JP2023528727A - 動的代謝制御を利用したキシロースからキシリトールを産生するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、キシリトールの産生のための遺伝子操作された微生物株及び関連するバイオプロセスに関する。具体的には、特定の酵素の活性を低下させるための動的に制御された合成代謝バルブの使用により、２段階プロセスにおけるキシリトール産生の増加がもたらされる。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月３日に出願された米国仮特許出願第６３／００４，７４０号及び２０２０年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０５６，０８５号の優先権を主張し、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年４月３日に出願された米国仮特許出願第６３／００４，７４０号及び２０２０年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０５６，０８５号の優先権を主張し、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、細菌株などの代謝的に操作された微生物、及びそのような株を利用するバイオプロセスに関する。これらの株は、キシロースからのキシリトールの産生をもたらす代謝経路の動的制御を提供する。
本発明は、細菌株などの代謝的に操作された微生物、及びそのような株を利用するバイオプロセスに関する。これらの株は、キシロースからのキシリトールの産生をもたらす代謝経路の動的制御を提供する。
配列表
本出願は、サイズが１７０５１バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年３月２９日に作成された４９１９６－４６＿ＳＴ２５としてＡＳＣＩＩ形式で電子出願された配列表を含む。
本出願は、サイズが１７０５１バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年３月２９日に作成された４９１９６－４６＿ＳＴ２５としてＡＳＣＩＩ形式で電子出願された配列表を含む。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、エネルギー省によって授与された連邦助成金番号ＥＥ０００７５６３、米国国防総省によって授与された連邦契約番号ＨＲ ００１１－１４－Ｃ－００７５、米国国防総省によって授与された連邦助成金番号ＯＮＲ ＹＩＰ １２０４３９５６、国防高等研究計画局番号ＨＲ００１１－１４－Ｃ－００７５、ＯＮＲ ＹＩＰ番号Ｎ０００１４－１６－１－２５５８、エネルギー省エネルギー効率・再生可能エネルギー局助成金番号ＥＥ０００７５６３、ＮＡＶＹ／ＯＮＲによって授与されたＮ０００１４－１６－１－２５５８、及び米国国立衛生研究所バイオテクノロジートレーニング助成金（Ｔ３２ＧＭ００８５５５）の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、エネルギー省によって授与された連邦助成金番号ＥＥ０００７５６３、米国国防総省によって授与された連邦契約番号ＨＲ ００１１－１４－Ｃ－００７５、米国国防総省によって授与された連邦助成金番号ＯＮＲ ＹＩＰ １２０４３９５６、国防高等研究計画局番号ＨＲ００１１－１４－Ｃ－００７５、ＯＮＲ ＹＩＰ番号Ｎ０００１４－１６－１－２５５８、エネルギー省エネルギー効率・再生可能エネルギー局助成金番号ＥＥ０００７５６３、ＮＡＶＹ／ＯＮＲによって授与されたＮ０００１４－１６－１－２５５８、及び米国国立衛生研究所バイオテクノロジートレーニング助成金（Ｔ３２ＧＭ００８５５５）の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
キシリトールは、甘味料として主に使用される工業用糖アルコールであり、同等の甘味を有するがスクロースよりもカロリーが低い。キシリトールの年間生産量は約１２５，０００トンであり、キシロースの還元を介して生産される。キシロースは、（グルコースに続いて）２番目に豊富な天然糖であるため、魅力的な供給原料である。キシロースを供給原料として、乳酸、コハク酸、キシロナート、１，２，４－ブタントリオール、及びキシリトールを含む、バイオ燃料（エタノール）から化学品まで、数多くの製品の生合成に利用できることが多くの研究で証明されている。
キシリトールの工業生産は伝統的な化学反応に依存しており、プロセスは数十年にわたって比較的変化していない。この変換は、高価な触媒を必要とし、供給原料として比較的純粋なキシロースを必要とする。生合成プロセスの開発を含む、より低コストのセルロース系糖流からキシリトールを産生するより経済的な方法を特定する努力がなされてきた。生合成産生は、コストを削減し、より低品質の供給原料を利用し、有機溶媒の使用を回避し、高価な還元触媒の必要性を排除する可能性を有する。しかし、キシロースからキシリトールを産生するほとんどの以前の生合成研究は、電子供与体として追加の糖（通常はグルコース）を必要とする生体内変換に依存している。グルコースの酸化（副産物グルコン酸を生成する）によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成し、これをキシロース還元に使用する。これらのプロセスは、キシリトール力価が高く、キシロースだけを考えると収率も良好であるが、キシロースと等モルのグルコースが必要なため、大きな非効率が生じる。
おそらく最も単純な変換はキシロースからキシリトールへの変換であり、これは単一の酵素、キシロースレダクターゼのみを必要とする。キシリトールの生合成産生は、化学変換と比較して、有機溶媒の使用を回避し、高価な還元触媒を必要とせず、製品の純度を改善しながら、コストを削減する可能性を有する。
本発明者らは、２段階の動的代謝制御を利用してキシロースからのキシリトール産生を最適化するために、遺伝子改変微生物株を合理的に設計した。図１に示すように、この設計には、キシリトール産生と競合するキシロース代謝を減少させるため、キシロースレダクターゼの過剰発現及びキシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性の動的減少が含まれていた。この目的に向けて、本発明者らは、遺伝子サイレンシング、ＸｙｌＡのタンパク質分解、又は両方の機能の組み合わせによって、リン酸欠乏又は他の原因事象時のｘｙｒＡの動的誘導、及びＸｙｌＡ活性の動的減少を可能にする株及びプラスミドを構築した。増殖と産物の形成を切り離すために合成代謝バルブ（ＳＭＶ）を使用するスケーラブルなバイオ発酵プロセスのための微生物株が本明細書で提供される。記載された株は、変化した場合、特定の誘導性条件下で微生物増殖に悪影響を及ぼす経路を含む、代謝経路の動的制御を提供する。
本発明者らはまた、操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるキシリトール生合成と一致する改善されたＮＡＤＰＨフラックスを十分に記載する。キシリトールは、ＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼを介してキシロースから産生される。本発明者らは、２段階動的代謝制御を利用して、キシリトール生合成を最適化するための２つのアプローチである、競合的フラックスが減少する化学量論的アプローチと、重要な調節代謝産物のレベルが減少する調節的アプローチとを比較している。化学量論的アプローチ及び調節的アプローチは、それぞれキシリトール産生を１６倍及び１００倍改善する。エノイル－ＡＣＰレダクターゼ及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのレベルが低下した株は、代謝産物プールの変化をもたらし、膜結合トランスヒドロゲナーゼ及び新しいＮＡＤＰＨ生成経路、すなわちＮＡＤＰＨ依存性フェレドキシンレダクターゼと結合したピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼの活性化を生じ、ＮＡＤＰＨプールの減少にもかかわらず、ＮＡＤＰＨフラックスの増加をもたらした。これらの株は、計装化バイオリアクターにおいて、理論収率の８６％でキシロースから２００ｇ／Ｌの力価のキシリトールを産生した。エノイル－ＡＣＰレダクターゼ及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼに対する動的制御は、ＮＡＤＰＨ依存性生体変換の改善を広く可能にするであろう。
本明細書では、動的フラックス制御を提供し、キシリトール産生が改善されたす１つ又は複数の合成代謝バルブを含有する、記載された遺伝子改変微生物を使用する、キシリトール産生のための多段階バイオプロセスも提供される。特定の実施形態では、炭素供給原料としては、キシロース、又はキシロースとグルコースの組み合わせ、アラビノース、マンノース、ラクトース、或いは二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、又は油を挙げることができる。更なる遺伝子改変を微生物に加えて、キシリトールを更なる化学産物又は燃料製品に更に変換することができる。
他の方法、特徴及び／又は利点は、以下の図及び詳細な説明を検討すると明らかになるか、又はそうなるであろう。そのような追加の方法、特徴、及び利点は全て、この説明内に含まれ、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。
本発明の新規な特徴は、特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が使用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
本発明は、キシリトール又は関連する化学産物の産生に有用性を有する様々な遺伝子改変微生物、及びこれらの微生物を使用してそのような化学産物を産生する方法に関する。
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクター並びに同じ（例えば、同じオペロン）又は異なる複数の発現ベクターを含み、「微生物」への言及は、単一の微生物並びに複数の微生物を含む、などである。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクター並びに同じ（例えば、同じオペロン）又は異なる複数の発現ベクターを含み、「微生物」への言及は、単一の微生物並びに複数の微生物を含む、などである。
本明細書で使用される「異種ＤＮＡ」、「異種核酸配列」などの用語は、以下の、（ａ）核酸の配列が、所与の宿主微生物に対して外来性（すなわち、天然で見出される）である、（ｂ）配列が、所与の宿主微生物において天然に見出すことができるが、不自然な（例えば、予想よりも大きい）量であるか、又は（ｃ）核酸の配列が、自然界で互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含む、のうちの少なくとも１つが真である核酸配列を指す。例えば、例（ｃ）に関して、組換え生産される異種核酸配列は、遺伝子発現を駆動する非天然プロモータなどの新たな機能性核酸を作成するように配置された無関係な遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。「異種」という用語は、「外因性」という用語を含むことを意図しており、これは、後者の用語が当技術分野で一般的に使用されるためである。異種核酸配列の導入前の宿主微生物のゲノムを参照すると、酵素をコードする核酸配列は、（異種核酸配列がそのゲノムに導入されるか否かにかかわらず）異種である。本明細書で使用される場合、染色体、並びに天然及び内因性は、宿主微生物の遺伝物質を指す。
本明細書で使用される「合成代謝バルブ」などの用語は、制御されたタンパク質分解、遺伝子サイレンシング、又は代謝フラックスを変化させるためのタンパク質分解と遺伝子サイレンシングの両方の組み合わせの使用を指す。
本明細書で使用される場合、「遺伝子破壊」という用語、又はその文法的等価物（「酵素機能を破壊する」、「酵素機能の破壊」などを含む）は、コードされた遺伝子産物が、そのように改変されていない微生物細胞中又は微生物細胞由来のポリペプチド活性と比較して低下したポリペプチド活性を有するようにする微生物への遺伝子改変を意味することを意図している。遺伝子改変は、例えば、遺伝子全体の欠失、転写若しくは翻訳に必要な調節配列の欠失若しくは他の改変、切断された遺伝子産物（例えば、酵素）をもたらす遺伝子の一部の欠失、又はコードされた遺伝子産物の活性を低下させる（検出できる活性レベルにならないことも含める）様々な突然変異戦略のいずれかによるものであってもよい。破壊には、酵素をコードする核酸配列の全部又は一部の欠失を広く含むことができ、他のタイプの遺伝子改変、例えば、停止コドンの導入、フレームシフト変異、遺伝子の一部の導入又は除去、及び分解シグナルの導入も含まれるが、これらに限定されず、これらの遺伝子改変は、ｍＲＮＡ転写レベル及び／又は安定性に影響を及ぼし、酵素をコードする遺伝子の上流のプロモータ又はリプレッサーを改変する。
本明細書で使用される生物産生、微小発酵（Ｍｉｃｒｏ－ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（微小発酵（ｍｉｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ））又は発酵は、好気性、微好気性又は嫌気性であってもよい。
遺伝子産物、すなわち酵素の遺伝子改変が本明細書において特許請求の範囲を含めて言及される場合、遺伝子改変は、述べられた遺伝子産物、すなわち酵素を通常コードする、遺伝子などの、又は遺伝子を含む核酸配列のものであることが理解される。
本明細書で使用される場合、「代謝フラックス」などの用語は、所与の基質からの産生速度、産生力価及び産生収率を含む、産物及び／又は副産物形成の変化をもたらす代謝の変化を指す。
種及び他の系統発生的同定は、微生物学の当業者に公知の分類に従う。
酵素は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別番号を参照して本明細書に列挙されており、これは当業者に公知である。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＵｎｉＰｒｏｔ．ｏｒｇ／でアクセスすることができる。遺伝子産物、すなわち酵素の遺伝子改変が本明細書において特許請求の範囲を含めて言及される場合、遺伝子改変は、述べられた遺伝子産物、すなわち酵素を通常コードする、遺伝子などの、又は遺伝子を含む核酸配列のものであることが理解される。
本明細書に記載の方法及び工程が特定の順序で生じる特定の事象を示す場合、当業者は、特定の工程の順序を変更することができ、そのような変更が本発明の変形例に従うことを認識するであろう。更に、特定の工程は、可能であれば並列処理で同時に実行されてもよく、順次実行されてもよい。
略語の意味は以下の通りであり、使用法から明らかなように、「Ｃ」は摂氏又は摂氏度を意味し、ＤＣＷは乾燥細胞重量を意味し、「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」、「ｈｒ」又は「ｈｒｓ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチ当たりのポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日数を意味し、「μＬ」又は「ｕＬ」又は「ｕｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」又は「ｕＭｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」又は「ｕｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は光子波長６００ｎｍで測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「％ｗ／ｖ」は「重量／体積パーセント」を意味し、「％ｖ／ｖ」は体積／体積パーセントを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピル－μ－Ｄ－チオガラクトピラノイジドを意味し、「ａＴｃ」はアンヒドロテトラサイクリンを意味し、「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。
