JP2003093060A - 耐酸性微生物を用いた有機酸及びアルコールの製造方法 - Google Patents
耐酸性微生物を用いた有機酸及びアルコールの製造方法Info
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- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 原料に対する収率が高くかつCO2排出量が少
ない有機酸及びアルコールの製造方法を提供する。 【解決手段】 アルコール生成微生物に有機酸生成酵素
をコードする遺伝子を組み込んだことを特徴とする微生
物、並びに該微生物を用いて糖化原料を発酵させ、得ら
れる発酵液から有機酸及びアルコールを回収することを
特徴とするアルコール及び有機酸の製造方法。
ない有機酸及びアルコールの製造方法を提供する。 【解決手段】 アルコール生成微生物に有機酸生成酵素
をコードする遺伝子を組み込んだことを特徴とする微生
物、並びに該微生物を用いて糖化原料を発酵させ、得ら
れる発酵液から有機酸及びアルコールを回収することを
特徴とするアルコール及び有機酸の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、有機酸及びアルコ
ール生成微生物並びにそれを用いた有機酸及びアルコー
ルの製造方法に関する。
ール生成微生物並びにそれを用いた有機酸及びアルコー
ルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、酵母サッカロマイセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）のエタノール発酵を利
用したエタノール生産技術が確立されている。しかし、
糖化原料をエタノール発酵する場合、エタノールとほぼ
同量のCO2が排出されるため原料に対する生産物の収率
が約50%と低く、この方法は非効率である。またエタノ
ールとほぼ同量のCO2が排出されるため、環境に対して
負荷が大きい。エタノールはクリーンなエネルギーとし
て注目されているにもかかわらず、その生産時に大量の
CO2を排出するという問題が生じている。
エ（Saccharomyces cerevisiae）のエタノール発酵を利
用したエタノール生産技術が確立されている。しかし、
糖化原料をエタノール発酵する場合、エタノールとほぼ
同量のCO2が排出されるため原料に対する生産物の収率
が約50%と低く、この方法は非効率である。またエタノ
ールとほぼ同量のCO2が排出されるため、環境に対して
負荷が大きい。エタノールはクリーンなエネルギーとし
て注目されているにもかかわらず、その生産時に大量の
CO2を排出するという問題が生じている。
【０００３】一方、ビフィズス菌の乳酸発酵を利用して
乳酸を製造する方法も確立されている。しかし、ビフィ
ズス菌は乳酸発酵の際に酢酸も生成するため、培養液中
の酸性度が高くなる。ビフィズス菌は嫌酸性であり、酸
性環境下において生育できないため、pHが低くなるとそ
れ以上乳酸を生成することができない。このため、ビフ
ィズス菌の培養管理において中和剤の使用が必須であ
る。この場合、中和剤の使用は、廃棄物が大量に出ると
いう点で問題がある。従って、糖化原料に対する生産物
の収率が高くかつCO2排出量の少ないエタノールの製造
方法と、中和剤を使用しない乳酸の製造方法が望まれて
いた。
乳酸を製造する方法も確立されている。しかし、ビフィ
ズス菌は乳酸発酵の際に酢酸も生成するため、培養液中
の酸性度が高くなる。ビフィズス菌は嫌酸性であり、酸
性環境下において生育できないため、pHが低くなるとそ
れ以上乳酸を生成することができない。このため、ビフ
ィズス菌の培養管理において中和剤の使用が必須であ
る。この場合、中和剤の使用は、廃棄物が大量に出ると
いう点で問題がある。従って、糖化原料に対する生産物
の収率が高くかつCO2排出量の少ないエタノールの製造
方法と、中和剤を使用しない乳酸の製造方法が望まれて
いた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、原料に対す
る収率が高くかつCO2排出量が少ない有機酸及びアルコ
ールの製造方法を提供することを目的とする。
る収率が高くかつCO2排出量が少ない有機酸及びアルコ
ールの製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討した結果、酵母サッカロマイセ
ス・セレビシエにおいてPDC1（ピルビン酸デカルボキシ
ラーゼ１）プロモーターの制御下に乳酸脱水素酵素（ラ
クテートデヒドロゲナーゼ）遺伝子を含有する形質転換
株を作製し、この形質転換株を用いて糖化原料を発酵さ
せることにより、中和剤を使用することなく乳酸を製造
し、かつCO2排出量を低減させたエタノール製造を行い
うることを見出し、本発明を完成するに至った。
を解決するため鋭意検討した結果、酵母サッカロマイセ
ス・セレビシエにおいてPDC1（ピルビン酸デカルボキシ
ラーゼ１）プロモーターの制御下に乳酸脱水素酵素（ラ
クテートデヒドロゲナーゼ）遺伝子を含有する形質転換
株を作製し、この形質転換株を用いて糖化原料を発酵さ
せることにより、中和剤を使用することなく乳酸を製造
し、かつCO2排出量を低減させたエタノール製造を行い
うることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、アルコール生成微生
物に有機酸生成酵素をコードする遺伝子を組み込んだこ
とを特徴とする微生物である。アルコール生成微生物と
しては、耐酸性のもの（例えば酵母）が挙げられる。こ
こで、酵母としてサッカロマイセス属に属するものを例
示することができる。本発明の微生物は、上記有機酸生
成酵素をコードする酵素とともに、さらにPDC1プロモー
ターが組み込まれたものであることが好ましい。有機酸
としては、L-乳酸が挙げられる。
物に有機酸生成酵素をコードする遺伝子を組み込んだこ
とを特徴とする微生物である。アルコール生成微生物と
しては、耐酸性のもの（例えば酵母）が挙げられる。こ
こで、酵母としてサッカロマイセス属に属するものを例
示することができる。本発明の微生物は、上記有機酸生
成酵素をコードする酵素とともに、さらにPDC1プロモー
ターが組み込まれたものであることが好ましい。有機酸
としては、L-乳酸が挙げられる。
【０００７】さらに、本発明は、有機酸生成酵素をコー
ドする遺伝子を含む組換えベクターを用いてアルコール
生成微生物を形質転換することを特徴とする、アルコー
ル及び有機酸を生成する微生物の作出方法である。さら
に、本発明は、前記微生物を用いて糖化原料を発酵さ
せ、得られる発酵液から有機酸及びアルコールを回収す
ることを特徴とするアルコール及び有機酸の製造方法で
ある。この場合、発酵は中和剤で処理することなく行う
ことができる。また、有機酸としてはL-乳酸が挙げられ
る。
ドする遺伝子を含む組換えベクターを用いてアルコール
生成微生物を形質転換することを特徴とする、アルコー
ル及び有機酸を生成する微生物の作出方法である。さら
に、本発明は、前記微生物を用いて糖化原料を発酵さ
せ、得られる発酵液から有機酸及びアルコールを回収す
ることを特徴とするアルコール及び有機酸の製造方法で
ある。この場合、発酵は中和剤で処理することなく行う
ことができる。また、有機酸としてはL-乳酸が挙げられ
る。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明は、アルコール生成微生物に有機酸
生成酵素をコードする遺伝子（有機酸生成酵素遺伝子と
いう）を組み込むことにより、同一宿主細胞からアルコ
ールと有機酸とを同時に生産することができるように改
変した微生物である。また、本発明の有機酸及びアルコ
ールの製造方法は、有機酸生成酵素遺伝子を含む組換え
ベクターを含有するアルコール生成微生物を用いて糖化
原料を発酵させ、得られる発酵液から有機酸及びアルコ
ールを採取することを特徴とする。
生成酵素をコードする遺伝子（有機酸生成酵素遺伝子と
いう）を組み込むことにより、同一宿主細胞からアルコ
ールと有機酸とを同時に生産することができるように改
変した微生物である。また、本発明の有機酸及びアルコ
ールの製造方法は、有機酸生成酵素遺伝子を含む組換え
ベクターを含有するアルコール生成微生物を用いて糖化
原料を発酵させ、得られる発酵液から有機酸及びアルコ
ールを採取することを特徴とする。
【００１０】本発明に係る方法の概要は以下の通りであ
る。 １．有機酸生成酵素遺伝子の単離 まず、有機酸生成酵素遺伝子を宿主であるアルコール生
成微生物に組み込むに際し、有機酸生成酵素遺伝子を含
む組換えベクターを構築する。「有機酸」には、当業者
に理解されうるあらゆる有機酸が含まれるが、例えば、
乳酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸などが挙
げられる。「有機酸生成酵素」とは、上記有機酸が生成
する過程において作用する酵素を意味し、例えば、ピル
ビン酸から乳酸を生成する乳酸脱水素酵素、コハク酸か
らフマル酸を生成するコハク酸脱水素酵素などの脱水素
酵素や、オキザロ酢酸からクエン酸を生成するクエン酸
シンターゼなどが挙げられる。
る。 １．有機酸生成酵素遺伝子の単離 まず、有機酸生成酵素遺伝子を宿主であるアルコール生
成微生物に組み込むに際し、有機酸生成酵素遺伝子を含
む組換えベクターを構築する。「有機酸」には、当業者
に理解されうるあらゆる有機酸が含まれるが、例えば、
乳酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸などが挙
げられる。「有機酸生成酵素」とは、上記有機酸が生成
する過程において作用する酵素を意味し、例えば、ピル
ビン酸から乳酸を生成する乳酸脱水素酵素、コハク酸か
らフマル酸を生成するコハク酸脱水素酵素などの脱水素
酵素や、オキザロ酢酸からクエン酸を生成するクエン酸
シンターゼなどが挙げられる。
【００１１】本発明において使用する有機酸生成酵素遺
伝子は、上述のような有機酸生成酵素をコードする遺伝
子であればどのようなものでもよく、また、宿主生物に
導入する目的遺伝子は、宿主と同種の生物由来の遺伝子
でもよく異種生物由来の遺伝子でもよい。
伝子は、上述のような有機酸生成酵素をコードする遺伝
子であればどのようなものでもよく、また、宿主生物に
導入する目的遺伝子は、宿主と同種の生物由来の遺伝子
でもよく異種生物由来の遺伝子でもよい。
【００１２】例えば、ピルビン酸から乳酸を生成する乳
酸脱水素酵素をコードする遺伝子（LDH遺伝子）などが
挙げられる。LDH遺伝子は、ストレプトコッカス属に属
する微生物、リゾプス属に属する微生物、ビフィドバク
テリウム属に属する微生物などから単離することが可能
である。
酸脱水素酵素をコードする遺伝子（LDH遺伝子）などが
挙げられる。LDH遺伝子は、ストレプトコッカス属に属
する微生物、リゾプス属に属する微生物、ビフィドバク
テリウム属に属する微生物などから単離することが可能
である。
【００１３】但し、目的遺伝子である有機酸生成酵素遺
伝子はLDH遺伝子に限定されるものではなく、その他酢
酸生成遺伝子、クエン酸生成遺伝子が挙げられる。目的
