JP2003334092A - エタノール生産制御方法 - Google Patents
エタノール生産制御方法Info
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- JP2003334092A JP2003334092A JP2003065349A JP2003065349A JP2003334092A JP 2003334092 A JP2003334092 A JP 2003334092A JP 2003065349 A JP2003065349 A JP 2003065349A JP 2003065349 A JP2003065349 A JP 2003065349A JP 2003334092 A JP2003334092 A JP 2003334092A
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- pyruvate decarboxylase
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子を有する宿主生物
中でエタノール生産を制御する技術を提供する。 【解決手段】 宿主生物に内在するピルビン酸脱炭酸酵
素の対ピルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれを超
える対ピルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱水素
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入
されている形質転換体とする。
中でエタノール生産を制御する技術を提供する。 【解決手段】 宿主生物に内在するピルビン酸脱炭酸酵
素の対ピルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれを超
える対ピルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱水素
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入
されている形質転換体とする。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、乳酸の高生産技
術に関し、詳しくは、酵母における乳酸生産に適した高
発現系に関する。
術に関し、詳しくは、酵母における乳酸生産に適した高
発現系に関する。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術の進歩により、微生
物、カビ、動植物および昆虫などの宿主で外来遺伝子を
発現させ、その形質転換体を増殖させることによって、
目的遺伝子産物を取得する技術が発展してきた。例え
ば、酵母などの培養によれば、発酵生産により大量の目
的遺伝子産物を生産させることも可能である。
物、カビ、動植物および昆虫などの宿主で外来遺伝子を
発現させ、その形質転換体を増殖させることによって、
目的遺伝子産物を取得する技術が発展してきた。例え
ば、酵母などの培養によれば、発酵生産により大量の目
的遺伝子産物を生産させることも可能である。
【０００３】これまで、酵母によってＬ−乳酸を生産さ
せようとする試みはいくつか存在している。ウシ由来の
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を酵母サッカロマイセ
ス・セレビシエに導入し、Ｌ−乳酸を生産させる試みが
ある(Eri Adahi et al., "Modification of metabolic
pasthway of Saccaromyces cerevisiae by the express
ion of lactate dehydrogenase and deletion of pyruv
ate genes fo the lactic acid fermentation at low p
H value", J. Ferment. Bioeng. Vol.86, No.3, 284-28
9, 1988、Danio Porro et al., "Development of metab
olically engineered Saccaromyces cerevisiae cells
for the production of lactic asid",Biotechnol.Pro
g. Vol.11, 294-298, 1995, 特表２００１−５１６５８
４号公報)。しかしながら、いずれの報告においても、
Ｌ−乳酸の高生産は認められていない。
せようとする試みはいくつか存在している。ウシ由来の
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を酵母サッカロマイセ
ス・セレビシエに導入し、Ｌ−乳酸を生産させる試みが
ある(Eri Adahi et al., "Modification of metabolic
pasthway of Saccaromyces cerevisiae by the express
ion of lactate dehydrogenase and deletion of pyruv
ate genes fo the lactic acid fermentation at low p
H value", J. Ferment. Bioeng. Vol.86, No.3, 284-28
9, 1988、Danio Porro et al., "Development of metab
olically engineered Saccaromyces cerevisiae cells
for the production of lactic asid",Biotechnol.Pro
g. Vol.11, 294-298, 1995, 特表２００１−５１６５８
４号公報)。しかしながら、いずれの報告においても、
Ｌ−乳酸の高生産は認められていない。
【０００４】サッカロマイセス・セレビシエにおけるピ
ルビン酸脱炭酸酵素は複数のアイソザイムを持つことが
知られており、通常の酵母においては、ピルビン酸脱炭
