JP2015530121A - 有機酸を産生するための組換え微生物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のいくつかの側面は、DE−FC36−02GO12001を得て、米国政府の援助の下に行われた。
関連出願への相互参照および電子出願書類の参照による組み込み
微生物株およびプラスミド
アクチノバチルス・サクシノゲネスのFZ45株およびFZ53株はアクチノバチルス・サクシノゲネス130Zの安定な変異体であり、モノフルオロ酢酸ナトリウム耐性である。Guettler et al.、INT’L J.SYST.BACT.(1999)49:207−216;および米国特許第5,573,931号を参照のこと。大腸菌−アクチノバチルス・サクシノゲネスのシャトルベクターpLS88(ATCC(American Type Culture Collection)に受入番号86980で寄託されている)をLeslie Slaney博士(マニトバ大学、カナダ)から提供して頂いた。プラスミドpLS88はヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)から単離され、スルホンアミド、ストレプトマイシン、およびカナマイシンに対する耐性に寄与し得ることが分かっている。
組換えDNAの操作は基本的に、当該分野において記述のある方法に従って行った。プラスミドDNAをアルカリ溶解法で調製した。通常、1.5mlの培養から抽出した多コピープラスミドを50μlの容量で再懸濁した。より大規模なDNAの調製にはQiagenプラスミド精製ミディおよびマキシキットを用い、製造業者の説明に従って調製した。制限エンドヌクレアーゼ、分子量マーカー、および予め染色してあるマーカーはNew England BiolabsおよびInvitrogenから購入し、制限消化は、およそ5倍の過剰量の酵素を使用した以外は製造業者の推奨条件に従って行った。DNAをTris−酢酸−アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。DNAをアガロースゲルから抽出し、Qiagenのゲル精製キットを用い、製造業者の説明に従って精製した。エビまたはウシのアルカリホスファターゼ(R℃he)と制限消化とを組み合わせてDNAの脱リン酸化を行った。ホスファターゼを70℃で15分間加熱することまたはQiagenの精製カラムを通すことで不活化した。ベクターDNAに対して3〜5倍量(モルで)の過剰の挿入断片と1μlのT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を加え、20μlの反応容量で1時間、25℃で反応させることでライゲーションを行った。大腸菌の形質転換はInvitrogenから購入した「ライブラリー効率コンピテント細胞(library efficiency competent cells)」を用い、製造業者の説明に従って行った。
プライマーTD299(配列番号5)、およびTD300(配列番号6)を使い、アクチノバチルス・サクシノゲネスのzwf遺伝子とプロモーターをアクチノバチルス・サクシノゲネスFZ45のゲノムDNAから増幅し、図3に示すように、pLS88からの派生物であるpJR762.47のBamH1とSal1部位の間に(pLS88のEcoRIとSphI部位の間に挿入したマルチクローニングサイトを利用して)挿入した。
プライマーTD223(配列番号7)およびTD218(配列番号8)を使い、アクチノバチルス・サクシノゲネスのMdh遺伝子とプロモーターをアクチノバチルス・サクシノゲネスFZ45のゲノムDNAから増幅した。増幅したDNAを図2に示すように、pLS88のEcoRI部位の間にEcoRI断片としてクローニングした。pISTONS1に挿入されたmdh遺伝子は1558bpで、コード領域は303番目から開始し(図9で太字および下線で示したatg)、1239番目で終止する(図9で太字および下線で示したtaa)。これを配列番号3として示した。プロモーターはこの配列の最初からで、コード領域の前で終わる。
制限酵素EcoRIを使って、アクチノバチルス・サクシノゲネスのmdh遺伝子をpISTONS1から切り出し、末端をクレノウポリメラーゼで埋めて平滑末端とし、この断片を、BamHI制限エンドヌクレアーゼで直線化し、クレノウポリメラーゼで末端を埋めておいたプラスミドp830.60にライゲーションした。この2つの遺伝子の配置はヘッドトゥーテールとなっている。
Zwf酵素とMdh酵素を過剰発現させることによる、ソルビトールからのコハク酸の産生
アクチノバチルス・サクシノゲネスの株(FZ53;FZ53/pLS88;FZ53/p830.60;FZ53/pPISTONS1およびFZ53/p856.78)を2Lの培地の入った発酵ベッセル(Bioflo III、New Brunswick)中で培養した。培地には、120g/Lのソルビトール、30g/L(固形)のトウモロコシの浸出液(CSL)(ADM由来の固形物、10〜12%)、1.6g/LのMg(OH)2、0.2mg/Lのビオチン、0.5g/Lのベタイン−塩酸、0.2mg/LのMSG、6.5mMのリン酸ナトリウム、7g/LのNa2CO3、0.5g/Lの酵母抽出物(AG900)を含めた。
一定の間隔で試料を発酵槽から採取し、10、000×gで4分間遠心して固形物を除去した。上清を0.2μMのフィルターで濾過してから解析にかけた。培養上清および濾液の糖および有機酸の濃度をHPLC(Agilent 1200シリーズ)で測定した。Aminex HPX−87H(300mm×7.8mm)カラム(Bio−Rad)を使用し、移動相としては0.013NのH2SO4を1.4ml/分の速度で流した。分析物のピークを検出し、屈折率検出器(Waters 2414)を使用して定量し、Sigmaから購入した有機酸標準物質の溶液を参照しながらピークの同定を行った。下記表1に、ソルビトール存在下で生育させた複数のアクチノバチルス・サクシノゲネス形質転換体の発酵に関する評価を示す。