遺伝子の調製は、当技術分野で周知の任意の手法を採用
することができる。例えば、目的遺伝子を供与源から単
離する場合には、グアニジンイソチオシアネート法によ
り調製されたRNAからcDNAを合成する方法により調製す
る。
伝子はLDH遺伝子に限定されるものではなく、その他酢
酸生成遺伝子、クエン酸生成遺伝子が挙げられる。目的
遺伝子の調製は、当技術分野で周知の任意の手法を採用
することができる。例えば、目的遺伝子を供与源から単
離する場合には、グアニジンイソチオシアネート法によ
り調製されたRNAからcDNAを合成する方法により調製す
る。
【００１４】また、上記有機酸生成酵素遺伝子は、該遺
伝子の配列が公知である場合、その配列に基づいてプラ
イマーを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用
して、別途調製することができる。あるいは、市販の生
物細胞又は組織由来のcDNAライブラリー又はゲノムライ
ブラリーから上記遺伝子を増幅し、精製することによっ
て得ることもできる。上記遺伝子の配列が既知ではない
場合には、先ず対応するタンパク質を精製してその部分
配列を決定し、その配列に基づいて放射性標識プローブ
を作製し、これを用いてcDNAライブラリー又ははゲノム
ライブラリーから上記遺伝子を含むクローンをスクリー
ニングし、必要に応じて再クローン化することによって
上記遺伝子を得ることができる。遺伝子クローニング及
びスクリーニングの手法については、例えば、Sambroo
k, J.,Fritsch, E., F.及びManiatis, T. 1989. Molecu
lar Cloning. A Laboratory Manual. 2nd. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
に記載される方法を使用することができる。
伝子の配列が公知である場合、その配列に基づいてプラ
イマーを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用
して、別途調製することができる。あるいは、市販の生
物細胞又は組織由来のcDNAライブラリー又はゲノムライ
ブラリーから上記遺伝子を増幅し、精製することによっ
て得ることもできる。上記遺伝子の配列が既知ではない
場合には、先ず対応するタンパク質を精製してその部分
配列を決定し、その配列に基づいて放射性標識プローブ
を作製し、これを用いてcDNAライブラリー又ははゲノム
ライブラリーから上記遺伝子を含むクローンをスクリー
ニングし、必要に応じて再クローン化することによって
上記遺伝子を得ることができる。遺伝子クローニング及
びスクリーニングの手法については、例えば、Sambroo
k, J.,Fritsch, E., F.及びManiatis, T. 1989. Molecu
lar Cloning. A Laboratory Manual. 2nd. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
に記載される方法を使用することができる。
【００１５】２．有機酸生成酵素遺伝子を含む組換えベ
クターの構築 上記単離された有機酸生成酵素遺伝子をアルコール生成
微生物に導入するために、有機酸生成酵素遺伝子を含む
組換えベクターを構築する。組換えベクターは、適当な
ベクターに有機酸生成酵素遺伝子を連結(挿入)すること
により得ることができる。有機酸生成酵素遺伝子を挿入
するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれ
ば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ
DNA等が挙げられる。
クターの構築 上記単離された有機酸生成酵素遺伝子をアルコール生成
微生物に導入するために、有機酸生成酵素遺伝子を含む
組換えベクターを構築する。組換えベクターは、適当な
ベクターに有機酸生成酵素遺伝子を連結(挿入)すること
により得ることができる。有機酸生成酵素遺伝子を挿入
するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれ
ば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ
DNA等が挙げられる。
【００１６】プラスミド DNAとしては、例えばpRS403、
pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYI
p型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラス
ミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC11
9、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396
又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpAC
YC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW21
8又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、枯草菌由
来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げら
れ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charo
n21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX17
4、M13mp18又はM13mp19などが挙げられる。レトロトラ
ンスポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用
ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。ベクターに
有機酸生成酵素遺伝子を挿入するには、まず、精製され
たDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNA
の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入し
てベクターに連結する方法などが採用される。
pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYI
p型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラス
ミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC11
9、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396
又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpAC
YC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW21
8又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、枯草菌由
来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げら
れ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charo
n21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX17
4、M13mp18又はM13mp19などが挙げられる。レトロトラ
ンスポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用
ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。ベクターに
有機酸生成酵素遺伝子を挿入するには、まず、精製され
たDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNA
の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入し
てベクターに連結する方法などが採用される。
【００１７】有機酸生成酵素遺伝子は、その遺伝子の機
能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必
要である。そこで、組換えベクターには、プロモーター
に有機酸生成酵素遺伝子を連結して発現カセットを作製
し、これに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメ
ント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、
選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連
結することができる。なお、選択マーカーとしては、例
えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、トリプトファン合成
遺伝子（Trp1遺伝子）、栄養要求性能を持つUra3遺伝
子、Ade2遺伝子、His3遺伝子、又は薬剤耐性能を持つG4
18耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン
耐性遺伝子などが利用可能である。
能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必
要である。そこで、組換えベクターには、プロモーター
に有機酸生成酵素遺伝子を連結して発現カセットを作製
し、これに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメ
ント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、
選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連
結することができる。なお、選択マーカーとしては、例
えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、トリプトファン合成
遺伝子（Trp1遺伝子）、栄養要求性能を持つUra3遺伝
子、Ade2遺伝子、His3遺伝子、又は薬剤耐性能を持つG4
18耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン
耐性遺伝子などが利用可能である。
【００１８】本発明においては、発現カセットのターミ
ネーター配列としてグリセルアルデヒド３リン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子（GAPDH）のターミネーター遺伝子を
使用しているが、本発明はこれに限定されるものではな
く、使用可能なターミネーター配列であればいかなるも