酸酵素１が機能しており、本遺伝子などの破壊が原因で
このタンパク質が発現しない状態となると、ピルビン酸
脱炭酸酵素５が機能し、エタノール生産が維持される機
構を備えている（"Autoregulation of yeast pyruvate
decarboxylase gene expression requires the enzyme
but not its catalytic activity", Ines Eberhardt, H
akan Cederberg, Haijuan Li, Stephan Koning, Frank
Jordan and Stephan Hohmann, Eur. J. Biochem. Vol.2
62, 191-201, 1999）。
ルビン酸脱炭酸酵素は複数のアイソザイムを持つことが
知られており、通常の酵母においては、ピルビン酸脱炭
酸酵素１が機能しており、本遺伝子などの破壊が原因で
このタンパク質が発現しない状態となると、ピルビン酸
脱炭酸酵素５が機能し、エタノール生産が維持される機
構を備えている（"Autoregulation of yeast pyruvate
decarboxylase gene expression requires the enzyme
but not its catalytic activity", Ines Eberhardt, H
akan Cederberg, Haijuan Li, Stephan Koning, Frank
Jordan and Stephan Hohmann, Eur. J. Biochem. Vol.2
62, 191-201, 1999）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このように、サッカロ
マイセス・セレビシエ中でＬ−乳酸を高生産させる技術
は完成していなかった。本発明の目的は、酵母サッカロ
マイセス・セレビシエなどのピルビン酸脱炭酸酵素遺伝
子を有する宿主生物中でエタノール生産を制御し乳酸を
安定的に大量生産させるための技術を提供することであ
る。
マイセス・セレビシエ中でＬ−乳酸を高生産させる技術
は完成していなかった。本発明の目的は、酵母サッカロ
マイセス・セレビシエなどのピルビン酸脱炭酸酵素遺伝
子を有する宿主生物中でエタノール生産を制御し乳酸を
安定的に大量生産させるための技術を提供することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、サッカロ
マイセス・セレビシエ中での乳酸生産させる場合に発現
させる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）について着目して検討
したところ、以下の発明を完成した。以上のことから、
以下の発明を開示することができる。本発明の一つの側
面は、宿主生物に内在するピルビン酸脱炭酸酵素の対ピ
ルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれを超える対ピ
ルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱水素酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入されてい
る形質転換体として開示される。本形質転換体におい
て、前記外来タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主染
色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターあ
るいは当該プロモーターと置換された当該プロモーター
のホモログによって制御可能に導入されている形質転換
体も提供される。本発明の形質転換体における前記外来
タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素酵素あるいはその
ホモログであることが好ましい。このタンパク質は、特
に、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
かあるいはそのホモログとすることが有用である。ま
た、当該タンパク質は、配列番号３に示すＤＮＡ配列に
よってコードされていることが好ましい。このＤＮＡ配
列は、配列番号４に示すＤＮＡ配列として形質転換体に
保有されていることが好ましい。前記宿主染色体上のプ
ロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモー
ターであることが好ましい形態である。また、このプロ
モーターとしては、配列番号２に示すＤＮＡ配列あるい
はそのホモログを利用することが好ましい。本形質転換
体において、前記宿主生物は、サッカロマイセス属であ
ることが好ましく、より好ましくは、サッカロマイセス
・セレビシエである。本発明の他の側面は、本形質転換
体を培養する工程と、前記工程で得られる培養物から乳
酸を分離する工程、とを備える、乳酸の製造方法として
開示される。この方法によれば、安定的に効率よく乳酸
を製造することができる。すなわち、本発明によれば、
以下の手段が提供される。
マイセス・セレビシエ中での乳酸生産させる場合に発現
させる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）について着目して検討
したところ、以下の発明を完成した。以上のことから、
以下の発明を開示することができる。本発明の一つの側
面は、宿主生物に内在するピルビン酸脱炭酸酵素の対ピ
ルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれを超える対ピ
ルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱水素酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入されてい
る形質転換体として開示される。本形質転換体におい
て、前記外来タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主染