Ｉ．炭素源
組換え微生物と共に本発明で使用される生物産生培地は、増殖段階と産生段階の両方に適した炭素源又は基質を含有しなければならない。適切な基質としては、キシロース又はキシロースとグルコースの組み合わせ、スクロース、キシロース、マンノース、アラビノース、油、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド又はグリセロールが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記の炭素基質及びそれらの混合物の全てが、炭素源として本発明に適していると考えられる。
組換え微生物と共に本発明で使用される生物産生培地は、増殖段階と産生段階の両方に適した炭素源又は基質を含有しなければならない。適切な基質としては、キシロース又はキシロースとグルコースの組み合わせ、スクロース、キシロース、マンノース、アラビノース、油、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド又はグリセロールが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記の炭素基質及びそれらの混合物の全てが、炭素源として本発明に適していると考えられる。
ＩＩ．微生物
本明細書に記載され、特許請求される特徴は、本明細書のリストから選択される微生物、或いは１つ又は複数の天然、導入、若しくは強化された産物の生物産生経路も含む別の適切な微生物において提供することができる。したがって、いくつかの実施形態では、微生物は、内因性産物産生経路（いくつかのそのような実施形態では、強化されてもよい）を含むが、他の実施形態では、微生物は内因性産物産生経路を含まない。
本明細書に記載され、特許請求される特徴は、本明細書のリストから選択される微生物、或いは１つ又は複数の天然、導入、若しくは強化された産物の生物産生経路も含む別の適切な微生物において提供することができる。したがって、いくつかの実施形態では、微生物は、内因性産物産生経路（いくつかのそのような実施形態では、強化されてもよい）を含むが、他の実施形態では、微生物は内因性産物産生経路を含まない。
より具体的には、本明細書に記載の様々な基準に基づいて、化学産物の生物産生に適した微生物宿主には、一般に、方法の項に記載の生物が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書に記載の任意の遺伝子又はタンパク質の宿主微生物又は供給源微生物は、微生物の以下のリストである、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）から選択することができる。いくつかの態様では、宿主微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である。
ＩＩＩ．培地及び培養条件
本明細書に開示される種類の１つから選択されるような適切な炭素源に加えて、生物産生培地は、培養物の増殖及び本発明の下での化学産物の生物産生の促進に適した、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液及び他の成分を含有しなければならない。
本明細書に開示される種類の１つから選択されるような適切な炭素源に加えて、生物産生培地は、培養物の増殖及び本発明の下での化学産物の生物産生の促進に適した、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液及び他の成分を含有しなければならない。
本発明の別の態様は、本発明の遺伝子改変微生物及び場合によりサプリメントを含む培地及び培養条件に関する。
典型的には、細胞は、適切な培地中で約２５℃～約４０℃の範囲の温度、並びに好熱性微生物については最大７０℃の温度で増殖される。適切な増殖培地は、当技術分野において十分に特徴付けられ、公知である。生物産生に適したｐＨ範囲はｐＨ２．０～ｐＨ１０．０であり、ｐＨ６．０～ｐＨ８．０が初期条件の典型的なｐＨ範囲である。しかし、特定の実施形態の実際の培養条件は、これらのｐＨ範囲によって限定されることを意味しない。生物産生は、撹拌の有無にかかわらず、好気性、微好気性又は嫌気性条件下で行うことができる。
ＩＶ．生物産生反応器及びシステム
本発明による方法及び／又は組成物を利用する発酵システムも本発明の範囲内である。本明細書に記載及び／又は言及される組換え微生物はいずれも、商業的に実行可能な操作で微生物が炭素源を産物に変換する産業用生物産生システムに導入することができる。生物産生システムは、そのような組換え微生物を、組換え微生物を増殖させるのに適した炭素源基質及び生物産生培地を用いてバイオリアクター容器に導入し、生物産生システムを適した温度範囲（及び反応が好気性又は微好気性である場合は溶存酸素濃度範囲）で適切な時間維持し、基質分子の一部を選択された化学産物に所望の変換を得ることを含む。生物産生は、撹拌の有無にかかわらず、好気性、微好気性又は嫌気性条件下で行うことができる。産業用生物産生システム及びその操作は、化学工学及びバイオプロセス工学の当業者に公知である。
本発明による方法及び／又は組成物を利用する発酵システムも本発明の範囲内である。本明細書に記載及び／又は言及される組換え微生物はいずれも、商業的に実行可能な操作で微生物が炭素源を産物に変換する産業用生物産生システムに導入することができる。生物産生システムは、そのような組換え微生物を、組換え微生物を増殖させるのに適した炭素源基質及び生物産生培地を用いてバイオリアクター容器に導入し、生物産生システムを適した温度範囲（及び反応が好気性又は微好気性である場合は溶存酸素濃度範囲）で適切な時間維持し、基質分子の一部を選択された化学産物に所望の変換を得ることを含む。生物産生は、撹拌の有無にかかわらず、好気性、微好気性又は嫌気性条件下で行うことができる。産業用生物産生システム及びその操作は、化学工学及びバイオプロセス工学の当業者に公知である。
生物産生培地中で産生される産物の量は、一般に、当技術分野で公知の多くの方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又はＧＣ／質量分析（ＭＳ）を用いて決定することができる。
Ｖ．遺伝子改変、ヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列
本発明の実施形態は、発現ベクターの宿主微生物への導入から生じてもよく、発現ベクターは、宿主微生物に通常見られる、又は通常見られない酵素をコードする核酸配列を含有する。
本発明の実施形態は、発現ベクターの宿主微生物への導入から生じてもよく、発現ベクターは、宿主微生物に通常見られる、又は通常見られない酵素をコードする核酸配列を含有する。
宿主細胞を遺伝子改変する能力は、任意の遺伝子改変された（組換え）微生物の作成に不可欠である。遺伝子導入技術のモードは、エレクトロポレーション、接合、形質導入、又は自然形質転換によるものであってもよい。広範囲の宿主接合性プラスミド及び薬物耐性マーカが利用可能である。クローニングベクターは、その宿主において機能することができる抗生物質耐性マーカの性質に基づいて、宿主生物に合わせて調整される。また、本明細書に開示されるように、遺伝子改変（組換え）微生物は、そのゲノムＤＮＡに対する改変を含む、プラスミド導入以外の改変を含むことができる。
より一般的には、制御配列と適合する条件下で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物におけるコード配列の発現を指示する１つ又は複数の（いくつかの）制御配列に作動可能に連結された、酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物を調製することができる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすように操作することができる。発現ベクターに応じて、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドの配列の操作が望ましいか、又は必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチド配列を改変するための技術は、当技術分野において十分に確立されている。
制御配列は、適切なプロモータ配列、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列であってもよい。プロモータ配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含むことができる。プロモータは、変異プロモータ、切断プロモータ及びハイブリッドプロモータを含む、好まれる宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってもよく、宿主細胞と相同又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。組換えＤＮＡプロモータ配列を改変及び利用するための技術は、当技術分野において十分に確立されている。
本発明の様々な実施形態では、遺伝子操作は、酵素の調節、したがって最終的な活性、又はそれぞれの経路のいずれかで同定された酵素の酵素活性を変更することを目的とした操作を含むことができる。そのような遺伝子改変は、選択された培養条件下で酵素活性及び／又は選択性の変化をもたらす転写、翻訳及び翻訳後改変を対象とすることができる。核酸配列の遺伝子操作は、コピー数を増加させ、及び／又は産物産生に関連する酵素の変異体の使用を含むことができる。そのような遺伝子改変を達成するための具体的な方法及びアプローチは、当業者に公知である。
様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は１つ又は複数の遺伝子欠失を含むことができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）、メチルグリオキサルシンターゼ（ｍｇｓＡ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、ｃｌｐＸＰプロテアーゼ特異性増強因子（ｓｓｐＢ）、ＡＴＰ依存性Ｌｏｎプロテアーゼ（ｌｏｎ）、外膜プロテアーゼ（ｏｍｐＴ）、ａｒｃＡ転写二重調節因子（ａｒｃＡ）、及びｉｃｌＲ転写調節因子（ｉｃｌＲ）をコードする遺伝子を、欠失させることを含めて破壊することができる。欠失を含むそのような遺伝子破壊は、限定することを意味するものではなく、様々な実施形態において様々な組み合わせで実施することができる。遺伝子欠失は、外来ＤＮＡを宿主染色体に組み込む方法と同様に、当技術分野で公知の多数の戦略によって達成することができる。
様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は、制御されたタンパク質分解、発現サイレンシング、又は制御されたタンパク質分解と発現サイレンシングの両方の組み合わせを標的とする酵素で構成される１つ又は複数の合成代謝バルブを含むことができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の１つの遺伝子によってコードされる１つの酵素又は多数の遺伝子によってコードされる多数の酵素の組み合わせは、代謝を変化させ、産物形成を改善するための合成代謝バルブとして設計することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の代表的な遺伝子としては、以下のｆａｂＩ、ｚｗｆ、ｇｌｔＡ、ｐｐｃ、ｕｄｈＡ、ｌｐｄ、ｓｕｃＤ、ａｃｅＡ、ｐｆｋＡ、ｌｏｎ、ｒｐｏＳ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｔｋｔＡ又はｔｋｔＢを挙げることができるが、これらに限定されない。これらの遺伝子のホモログ及び／又は更なる微生物種における他の遺伝子を同定する方法は当業者に公知であることが理解される。
本明細書で提供される全ての核酸及びアミノ酸配列について、これらの配列の保存的に改変された変異体が含まれ、その様々な実施形態において本発明の範囲内であることが理解される。機能的に等価な核酸及びアミノ酸配列（機能的変異体）は、保存的に改変された変異体、並びに十分に当業者の技能の範囲内であるより広範囲に変化する配列、及びこれらを含む微生物を含むことができ、また、そのような配列及び／又は微生物を含む方法及びシステムと同様に、本発明の様々な実施形態の範囲内である。
したがって、上記の様々なセクションに記載されるように、本発明のいくつかの組成物、方法及びシステムは、フラックスを再分配するための合成代謝バルブと組み合わせて、中央中間体から所望の産物を産生するための産生経路の両方を含む遺伝子改変微生物を提供することを含む。
本発明の態様はまた、選択された炭素源を選択された産物に変換する際の微生物の全体的な有効性を改善するための複数の遺伝子改変の提供に関する。遺伝子改変のより基本的な組み合わせを実質的に超えて比産生性、体積産生性、力価及び収量を増加させるための特定の組み合わせが、例などに示されている。
上記の遺伝子改変に加えて、様々な実施形態では、合成代謝バルブを含む遺伝子改変も提供され、産物の産生において消費され得る補因子ＮＡＤＰＨ及び／又はＮＡＤＨのプール及び利用可能性を増加させる。
ＶＩ．合成代謝バルブ
合成代謝バルブの使用は、産生期中の代謝フラックス及び生理学的要求をよりシンプルにモデル化することができ、増殖細胞を定常期の生体触媒に変える。これらの合成代謝バルブを使用して、多段階発酵プロセスにおいて、必須遺伝子をオフにし、炭素、電子、及びエネルギーフラックスを産物形成に向け直すことができる。以下の、１）転写遺伝子サイレンシング又は抑制技術と、２）誘導性及び選択的酵素分解との組合せ、並びに３）定常又は非分裂細胞状態を誘導するための栄養制限の１つ又は複数は、記載される合成バルブを提供する。ＳＭＶは、任意の経路及び微生物宿主に一般化することができる。これらの合成代謝バルブは、再生可能な化学物質及び燃料、並びに全細胞触媒作用によって産生することができる任意の産物の産生に有用な新規の迅速な代謝工学戦略を可能にする。
特に、本発明は、制御された遺伝子サイレンシング及び制御されたタンパク質分解の１つ又は複数若しくは組み合わせを含む合成代謝バルブの構築を記載する。当業者は、遺伝子サイレンシング及び制御されたタンパク質分解のためのいくつかの方法を認識していることが理解される。
ＶＩ．Ａ遺伝子サイレンシング
特に、本発明は、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御された遺伝子サイレンシングの使用を記載する。ｍＲＮＡサイレンシング又はＲＮＡ干渉、転写リプレッサーを介したサイレンシング及びＣＲＩＳＰＲ干渉を含むがこれらに限定されない、制御された遺伝子サイレンシングのための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。ＲＮＡ干渉のための方法及び機構は、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．「ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００３；６７（４）ｐ６５７－６８５．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＭＭＢＲ．６７．６５７－６８５．２００３によって教示されている。ＣＲＩＳＲＰＲ干渉のための方法及び機構は、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｃｅｌｌ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３；１５２（５）ｐ１１７３－１１８３．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０２．０２２によって教示されている。更に、ネイティブ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＡＳＣＡＤＥシステムを使用したＣＲＩＳＲＰＲ干渉のための方法論及び機構は、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ」ＮＡＲ．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４；ＤＯＩ：１０．１０９３によって教示されている。更なる多数の転写リプレッサーシステムは当技術分野で周知であり、遺伝子発現をオフにするために使用することができる。