のを使用してもよい。
ネーター配列としてグリセルアルデヒド３リン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子（GAPDH）のターミネーター遺伝子を
使用しているが、本発明はこれに限定されるものではな
く、使用可能なターミネーター配列であればいかなるも
のを使用してもよい。
【００１９】３．組換えベクターによるアルコール生成
微生物の形質転換 次に、上記組換えベクターを用いてアルコール生成微生
物宿主（この宿主は対酸性微生物である）を形質転換
し、有機酸生成遺伝子を含む組換えベクターを含有する
微生物を得る。
微生物の形質転換 次に、上記組換えベクターを用いてアルコール生成微生
物宿主（この宿主は対酸性微生物である）を形質転換
し、有機酸生成遺伝子を含む組換えベクターを含有する
微生物を得る。
【００２０】本発明に使用する微生物は、耐酸性を有
し、かつアルコール発酵を行うことができる限り特に限
定されるものではなく、天然から採取されたものも含ま
れる。「耐酸性微生物」とは、酸性条件、好ましくはpH
が6以下、さらに好ましくはpH２〜５でアルコール発酵
を行うことができる微生物を意味する。本発明では、例
えば乳酸脱水素遺伝子を組み込んだ組換えベクターを上
記耐酸性微生物に導入して形質転換体を得、乳酸脱水素
遺伝子が機能するように操作することにより、アルコー
ルを生成するとともに、乳酸も生成することができるよ
うになる。「乳酸脱水素遺伝子が機能する」とは、該遺
伝子が組み込まれたベクターを導入した宿主（微生物）
を培養して乳酸を生成させたときに、乳酸の蓄積により
培地のpHが酸性になっても（特に、pH6以下に下がって
も）当該発現が維持されて乳酸を生成し得るように発現
することを意味する。
し、かつアルコール発酵を行うことができる限り特に限
定されるものではなく、天然から採取されたものも含ま
れる。「耐酸性微生物」とは、酸性条件、好ましくはpH
が6以下、さらに好ましくはpH２〜５でアルコール発酵
を行うことができる微生物を意味する。本発明では、例
えば乳酸脱水素遺伝子を組み込んだ組換えベクターを上
記耐酸性微生物に導入して形質転換体を得、乳酸脱水素
遺伝子が機能するように操作することにより、アルコー
ルを生成するとともに、乳酸も生成することができるよ
うになる。「乳酸脱水素遺伝子が機能する」とは、該遺
伝子が組み込まれたベクターを導入した宿主（微生物）
を培養して乳酸を生成させたときに、乳酸の蓄積により
培地のpHが酸性になっても（特に、pH6以下に下がって
も）当該発現が維持されて乳酸を生成し得るように発現
することを意味する。
【００２１】本発明において宿主として使用される耐酸
性のアルコール生成微生物は、例えば、サッカロマイセ
ス属等の酵母、あるいはリゾプス属に属するカビなどが
挙げられるが(例えば下記微生物参照)、これらの微生物
に限定されるものではない。
性のアルコール生成微生物は、例えば、サッカロマイセ
ス属等の酵母、あるいはリゾプス属に属するカビなどが
挙げられるが(例えば下記微生物参照)、これらの微生物
に限定されるものではない。
【００２２】 酵母菌
サッカロマイセス属：サッカロマイセス・セレビシエ(S
accharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・クルー
ベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・パ
ラドキサス(Saccharomyces paradoxus)、サッカロマイ
セス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus) クルーベルマイセス属：クルーベルマイセス・ラクティ
ス(Kluyveromyces lactis)、クルーベルマイセス・マル
キシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、ピキア属：ピ
キア・パストリス(Pichia pastoris） カビ リゾプス属：リゾプス・デレマー(Rhyzopus delemer) アスペルギルス属：アスペルギルス・ニガー(Aspergill
us niger)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryz
ae) ムコール属：ムコール・ロウキシ（Mucor rouxii） ザイモモナス属：ザイモモナス・モビリス（Zymomonas
mobilis）
accharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・クルー
ベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・パ
ラドキサス(Saccharomyces paradoxus)、サッカロマイ
セス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus) クルーベルマイセス属：クルーベルマイセス・ラクティ
ス(Kluyveromyces lactis)、クルーベルマイセス・マル
キシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、ピキア属：ピ
キア・パストリス(Pichia pastoris） カビ リゾプス属：リゾプス・デレマー(Rhyzopus delemer) アスペルギルス属：アスペルギルス・ニガー(Aspergill
us niger)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryz
ae) ムコール属：ムコール・ロウキシ（Mucor rouxii） ザイモモナス属：ザイモモナス・モビリス（Zymomonas
mobilis）
【００２３】酵母を宿主とする場合は、前記プロモータ
ーとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定さ
れず、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ１プロモー
ター（PDC1プロモーター）、gal1プロモーター、gal10
プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモータ
ー、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモ
ーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロ
モーター等が挙げられる。サッカロマイセス属に属する
酵母を宿主として使用する場合には、PDC1プロモーター
を用いることが好ましく、また、このプロモーターは染
色体導入型ベクターと組み合わせて使用することが好ま
しい。PDC1プロモーターは強力なプロモーターであり、
このプロモーターの制御下において有機酸生成酵素遺伝
子は高発現される。また、PDC1プロモーターと共に有機
酸生成酵素遺伝子を宿主の染色体上に導入することによ
ってPDC1プロモーターが元来制御する遺伝子（PDC1）が
失われても、宿主は生育及び代謝を継続することができ
るため（これをオートレギュレーションという）、この
プロモーターの使用には利点がある。酵母への組換えベ
クターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法
であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーショ
ン法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol.,
194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et a
l. (1978) Proc.Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-193
3)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J.Bacteriol. 15
3, 163-168)等が挙げられる。
ーとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定さ
れず、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ１プロモー
ター（PDC1プロモーター）、gal1プロモーター、gal10
プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモータ
ー、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモ
ーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロ
モーター等が挙げられる。サッカロマイセス属に属する
酵母を宿主として使用する場合には、PDC1プロモーター
を用いることが好ましく、また、このプロモーターは染
色体導入型ベクターと組み合わせて使用することが好ま
しい。PDC1プロモーターは強力なプロモーターであり、
このプロモーターの制御下において有機酸生成酵素遺伝
子は高発現される。また、PDC1プロモーターと共に有機
酸生成酵素遺伝子を宿主の染色体上に導入することによ
ってPDC1プロモーターが元来制御する遺伝子（PDC1）が
失われても、宿主は生育及び代謝を継続することができ
るため（これをオートレギュレーションという）、この
プロモーターの使用には利点がある。酵母への組換えベ
クターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法
であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーショ
ン法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol.,
194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et a
l. (1978) Proc.Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-193
3)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J.Bacteriol. 15
3, 163-168)等が挙げられる。
【００２４】細菌を宿主とする場合は、組換えベクター
が該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモータ
ー、リボゾーム結合配列、有機酸生成酵素遺伝子、転写
終結配列により構成されていることが好ましい。また、
プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDN
Aを導入する方法であれば特に限定されるものではな
い。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N.
