 분해 (proteolysis)의 조합을 포함하는, 유전적으로 변형된 미생물 균주.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 생성물은 메발로네이트 (mevalonate) 또는 3-하이드록시프로피온산 (3-hydroxypropionic acid)이고;
    상기 생산 경로의 효소는 아세틸-CoA 아세틸전이효소 (acetyl-CoA acetyltransferase), NADPH 의존적 HMG-CoA 환원효소 (NADPH dependent HMG-CoA reductase), HMG-CoA 합성효소 (HMG-CoA synthase) 또는 이들의 조합 중 하나이며,
    상기 합성 대사 밸브는 fabI, gltA1 또는 gltA2 유전자 발현의 침묵 및 fabI 또는 udhA 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 단백질 분해 (proteolysis)의 조합을 포함하는, 유전적으로 변형된 미생물 균주.
  10. 제7항에 따른 유전적으로 변형된 미생물 균주를 포함하는 복수의 미생물(plurality of microorganisms)로,
    상기 유전적으로 변형된 미생물 균주 각각은 그 내부의 생산 효소, 유전자 침묵(gene silencing)에 의해 침묵되는 효소 또는 단백질 분해(proteolysis)에 의해 분해의 대상이 되는 효소가 서로 상이한 것을 특징으로 하는 복수의 미생물.
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