特に、本発明は、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御された遺伝子サイレンシングの使用を記載する。ｍＲＮＡサイレンシング又はＲＮＡ干渉、転写リプレッサーを介したサイレンシング及びＣＲＩＳＰＲ干渉を含むがこれらに限定されない、制御された遺伝子サイレンシングのための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。ＲＮＡ干渉のための方法及び機構は、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．「ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００３；６７（４）ｐ６５７－６８５．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＭＭＢＲ．６７．６５７－６８５．２００３によって教示されている。ＣＲＩＳＲＰＲ干渉のための方法及び機構は、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｃｅｌｌ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３；１５２（５）ｐ１１７３－１１８３．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０２．０２２によって教示されている。更に、ネイティブ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＡＳＣＡＤＥシステムを使用したＣＲＩＳＲＰＲ干渉のための方法論及び機構は、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ」ＮＡＲ．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４；ＤＯＩ：１０．１０９３によって教示されている。更なる多数の転写リプレッサーシステムは当技術分野で周知であり、遺伝子発現をオフにするために使用することができる。
ＶＩ．Ｂ制御されたタンパク質分解
特に、本発明は、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御されたタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）又はタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）の使用を記載する。特定のプロテアーゼによる標的化タンパク質切断及び特定のペプチドタグによる分解のためのタンパク質の制御された標的化を含むがこれらに限定されない、制御されたタンパク質分解のための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。制御されたタンパク質分解のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｃｌｐＸＰプロテアーゼの使用のためのシステムは、ＭｃＧｉｎｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎｅ ２００６；２２（５）ｐ７０１－７０７によって教示されている。この方法は、ＤＡＳ４（又はＤＡＳ＋４）タグなどの特定のＣ末端ペプチドタグを付加することに依存する。このタグを有するタンパク質は、特異性増強シャペロンｓｓｐＢが発現されるまで、ｃｌｐＸＰプロテアーゼによって分解されない。ｓｓｐＢは、ｃｌｐＸＰプロテアーゼによるＤＡＳ４タグ付きタンパク質の分解を誘導する。更なる多数の部位では、特異的プロテアーゼ系が当技術分野で公知である。タンパク質は、所与のプロテアーゼの特定の標的部位を含むように操作され、次いでプロテアーゼの制御された発現後に切断することができる。いくつかの実施形態では、切断は、タンパク質の不活性化又は分解をもたらすと予想することができる。例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ（「ＣｌｐＳ ｉｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ－ｅｎｄ ｒｕｌｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｒｃｈ ２００９．７２（２），５０６－５１７．ｄｏｉ：１０．１１１１）は、ｃｌｐＳ依存性ｃｌｐＡＰ分解を提供する際に目的のタンパク質にＮ末端配列を付加することができることを教示している。更に、この配列は、ＵＬＰヒドロラーゼなどによって制御可能に切断されることができる追加のＮ末端配列によって更にマスクすることができる。これにより、ヒドロラーゼ発現に依存する制御されたＮ末端則分解が可能になる。したがって、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで制御されたタンパク質分解のためにタンパク質をタグ化することが可能である。Ｎ末端タグとＣ末端タグのどちらを使用するかは、制御された分解開始前にどちらのタグがタンパク質機能に影響を及ぼすかどうかに大きく依存する。
特に、本発明は、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御されたタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）又はタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）の使用を記載する。特定のプロテアーゼによる標的化タンパク質切断及び特定のペプチドタグによる分解のためのタンパク質の制御された標的化を含むがこれらに限定されない、制御されたタンパク質分解のための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。制御されたタンパク質分解のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｃｌｐＸＰプロテアーゼの使用のためのシステムは、ＭｃＧｉｎｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎｅ ２００６；２２（５）ｐ７０１－７０７によって教示されている。この方法は、ＤＡＳ４（又はＤＡＳ＋４）タグなどの特定のＣ末端ペプチドタグを付加することに依存する。このタグを有するタンパク質は、特異性増強シャペロンｓｓｐＢが発現されるまで、ｃｌｐＸＰプロテアーゼによって分解されない。ｓｓｐＢは、ｃｌｐＸＰプロテアーゼによるＤＡＳ４タグ付きタンパク質の分解を誘導する。更なる多数の部位では、特異的プロテアーゼ系が当技術分野で公知である。タンパク質は、所与のプロテアーゼの特定の標的部位を含むように操作され、次いでプロテアーゼの制御された発現後に切断することができる。いくつかの実施形態では、切断は、タンパク質の不活性化又は分解をもたらすと予想することができる。例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ（「ＣｌｐＳ ｉｓ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ－ｅｎｄ ｒｕｌｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｒｃｈ ２００９．７２（２），５０６－５１７．ｄｏｉ：１０．１１１１）は、ｃｌｐＳ依存性ｃｌｐＡＰ分解を提供する際に目的のタンパク質にＮ末端配列を付加することができることを教示している。更に、この配列は、ＵＬＰヒドロラーゼなどによって制御可能に切断されることができる追加のＮ末端配列によって更にマスクすることができる。これにより、ヒドロラーゼ発現に依存する制御されたＮ末端則分解が可能になる。したがって、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで制御されたタンパク質分解のためにタンパク質をタグ化することが可能である。Ｎ末端タグとＣ末端タグのどちらを使用するかは、制御された分解開始前にどちらのタグがタンパク質機能に影響を及ぼすかどうかに大きく依存する。
本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御されたタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）又はタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）の使用を記載する。広範囲のグラム陰性並びにグラム陽性細菌、酵母及び更には古細菌を含む、他の微生物宿主における制御されたタンパク質分解のための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。特に、制御されたタンパク質分解のための系は、天然の微生物宿主から移され、非天然宿主で使用することができる。例えば、Ｇｒｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ「Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ｔｕｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，Ａｒｔｉｃｌｅ １２７．ｄｏｉ：１０．１０３８は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｃｌｐＸＰプロテアーゼの発現及び使用を教示している。そのようなアプローチは、合成代謝バルブのための方法を任意の遺伝的に扱いやすい宿主に移すために使用することができる。
ＶＩ．Ｃ合成代謝バルブの制御
特に、本発明は、多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスを制御するための合成代謝バルブの使用を記載する。多段階発酵における段階間の移行で使用することができる、発現を誘導するための当技術分野で公知の多数の方法がある。これらとしては、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）、アラビノース、ラフィノース、トリプトファンなどを含む人工化学誘導剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの公知の誘導物質の使用を遺伝子発現サイレンシング及び／又は制御されたタンパク質分解の制御に結び付けるシステムは、多段階発酵プロセスにおける増殖期と産生期との間の移行を制御するために遺伝子改変微生物系に組み込むことができる。
特に、本発明は、多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスを制御するための合成代謝バルブの使用を記載する。多段階発酵における段階間の移行で使用することができる、発現を誘導するための当技術分野で公知の多数の方法がある。これらとしては、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）、アラビノース、ラフィノース、トリプトファンなどを含む人工化学誘導剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの公知の誘導物質の使用を遺伝子発現サイレンシング及び／又は制御されたタンパク質分解の制御に結び付けるシステムは、多段階発酵プロセスにおける増殖期と産生期との間の移行を制御するために遺伝子改変微生物系に組み込むことができる。
更に、増殖中に消費される１つ又は複数の制限栄養素の枯渇によって、多段階発酵における増殖と産生との間の移行を制御することが望ましい場合がある。制限栄養素としては、リン酸塩、窒素、硫黄及びマグネシウムを挙げることができるが、これらに限定されない。これらの栄養制限に応答する天然の遺伝子発現系を使用して、遺伝子発現サイレンシング及び／又は制御されたタンパク質分解の制御を、多段階発酵プロセスにおける増殖期と産生期との間の移行に動作可能に結び付けることができる。
本発明の範囲内には、遺伝子改変微生物が含まれ、その微生物は、０．０５ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．０８ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．１ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．１３ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．１５ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．１７５ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．２ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．２５ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．３ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．３５ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．４ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、０．４５ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超、又は０．５ｇ／ｇＤＣＷ－ｈｒ超の速度から選択され比速度でキシリトールを産生することができる。
本発明の範囲内には、遺伝子改変微生物が含まれ、その微生物は、０．５ｇ産物／ｇキシロース超、０．６ｇ産物／ｇキシロース超、０．７ｇ産物／ｇキシロース超、０．８ｇ産物／ｇキシロース超、０．９ｇ産物／ｇキシロース超、０．９５ｇ産物／ｇキシロース超、又は０．９８ｇ産物／ｇキシロース超の収率でキシロース又は別の糖源からキシリトールを産生することができる。
様々な実施形態では、本発明は、水性媒体中の炭素源と、本明細書の請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物とを含む培養系を含み、当該遺伝子改変微生物は、水性媒体の体積が５ｍＬ超、１００ｍＬ超、０．５Ｌ超、１Ｌ超、２Ｌ超、１０Ｌ超、２５０Ｌ超、１０００Ｌ超、１０，０００Ｌ超、５０，０００Ｌ超、１００，０００Ｌ超又は２００，０００Ｌ超から選択される場合など、及び水性媒体の体積が２５０Ｌ超で鋼製容器内に含まれる場合などでは、０．０５ｇＤＣＷ／Ｌ超、０．１ｇＤＣＷ／Ｌ超、１ｇＤＣＷ／Ｌ超、５ｇＤＣＷ／Ｌ超、１０ｇＤＣＷ／Ｌ超、１５ｇＤＣＷ／Ｌ超、又は２０ｇＤＣＷ／Ｌ超から選択される量で存在する。
発明態様の概要
一態様では、キシリトールを産生するための遺伝子改変微生物が提供される。キシロースレダクターゼ（ｘｙｒＡ）の発現及び誘導性合成代謝バルブの誘導性改変を特徴とする遺伝子改変微生物。１つ又は複数の酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングすることを特徴とする遺伝子発現サイレンシング合成代謝バルブ、或いは１つ又は複数の酵素の酵素分解を誘導することを特徴とする酵素分解合成代謝バルブ、又はそれらの組み合わせを特徴とする、合成代謝バルブ。
一態様では、キシリトールを産生するための遺伝子改変微生物が提供される。キシロースレダクターゼ（ｘｙｒＡ）の発現及び誘導性合成代謝バルブの誘導性改変を特徴とする遺伝子改変微生物。１つ又は複数の酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングすることを特徴とする遺伝子発現サイレンシング合成代謝バルブ、或いは１つ又は複数の酵素の酵素分解を誘導することを特徴とする酵素分解合成代謝バルブ、又はそれらの組み合わせを特徴とする、合成代謝バルブ。