et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 211
0-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
が該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモータ
ー、リボゾーム結合配列、有機酸生成酵素遺伝子、転写
終結配列により構成されていることが好ましい。また、
プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDN
Aを導入する方法であれば特に限定されるものではな
い。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N.
et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 211
0-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２５】上述のようにして、アルコール生成微生物
に有機酸生成酵素遺伝子を含む組換えベクターを導入す
ることにより、形質転換された耐酸性微生物を得ること
ができる。なお、形質転換体は、導入した組換えベクタ
ー中に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択
される。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を選択マーカ
ーとして使用した場合には、アンピシリンを含有する培
地中で培養することにより形質転換体を選択する。
に有機酸生成酵素遺伝子を含む組換えベクターを導入す
ることにより、形質転換された耐酸性微生物を得ること
ができる。なお、形質転換体は、導入した組換えベクタ
ー中に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択
される。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を選択マーカ
ーとして使用した場合には、アンピシリンを含有する培
地中で培養することにより形質転換体を選択する。
【００２６】４．耐酸性アルコール生成微生物を用いた
発酵 酵母菌等の耐酸性のアルコール生成微生物を宿主として
得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が
資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質
転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれ
ば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素
源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、
デンプン等の炭水化物が用いられる。窒素源としては、
アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しく
は有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物の
ほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等
が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、
リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、通
常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30
℃で６〜24時間行う。
発酵 酵母菌等の耐酸性のアルコール生成微生物を宿主として
得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が
資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質
転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれ
ば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素
源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、
デンプン等の炭水化物が用いられる。窒素源としては、
アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しく
は有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物の
ほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等
が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、
リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、通
常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30
℃で６〜24時間行う。
【００２７】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、Laczプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地
に添加してもよい。
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、Laczプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地
に添加してもよい。
【００２８】上述のようにして培養した耐酸性微生物
は、集菌して、さらに糖化原料を添加した発酵条件下に
て培養する。集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定
常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対
数増殖期中期から後期の状態にある時に行うのが好まし
い。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等の
いかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食
塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる緩衝液
を使用してもよく、また、水を用いて菌体を洗浄するこ
ともできる。
は、集菌して、さらに糖化原料を添加した発酵条件下に
て培養する。集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定
常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対
数増殖期中期から後期の状態にある時に行うのが好まし
い。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等の
いかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食
塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる緩衝液
を使用してもよく、また、水を用いて菌体を洗浄するこ
ともできる。
【００２９】集菌した微生物を発酵条件下にて培養する
ための培地としては、通常は糖類、ペプトン、酵母エキ
スを含む。好ましくは、0.1〜10％グルコース、0.1〜10
％ペプトン及び0.1〜10％酵母エキスを含み、さらに好
ましくは約2％のグルコース、約2％のペプトン及び約1
％の酵母エキスを含む培地が使用される。
ための培地としては、通常は糖類、ペプトン、酵母エキ
スを含む。好ましくは、0.1〜10％グルコース、0.1〜10
％ペプトン及び0.1〜10％酵母エキスを含み、さらに好
ましくは約2％のグルコース、約2％のペプトン及び約1
％の酵母エキスを含む培地が使用される。
【００３０】また、培地として予め濾過除菌したものを
用いることができ、特に酵母用培地としてYPD液体培地
が挙げられる。培地には、発酵される糖化原料の他、コ
ーンスティープリカー、サツマイモ糖化液等を含有させ
てもよい。ここで、「発酵」とは、本発明の耐酸性アル
コール生成微生物が糖化原料を分解し、新たな生成物を
生成する現象を指し、例えば、アルコール発酵、乳酸発
酵、プロピオン酸発酵などが挙げられる。
用いることができ、特に酵母用培地としてYPD液体培地
が挙げられる。培地には、発酵される糖化原料の他、コ
ーンスティープリカー、サツマイモ糖化液等を含有させ
てもよい。ここで、「発酵」とは、本発明の耐酸性アル
コール生成微生物が糖化原料を分解し、新たな生成物を
生成する現象を指し、例えば、アルコール発酵、乳酸発
酵、プロピオン酸発酵などが挙げられる。
【００３１】糖化原料としては、さつまいも、ジャガイ
モ、トウモロコシ等が挙げられる。これらの原料を洗浄
及び破砕した後、液化・糖化槽に入れ、90〜120℃、好
ましくは120℃の蒸気で5〜30分、好ましくは15分処理す
る。原料に対し0.5〜2.5倍の水を加えた後、α-アミラ
ーゼ、グルコアミラーゼなどの市販の酵素（例えば「タ
ーマミル」（ノボザイム・ジャパン社）及び「スミチー