色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターあ
るいは当該プロモーターと置換された当該プロモーター
のホモログによって制御可能に導入されている形質転換
体も提供される。本発明の形質転換体における前記外来
タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素酵素あるいはその
ホモログであることが好ましい。このタンパク質は、特
に、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
かあるいはそのホモログとすることが有用である。ま
た、当該タンパク質は、配列番号３に示すＤＮＡ配列に
よってコードされていることが好ましい。このＤＮＡ配
列は、配列番号４に示すＤＮＡ配列として形質転換体に
保有されていることが好ましい。前記宿主染色体上のプ
ロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモー
ターであることが好ましい形態である。また、このプロ
モーターとしては、配列番号２に示すＤＮＡ配列あるい
はそのホモログを利用することが好ましい。本形質転換
体において、前記宿主生物は、サッカロマイセス属であ
ることが好ましく、より好ましくは、サッカロマイセス
・セレビシエである。本発明の他の側面は、本形質転換
体を培養する工程と、前記工程で得られる培養物から乳
酸を分離する工程、とを備える、乳酸の製造方法として
開示される。この方法によれば、安定的に効率よく乳酸
を製造することができる。すなわち、本発明によれば、
以下の手段が提供される。
【０００７】（１）宿主生物に内在するピルビン酸脱炭
酸酵素の対ピルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれ
を超える対ピルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱
水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが
導入されている形質転換体。 （２）前記外来タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主
染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーター
あるいは当該プロモーターと置換された当該プロモータ
ーのホモログによって制御可能に導入されている、
（１）記載の形質転換体。 （３）前記宿主生物は、サッカロマイセス属である、
（１）または（２）に記載の形質転換体。 （４）前記宿主生物は、サッカロマイセス・セレビシエ
である、（１）または（２）に記載の形質転換体。 （５）前記外来タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素酵
素あるいはそのホモログである、（１）〜（４）のいず
れかに記載の形質転換体。 （６）宿主生物に内在するピルビン酸脱炭酸酵素の対ピ
ルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれを超える対ピ
ルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱水素酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入されてお
り、前記外来タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主染
色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターあ
るいは当該プロモーターと置換された当該プロモーター
のホモログによって制御可能に導入されている形質転換
体。 （７）前記宿主染色体上のプロモーターは、ピルビン酸
脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターである、（６）記載の
形質転換体。 （８）前記宿主生物は、サッカロマイセス属である、
（６）または（７）に記載の形質転換体。 （９）前記宿主生物は、サッカロマイセス・セレビシエ
である、（６）または（７）に記載の形質転換体。 （１０）前記外来タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素
酵素あるいはそのホモログである、（６）〜（９）のい
ずれかに記載の形質転換体。 （１１）ウシ由来の乳酸脱水素酵素あるいはそのホモロ
グをコードするＤＮＡが、サッカロマイセス属の宿主染
色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモーター
あるいは当該プロモーターと置換された当該プロモータ
ーのホモログによって制御可能に導入されている形質転
換体。 （１２）前記宿主は、サッカロマイセス・セレビシエで
ある、（１０）記載の形質転換体。 （１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の形質転換
体を培養する工程と、前記工程で得られる培養物から乳
酸を分離する工程、とを備える、乳酸の製造方法。
酸酵素の対ピルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれ
を超える対ピルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱
水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが
導入されている形質転換体。 （２）前記外来タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主
染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーター
あるいは当該プロモーターと置換された当該プロモータ
ーのホモログによって制御可能に導入されている、
（１）記載の形質転換体。 （３）前記宿主生物は、サッカロマイセス属である、
（１）または（２）に記載の形質転換体。 （４）前記宿主生物は、サッカロマイセス・セレビシエ