一態様では、遺伝子改変微生物のキシロースレダクターゼは、ＮＡＤＰＨ依存性キシロースレダクターゼであるか、又はキシロースレダクターゼは、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｘｙｒＡ遺伝子であってもよい。
一態様では、遺伝子改変微生物は、キシロース供給原料からキシリトールを産生する。当然ながら、遺伝子改変微生物は、キシロース及び第２の糖の任意の比のブレンドを含む供給原料を使用することができる。
一態様では、遺伝子改変微生物の遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブは、キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子若しくはキシロースイソメラーゼ酵素、又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子若しくはグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素の制御を対象とすることができる。
一態様では、遺伝子改変微生物の遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブは、２つ以上の遺伝子、例えば、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素、及びキシロースイソメラーゼをコードする遺伝子又はキシロースイソメラーゼ酵素の制御を対象とすることができる。
更に別の態様では、遺伝子改変微生物の遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブは、２つ以上の遺伝子、例えば、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素、及びエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）をコードする遺伝子又はエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）酵素の制御を対象とすることができる。
更に別の態様では、一態様において、遺伝子改変微生物の遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブは、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子のサイレンシング並びにグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素及びエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）酵素の酵素分解を制御することを対象とすることができる。
別の態様では、キシロースレダクターゼの発現、遺伝子発現サイレンシング合成代謝バルブ、及び酵素分解合成代謝バルブは、多段階バイオ発酵プロセスの移行期の条件下で誘導される。誘導は、栄養欠乏又はリン酸欠乏を介して起こり得る。
一態様では、遺伝子改変微生物は染色体欠失を更に含むことができる。
一態様では、遺伝子発現のサイレンシングは、ＣＲＩＳＰＲ干渉を含み、遺伝子改変微生物は、ＣＡＳＣＡＤＥガイドアレイも発現し、アレイは、複数の遺伝子の同時サイレンシングのために異なる遺伝子を標的化するためにそれぞれ特異的な低分子ガイドＲＮＡをコードする２つ以上の遺伝子を含む。
一態様では、遺伝子改変微生物は、バイオ発酵プロセスにおいて約２４時間で０．０８ｇ／Ｌを超えるキシリトール産物力価を産生する。
一態様では、本発明は、（ａ）遺伝子改変微生物を提供する工程を含む、遺伝子改変微生物からキシリトールを産生するための多段階発酵バイオプロセスを提供する。キシロースレダクターゼの発現の改変と、１つ又は複数の酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングすることを特徴とする遺伝子発現サイレンシング合成代謝バルブ、又は１つ又は複数の酵素の酵素分解を誘導することを特徴とする酵素分解合成代謝バルブ又はそれらの組み合わせを含む、合成代謝バルブとを特徴とする、遺伝子改変微生物。各合成代謝バルブの１つ又は複数の酵素は、同じか、又は異なる。本方法は、キシロース供給原料を含む培地中で遺伝子改変微生物を増殖させる工程、及び増殖期からキシリトールに移行する工程を更に含む。移行工程は、合成代謝バルブを誘導して微生物の増殖を遅延又は停止させること、及びキシロースレダクターゼの発現を誘導し、それによってキシリトールを産生することを含む。
いくつかの態様では、多段階発酵バイオプロセスは、遺伝子改変微生物の遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブが、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素、及びエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）をコードする遺伝子又はエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）酵素を含む少なくとも２つの遺伝子の制御を対象とすることを特徴とする遺伝子改変微生物を使用することができる。
いくつかの態様では、多段階発酵バイオプロセスは、バイオ発酵プロセスにおいて２４時間で０．０８ｇ／Ｌを超えるキシリトール産物力価を産生する。
いくつかの態様では、多段階発酵バイオプロセスの移行期は、増殖培地のリン酸欠乏を介して起こる。いくつかの態様では、多段階発酵バイオプロセスの遺伝子改変微生物は、染色体欠失を更に特徴とする。
一態様では、キシリトールを産生する遺伝子改変微生物であって、微生物は、キシロースイソメラーゼの誘導性低下、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の誘導性低下を含み、その結果、微生物は、誘導時に供給原料であるキシロースからキシリトールを産生する。別の態様では、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である。一態様では、微生物の誘導は栄養欠乏を介して起こる。一態様では、微生物の誘導はリン酸欠乏を介して起こる。
一態様では、本発明は、キシロースイソメラーゼの誘導性低下及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の誘導性低下を含む、遺伝子改変微生物からキシリトールを産生するための多段階発酵バイオプロセスを提供する。バイオプロセスは、（ａ）遺伝子改変微生物を提供すること、（ｂ）キシロース供給原料を含む培地中で遺伝子改変微生物を増殖させること、（ｃ）合成代謝バルブを誘導して、微生物の増殖を減速又は停止させること、及びキシロースイソメラーゼの発現を誘導することによって、増殖期からキシリトール産生期へ移行させること、それにより、（ｄ）キシリトールを産生することの工程を含む。
一態様では、キシリトールを産生する遺伝子改変微生物であって、微生物は、キシロースレダクターゼの誘導性低下、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の誘導性低下、エノイル－ＡＣＰレダクターゼの誘導性低下を含み、株は、誘導時に供給原料であるキシロースからキシリトールを産生する。一態様では、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である。いくつかの態様では、微生物の誘導は栄養欠乏又はリン酸欠乏を介して起こる。
一態様では、本発明は、キシロースレダクターゼの誘導性低下及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の誘導性低下、エノイル－ＡＣＰレダクターゼの誘導性低下を含む、遺伝子改変微生物からキシリトールを産生するための多段階発酵バイオプロセスを提供する。バイオプロセスは、（ａ）遺伝子改変微生物を提供すること、（ｂ）キシロース供給原料を含む培地中で遺伝子改変微生物を増殖させること、（ｃ）合成代謝バルブを誘導して、微生物の増殖を減速又は停止させること、及びキシロースレダクターゼの発現を誘導することによって、増殖期からキシリトール産生期へ移行させること、それにより、（ｄ）キシリトールを産生することの工程を含む。
一態様では、キシリトールを産生するための遺伝子改変微生物であって、微生物は、膜結合トランスヒドロゲナーゼ活性の活性が増大し、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼの活性が増大し、ＮＡＤＰＨ依存性フェレドキシンレダクターゼの活性が増大することを含み、微生物は、化学産物の生合成がＮＡＤＰＨを必要とする少なくとも１つの化学産物を産生する。
開示された実施形態は非限定的である
本発明の様々な実施形態を本明細書で示し説明してきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることが強調される。その様々な実施形態において、本明細書の本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置き換えを行うことができる。具体的には、いかなる理由であれ、本明細書においてリスト、表若しくは他のグループ（図１及び図４に示す代謝経路酵素など）において述べられているか、若しくは別段で提示されている、化合物、核酸配列、機能性酵素を含む特定のタンパク質を含むポリペプチド、代謝経路酵素若しくは中間体、要素若しくは他の組成物、又は濃度の任意のグループ化について、別段明確に述べられていない限り、そのような各グループ化は、様々なサブセット実施形態の基礎を提供し、それを識別するのに役立ち、その最も広い範囲のサブセット実施形態は、それぞれ述べられているグループ化の１つ又は複数のメンバー（又はサブセット）を除外することによって、そのようなグループ化の全てのサブセットを含むことが意図されている。更に、本明細書に任意の範囲が記載されている場合、別段明確に述べられていない限り、その範囲は、その中の全ての値及びその中の全ての部分範囲を含む。
本発明の様々な実施形態を本明細書で示し説明してきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることが強調される。その様々な実施形態において、本明細書の本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置き換えを行うことができる。具体的には、いかなる理由であれ、本明細書においてリスト、表若しくは他のグループ（図１及び図４に示す代謝経路酵素など）において述べられているか、若しくは別段で提示されている、化合物、核酸配列、機能性酵素を含む特定のタンパク質を含むポリペプチド、代謝経路酵素若しくは中間体、要素若しくは他の組成物、又は濃度の任意のグループ化について、別段明確に述べられていない限り、そのような各グループ化は、様々なサブセット実施形態の基礎を提供し、それを識別するのに役立ち、その最も広い範囲のサブセット実施形態は、それぞれ述べられているグループ化の１つ又は複数のメンバー（又はサブセット）を除外することによって、そのようなグループ化の全てのサブセットを含むことが意図されている。更に、本明細書に任意の範囲が記載されている場合、別段明確に述べられていない限り、その範囲は、その中の全ての値及びその中の全ての部分範囲を含む。
また、より一般的には、本明細書の開示、議論、例及び実施形態によれば、当業者の技術の範囲内で、従来の分子生物学、細胞生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術を使用することができる。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１（ｖｏｌｕｍｅ １－３），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６を参照されたい。これらの公開されたリソースは、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の公開リソースは、本明細書に記載された本発明と併せて有用な説明、例えば、糖源から化学産物を工業的に生物産生する方法、及びそのような変換を達成するために使用することができる産業システムに関して、参照により本明細書に組み込まれる（例えば、バイオリアクターの設計に関して、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｊ．Ｅ．Ｂａｉｌｅｙ ａｎｄ Ｄ．Ｆ．Ｏｌｌｉｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６の第９章、５３３～６５７ページ、例えば、プロセス及び分離技術分析に関して、Ｕｎｉｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｌ．ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３、例えば、分離技術の教示に関して、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｓｔａｇｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｐ．Ｃ．Ｗａｎｋａｔ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ ＵＳＡ，１９８８）。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、２０１４年６月１１日に出願された米国仮出願第６２／０１０，５７４号、及び２０１７年２月２１日に出願された米国仮出願第６２／４６１，４３６号、並びに２０１５年６月１１日に出願された国際出願ＵＳ２０１５／０３５３０６号及び２０１８年２月２１日に出願された国際出願ＵＳ２０１８／０１９０４０号を含めて、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
例
本明細書の例は、限定することを意図しないいくつかの例を提供する。全ての試薬は、特に明記しない限り、商業的に入手される。種及び他の系統発生的同定は、微生物学、分子生物学及び生化学の当業者に公知の分類に従う。
本明細書の例は、限定することを意図しないいくつかの例を提供する。全ての試薬は、特に明記しない限り、商業的に入手される。種及び他の系統発生的同定は、微生物学、分子生物学及び生化学の当業者に公知の分類に従う。
一般的な方法
試薬及び培地
全ての試薬及び化学物質は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手した。ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）は、ＢｉｏＢａｓｉｃ社（ニューヨーク州アムハースト）から入手した。結晶性キシロースは、Ｐｒｏｆｏｏｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（イリノイ州ネイパービル）から入手した。全ての培地であるＳＭ１０＋＋、ＳＭ１０リン酸なし、及びＦＧＭ２５は、全ての培地配合物においてグルコースの代わりにキシロース（グルコース１グラムに対してキシロース１グラム）を使用したことを除いて、以前に報告されたように調製した（Ｍｅｎａｃｈｏ－Ｍｅｌｇａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃａｌａｂｌｅ，ｔｗｏ－ｓｔａｇｅ，ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２６，４４（２０２０））。ＬＢ、Ｌｅｎｎｏｘ配合物をルーチンの株増殖に使用した。使用した抗生物質濃度は以下の、カナマイシンが３５μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコールが３５μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシンが１０μｇ／ｍＬ、１０ゼオシンが１００μｇ／ｍＬ、ブラスチシジンが１００μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシンが２５μｇ／ｍＬ、テトラサイクリンが５μｇ／ｍＬの通りであった。