ム」（新日本化学社））を原料重量に対して0.5〜１％
添加する。温度50〜95℃、好ましくは60℃で15〜20時間
保持すれば原料の液化、糖化が完了する。上記のように
して得られた液を遠心分離にかけ、固形分（リグニン
等）を分離し、原液とする。
モ、トウモロコシ等が挙げられる。これらの原料を洗浄
及び破砕した後、液化・糖化槽に入れ、90〜120℃、好
ましくは120℃の蒸気で5〜30分、好ましくは15分処理す
る。原料に対し0.5〜2.5倍の水を加えた後、α-アミラ
ーゼ、グルコアミラーゼなどの市販の酵素（例えば「タ
ーマミル」（ノボザイム・ジャパン社）及び「スミチー
ム」（新日本化学社））を原料重量に対して0.5〜１％
添加する。温度50〜95℃、好ましくは60℃で15〜20時間
保持すれば原料の液化、糖化が完了する。上記のように
して得られた液を遠心分離にかけ、固形分（リグニン
等）を分離し、原液とする。
【００３２】発酵条件は以下の通りである。
温度：25〜33℃、好ましくは30℃
菌体密度：10〜30％、好ましくは25％（湿重量ベース）
基質濃度：5〜20％、好ましくは10％（バッチ発酵の初
期濃度） 発酵時間：10〜30時間、好ましくは20〜24時間
期濃度） 発酵時間：10〜30時間、好ましくは20〜24時間
【００３３】発酵培養後、有機酸及びアルコールはその
発酵液から回収することにより得ることができる。「発
酵液」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌
体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する
ものである。有機酸及びアルコールが菌体内又は細胞内
に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することに
より抽出する。また、有機酸及びアルコールが菌体外又
は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用
するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。そ
の後、有機酸及びアルコールの単離精製に用いられる一
般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用い
ることにより、前記培養物中から有機酸及びアルコール
を単離精製することができる。
発酵液から回収することにより得ることができる。「発
酵液」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌
体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する
ものである。有機酸及びアルコールが菌体内又は細胞内
に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することに
より抽出する。また、有機酸及びアルコールが菌体外又
は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用
するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。そ
の後、有機酸及びアルコールの単離精製に用いられる一
般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用い
ることにより、前記培養物中から有機酸及びアルコール
を単離精製することができる。
【００３４】乳酸を単離精製する場合は、発酵液を遠心
分離装置又はフィルターにかけて菌体と液分とを分離
し、乳酸の液分の採取（精製・濃縮）を行う。液分の精
製・濃縮は、一般に海水や食品の脱塩に広く採用されて
いるイオン交換膜を利用した電気透析装置（例えばアシ
ライザー（旭化成社））により行うことができる。な
お、電気透析時の各種液の温度は、通常、20〜45℃、好
ましくは35〜40℃の範囲である。電気透析を行うと、イ
オン性物質と非イオン性物質を分離すると同時に乳酸を
濃縮することが可能である。
分離装置又はフィルターにかけて菌体と液分とを分離
し、乳酸の液分の採取（精製・濃縮）を行う。液分の精
製・濃縮は、一般に海水や食品の脱塩に広く採用されて
いるイオン交換膜を利用した電気透析装置（例えばアシ
ライザー（旭化成社））により行うことができる。な
お、電気透析時の各種液の温度は、通常、20〜45℃、好
ましくは35〜40℃の範囲である。電気透析を行うと、イ
オン性物質と非イオン性物質を分離すると同時に乳酸を
濃縮することが可能である。
【００３５】一方、アルコールを分離精製する場合は、
発酵液を遠心分離装置又はフィルターにかけて菌体と液
分とを分離し、エタノールの液分の採取を行う。液分の
精製・濃縮は蒸留法により行うことができる。電気透析
で除去できなかったアミノ酸、無機イオン（K,Ca,Mg
等）等は、クロマト分離装置、イオン交換装置により除
去することができる。クロマト分離装置としては、例え
ば固定層式、移動層式、類似的移動層式等が挙げられ
る。
発酵液を遠心分離装置又はフィルターにかけて菌体と液
分とを分離し、エタノールの液分の採取を行う。液分の
精製・濃縮は蒸留法により行うことができる。電気透析
で除去できなかったアミノ酸、無機イオン（K,Ca,Mg
等）等は、クロマト分離装置、イオン交換装置により除
去することができる。クロマト分離装置としては、例え
ば固定層式、移動層式、類似的移動層式等が挙げられ
る。
【００３６】ところで、本発明に従って、エタノールを
生産する酵母にL-乳酸脱水素酵素遺伝子の導入を行い、
エタノール発酵を行うと同時に乳酸発酵を行う酵母を作
出すると、当該酵母において以下の２つの反応が行われ
る。 （1）C6H12O6 → 2C2H5OH+2 CO2 エタノール発酵 （2）C6H12O6 → 2CH3CH(OH)COOH 乳酸発酵 乳酸発酵の反応(2)ではCO2は排出されないため、エタノ
ール発酵と同時に乳酸発酵(1)を行うことで、エタノー
ル発酵の際に排出されるCO2量を低減できる。さらにま
た、この酵母を用いることにより糖化原料に対する生産
物の収率を向上することができる。
生産する酵母にL-乳酸脱水素酵素遺伝子の導入を行い、
エタノール発酵を行うと同時に乳酸発酵を行う酵母を作
出すると、当該酵母において以下の２つの反応が行われ
る。 （1）C6H12O6 → 2C2H5OH+2 CO2 エタノール発酵 （2）C6H12O6 → 2CH3CH(OH)COOH 乳酸発酵 乳酸発酵の反応(2)ではCO2は排出されないため、エタノ
ール発酵と同時に乳酸発酵(1)を行うことで、エタノー
ル発酵の際に排出されるCO2量を低減できる。さらにま
た、この酵母を用いることにより糖化原料に対する生産
物の収率を向上することができる。
【００３７】また本発明に従って作出した上記酵母を用
いた乳酸発酵は、上記酵母が耐酸性であるため、培地が
酸性になっても生育し、発酵を維持することができる。
従って、上記発酵の際に炭酸カルシウム、水酸化ナトリ
ウム、アンモニアなどの中和剤を添加する必要はなく、
中和反応に伴う副産物（廃棄物）が排出されないため、
コスト低減を図ることができる。
いた乳酸発酵は、上記酵母が耐酸性であるため、培地が
酸性になっても生育し、発酵を維持することができる。
従って、上記発酵の際に炭酸カルシウム、水酸化ナトリ
ウム、アンモニアなどの中和剤を添加する必要はなく、
中和反応に伴う副産物（廃棄物）が排出されないため、
コスト低減を図ることができる。
【００３８】
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００３９】〔実施例１〕ベクターの構築
本実施例のために新たに構築した染色体導入型ベクター
をpBTrp-PDC1-LDHと名付け、以下に本ベクター構築例の
詳細を記す。なお本実施例の概要を図１に示す。ベクタ
ー構築の手順はこれに限定されるものではない。
をpBTrp-PDC1-LDHと名付け、以下に本ベクター構築例の
詳細を記す。なお本実施例の概要を図１に示す。ベクタ
ー構築の手順はこれに限定されるものではない。
【００４０】本実施例において、サッカロマイセス・セ
レビシエ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ１遺伝子
（PDC1遺伝子）プロモーター配列の制御下で、異種遺伝
子としてビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobact
erium longum）由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子（LDH遺伝子）を使用した。
レビシエ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ１遺伝子
（PDC1遺伝子）プロモーター配列の制御下で、異種遺伝
子としてビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobact
erium longum）由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子（LDH遺伝子）を使用した。
【００４１】ベクターの構築にあたって、必要な遺伝子
断片であるPDC1遺伝子のプロモーター断片（PDC1P）971
bpと、PDC1遺伝子下流領域断片（PDC1D）518bpは、サッ
カロマイセス・セレビシエ YPH株（Stratagene社）のゲ
ノムDNAを鋳型として使用したPCR増幅法によって単離を
行った。
断片であるPDC1遺伝子のプロモーター断片（PDC1P）971