Zwf酵素とMdh酵素を過剰発現させることによる、グルコースからのコハク酸の産生
実施例1で説明したアクチノバチルス・サクシノゲネスの株(FZ53;FZ53/pLS88;FZ53/p830.60;FZ53/pISTONS1およびFZ53/p856.78)を実施例2で説明したものと同じ培地(ただし培養のpHを維持するために容器に6gのMgCO3を予め加えておくという変更を加えた)を入れた50mLの嫌気的バイアル中で培養した。同様のシードバイアルから2.5mLを播種した(5%(v/v)の摂取材料)。150回/分でバイアルを撹拌しながら38℃でインキュベートした。
Claims (20)
- グルコース−6−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素を発現している組換え微生物。
- 前記組換え生物がコハク酸産生微生物である、請求項1の組換え微生物。
- アクチノバチルス・サクシノゲネスの16SリボソームRNAの配列と少なくとも90%の相同性を有する16SリボソームRNAの配列を含んでいる、請求項1の組換え微生物。
- アクチノバチルス・サクシノゲネス、ビスガードタクソン6またはビスガードタクソン10である、請求項1の組換え微生物。
- 異種または過剰発現したグルコース−6−リン酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび異種または過剰発現したリンゴ酸脱水素酵素をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記グルコース−6−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素がアクチノバチルス・サクシノゲネスの酵素である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記グルコース−6−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素がアクチノバチルス・サクシノゲネスの酵素である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記グルコース−6−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素が大腸菌の酵素である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記グルコース−6−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素が大腸菌の酵素である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記グルコース−6−リン酸脱水素酵素が配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも約40%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記リンゴ酸脱水素酵素が配列番号4に示すアミノ酸配列と少なくとも約60%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が、グルコース−6−リン酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素だけを発現している微生物よりも多量の有機酸を産生する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記微生物が約50g/L〜150g/Lの濃度でコハク酸を産生することが可能な、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 有機酸を産生するための過程であって、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換え微生物を発酵培地中で培養することを含む過程。
- 組換え微生物を炭素源と共に、有機酸を産生するのに好ましい条件で培養する工程を含む有機酸の産生方法であって、ここで前記組換え微生物がグルコース−6−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素のうちの少なくとも1つを発現している、産生方法。
- 前記組換え微生物がグルコース−6−リン酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素の両方を発現する、請求項15に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換え微生物を炭素源と共に、有機酸を産生するのに好ましい条件で培養することを含む、有機酸の産生方法。
- 前記有機酸がコハク酸またはプロピオン酸である、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有機酸がコハク酸である請求項18に記載の方法。
- 前記炭素源がグルコースまたはソルビトールである、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
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