株及びプラスミドの構築
本研究で使用した株及びプラスミドのリストについては、補足表Ｓ１を参照されたい。本研究で使用した合成ＤＮＡの配列を補足表Ｓ２に示す。染色体改変を、標準的な組み換え法を使用して構築した（Ｌｉｏｃｈｅｖ，Ｓ．Ｉ．ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１３２８－１３３１（１９９４））。組み換えプラスミドｐＳＩＭ５は、Ｄｏｎａｌｄ Ｃｏｕｒｔ（ＮＣＩ、ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｃｏｕｒｔ－ｌａｂ．ｈｔｍｌ）から親切に入手した。５３、５４個のＣ末端ＤＡＳ＋４タグを直接組み込みによって付加し、前述のように遺伝子の抗生物質耐性カセット３’の組み込みによって選択した。２４の全ての株をＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動によって確認し、配列決定によって確認した。株の確認及び配列決定に使用されるオリゴについては、表Ｓ３を参照されたい。
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のｘｙｒＡ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のためにコドン最適化し、キシロースレダクターゼの低リン酸誘導を可能にするプラスミドｐＨＣＫａｎ－ｘｙｒＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５８６１３）をＴＷＩＳＴ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンフランシスコ）によって構築した。ｐＣＤＦ－ｐｎｔＡＢ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１５８６０９）を、ｐＣＤＦ－ｅｖ３０からＰＣＲ及びギブソン・アセンブリを使用して構築して、低リン酸誘導性ｕｇｐＢｐプロモータからのｐｎｔＡＢオペロンの発現を駆動した（Ｍｏｒｅｂ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄｉａ Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｗｏ－ｓｔａｇｅ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０２０）ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．０ｃ００１８２）。ｐＣＡＳＣＡＤＥガイドＲＮＡアレイプラスミドを、前述のようにＰＣＲとギブソン・アセンブリとの組み合わせによって調製した。ｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミド構築に使用されるオリゴについては、表Ｓ４を参照されたい。
染色体改変を、標準的な組み換え法を使用して構築した。ｘｙｌＡ遺伝子上のＣ末端ＤＡＳ＋４タグを直接組み込みによって付加し、遺伝子の抗生物質耐性カセット３’の組み込みによって選択した。全ての株をＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動によって確認し、配列決定によって確認した。
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のｘｙｒＡ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用にコドン最適化し、キシロースレダクターゼの低リン酸誘導を可能にするプラスミドｐＨＣＫａｎ－ＩＮＳ：ｙｉｂＤｐ－６ｘｈｉｓ－ｘｙｒＡをＴＷＩＳＴ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって構築した。ｐＣＡＳＣＡＤＥガイドＲＮＡアレイプラスミドを、前述のようにＰＣＲとギブソン・アセンブリとの組み合わせによって調製した。
微小発酵及び１Ｌ発酵
全ての培地配合物においてグルコースの代わりにキシロース（グルコース１グラムに対してキシロース１グラム）を使用したことを除いて、計装化バイオリアクターにおける微小発酵及び１Ｌ発酵を以前に報告されたように行った。ガイドアレイの安定性を、ｐＣＡＳＣＡＤＥベクターの形質転換をＰＣＲにより確認した後、９６ウェルプレートの微小発酵で評価した。
キシロース及びキシリトールの定量
微小発酵では、キシロース及びキシリトールを、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（アイルランドのウィックロー、カタログ番号Ｋ－ＸＹＬＯＳＥ及びＫ－ＳＯＲＢ）からの市販のバイオアッセイによって、製造業者の指示に従って定量した。全ての結果を、４９２ｎｍでの吸光度を測定することによって試験した。タンク発酵の定量のために、屈折率検出器と一体化したＨＰＬＣ法を使用して、キシロース及びキシリトールの両方を測定した。５５℃で、Ｒｅｚｅｘ ＲＯＡ－有機酸Ｈ＋（８％）分析ＨＰＬＣカラム（カタログ番号００Ｈ－０１３８－Ｋ０、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、カリフォルニア州トーランス、３００×７．８ｍｍｅ）を化合物の分離に使用した。参照により、イソクラティック溶離液溶媒として硫酸を選択し、流速を０．５ｍＬ／分に設定した。Ｗａｔｅｒｓ２４１４ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ（ＲＩ）検出器（米国マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ社）と統合されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣをクロマトグラフィー検出に使用した。試料及び標準液の注入量は１０μＬとした。濾過した超純水を用いて試料を２０倍に希釈し、全ての試料点が標準直線範囲内になるようにした。標準偏差範囲は０．０１～２０ｇ／Ｌであった。ＭａｓｓＬｙｎｘ ｖ４．１ソフトウェアを全てのピーク積分及び濃度分析に使用した。
微小発酵では、キシロース及びキシリトールを、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（アイルランドのウィックロー、カタログ番号Ｋ－ＸＹＬＯＳＥ及びＫ－ＳＯＲＢ）からの市販のバイオアッセイによって、製造業者の指示に従って定量した。全ての結果を、４９２ｎｍでの吸光度を測定することによって試験した。タンク発酵の定量のために、屈折率検出器と一体化したＨＰＬＣ法を使用して、キシロース及びキシリトールの両方を測定した。５５℃で、Ｒｅｚｅｘ ＲＯＡ－有機酸Ｈ＋（８％）分析ＨＰＬＣカラム（カタログ番号００Ｈ－０１３８－Ｋ０、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、カリフォルニア州トーランス、３００×７．８ｍｍｅ）を化合物の分離に使用した。参照により、イソクラティック溶離液溶媒として硫酸を選択し、流速を０．５ｍＬ／分に設定した。Ｗａｔｅｒｓ２４１４ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ（ＲＩ）検出器（米国マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ社）と統合されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣをクロマトグラフィー検出に使用した。試料及び標準液の注入量は１０μＬとした。濾過した超純水を用いて試料を２０倍に希釈し、全ての試料点が標準直線範囲内になるようにした。標準偏差範囲は０．０１～２０ｇ／Ｌであった。ＭａｓｓＬｙｎｘ ｖ４．１ソフトウェアを全てのピーク積分及び濃度分析に使用した。
発酵
全ての培地配合物において、グルコースの代わりにキシロース（１グラムのグルコースに対して１グラムのキシロース）を使用したことを除いて、最小培地微小発酵を以前に報告されたように行った（Ｍｏｒｅｂ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄｉａ Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｗｏ－ｓｔａｇｅ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０２０）ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．０ｃ００１８２及びＭｅｎａｃｈｏ－Ｍｅｌｇａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃａｌａｂｌｅ，ｔｗｏ－ｓｔａｇｅ，ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２６，４４（２０２０））。ガイドアレイの安定性は、Ｌｉらによる評価に先立ち、ｐＣＡＳＣＡＤＥプラスミドの形質転換をＰＣＲにより確認した。２４流加培養発酵は、以前に報告されたように、グルコースの代わりにキシロースを用いて行った（Ｍｅｎａｃｈｏ－Ｍｅｌｇａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃａｌａｂｌｅ，ｔｗｏ－ｓｔａｇｅ，ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２６，４４（２０２０）。キシロース供給は以下のように変更した。出発バッチのグルコース濃度は２５ｇ／Ｌであった。細胞が指数増殖期中期に入ったときに、濃縮した滅菌濾過キシロース供給材料（５００ｇ／Ｌ）を初期速度１０ｇ／ｈでタンクに添加した。次いで、この速度を指数関数的に増加させ、総グルコース４０ｇが添加されるまで１．０８３時間（６５分）ごとに倍増し、その後、供給材料を１．７５ｇ／ｈｒに維持した。接種８５時間後にキシロース蓄積により供給材料を０．８７５ｇ／時間に減少させ、接種１２０時間後に停止させた。
（ＸｙｒＡ）キシロースレダクターゼの精製及び活性アッセイ
プラスミドｐＨＣＫａｎ－ｘｙｒＡ（６×ｈｉｓタグを有する）を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）をルリア培地（レノックス配合物）中で一晩培養した。一晩培養物を使用して、適切な抗生物質を含むＳＭ１０＋＋培地（グルコースの代わりにキシロースを炭素源として含む）に接種した。細胞を３７℃で１６時間培養した後、細胞を遠心分離し、ＳＭ１０リン酸なし培地でペレットを洗浄した。次に、洗浄したペレットを再懸濁し、適切な抗生物質と共に再びＳＭ１０リン酸なし培地中で培養した。発現後、産生後の細胞を凍結融解サイクルによって溶解した。ＸｙｒＡタンパク質を、製造業者の指示に従ってＮｉ－ＮＴＡレジン（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７８６－９３９）を使用して精製した。ＸｙｒＡの動態アッセイを、補因子としてＮＡＤＰＨを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で構成される反応緩衝液中で行った（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｘｙｒＡ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｄ－Ｘｙｌｏｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｉｔｏｌ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７，２８０－２８４（１９９９））。これらのアッセイでは、ＮＡＤＰＨは初期レベル５０μＭで一定に保たれた。アッセイの結果を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸光度を１．５時間（１５秒／読み取り）監視することによって測定した。反応速度をキシロース濃度の関数としてプロットする。イーディー＝ホフステー式を使用して、パラメータＶｍａｘ＝２２．６±１．０１Ｕ、ｋｃａｔ＝１３．５６±３．０５ｓ－１及びＫｍ：３５．１２±３．０５ｍＭを得た。
（ＸｙｌＡ）キシロースイソメラーゼの定量
細胞抽出物からのキシロースイソメラーゼ活性を、前述の方法と同様であり、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸光度の減少後に、Ｄ－キシロースレダクターゼ共役酵素アッセイで定量した（Ｇｕａｍａｎ，Ｌ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．ｘｙｌＡ ａｎｄ ｘｙｌＢ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ａ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｘｙｌｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５，１６５－１７３（２０１８）及びＬｅｅ，Ｓ．－Ｍ．，Ｊｅｌｌｉｓｏｎ，Ｔ．＆Ａｌｐｅｒ，Ｈ．Ｓ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｘｙｌｏｓｅ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８，５７０８－５７１６（２０１２））。培養物を振盪フラスコ中のＳＭ１０＋＋培地中で増殖させ、指数期中期に回収し、洗浄し、ＳＭ１０リン酸なし培地に再懸濁した。１６時間のリン酸欠乏後、細胞を１０分間の遠心分離（４１２２ＲＣＦ、４℃）によってペレット化し、製造業者のプロトコルに従ってＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７０５８４）で溶解した。細胞片を、２０分間（４１２２ＲＣＦ、４℃）の２回の遠心分離、続いて２０分間のハードスピン（１４０００ＲＣＦ、４℃）によって除去した。溶解物をＡｍｉｃｏｎ３０ＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＵＦＣ８０３０）で製造業者のプロトコルに従って濾過し、３回洗浄して緩衝液を反応緩衝液（４５ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．６）と交換し、代謝産物を除去した。試料を、３１．２５ｍＭキシロース、０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、及び１ｕｇ／ｍＬの精製Ｄ－キシロースレダクターゼ（上記参照）を含有するウェル当たり１００ｕＬの濾過細胞抽出物を含む９６ウェルプレートにおいて三連でアッセイした。３４０ｎｍでの吸光度を１５秒毎に１．５時間測定し、線形領域の傾きを用いてＸｙｌＡ活性を定量した。各試料の総タンパク質濃度を標準的なブラッドフォードアッセイで決定した。速度論的パラメータは以下のｋｃａｔ：１３．５６±３．０５ｓ－１、Ｋｍ：３５．１２±３．０５ｍＭの通りであった。
（ＵｄｈＡ）可溶性トランスヒドロゲナーゼの定量