bpと、PDC1遺伝子下流領域断片（PDC1D）518bpは、サッ
カロマイセス・セレビシエ YPH株（Stratagene社）のゲ
ノムDNAを鋳型として使用したPCR増幅法によって単離を
行った。
【００４２】サッカロマイセス・セレビシエ YPH株のゲ
ノムDNAは、ゲノム調製キット、Fast DNA Kit（Bio 101
社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従い、調製し
た。DNA濃度は分光光度計Ultro spec 3000（Amersham P
harmacia Biotech社）にて測定した。
ノムDNAは、ゲノム調製キット、Fast DNA Kit（Bio 101
社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従い、調製し
た。DNA濃度は分光光度計Ultro spec 3000（Amersham P
harmacia Biotech社）にて測定した。
【００４３】PCR反応には、増幅酵素として、増幅断片
の正確性が高いとされるPyrobest DNA polymerase（宝
酒造社）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマ
イセス・セレビシエ YPH株のゲノムDNA 50ng/サンプ
ル、プライマーDNA 50pmol/サンプル、及びPyrobest DN
A polymerase 0.2ユニット/サンプルを合計で50μlの反
応系に調製した。反応溶液を、PCR増幅装置Gene Amp PC
R system 9700（PE Applied Biosystems社）によってDN
A増幅を行った。PCR増幅装置の反応条件は、96℃ 2分の
後、（96℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 90秒）を25サイク
ル行い、その後4℃とした。PDC1P増幅断片とPDC1D増幅
断片を1%TBEアガロースゲル電気泳動にて遺伝子増幅断
片の確認を行った。なお反応に使用したプライマーDNA
は、合成DNA（サワデーテクノロジー社）を用い、この
プライマーのDNA配列は以下の通りである。 PDC1P断片の増幅 ・PDC1P-LDH-U（31mer,Tm値58.3℃）末端に制限酵素Bam
HIサイトを付加：ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CT
A TCT C（配列番号１） ・PDC1P-LDH-D（31mer、Tm値54.4℃）末端に制限酵素Ec
oRIサイトを付加：ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT G
AC TGT G（配列番号２） PDC1D断片の増幅 ・PDC1D-LDH-U（31mer、Tm値55.3℃）末端に制限酵素Xh
oIサイトを付加：ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CT
T GGT CGA C（配列番号３） ・PDC1D-LDH-D（31mer、Tm値54.4℃）末端に制限酵素Ap
aIサイトを付加：ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GA
C TGT G（配列番号４）
の正確性が高いとされるPyrobest DNA polymerase（宝
酒造社）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマ
イセス・セレビシエ YPH株のゲノムDNA 50ng/サンプ
ル、プライマーDNA 50pmol/サンプル、及びPyrobest DN
A polymerase 0.2ユニット/サンプルを合計で50μlの反
応系に調製した。反応溶液を、PCR増幅装置Gene Amp PC
R system 9700（PE Applied Biosystems社）によってDN
A増幅を行った。PCR増幅装置の反応条件は、96℃ 2分の
後、（96℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 90秒）を25サイク
ル行い、その後4℃とした。PDC1P増幅断片とPDC1D増幅
断片を1%TBEアガロースゲル電気泳動にて遺伝子増幅断
片の確認を行った。なお反応に使用したプライマーDNA
は、合成DNA（サワデーテクノロジー社）を用い、この
プライマーのDNA配列は以下の通りである。 PDC1P断片の増幅 ・PDC1P-LDH-U（31mer,Tm値58.3℃）末端に制限酵素Bam
HIサイトを付加：ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CT
A TCT C（配列番号１） ・PDC1P-LDH-D（31mer、Tm値54.4℃）末端に制限酵素Ec
oRIサイトを付加：ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT G
AC TGT G（配列番号２） PDC1D断片の増幅 ・PDC1D-LDH-U（31mer、Tm値55.3℃）末端に制限酵素Xh
oIサイトを付加：ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CT
T GGT CGA C（配列番号３） ・PDC1D-LDH-D（31mer、Tm値54.4℃）末端に制限酵素Ap
aIサイトを付加：ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GA
C TGT G（配列番号４）
【００４４】上記反応にて取得したPDC1P及びPDC1D各遺
伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処理によって
精製した後、PDC1P増幅断片を制限酵素BamHI/EcoRI、及
びPDC1D増幅断片を制限酵素XhoI/ApaIにて制限酵素反応
処理を行った。なお以下に用いた酵素類はすべて宝酒造
社製のものを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限
酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルはMolecular Cl
oning A Laboratory Manual second edition（Maniatis
et al.,Cold Spring Harbor Laboratory press.1989）
に従った。
伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処理によって
精製した後、PDC1P増幅断片を制限酵素BamHI/EcoRI、及
びPDC1D増幅断片を制限酵素XhoI/ApaIにて制限酵素反応
処理を行った。なお以下に用いた酵素類はすべて宝酒造
社製のものを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限
酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルはMolecular Cl
oning A Laboratory Manual second edition（Maniatis
et al.,Cold Spring Harbor Laboratory press.1989）
に従った。
【００４５】ベクターの構築における一連の反応操作
は、一般的なDNAサブクローニング法に準じて行った。
すなわち、制限酵素BamHI/EcoRI（宝酒造社）及び脱リ
ン酸化酵素Alkaline Phosphatase（BAP、宝酒造社）を
施したpBluescriptII SK+ベクター（東洋紡社）に、上
記PCR法にて増幅し、制限酵素処理を施したPDC1P断片を
T4DNA Ligase反応によって連結させた（図１A）。T4 DN
A Ligase反応には、LigaFast Rapid DNA Ligation Syst
em（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに
従った。
は、一般的なDNAサブクローニング法に準じて行った。
すなわち、制限酵素BamHI/EcoRI（宝酒造社）及び脱リ
ン酸化酵素Alkaline Phosphatase（BAP、宝酒造社）を
施したpBluescriptII SK+ベクター（東洋紡社）に、上
記PCR法にて増幅し、制限酵素処理を施したPDC1P断片を
T4DNA Ligase反応によって連結させた（図１A）。T4 DN
A Ligase反応には、LigaFast Rapid DNA Ligation Syst
em（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに
従った。
【００４６】次にLigation反応を行った溶液を、コンピ
テント細胞へ形質転換を行った。コンピテント細胞は大
腸菌JM109株（東洋紡社）を用い、詳細は付属のプロト
コールに従って行った。得られた培養液は抗生物質アン
ピシリン100μg/mlを含有したLBプレートにまいて一晩
培養した。生育したコロニーを、インサート断片のプラ
イマーDNAを用いたコロニーPCR法による確認、及びミニ
プレップによるプラスミドDNA調製溶液を、制限酵素処
理による確認を行い、目的とするベクターpBPDC1Pベク
ターを単離した（図１B）。
テント細胞へ形質転換を行った。コンピテント細胞は大
腸菌JM109株（東洋紡社）を用い、詳細は付属のプロト