である、（１）または（２）に記載の形質転換体。 （５）前記外来タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素酵
素あるいはそのホモログである、（１）〜（４）のいず
れかに記載の形質転換体。 （６）宿主生物に内在するピルビン酸脱炭酸酵素の対ピ
ルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれを超える対ピ
ルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱水素酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入されてお
り、前記外来タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主染
色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターあ
るいは当該プロモーターと置換された当該プロモーター
のホモログによって制御可能に導入されている形質転換
体。 （７）前記宿主染色体上のプロモーターは、ピルビン酸
脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターである、（６）記載の
形質転換体。 （８）前記宿主生物は、サッカロマイセス属である、
（６）または（７）に記載の形質転換体。 （９）前記宿主生物は、サッカロマイセス・セレビシエ
である、（６）または（７）に記載の形質転換体。 （１０）前記外来タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱水素
酵素あるいはそのホモログである、（６）〜（９）のい
ずれかに記載の形質転換体。 （１１）ウシ由来の乳酸脱水素酵素あるいはそのホモロ
グをコードするＤＮＡが、サッカロマイセス属の宿主染
色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモーター
あるいは当該プロモーターと置換された当該プロモータ
ーのホモログによって制御可能に導入されている形質転
換体。 （１２）前記宿主は、サッカロマイセス・セレビシエで
ある、（１０）記載の形質転換体。 （１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の形質転換
体を培養する工程と、前記工程で得られる培養物から乳
酸を分離する工程、とを備える、乳酸の製造方法。
【０００８】本発明の形質転換体は、宿主生物に内在す
るピルビン酸脱炭酸酵素の対ピルビン酸基質親和性と同
等かあるいはそれを超える対ピルビン酸基質親和性を備
える外来の乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡが導入され、当該外来タンパク質が発現
されるようになっている。ピルビン酸は、エタノール生
産に繋がるピルビン酸脱炭酸酵素と乳酸生産を触媒する
乳酸脱水素酵素などの共通の基質である。本形質転換体
においては、乳酸脱水素酵素の方がピルビン酸脱炭酸酵
素よりもピルビン酸に対する基質親和性が高いので、ピ
ルビン酸脱炭酸酵素によって触媒されるエタノール生産
が抑制され、外来の乳酸脱水素酵素による乳酸生産が促
進される。これにより、形質転換体による乳酸生産を増
大させることができる。
るピルビン酸脱炭酸酵素の対ピルビン酸基質親和性と同
等かあるいはそれを超える対ピルビン酸基質親和性を備
える外来の乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡが導入され、当該外来タンパク質が発現
されるようになっている。ピルビン酸は、エタノール生
産に繋がるピルビン酸脱炭酸酵素と乳酸生産を触媒する
乳酸脱水素酵素などの共通の基質である。本形質転換体
においては、乳酸脱水素酵素の方がピルビン酸脱炭酸酵
素よりもピルビン酸に対する基質親和性が高いので、ピ
ルビン酸脱炭酸酵素によって触媒されるエタノール生産
が抑制され、外来の乳酸脱水素酵素による乳酸生産が促
進される。これにより、形質転換体による乳酸生産を増
大させることができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。 （形質転換体）形質転換体において発現される外来タン
パク質は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を有し、か
つ、形質転換しようとする宿主生物に内在するピルビン
酸脱炭酸酵素との関係において、その酵素の対ピルビン
酸基質親和性と同等かあるいはそれを超える対ピルビン
酸基質親和性を備えている。ここで、ＬＤＨは、酵母な
どの生物の解糖系において、ピルビン酸から乳酸を生産
する反応を媒介する酵素として知られている。ここで、
乳酸は、Ｌ（＋）−乳酸とＤ（−）−乳酸とを含むが、
好ましくは、Ｌ（＋）−乳酸である。Ｌ（＋）−乳酸
は、Ｌ（＋）−ＬＤＨによって産生され、Ｄ（−）−乳
酸は、Ｄ（−）−ＬＤＨによって生産される。
て詳細に説明する。 （形質転換体）形質転換体において発現される外来タン
パク質は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を有し、か
つ、形質転換しようとする宿主生物に内在するピルビン
酸脱炭酸酵素との関係において、その酵素の対ピルビン
酸基質親和性と同等かあるいはそれを超える対ピルビン
酸基質親和性を備えている。ここで、ＬＤＨは、酵母な
どの生物の解糖系において、ピルビン酸から乳酸を生産
する反応を媒介する酵素として知られている。ここで、
乳酸は、Ｌ（＋）−乳酸とＤ（−）−乳酸とを含むが、
好ましくは、Ｌ（＋）−乳酸である。Ｌ（＋）−乳酸
は、Ｌ（＋）−ＬＤＨによって産生され、Ｄ（−）−乳
酸は、Ｄ（−）−ＬＤＨによって生産される。
【００１０】本発明で用いる外来タンパク質としてＬＤ
Ｈを用いることができる。生物の種類に応じてあるいは
生体内においても各種同族体が存在する。本発明におけ
るＬＤＨ活性を備えるタンパク質としては、天然由来の
ＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的
に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、
好ましくは、酵母などの真核微生物由来であり、より好
ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来で
あり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含
む高等真核生物由来である。最も好ましくは、ウシ由来
のＬＤＨである。例えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列
番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げる
ことができる。ウシ由来ＬＤＨとしては、筋肉由来、心
臓由来などのＬＤＨがあり、いずれも使用することがで
きる。なお、酵素番号としては、ＥＣ １．１．１．２
７を挙げることができる。
Ｈを用いることができる。生物の種類に応じてあるいは
生体内においても各種同族体が存在する。本発明におけ
るＬＤＨ活性を備えるタンパク質としては、天然由来の
ＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的
に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、
好ましくは、酵母などの真核微生物由来であり、より好
ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来で
あり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含
む高等真核生物由来である。最も好ましくは、ウシ由来
のＬＤＨである。例えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列
番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げる
ことができる。ウシ由来ＬＤＨとしては、筋肉由来、心
臓由来などのＬＤＨがあり、いずれも使用することがで
きる。なお、酵素番号としては、ＥＣ １．１．１．２
７を挙げることができる。
【００１１】さらに、本発明における外来タンパク質
は、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨ
ホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列におい
て、１もしくは数個のアミノ酸配列の置換、欠失、挿入
および／または付加されたアミノ酸配列でありかつＬＤ
Ｈ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬ
ＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好まし
くは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタン
パク質を含んでいる。なお、アミノ酸配列における変異
の数は、もとのタンパク質の機能が維持できる限り制限
されないが、全アミノ酸の７０％以内であることが好ま
しく、より好ましくは、３０％以内であり、さらに好ま
しくは２０％以内である。例えば、配列番号１に示すア
ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有
し、かつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、あるい
は、配列番号１に示すアミノ酸配列との相同性が少なく
とも７０％、好ましくは８０％を有し、かつＬＤＨ活性
を有するタンパク質は、好ましいホモログである。な
お、配列の相同性は、BLAST(http://blast.genome.ad.j
p/)、FASTA(http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.htm
l)などによる相同性検索を利用して決定することができ
る。
は、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨ
ホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列におい
て、１もしくは数個のアミノ酸配列の置換、欠失、挿入
および／または付加されたアミノ酸配列でありかつＬＤ
Ｈ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬ
ＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好まし
くは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタン
パク質を含んでいる。なお、アミノ酸配列における変異
の数は、もとのタンパク質の機能が維持できる限り制限
されないが、全アミノ酸の７０％以内であることが好ま
しく、より好ましくは、３０％以内であり、さらに好ま
しくは２０％以内である。例えば、配列番号１に示すア
ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有
し、かつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、あるい
は、配列番号１に示すアミノ酸配列との相同性が少なく
とも７０％、好ましくは８０％を有し、かつＬＤＨ活性
を有するタンパク質は、好ましいホモログである。な
お、配列の相同性は、BLAST(http://blast.genome.ad.j
p/)、FASTA(http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.htm
l)などによる相同性検索を利用して決定することができ
る。
【００１２】なお、アミノ酸配列における改変は、改変
しようとするアミノ酸配列に、部位特異的変位導入法
（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausu
bel etal., (1987) Publish . John Wily & Sons Secto
in 8.1-8.5）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、お
よび／または付加変異を導入することにより行うことが
できる。また、このような改変は、人工的に変異を導入
しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理
に基づいてあるいはこれに限られず自然界におけるアミ
ノ酸の変異によっても生じたものも包含される。
しようとするアミノ酸配列に、部位特異的変位導入法
（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausu
bel etal., (1987) Publish . John Wily & Sons Secto
in 8.1-8.5）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、お
よび／または付加変異を導入することにより行うことが
できる。また、このような改変は、人工的に変異を導入
しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理
に基づいてあるいはこれに限られず自然界におけるアミ
ノ酸の変異によっても生じたものも包含される。
【００１３】また、本発明で用いる外来タンパク質は、
ピルビン酸に対して高い基質親和性を有していることが
好ましい。ここで基質親和性とは、式（１）にに示すミ
カエリス−メンテン（Michaelis-Menten）の式における
Ｋｍ値である。
ピルビン酸に対して高い基質親和性を有していることが
好ましい。ここで基質親和性とは、式（１）にに示すミ
カエリス−メンテン（Michaelis-Menten）の式における
Ｋｍ値である。
【数１】ｖ０＝ｋ2Ｅ０[S]/([S]+Km) …………（１）
ただし、ｖ０は定常初速度、[S]は基質濃度、[ES]は酵
素と基質との複合体の濃度、E０は酵素の全濃度、ｋ2は
ES→E＋Sの場合の速度定数である。ミカエリス−メンテ
ンの式は、以下の式（２）に示す基質Ｓ、酵素Ｅ、基質
−酵素複合体ＥＳ、および生成物Ｐとの関係に基づいて
いる。ｋ１は、基質Ｓと酵素Ｅが複合体ＥＳを形成する
ときの平衡定数であり、ｋ２は、複合体ＥＳから生成物
Ｐと酵素Ｅとが生成する平衡定数であり、ｋ−１は、複
合体ＥＳが酵素Ｅと基質Ｓとに解離するときの平衡定数
である。
素と基質との複合体の濃度、E０は酵素の全濃度、ｋ2は
ES→E＋Sの場合の速度定数である。ミカエリス−メンテ
ンの式は、以下の式（２）に示す基質Ｓ、酵素Ｅ、基質
−酵素複合体ＥＳ、および生成物Ｐとの関係に基づいて
いる。ｋ１は、基質Ｓと酵素Ｅが複合体ＥＳを形成する
ときの平衡定数であり、ｋ２は、複合体ＥＳから生成物
Ｐと酵素Ｅとが生成する平衡定数であり、ｋ−１は、複
合体ＥＳが酵素Ｅと基質Ｓとに解離するときの平衡定数
である。
【数２】
【００１４】ここで、定数からＫｍは以下の式（３）で
定義することができる。
定義することができる。
【数３】
さらに、式（４）に示すように、各種濃度で書き換える
ことができる。
ことができる。
【数４】Ｋｍ＝（E０-[ES]）[S]/[ES] （４）
【００１５】基質親和性は、例えば、酵素濃度一定下
で、基質濃度[S]と初速度ｖ０との関係を求め、基質濃
度を横軸に初速度を縦軸にとったグラフなどから求める
ことができる。また、Lineweaver-Burkプロットによっ
ても求めることができる。
で、基質濃度[S]と初速度ｖ０との関係を求め、基質濃
度を横軸に初速度を縦軸にとったグラフなどから求める
ことができる。また、Lineweaver-Burkプロットによっ
ても求めることができる。
【００１６】本発明の外来タンパク質の対ピルビン酸基
質親和性は、宿主生物のピルビン酸脱炭酸酵素との関係
において、この酵素の対ピルビン酸基質親和性と同等か
あるいはそれを超えていることが好ましい。基質親和性
の比較は、好ましくは、温度およびｐＨなどの条件を共
通とする。温度やｐＨ条件は、宿主生物におけるこれら
の酵素の触媒する環境を考慮して決定することができ
る。例えば、温度３０〜３７℃、ｐＨを６．０〜７．５
の条件下で両酵素の基質親和性を測定することが好まし
い。
質親和性は、宿主生物のピルビン酸脱炭酸酵素との関係
において、この酵素の対ピルビン酸基質親和性と同等か
あるいはそれを超えていることが好ましい。基質親和性
の比較は、好ましくは、温度およびｐＨなどの条件を共
通とする。温度やｐＨ条件は、宿主生物におけるこれら
の酵素の触媒する環境を考慮して決定することができ
る。例えば、温度３０〜３７℃、ｐＨを６．０〜７．５
の条件下で両酵素の基質親和性を測定することが好まし
い。
【００１７】本外来タンパク質の対ピルビン酸基質親和
性は、好ましくは、約１．５ｍＭ以下である。１．５ｍ
Ｍを超えると、宿主生物のもつピルビン酸脱炭酸酵素と
ピルビン酸とが反応しやすくなるからである。より好ま
しくは約１ｍM以下である。さらに好ましくは、約０．
５ｍＭ以下であり、もっとも好ましくは、約０．１ｍＭ
以下である。また、本外来タンパク質の対ピルビン酸基
質親和性は、宿主生物のピルビン酸脱炭酸酵素の対ピル
ビン酸基質親和性と同等かそれよりも高いことが好まし
い。宿主生物の当該酵素のピルビン酸基質親和性よりも
低ければ、宿主生物のピルビン酸脱炭酸酵素とピルビン
酸とが反応しやすくなるからである。なお、本明細書に
おいて基質親和性が同等とは、対比する双方の基質親和
性、すなわち、Ｋｍ値が同等であることを意味し、基質
親和性が高いとは、対比しようとするタンパク質のＫｍ
値が対比すべき他方のタンパク質のＫｍ値よりも低いこ
とを意味する。
性は、好ましくは、約１．５ｍＭ以下である。１．５ｍ
Ｍを超えると、宿主生物のもつピルビン酸脱炭酸酵素と
ピルビン酸とが反応しやすくなるからである。より好ま
しくは約１ｍM以下である。さらに好ましくは、約０．
５ｍＭ以下であり、もっとも好ましくは、約０．１ｍＭ
以下である。また、本外来タンパク質の対ピルビン酸基