可溶性トランスヒドロゲナーゼの活性を、以前に報告された方法によって定量した（Ｃｈｏｕ，Ｈ．－Ｈ．，Ｍａｒｘ，Ｃ．Ｊ．＆Ｓａｕｅｒ，Ｕ．Ｔｒａｎｓｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｖａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＮＡＤＰＨ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．１１，ｅ１００５００７（２０１５）及びＳａｕｅｒ，Ｕ．，Ｃａｎｏｎａｃｏ，Ｆ．，Ｈｅｒｉ，Ｓ．，Ｐｅｒｒｅｎｏｕｄ，Ａ．＆Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｔｒａｎｓｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ＵｄｈＡ ａｎｄ ＰｎｔＡＢ ｈａｖｅ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＮＡＤＰＨ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，６６１３－６６１９（２００４））。ＵｄｈＡ発現及び細胞溶解のプロセスは、上記のＸｙｒＡ発現と同じ方法を用いて行った。溶解物を１５分間（４２００ＲＰＭ、４℃）遠心分離して、大きな破片を除去した。２回目のハードスピンを３０分間（１４０００ＲＰＭ、４℃）行い、残った破片を除去し、更に膜画分を可溶性トランスヒドロゲナーゼから分離した。溶解物をアッセイ反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ、ｐＨ７．６）で１：５に希釈し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ）に移した。試料を３０分間（４２００ＲＰＭ、４℃）遠心分離し、この工程を３回繰り返して代謝産物を除去し、溶解緩衝液をアッセイ緩衝液と交換した。濾過後、試料のタンパク質濃度を標準的なブラッドフォードアッセイで定量した。
次いで、可溶性トランスヒドロゲナーゼ活性を室温でアッセイした。等しい体積の溶解物及び反応緩衝液を、ウェル当たり１００ｕＬの最終体積並びに０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ及び１ｍＭ ３－アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（ＡＰＡＤ＋）の最終濃度で混合することによって、黒色９６ウェルプレートでアッセイを行った。ＡＰＡＤ＋の還元及びＮＡＤＰＨの酸化にそれぞれ起因する４００ｎｍ及び３１０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレートリーダによって３０秒間隔で３０分間同時に監視した。標準曲線を使用して、ＮＡＤＰＨのモル吸収率（３．０４＊１０３Ｍ－１ｃｍ－１）を計算した。モル吸収率を使用して、線形領域の測定された勾配を毎分の濃度変化に変換した。比活性（総タンパク質１ｍｇ当たりのユニット）は、１分間当たりの濃度の変化をタンパク質濃度で割ることによって決定した。
ＦａｂＩの定量
Ｃ末端ＧＦＰタグを介したＦａｂＩの定量は、ＡｂＣａｍのＧＦＰ定量キット（英国ケンブリッジ、カタログ番号ａｂ１７１５８１）を製造業者の指示に従って使用して行った。
キシロース及びキシリトールの定量
微小発酵では、キシロース及びキシリトールを、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（アイルランドのウィックロー、カタログ番号Ｋ－ＸＹＬＯＳＥ及びＫ－ＳＯＲＢ）からの市販のバイオアッセイによって、製造業者の指示に従って定量した。屈折率検出器と一体化したＨＰＬＣ法を使用して、計装化発酵からキシロース及びキシリトールの両方を定量した。簡潔には、Ｒｅｚｅｘ ＲＯＡ－有機酸Ｈ＋（８％）分析ＨＰＬＣカラム（カタログ番号００Ｈ－０１３８－Ｋ０、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、カリフォルニア州トーランス、３００×７．８ｍｍｅ）をキシロース及びキシリトールの分離に使用した。流速０．５ｍＬ／分、５５℃でのイソクラティック移動相としての５ｍＭ硫酸。検出には、Ｗａｔｅｒｓ２４１４ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ（ＲＩ）検出器（米国マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ社）と統合されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣを使用した。試料及び標準液の注入量は１０μＬであった。試料は、直線範囲（０．０１～２０ｇ／Ｌ）になるように水で２０倍希釈した。ＭａｓｓＬｙｎｘ ｖ４．１ソフトウェアを全てのピーク積分及び分析に使用した。
ＮＡＤＰＨプールの定量
ＮＡＤＰＨプールを、ＮＡＤＰＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡｂＣａｍ、英国ケンブリッジ、カタログ番号ａｂ１８６０３１）を製造業者の指示に従って使用して測定した。ＸｙｒＡ発現について上記のように培養及びリン酸欠乏を行った（細胞内にｘｙｒＡプラスミドが存在しなかったことを除く）。アッセイキット中の溶解緩衝液を用いて細胞を溶解した。
代謝モデリング
インシリコ分析を、開始点として以前に報告された再構成を有するＣＯＢＲＡｐｙ Ｐｙｔｈｏｎパッケージを使用して開発された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の制約ベース（ＣＯＢＲＡ）モデルを実装して実行した。この精選された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＭＧ１６５５再構築は、２，７１９の代謝反応及び１，１９２の固有の代謝産物を含む。このモデルを以下のように適合させた。最初に、キシリトール産生及び輸送のための欠損反応及び代謝産物を表Ｓ５に示すように添加した。
全ての反応、代謝産物の化学量論及び識別因子をＢｉＧＧモデルデータベースから抽出した。得られたモデルを、ＣＯＢＲＡｐｙ検証法を用いて、質量バランス及び代謝産物区画式について検証した。適切にバランスが取れたら、増殖モデルを作成し、分析した。具体的な評価条件及びバイオマスフラックスを表Ｓ６に示す。
＊（Ｐｒａｓａｄ，Ｓ．，Ｓｉｎｇｈ，Ａ．＆Ｊｏｓｈｉ，Ｈ．Ｃ．Ｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｆｕｅｌ ｆｒｏｍ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ，ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ｕｒｂａｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｒｅｓｏｕｒ．Ｃｏｎｓｅｒｖ．Ｒｅｃｙｃｌ．５０，１－３９（２００７））からの番号。
次に、キシリトール微小発酵から得られた実験データを使用してモデルの制約を与えた。具体的な制約としては、ｉ）それぞれ総フラックスの１０％及び９０％でピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）及びピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ｙｂｄｋ）によるピルビン酸消費の比を設定すること、及びｉｉ）フェレドキシン／フラボドキシンレダクターゼを可逆的反応に設定すること、及びｉｉｉ）最小培地条件下で１０ｍｍｏｌ／ｇＣＤＷ＊ｈｒの投入フラックスでキシロースを唯一の炭素源として使用することが含まれた。最後に、特定のキシリトール産生株のセットを構築し、Ｆｌｕｘ Ｂａｌａｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＦＢＡ）を使用してインシリコで評価して、キシリトール収率を得て、目的の補因子及び／又は代謝産物並びに産生及び消費フラックスを分析した。分析した具体的なケースには、表Ｓ７に示すように、Ｚｗｆ、ＦａｂＩ、ＧｌｔＡ、ＸｙｌＡ、ＰｎｔＡＢ及びＵｄｈＡの活性の減少又は増加が含まれた。各ケース／状態について、以下のデータであるキシリトール収率、ＮＡＤＰＨ産生及び消費ｇ反応フラックス、並びにフラックス分布の可視化のための中心代謝のエッシャーマップを得た。最後に、最も関連性の高い株間のフラックスの主な変化を分析した。
例１：ＸｙｒＡキシロースレダクターゼの特徴付け
ここで、図２（Ａ）を参照すると、（増殖のための）ＳＭ１０＋＋と（発現のための）ＳＭ１０－リン酸なしとの培地の組み合わせを使用したＢＬ２１におけるＸｙｒＡの発現が示されている。発現後、産生後の細胞を凍結融解サイクルによって溶解した。次に、プラスミド配列に設計されたＸｙｒＡ上のＨｉｓタグを利用して、ｘｙｒＡタンパク質をＮ－Ｎレジンによって抽出した。図２（Ｂ）では、補因子としてのＮＡＤＰＨによるｘｙｒＡの活性。反応速度をキシロース濃度の関数としてプロットする。これらのアッセイでは、ＮＡＤＰＨは初期レベル５０ｕＭで一定に保たれた。図２（Ｃ）、このプロジェクト及び比較としての他の研究ソースからのＸｙｒＡの速度論的パラメータ。ＸｙｒＡの動態は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６（５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有）を使用して測定した。２６５０ｕＭ ＮＡＤＰＨ。アッセイの結果を、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの吸光度を監視することによって測定した。イーディー＝ホフステー式を使用して、パラメータＶｍａｘ＝２２．６Ｕ、ｋｃａｔ＝１３．５ｓ－１及びｋｍ＝３５．１２ｍＭを確立し、タンク発酵プロセスで使用できるタンパク質酵素活性を確認した。Ｖｍａｘを知ることにより、所望の特定の産生速度に達するのに必要な最小発現レベルを確立することができる。
例２：キシリトールの生物産生のための代謝バルブの設計
リン酸欠乏定常期において、２段階の動的代謝制御を利用してキシロースからのキシリトール産生を最適化するための合理的に設計された株を開発した。図１に示すように、この設計には、キシリトール産生と競合するキシロース代謝を減少させるため、キシロースレダクターゼの過剰発現及びキシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性の動的減少が含まれていた。この目的に向けて、本発明者らは、遺伝子サイレンシング、ＸｙｌＡのタンパク質分解、又は組み合わせによって、リン酸欠乏時のｘｙｒＡの動的誘導、及びＸｙｌＡ活性の動的減少を可能にする株及びプラスミドを構築した。使用したプラスミド及び株については、表１及び２を参照されたい。Ｍｏｒｅｂらによって報告されているように、これらの株を９６ウェルプレート微小発酵で評価し、結果を図３に示す。
リン酸欠乏定常期において、２段階の動的代謝制御を利用してキシロースからのキシリトール産生を最適化するための合理的に設計された株を開発した。図１に示すように、この設計には、キシリトール産生と競合するキシロース代謝を減少させるため、キシロースレダクターゼの過剰発現及びキシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性の動的減少が含まれていた。この目的に向けて、本発明者らは、遺伝子サイレンシング、ＸｙｌＡのタンパク質分解、又は組み合わせによって、リン酸欠乏時のｘｙｒＡの動的誘導、及びＸｙｌＡ活性の動的減少を可能にする株及びプラスミドを構築した。使用したプラスミド及び株については、表１及び２を参照されたい。Ｍｏｒｅｂらによって報告されているように、これらの株を９６ウェルプレート微小発酵で評価し、結果を図３に示す。
例３：２段階動的制御を利用したキシリトール産生
ＸｙｌＡ（「Ｘ」）活性に対する動的制御は、キシリトール産生の中程度の改善しかもたらさなかったので、図３において、本発明者らは、キシリトール産生に対するより大きなバルブセットの潜在的影響を評価した。本発明者らは、重要な代謝経路にバルブを有する株のセットを構築した（図４）。これらのバルブには、クエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ－「Ｇ」）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ－「Ｚ」）、エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＩ－「Ｆ」）及び可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ｕｄｈＡ－「Ｕ」）が含まれ、これらはそれぞれトリカルボン酸サイクル、ペントースリン酸経路、脂肪酸生合成及びＮＡＤＰＨ供給を介してフラックスを制御する。株をＸ、Ｕ、Ｇ、Ｚ及びＦバルブの組み合わせで構築し、キシリトール産生について評価した。上記のように、動的代謝制御は、Ｃ末端ＤＡＳ＋４デグロンタグをｘｙｌＡ、ｕｄｈＡ、ｚｗｆ、ｇｌｔＡ及びｆａｂＩ遺伝子に付加すること、並びにそれらの転写のサイレンシングを可能にするガイドＲＮＡの過剰発現によって達成された。詳細な染色体改変及びプラスミド構築については、方法の節を参照されたい。
ＸｙｌＡ（「Ｘ」）活性に対する動的制御は、キシリトール産生の中程度の改善しかもたらさなかったので、図３において、本発明者らは、キシリトール産生に対するより大きなバルブセットの潜在的影響を評価した。本発明者らは、重要な代謝経路にバルブを有する株のセットを構築した（図４）。これらのバルブには、クエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ－「Ｇ」）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ－「Ｚ」）、エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＩ－「Ｆ」）及び可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ｕｄｈＡ－「Ｕ」）が含まれ、これらはそれぞれトリカルボン酸サイクル、ペントースリン酸経路、脂肪酸生合成及びＮＡＤＰＨ供給を介してフラックスを制御する。株をＸ、Ｕ、Ｇ、Ｚ及びＦバルブの組み合わせで構築し、キシリトール産生について評価した。上記のように、動的代謝制御は、Ｃ末端ＤＡＳ＋４デグロンタグをｘｙｌＡ、ｕｄｈＡ、ｚｗｆ、ｇｌｔＡ及びｆａｂＩ遺伝子に付加すること、並びにそれらの転写のサイレンシングを可能にするガイドＲＮＡの過剰発現によって達成された。詳細な染色体改変及びプラスミド構築については、方法の節を参照されたい。
パネルは、Ｘ、Ｕ、Ｇ、Ｚ及びＦの約３７０個のバルブの組み合わせからなり、これを少なくとも三連での９６ウェルプレート微小発酵について２段階でキシリトール産生について評価した。これらの実験の結果を図５Ａ及び図５Ｂに示す。キシリトール力価は、約０ｇ／Ｌ－ＯＤ（６００ｎｍ）～約９．３５ｇ／Ｌ－ＯＤ（６００ｎｍ）の範囲であった。サイレンシングとタンパク質分解の組み合わせの約８０％が、０．１０６ｇ／Ｌ－ＯＤしかもたらさなかった対照株よりも良好に機能した。一元配置分散分析によって、バルブ株と対照株との間の特異的キシリトール産生（キシリトール（ｇ／Ｌ）／単位ＯＤ６００ｎｍ）の有意差を決定した（Ｆ（４１４，８５１）＝７．５９８、ｐ＜０．０００１）。
Ｐ値を使用してｐ値ヒートマップを生成し（図６）、０．０５未満のｐ値を有する組み合わせのみが強調表示されている。アッセイされなかったか、又は２回未満しか成功しなかった反復（成功しなかったのは細胞が増殖しなかったため）を有する組み合わせは、統計分析に適格ではないので、灰色のドットで示される。Ｘバルブの組み込みは、一般に、キシリトール産生を増加させたが、驚くべきことに、２つの最も高いキシリトール産生体は、ＸバルブもＵバルブも有さず（ＮＡＤＰＨレベルを増加させるはずである）、むしろＦ、Ｇ及びＺバルブの組み合わせを有していた。最も高い産生株は、キシリトール特異的産生性が９．３５ｇ／Ｌ－ＯＤ６００ｎｍに達することができたＦ及びＺバルブの組み合わせを有していた。この遺伝的組み合わせの性能はまた、Ｆバルブ又はＺバルブのいずれか単独よりも相乗的であった。これらの２つの酵素は、図４に見られるようなキシリトール生合成の直接的又は予測可能な影響を有さないので、これは驚くべきことであった。
例４：計装化バイオリアクターにおけるキシリトールの産生
微小発酵からの結果（図５及び図６）に基づいて、本発明者らは、９．３５ｇ／Ｌ－ＯＤ６００の力価を有する「Ｚ－ＦＺ」バルブ株（ｚｗｆ「Ｚ」のサイレンシング並びにｆａｂＩ及びｚｗｆ「ＦＺ」のタンパク質分解）並びに対照を計装化バイオリアクターでの評価のために選択した。発酵は、リン酸が培地中で制限的であり、図５に上に示すように定常期でのリン酸欠乏及びキシリトール産生をもたらす、Ｍｅｎａｃｈｏ－Ｍｅｌｇａｒらに従って行った。これらの発酵の結果を以下の図６に示す。Ｚ－ＦＺ株（図６Ａ）は、１６０時間で最大１０４＋／－１１．３１ｇ／Ｌのキシリトール産生を可能にしたが、本発明者らの対照株ＤＬＦ＿００２５－ＥＶ（図６Ｂ）におけるｘｙｒＡ発現は、同じ時間内で約３ｇ／Ｌのキシリトールしかもたらさなかった。