コールに従って行った。得られた培養液は抗生物質アン
ピシリン100μg/mlを含有したLBプレートにまいて一晩
培養した。生育したコロニーを、インサート断片のプラ
イマーDNAを用いたコロニーPCR法による確認、及びミニ
プレップによるプラスミドDNA調製溶液を、制限酵素処
理による確認を行い、目的とするベクターpBPDC1Pベク
ターを単離した（図１B）。
【００４７】ついでトヨタ自動車（株）によって構築さ
れたpYLD1ベクターを制限酵素EcoRI/AatII処理及び末端
修飾酵素T4 DNA polymerase処理することで得られるLDH
遺伝子断片を、同じく制限酵素EcoRI処理、末端修飾酵
素T4 DNA polymerase処理を行ったpBPDC1Pベクター中
に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、pBPD
C1P-LDH Iベクターを作製した（図１C）。なお、上記の
pYLD1ベクターは大腸菌に導入され（名称：「E. coli p
YLD1」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄
託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、受
託番号FERM BP-7423としてブダペスト条約に基づき国際
寄託されている（原寄託日：平成11（1999）年10月26
日）。続いてこのベクターをXhoI/ApaI処理し、増幅し
たPDC1D断片を連結させてpBPDC1P-LDH IIベクターを作
製した（図２A）。最後にpBPDC1P-LDH IIベクターをEco
RV処理したものに、pRS404ベクター(Stratagene社)をAa
tII/SspI処理、T4 DNA polymerase処理して得られたTrp
1マーカー断片を連結させて、最終コンストラクトであ
る染色体導入型pBTrp-PDC1-LDHベクターを構築した（図
２B）。
れたpYLD1ベクターを制限酵素EcoRI/AatII処理及び末端
修飾酵素T4 DNA polymerase処理することで得られるLDH
遺伝子断片を、同じく制限酵素EcoRI処理、末端修飾酵
素T4 DNA polymerase処理を行ったpBPDC1Pベクター中
に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、pBPD
C1P-LDH Iベクターを作製した（図１C）。なお、上記の
pYLD1ベクターは大腸菌に導入され（名称：「E. coli p
YLD1」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄
託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、受
託番号FERM BP-7423としてブダペスト条約に基づき国際
寄託されている（原寄託日：平成11（1999）年10月26
日）。続いてこのベクターをXhoI/ApaI処理し、増幅し
たPDC1D断片を連結させてpBPDC1P-LDH IIベクターを作
製した（図２A）。最後にpBPDC1P-LDH IIベクターをEco
RV処理したものに、pRS404ベクター(Stratagene社)をAa
tII/SspI処理、T4 DNA polymerase処理して得られたTrp
1マーカー断片を連結させて、最終コンストラクトであ
る染色体導入型pBTrp-PDC1-LDHベクターを構築した（図
２B）。
【００４８】構築した染色体導入型pBTrp-PDC1-LDHベク
ターの確認の為に塩基配列決定を行った。塩基配列解析
装置としてはABI PRISM 310 Genetic Analyzer（PE App
liedBiosystems社）を使用し、試料の調製法、及び機器
の使用方法などの詳細は本装置付属のマニュアルに従っ
た。試料となるベクターDNAはアルカリ抽出法により調
製したものを用い、これをGFX DNA Purification kit
（Amersham PharmaciaBiotech社）にてカラム精製した
後、分光光度計Ultro spec 3000（Amersham Pharmacia
Biotech社）にてDNA濃度を測定したものを用いた。
ターの確認の為に塩基配列決定を行った。塩基配列解析
装置としてはABI PRISM 310 Genetic Analyzer（PE App
liedBiosystems社）を使用し、試料の調製法、及び機器
の使用方法などの詳細は本装置付属のマニュアルに従っ
た。試料となるベクターDNAはアルカリ抽出法により調
製したものを用い、これをGFX DNA Purification kit
（Amersham PharmaciaBiotech社）にてカラム精製した
後、分光光度計Ultro spec 3000（Amersham Pharmacia
Biotech社）にてDNA濃度を測定したものを用いた。
【００４９】〔実施例２〕組換えベクターの宿主への導
入 宿主である酵母IFO2260株（社団法人・発酵研究所に登
録されている菌株）のトリプトファン要求株は、10mlYP
D培地にて30℃で対数増殖期まで培養を行い、集菌及びT
Eバッファーによる洗浄を行った後、0.5mlTEバッファー
と0.5ml、0.2M酢酸リチウムを加え、30℃にて１時間振
盪培養を行った。その後、制限酵素Apa1及びSpe1で処理
したpBTRPPDC1LDHを加えた。
入 宿主である酵母IFO2260株（社団法人・発酵研究所に登
録されている菌株）のトリプトファン要求株は、10mlYP
D培地にて30℃で対数増殖期まで培養を行い、集菌及びT
Eバッファーによる洗浄を行った後、0.5mlTEバッファー
と0.5ml、0.2M酢酸リチウムを加え、30℃にて１時間振
盪培養を行った。その後、制限酵素Apa1及びSpe1で処理
したpBTRPPDC1LDHを加えた。
【００５０】このプラスミドの菌懸濁液を30℃で30分間
振盪培養後、70%ポリエチレングリコール4000を150ml加
え、よく撹絆した。30℃にて１時間振盪培養した後、42
℃にて5分間ヒートショックを与えた。菌体を洗浄した
後、200mlの水に懸だくしたものを選択培地に塗株し
た。
振盪培養後、70%ポリエチレングリコール4000を150ml加
え、よく撹絆した。30℃にて１時間振盪培養した後、42
℃にて5分間ヒートショックを与えた。菌体を洗浄した
後、200mlの水に懸だくしたものを選択培地に塗株し
た。
【００５１】得られたコロニーを選択培地で単離を行
い、コロニーを得た後、PCRにてPDC1プロモーターの下
流にLDHが導入されている株を取得した。更に、胞子形
成培地で胞子形成を行い、2倍体である染色体両方に上
記ベクターが導入されている株を取得した。酵母サッカ
ロマイセス・セレビシエが図２に示したpBTRPPDC1LDHで
形質転換され、ゲノム上に導入されたことをPCRで確認
した。上記ベクターのゲノム上の構造を図３に示す。
い、コロニーを得た後、PCRにてPDC1プロモーターの下
流にLDHが導入されている株を取得した。更に、胞子形
成培地で胞子形成を行い、2倍体である染色体両方に上
記ベクターが導入されている株を取得した。酵母サッカ
ロマイセス・セレビシエが図２に示したpBTRPPDC1LDHで
形質転換され、ゲノム上に導入されたことをPCRで確認
した。上記ベクターのゲノム上の構造を図３に示す。
【００５２】〔実施例３〕発酵試験
YPD液体培地(グルコース15%)を用いて、上記形質転換株
と非形質転換株に対して発酵テストを行った。乳酸及び
エタノールは、それぞれ、王子計測機器株式会社製バイ
オセンサBF-4により測定した。収率は、生産物量を発酵
前の糖含量で割ることにより計算した。更にCO2発生率
について見積りを行った。CO2発生率は、100から、生産
物の収率を引くことにより計算した。この結果を表１に
示す。
と非形質転換株に対して発酵テストを行った。乳酸及び
エタノールは、それぞれ、王子計測機器株式会社製バイ
オセンサBF-4により測定した。収率は、生産物量を発酵
前の糖含量で割ることにより計算した。更にCO2発生率
について見積りを行った。CO2発生率は、100から、生産
物の収率を引くことにより計算した。この結果を表１に
示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】表１に示す結果によれば、乳酸脱水素酵素
遺伝子（LDH）を含有する形質転換株は、エタノール製
造に伴うCO2排出量を20%低減できるとともに、エタノー
ルと乳酸をあわせた生産物の量についても約15%増加し
ている。従って、本発明の方法は、エタノール及び乳酸
の製造に有効な手段であるといえる。
遺伝子（LDH）を含有する形質転換株は、エタノール製
造に伴うCO2排出量を20%低減できるとともに、エタノー
ルと乳酸をあわせた生産物の量についても約15%増加し
ている。従って、本発明の方法は、エタノール及び乳酸
の製造に有効な手段であるといえる。
【００５５】
【発明の効果】本発明により、耐酸性微生物を用いた有
機酸及びアルコールの製造方法が提供される。本発明の
方法は、原料に対する収率が高くかつCO2排出量が少な
いため有用である。また本発明の方法は中和剤の使用を
必要としないため有用である。
機酸及びアルコールの製造方法が提供される。本発明の
方法は、原料に対する収率が高くかつCO2排出量が少な
いため有用である。また本発明の方法は中和剤の使用を
必要としないため有用である。
【００５６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha,
Toyota Central R&D Labs.