例５：ＮＡＤＰＨフラックス及びキシリトール生合成の改善
キシロースからキシリトールを産生する以前の研究のほとんどは、電子供与体として追加の糖（通常はグルコース）を必要とする生物変換に依存している（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，Ｔ．Ｌ．ｄｅ，ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｉ．Ｊ．，ｄｅ Ｍａｃｅｄｏ，Ｇ．Ｒ．＆Ｒｏｃｈａ，Ｍ．Ｖ．Ｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｉｔｏｌ ｆｒｏｍ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｗａｓｔｅｓ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９，１７７９－１７８９（２０１４）、Ｃｉｒｉｎｏ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．＆Ｉｎｇｒａｍ，Ｌ．Ｏ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｘｙｌｉｔｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｘｙｌｏｓｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５，１１６７－１１７６（２００６）及びＳｕ，Ｂ．，Ｗｕ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｌｉｎ，Ｊ．＆Ｙａｎｇ，Ｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｉｔｏｌ ｆｒｏｍ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．３１，１１２－１２２（２０１５））。グルコースの酸化（副生成物であるグルコン酸を生成する）によりＮＡＤＰＨが生成され、ＮＡＤＰＨはその後、キシロース還元に使用される（Ｊｉｎ，Ｌ．－Ｑ．，Ｘｕ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｌｉｕ，Ｚ．－Ｑ．＆Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．－Ｇ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｘｙｌｉｔｏｌ ｆｒｏｍ Ｘｙｌｏｓｅ ｂｙ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｘｙｌｏｓｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８７，１１４３－１１５７（２０１９）。これらのプロセスは、キシリトール力価が高く、キシロースを考えると収率も良好であるが、キシロースと等モルのグルコースが必要なため、大きな非効率が生じる。より広範には、多数の代謝産物の合成並びに細胞ベースの生体変換に有用なＮＡＤＰＨの利用可能性又はフラックスの改善は、代謝工学における長年の課題であった。
本発明者らは、２段階動的代謝制御（ＤＭＣ）を適用して、唯一の供給原料としてキシロースを使用してＮＡＤＰＨフラックス及びキシリトール産生を改善した（Ｂｕｒｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｃ．Ｂ．，Ｙｅ，Ｚ．，Ｒｅｅｄ，Ｂ．Ｒ．＆Ｍｏｒｅｂ，Ｅ．Ａ．Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｎｅｓｓ：ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｄｙｎａｍｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｗｏ－ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ（２０１６））。代謝に対する動的制御は、代謝工学において一般的なアプローチとなっており、３－ヒドロキシプロピオン酸からミオイノシトール及び他の多くの様々な生成物の産生に使用されている。本発明者らは最近、２段階バイオプロセスへの動的代謝制御の拡張を報告しており、ここで、産物は、代謝的に産生するリン酸欠乏定常期で産生される。このアプローチの実施は、それぞれデグロンタグ及びＣＲＩＳＰＲ干渉を使用する、制御されたタンパク質分解及び遺伝子サイレンシングの併用に依存する。重要なことに、これらの初期研究において、本発明者らは、動的代謝制御から生じる改善された代謝フラックスが、他の重要な代謝経路のフィードバック調節因子である中心代謝産物のレベルを低下させる結果であってもよいことを実証した。具体的には、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼレベルを低下させると、ピルビン酸フェレドキシン／フラボドキシンオキシドレダクターゼ（Ｐｆｏ）の発現及び活性を増加させるＳｏｘＲＳレグロンが活性化されることが最近示された。Ｐｆｏは、定常期におけるアセチル－ＣｏＡ産生の改善をもたらす。（図１１（Ａ）参照）。この研究では、キシロースからのキシリトール産生に対する合成代謝バルブの組み合わせの評価を報告する。第１に、Ｐｆｏ活性の増加は、アセチル－ＣｏＡフラックスの改善だけでなく、ＮＡＤＰＨ産生ももたらす。ＮＡＤＰＨは、還元型フラボドキシン／フェレドキシンから、ＮＡＤＰＨ依存性フラボドキシン／フェレドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ）の作用を介して産生される。本発明者らはまた、ＮＡＤＰＨフラックスを制御する重要な調節機構、すなわち、脂肪酸代謝産物による膜結合トランスヒドロゲナーゼ（ＰｎｔＡＢ）の阻害を同定する。脂肪酸生合成を動的に破壊することにより、本発明者らはＰｎｔＡＢの阻害を緩和する。この機構は、Ｐｆｏの活性化と相乗的であり、ＮＡＤＰＨフラックス及びキシリトール産生を大幅に増加させる。本発明者らは、この「調節」アプローチを、キシリトール産生と競合する重要な酵素のレベルが動的に低下する、より直感的な化学量論的戦略と比較する。重要なことに、ＮＡＤＰＨフラックスの改善は、部分的にはＮＡＤＰＨプールの減少の結果である。ＮＡＤＰＨプールの減少は、ＮＡＤＰＨフラックスの増加をもたらす発現及び活性の変化を駆動し、これはおそらく、セットポイントのＮＡＤＰＨレベルを回復させるために進化した調節機構である。これらの結果は、プールとフラックスが同等ではなく、必ずしも相関していないことを想起させるものである。
化学量論的戦略
本発明者らは、最初に、重要な競合経路のレベルの低下に依存して、２段階の動的代謝制御を利用してキシロースからのキシリトール産生を最適化する株を合理的に設計した。図１に示すように、この設計は、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）及び可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ｕｄｈＡ）活性の動的減少を含んでいた。これらの改変は、キシリトール産生と競合し、ＮＡＤＰＨ供給を増加させるキシロース代謝を減少させるように設計された。ＮＡＤＰＨは可溶性トランスヒドロゲナーゼによって消費され得る。この目的に向けて、本発明者らは、リン酸欠乏時にＸｙｌＡ及びＵｄｈＡレベルの動的減少を可能にする株及びプラスミドを構築した。本研究で使用した株及びプラスミドについては補足表Ｓ１を参照されたい。上記及び以前に報告されたように、Ｃ末端ＤＡＳ＋４デグロンタグを染色体ｘｙｌＡ及びｕｄｈＡ遺伝子に付加すること、並びにそれらの発現をサイレンシングすることを目的としたガイドＲＮＡの過剰発現によって、活性の動的減少を達成した。２段階培養における酵素レベルに対するこれらの改変の影響を図９Ａ～Ｂに示す。ＸｙｌＡの場合、タンパク質分解は活性の約６０％の低下をもたらした。本発明者らが驚いたことに、ｇＲＮＡのサイレンシングは、実際には、増大したＸｙｌＡ活性レベルをもたらした。この背後にあるメカニズムは現在知られておらず、更なる研究を必要とする。サイレンシングとタンパク質分解の組み合わせは、タンパク質分解単独と比較した場合、活性の更なる低下をもたらさなかった。ＵｄｈＡの場合、タンパク質分解は活性の約３０％の低下をもたらしたが、サイレンシングはタンパク質分解の有無にかかわらず活性レベルに検出可能な影響を及ぼさなかった。
ＸｙｌＡ又は「Ｘバルブ」のタンパク質分解とサイレンシングの組み合わせ、及び「Ｕバルブ」であるＵｄｈＡの場合のタンパク質分解のみを、キシリトール産生について評価する。具体的には、これらの代謝バルブを用いて、並びにキシロースレダクターゼ（アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）からのｘｙｒＡ）の過剰発現のために株を操作し、Ｍｏｒｅｂらによって報告されているように、２段階最小培地微小発酵で評価した。結果を図１０Ａ～Ｃに示す。更に、ＸｙｒＡ動態の確認分析を実施し、結果を補足図１１に示す。改変の組み合わせは、対照と比較してキシリトール産生の１６倍の増加をもたらした。
調節の戦略
調節の戦略の影響を調査するために、次に、図１２Ａに示すように、キシリトール産生に対するより大きなバルブのセットの潜在的な影響を評価しようとした。本発明者らは、それぞれトリカルボン酸回路、ペントースリン酸経路及び脂肪酸生合成を介してフラックスを制御するクエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）及びエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＩ）のバルブを有する株のセットを構築した。本発明者らは以前に、タンパク質分解（ＤＡＳ＋４タグ）、遺伝子サイレンシング（ｚｗｆプロモータ又はｇｌｔＡｐ２プロモータのいずれか）のいずれか又はその両方を含むＧｌｔＡ（「Ｇバルブ」）及びＺｗｆ（「Ｚバルブ」）における代謝バルブの構築を報告した。ＦａｂＩの場合、本発明者らは、ＦａｂＩレベルに対する２段階動的制御を評価するために新しい株及びプラスミドを構築した。この目的に向けて、Ｌｉらによって同様に報告されたように、本発明者らは、ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベルの定量化を可能にするために、ｆａｂＩ対立遺伝子のＣ末端にスーパーフォルダＧＦＰを付加した。残念ながら、予想外にも、ｆａｂＩ発現をサイレンシングするプラスミドを評価した場合、ガイドＲＮＡプロトスペーサの喪失が観察され（図１３Ａ～図１３Ｄ）、その結果、ｆａｂＩがサイレンシングされた結果を確実に得ることができなかった。ＦａｂＩタンパク質分解はＦａｂＩレベルの約７５％の低下をもたらし（図１４）、その結果、タンパク質分解単独は「Ｆバルブ」と呼ばれる。株を「Ｘ」、「Ｕ」、「Ｇ」、「Ｚ」及び「Ｆ」バルブの組み合わせで構築し、ここでも最小培地微小発酵でキシリトール産生について評価した。結果を図１２Ａ～図１２Ｄに示す。驚いたことに、最も高いキシリトール産生体は、「Ｘ」バルブも「Ｕ」バルブも有さず、むしろ「Ｆ」バルブと「Ｚ」バルブの組み合わせを有していた。「ＦＺ」バルブ株におけるキシリトール産生は、「Ｆ」又は「Ｚ」バルブ単独よりも相乗的であった（図１２Ｂ）。これらの２つの酵素は、図１２Ａに見られるようなキシリトール生合成の直接的又は予測可能な影響を有さないので、これは驚くべきことであった。本発明者らは最近、「Ｚ」バルブがＰｆｏ（ｙｄｂＫ遺伝子によってコードされる）の活性化をもたらすことによってアセチル－ＣｏＡフラックスの増加をもたらすことを報告した。Ｐｆｏによるフラックスの増加に伴い、本発明者らは、還元型フェレドキシン／フラボドキシンからフェレドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ）を介してＮＡＤＰＨが生成され得ると仮定した。図１５に示すように、ｙｄｂＫ及びｆｐｒの欠失を使用して、本発明者らは、この経路、具体的にはＦｐｒが実際に、本発明者らの「ＦＺ」バルブ株で観察されるキシリトール産生及びＮＡＤＰＨフラックスの増加に部分的に関与していることを確認した。これは、本発明者らの知る限りでは、Ｆｐｒがインビボで可逆的であることの最初の確認である。Ｆｐｒを介したこの逆方向のフラックスは、（以下で論じられるように）低ＮＡＤＰＨプールに依存し得る。「Ｆ」バルブの相乗効果は、幾分予想外であった。しかし、ＦａｂＩ（エノイル－ＡＣＰレダクターゼ）に対する動的制御によるＮＡＤＰＨフラックスの上昇は、脂肪酸代謝産物、特にアシル－ＣｏＡ（及び潜在的にそれらの前駆体アシル－ＡＣＰ）のレベルの低下に起因し得る。脂肪アシル－ＣｏＡは、ｐｎｔＡＢ遺伝子によってコードされる膜結合トランスヒドロゲナーゼの競合的阻害剤である（図１２Ａ）。パルミトイル－ＣｏＡは、具体的には、Ｋｉが１～５μＭと報告された。ＦａｂＩレベル及び／又は活性の制御は、アシル－ＡＣＰプールを減少させ、その結果、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ及びマロニル－ＣｏＡ合成のフィードバック阻害を緩和することが以前に示されている。本発明者らの知る限り、これは、ＮＡＤＰＨフラックスの制御におけるこれらの代謝産物の重要性を実証する最初の研究である。以前の報告は、アシル－ＣｏＡ（最小培地では脂肪酸生合成に由来する）によるＰｎｔＡＢの阻害を実証しており、アシル－ＡＣＰも阻害剤として作用する可能性が残っているが、この仮説を確認するためには今後の研究が必要である。
次に、本発明者らは、キシリトール産生に影響を与える可能性のある、「ＦＺ」バルブの上のいくつかの追加の改変を評価した。（図１５Ｂ～図１５Ｄ）。具体的には、「Ｇ」バルブ及び「Ｕ」バルブの添加並びにｐｎｔＡＢの過剰発現を評価した。プラスミドに基づくｐｎｔＡＢ遺伝子の過剰発現（低リン酸誘導性プロモータを使用）は、キシリトール産生の有意な改善をもたらした（図１５Ｂ）。対照的に、「Ｇ」又は「Ｕ」バルブのいずれかを「ＦＺ」組み合わせに追加しても、キシリトール合成は増加せず、むしろキシリトール産生の有意な減少をもたらした（図１５Ｃ～図１５Ｄ）。これは、クエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ）活性、及びＴＣＡサイクルを介したフラックスが、最適なＮＡＤＰＨフラックスに必要であることを示唆している。
これらの実験からの結果を使用して、本発明者らは、いくつかの細胞内フラックスの境界条件を推定することができた。例えば、図１５Ｂから、本発明者らは、Ｐｆｏ／Ｆｐｒ経路を介したフラックスがＮＡＤＰＨ／キシリトール産生の最大約５５％を占めると推定することができる。結果として、本発明者らは、最適な増殖期とキシリトール産生期とを比較して、図１６Ａ～図１６Ｂに示すように、化学量論的代謝モデルを構築することができる。重要なことに、このモデルは、実際にＴＣＡフラックスがキシリトール産生に重要であることを確認し（図１７Ａ～Ｂ）、ＮＡＤＰＨフラックス及びキシリトール産生の増加を説明するためには、Ｐｆｏ／Ｆｐｒ経路を介したフラックスに加えて、ＰｎｔＡＢ活性の４倍の増加が必要であることを確認する。このモデルは、以下で論じられるように流加培養発酵で測定された収率と一致して、この代謝状態における全体的な最大キシリトール収率は約０．８６４ｇ／ｇのキシロースと予測される。
計装化バイオリアクターにおける産生
次に、本発明者らは、ｐｎｔＡＢ過剰発現あり及びなしの「ＦＺ」バルブ株を用いた計装化バイオリアクターにおけるキシリトール産生を対照株と比較した。最小培地流加培養発酵を、定常期におけるリン酸欠乏及びキシリトール生合成の誘導の前に、培地が標的バイオマスレベル（約２５ｇＣＤＷ／Ｌ）を保持するのに十分なバッチリン酸を有する、Ｍｅｎａｃｈｏ－Ｍｅｌｇａｒらによって記載されるように行った。これらの研究の結果を図１８に示す。本発明者らの対照株（ＤＬＦ＿Ｚ００２５）におけるｘｙｒＡ発現は、１リットル当たり数グラムのキシリトールしかもたらさなかったが（図１８Ａ）、「ＦＺ」バルブの組み込みは、１６０時間の産生で１００ｇ／Ｌを超える力価をもたらした（図１８Ｂ）。ｐｎｔＡＢの更なる過剰発現（図１８Ｃ）は、１７０時間で２００ｇ／Ｌ（１８５～２０４ｇ／Ｌ）を超える最大力価をもたらした。これらの二連発酵では、平均全キシリトール収率は０．８７３＋／－０．０２６ｇ／ｇキシロースであり、平均産生収率（定常期で）は０．９３５＋／－０．０１１ｇ／ｇキシロースであった。
改善されたＮＡＤＰＨフラックスはＮＡＤＰＨプールと相関しない。
最後に、本発明者らは、本発明者らの操作株のセットにおけるＮＡＤＰＨのレベルを測定した。結果を図１９Ａに示す。興味深いことに、特異的キシリトール産生とＮＡＤＰＨプールとの間に相関はなかった。この場合、最も高いＮＡＤＰＨプールを有する３つの株は対照株、及びエノイル－ＡＣＰレベル（「Ｆ」バルブ）又は可溶性トランスヒドロゲナーゼ（「Ｕ」バルブ）レベルを動的に制御する株であった。「Ｚ」バルブ（グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのレベル低下）の添加は、ＮＡＤＰＨプールの減少をもたらしたが、ＮＡＤＰＨフラックスの増加をもたらした。ｙｄｂＫ及び／又はｆｐｒのいずれかの欠失もＮＡＤＰＨレベルの減少をもたらし、ｐｎｔＡＢを過剰発現させるとキシリトール産生速度及びフラックスが増加するが、「ＦＺ」バックグラウンドではＮＡＤＰＨプールは改善されなかった。
２段階動的制御の使用は、ＮＡＤＰＨフラックス及びキシリトール産生の増強をもたらす通常の代謝状態を生じた。本発明者らの知る限り、これは、特にキシロースを唯一の炭素源として、操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてこれまでに産生されたキシリトールの最も高い力価及び収率である。更に、これらの改変によって生成された産生定常期は、少なくとも１７０時間に延長することができる。この研究の焦点はキシリトール産生にあったが、ＮＡＤＰＨフラックスに影響を及ぼす「Ｆ」及び「Ｚ」バルブの同定は、より複雑な経路を含む他のＮＡＤＰＨ依存性プロセスに適用可能であり、日常的なＮＡＤＰＨ依存性生体変換のための容易な方法を表し得る。トランスヒドロゲナーゼ活性に対するＦａｂＩ活性及び脂肪酸代謝産物プールの影響は、以前の生化学的研究と一致しており、ＮＡＤＰＨ供給と脂肪酸合成需要とのバランスをとるように進化した可能性が高い。残念なことに、このフィードバック調節機構は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における過去数十年の代謝工学研究で失われてきたが、ＮＡＤＰＨフラックスを改善するための強力なアプローチである。「Ｆ」バルブと「Ｚ」バルブとの予測不可能な組み合わせは、ＮＡＤＰＨフラックスに関する標準的な考えと矛盾しており、Ｚｗｆは細胞内のＮＡＤＰＨの主要な供給源の１つと考えられることが多く、Ｚｗｆ活性を低下させることは、ＮＡＤＰＨ供給を増加させるために行うべき変更のリストでは上位にない。
ＮＡＤＰＨプールと本発明者らの結果との間の相関の欠如を説明するために、本発明者らは、図１に示すような概念モデルを開発した。「Ｚ」バルブは、酸化剤及びＮＡＤＰＨレベルに感受性であるＳｏｘＲＳレギュロンを活性化するＮＡＤＰＨプールの減少をもたらす。ＳｏｘＲＳ活性化は、高い速度のピルビン酸酸化を維持するために必要とされるＰｆｏの発現増加をもたらし、Ｆｐｒを介してＮＡＤＰＨを生成する。一意的には、本研究は、Ｐｆｏ及びＦｐｒを利用するＮＡＤＰＨ産生のための以前に報告されていない経路を特定し、Ｆｐｒがインビボで可逆的反応を触媒することを裏付けている。Ｐｆｏ発現は、ピルビン酸酸化及び糖消費だけでなく、ＴＣＡサイクルを介したＮＡＤＨ産生にも必要である。ＴＣＡフラックスの増加は、ＮＡＤＰＨフラックスを最大化するためにＰｎｔＡＢの基質として必要な過剰なＮＡＤＨを産生する。ＴＣＡサイクルの破壊（「Ｇ」バルブ、図１５Ｂ）は、ＮＡＤＨ産生及びアセチル－ＣｏＡ消費をなくし、ＮＡＤＰＨフラックスを大幅に減少させる。「Ｆ」バルブによるＮＡＤＰＨレベルの増加は、考察された結果に照らして理にかなっており、膜結合トランスヒドロゲナーゼであるＰｎｔＡＢの活性の増加に起因する。可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ＵｄｈＡ、図１５Ｄ）レベルの低下は、おそらくＳｏｘＲＳ活性化及びＰｆｏ発現を低下させるＮＡＤＰＨプールの増加をもたらす（図１９）。簡単に言えば、代謝ネットワークは、糖消費及びＮＡＤＰＨフラックスを増加させて補償することによって、ＮＡＤＰＨ及びアシル－ＣｏＡプールの減少に応答する。「セット」ポイントのＮＡＤＰＨプールが回復した場合、又は糖異化の継続が停止した場合、ＮＡＤＰＨフラックスの継続は停止される。
最後に、ＮＡＤＰＨフラックス及びキシリトール産生の増強をもたらす代謝状態は、それが中心的な代謝産物に起因するフィードバック阻害の操作に依存しているので、増殖共役プロセスにおいて同定及び／又は操作することが困難であろう。これらの中心的な代謝調節回路は、増殖を最適化し、環境及び生理学的動揺に対する適応応答を可能にするために、フラックスのバランスをとるように進化してきた。動的代謝制御、特に２段階動的代謝制御は、細胞の増殖又は生存に影響を与えることなく、中心代謝産物レベルを操作するのに独特に適している。このアプローチは、代謝フラックスを増強し、今後の代謝工学戦略を推進する高い可能性を有する中央制御機構の発見及び操作につながる可能性がある。
配列表１～３１ ＜２２３＞合成
Claims (31)
- キシロースからキシリトールを産生するための遺伝子改変微生物であって、
キシロースレダクターゼの発現の誘導性改変と、
誘導性合成代謝バルブであって、
１つ又は複数の酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングすることを特徴とする遺伝子発現サイレンシング合成代謝バルブ、又は
１つ又は複数の酵素の酵素分解を誘導することを特徴とする酵素分解合成代謝バルブ、又は
それらの組み合わせ
を含む、誘導性合成代謝バルブと、
を含む、遺伝子改変微生物。 - 前記キシロースレダクターゼが、ＮＡＤＰＨ依存性キシロースレダクターゼである、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記キシロースレダクターゼが、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｘｙｒＡ遺伝子である、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記遺伝子改変微生物が、キシロース供給原料からキシリトールを産生する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブが、キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子又はキシロースイソメラーゼ酵素の制御を対象とする、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブが、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素の制御を対象とする、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブが、
グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素、及び
キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子又はキシロースイソメラーゼ酵素
を含む少なくとも２つの遺伝子の制御を対象とする、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。 - 遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブが、
グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素、及び
エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）をコードする遺伝子又はエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）酵素
を含む少なくとも２つの遺伝子の制御を対象とする、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。 - 遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブが、
グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子のサイレンシング
並びにグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素及びエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）酵素の酵素分解
からなる、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。 - キシロースレダクターゼの発現、遺伝子発現サイレンシング合成代謝バルブ、及び酵素分解合成代謝バルブが、多段階バイオ発酵プロセスの移行期の条件下で誘導される、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記誘導が栄養欠乏を介して起こる、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記誘導がリン酸欠乏を介して起こる、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 染色体欠失を更に含む、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 遺伝子発現のサイレンシングがＣＲＩＳＰＲ干渉を含み、遺伝子改変微生物がＣＡＳＣＡＤＥガイドアレイも発現し、前記アレイが、複数の遺伝子の同時サイレンシングのために異なる遺伝子を標的化するためにそれぞれ特異的な低分子ガイドＲＮＡをコードする２つ以上の遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記微生物が、バイオ発酵プロセスにおいて約２４時間で２０ｇ／Ｌを超えるキシリトール産物力価を産生する、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
- 遺伝子改変微生物からキシリトールを産生するための多段階発酵バイオプロセスであって、
（ａ）遺伝子改変微生物を提供することであって、
キシロースレダクターゼの発現の改変、及び
合成代謝バルブであって、
１つ又は複数の酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングすることを特徴とする遺伝子発現サイレンシング合成代謝バルブ、又は
１つ又は複数の酵素の酵素分解を誘導することを特徴とする酵素分解合成代謝バルブ、又は
それらの組み合わせを含み、
各合成代謝バルブの１つ又は複数の酵素が同じであるか又は異なる、合成代謝バルブを含む、
遺伝子改変微生物を提供することと、
（ｂ）キシロース供給原料を含む培地中で前記遺伝子改変微生物を増殖させることと、
（ｃ）前記合成代謝バルブを誘導して、前記微生物の増殖を減速又は停止させること、及びキシロースレダクターゼの発現を誘導することによって、増殖期からキシリトール産生期へ移行させることと、それにより、
（ｄ）キシリトールを産生することと、
を含む、多段階発酵バイオプロセス。 - 遺伝子改変微生物の遺伝子サイレンシング合成代謝バルブ又は酵素分解合成代謝バルブが、
グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をコードする遺伝子又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）酵素、
エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）をコードする遺伝子又はエノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ｆａｂＩ）酵素、及び
キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子又はキシロースイソメラーゼ酵素
からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子の制御を対象とする、請求項１６に記載の多段階発酵バイオプロセス。 - 前記バイオプロセスが、バイオ発酵プロセスにおいて約２４時間で２０ｇ／Ｌを超えるキシリトール産物力価を産生する、請求項１６に記載の多段階発酵バイオプロセス。
- 前記誘導移行期が、前記増殖培地のリン酸欠乏を介して起こる、請求項１６に記載の多段階発酵バイオプロセス。
- 前記遺伝子改変微生物が、染色体欠失を更に含む、請求項１６に記載の多段階発酵バイオプロセス。
- キシリトールを産生するための遺伝子改変微生物であって、前記微生物が、
キシロースイソメラーゼの誘導性低下と、
グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の誘導性低下と、
を含み、
当該株が、誘導時に供給原料キシロースからキシリトールを産生する、遺伝子改変微生物。 - 前記微生物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である、請求項２１に記載の遺伝子改変微生物。
- 誘導が栄養欠乏を介して起こる、請求項２１に記載の遺伝子改変微生物。
- 誘導がリン酸欠乏を介して起こる、請求項２１に記載の遺伝子改変微生物。
- （ａ）遺伝子改変微生物を提供することと、
（ｂ）キシロース供給原料を含む培地中で前記遺伝子改変微生物を増殖させることと、
（ｃ）合成代謝バルブを誘導して、前記微生物の増殖を減速又は停止させること、及び
キシロースイソメラーゼの発現を誘導することによって、
増殖期からキシリトール産生期へ移行させることと、それにより、
（ｄ）キシリトールを産生することと、
を含む、請求項２１に記載の遺伝子改変微生物からキシリトールを産生するための多段階発酵バイオプロセス。 - キシリトールを産生するための遺伝子改変微生物であって、前記微生物が、
キシロースレダクターゼの誘導性低下と、
グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の誘導性低下と、
エノイル－ＡＣＰレダクターゼの誘導性低下と、
を含み、
当該株が、誘導時に供給原料キシロースからキシリトールを産生する、遺伝子改変微生物。 - 前記微生物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物である、請求項２６に記載の遺伝子改変微生物。
- 誘導が栄養欠乏を介して起こる、請求項２６に記載の遺伝子改変微生物。
- 誘導がリン酸欠乏を介して起こる、請求項２６に記載の遺伝子改変微生物。
- （ａ）遺伝子改変微生物を提供することと、
（ｂ）キシロース供給原料を含む培地中で前記遺伝子改変微生物を増殖させることと、
（ｃ）合成代謝バルブを誘導して、前記微生物の増殖を減速又は停止させること、及びキシロースレダクターゼの発現を誘導することによって、増殖期からキシリトール産生期へ移行させることと、それにより、
（ｄ）キシリトールを産生することと、
を含む、請求項２６に記載の遺伝子改変微生物からキシリトールを産生するための多段階発酵バイオプロセス。 - 遺伝子改変微生物であって、
膜結合トランスヒドロゲナーゼ活性の活性が増大し、
ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼの活性が増大し、
ＮＡＤＰＨ依存性フェレドキシンレダクターゼの活性が増大し、
前記微生物が、化学産物の生合成がＮＡＤＰＨを必要とする少なくとも１つの化学産物を産生する、遺伝子改変微生物。
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