<120> A method of producing organic acids and alcohols using aciduric mi
croorganisms
<130> P01-0463
<140>
<141>
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 1
atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c 31
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 2
atatatgaat tctttgattg atttgactgt g 31
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 3
atatatctcg aggccagcta acttcttggt cgac 34
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA
<400> 4
atatatgaat tctttgattg atttgactgt g 31
【００５７】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
【図１】染色体導入型ベクターpBTrp-PDC1-LDHの構築図
である。
である。
【図２】染色体導入型ベクターpBTrp-PDC1-LDHの構築図
である。
である。
【図３】ベクターpBTrp-PDC1-LDHを用いて酵母サッカロ
マイセス・セレビシエの形質転換を行った場合に得られ
る株のゲノム構造を示す図である。
マイセス・セレビシエの形質転換を行った場合に得られ
る株のゲノム構造を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｐ 7/06
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｐ 7/56
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(72)発明者 早乙女 理
愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自動
車株式会社内
(72)発明者 保谷 典子
愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自動
車株式会社内
(72)発明者 松尾 康生
愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自動
車株式会社内
(72)発明者 石田 亘広
愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番
地の１ 株式会社豊田中央研究所内
(72)発明者 平井 正名
愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番
地の１ 株式会社豊田中央研究所内
(72)発明者 北本 勝ひこ
茨城県牛久市上柏田３−44−18
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 BA80 CA03 DA12
EA04 FA02
4B064 AC03 AD02 CA06 CA19 CC24
DA10
4B065 AA21Y AA80X AA80Y AB01
AC14 BA02 CA06 CA10
Claims (10)
- 【請求項１】 アルコール生成微生物に有機酸生成酵素
をコードする遺伝子を組み込んだことを特徴とする微生
物。 - 【請求項２】 さらにPDC1プロモーターが組み込まれた
請求項１記載の微生物。 - 【請求項３】 アルコール生成微生物が耐酸性のもので
ある請求項１又は２記載の微生物。 - 【請求項４】 アルコール生成微生物が酵母である請求
項１〜３のいずれかに記載の微生物。 - 【請求項５】 酵母がサッカロマイセス属に属するもの
である請求項４記載の微生物。 - 【請求項６】 有機酸がL-乳酸である請求項１〜５のい
ずれかに記載の微生物。 - 【請求項７】 有機酸生成酵素をコードする遺伝子を含
む組換えベクターを用いてアルコール生成微生物を形質
転換することを特徴とする、アルコール及び有機酸を生
成する微生物の作出方法。 - 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載の微生物
を用いて糖化原料を発酵させ、得られる発酵液から有機
酸及びアルコールを採取することを特徴とするアルコー
ル及び有機酸の製造方法。 - 【請求項９】 発酵が、中和剤で処理することなく行わ
れるものである請求項８記載の製造方法。 - 【請求項１０】 有機酸がL-乳酸である請求項８又は９
記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001286640A JP2003093060A (ja) | 2001-09-20 | 2001-09-20 | 耐酸性微生物を用いた有機酸及びアルコールの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001286640A JP2003093060A (ja) | 2001-09-20 | 2001-09-20 | 耐酸性微生物を用いた有機酸及びアルコールの製造方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011280788A Division JP2012061006A (ja) | 2011-12-22 | 2011-12-22 | 耐酸性微生物を用いた有機酸及びアルコールの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003093060A true JP2003093060A (ja) | 2003-04-02 |
Family
ID=19109583
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001286640A Pending JP2003093060A (ja) | 2001-09-20 | 2001-09-20 | 耐酸性微生物を用いた有機酸及びアルコールの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003093060A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009517045A (ja) * | 2005-11-23 | 2009-04-30 | ネイチャーワークス・エル・エル・シー | Ｌ−又はｄ−ラクタート：フェリチトクロームｃ酸化還元酵素遺伝子が機能しない乳酸産生酵母 |
| WO2009072593A1 (ja) | 2007-12-07 | 2009-06-11 | Toray Industries, Inc. | 乳酸脱水素酵素発現カセット、形質転換酵母および乳酸の製造方法 |
| EP2147976A2 (en) | 2005-10-14 | 2010-01-27 | Toray Industries, Inc. | Yeast and method of producing L-lactic acid |
| WO2011043401A1 (ja) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | 三井化学株式会社 | イソプロピルアルコール生産酵母及びイソプロピルアルコール生産方法 |
| US20140329275A1 (en) * | 2011-10-10 | 2014-11-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Biocatalysis cells and methods |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999014335A1 (en) * | 1997-09-12 | 1999-03-25 | A.E. Staley Manufacturing Company | Yeast strains for the production of lactic acid |
| WO2000071738A1 (en) * | 1999-05-21 | 2000-11-30 | Cargill Dow Llc | Methods and materials for the synthesis of organic products |
| JP2001204468A (ja) * | 2000-01-27 | 2001-07-31 | Toyota Motor Corp | 耐酸性乳酸生成微生物 |
-
2001
- 2001-09-20 JP JP2001286640A patent/JP2003093060A/ja active Pending
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| US8071357B2 (en) | 2005-10-14 | 2011-12-06 | Toray Industries, Inc. | Yeast and method of producing L-lactic acid |
| JP2009517045A (ja) * | 2005-11-23 | 2009-04-30 | ネイチャーワークス・エル・エル・シー | Ｌ−又はｄ−ラクタート：フェリチトクロームｃ酸化還元酵素遺伝子が機能しない乳酸産生酵母 |
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| US8859260B2 (en) | 2007-12-07 | 2014-10-14 | Toray Industries, Inc. | Expression cassette for lactase dehydrogenase, transformed yeast and method of producing lactic acid |
| WO2011043401A1 (ja) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | 三井化学株式会社 | イソプロピルアルコール生産酵母及びイソプロピルアルコール生産方法 |
| US20140329275A1 (en) * | 2011-10-10 | 2014-11-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Biocatalysis cells and methods |
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| A521 | Written amendment |
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