質親和性は、宿主生物のピルビン酸脱炭酸酵素の対ピル
ビン酸基質親和性と同等かそれよりも高いことが好まし
い。宿主生物の当該酵素のピルビン酸基質親和性よりも
低ければ、宿主生物のピルビン酸脱炭酸酵素とピルビン
酸とが反応しやすくなるからである。なお、本明細書に
おいて基質親和性が同等とは、対比する双方の基質親和
性、すなわち、Ｋｍ値が同等であることを意味し、基質
親和性が高いとは、対比しようとするタンパク質のＫｍ
値が対比すべき他方のタンパク質のＫｍ値よりも低いこ
とを意味する。
【００１８】本形質転換体においては、このような外来
タンパク質をコードするＤＮＡが導入されている。本Ｄ
ＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなど、そ
の由来を問うものではない。また、本ＤＮＡは、ＬＤＨ
をコードする天然由来の塩基配列を有していてもよい
し、かかる塩基配列の一部あるいは全体が改変された塩
基配列であって、ＬＤＨ活性を有するタンパク質をコー
ドするものであってもよい。また、ＬＤＨホモログをコ
ードする合成あるいは天然由来の塩基配列を有するＤＮ
Ａであってもよい。
タンパク質をコードするＤＮＡが導入されている。本Ｄ
ＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなど、そ
の由来を問うものではない。また、本ＤＮＡは、ＬＤＨ
をコードする天然由来の塩基配列を有していてもよい
し、かかる塩基配列の一部あるいは全体が改変された塩
基配列であって、ＬＤＨ活性を有するタンパク質をコー
ドするものであってもよい。また、ＬＤＨホモログをコ
ードする合成あるいは天然由来の塩基配列を有するＤＮ
Ａであってもよい。
【００１９】本発明で使用するＤＮＡは、形質転換しよ
うとする宿主生物において多用されるコドン用法を用い
た塩基配列を有することができる。例えば、本ＤＮＡ
は、サッカロマイセス属、とくに、サッカロマイセス・
セレビシエにおけるコドン用法を用いて遺伝暗号化され
た塩基配列を有することができる。
うとする宿主生物において多用されるコドン用法を用い
た塩基配列を有することができる。例えば、本ＤＮＡ
は、サッカロマイセス属、とくに、サッカロマイセス・
セレビシエにおけるコドン用法を用いて遺伝暗号化され
た塩基配列を有することができる。
【００２０】なお、ＤＮＡは、化学的に合成することも
できるし、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤
本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞
工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９
９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用することもでき
る。
できるし、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤
本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞
工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９
９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用することもでき
る。
【００２１】（ＤＮＡ構築物）本外来タンパク質のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを導入し、このＤＮＡがコ
ードするタンパク質を発現させることにより、宿主細胞
において乳酸を生産させることができる。形質転換にあ
たっては、本ＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを、宿主
細胞内で発現可能とするＤＮＡ構築物を用いる。形質転
換のためのＤＮＡ構築物の態様としては、特に限定しな
いでプラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮ
Ａ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体
（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）を、外来遺伝子
の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の
種類に応じて選択して採用することができる。また、線
状あるいは環状の形態を問うものではない。したがっ
て、本ＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡの他、これらのいずれ
かの態様のベクターの構成セグメントを備えることがで
きる。好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクタ
ー、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分
野において周知である。
ノ酸配列をコードするＤＮＡを導入し、このＤＮＡがコ
ードするタンパク質を発現させることにより、宿主細胞
において乳酸を生産させることができる。形質転換にあ
たっては、本ＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを、宿主
細胞内で発現可能とするＤＮＡ構築物を用いる。形質転
換のためのＤＮＡ構築物の態様としては、特に限定しな
いでプラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮ
Ａ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体
（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）を、外来遺伝子
の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の
種類に応じて選択して採用することができる。また、線
状あるいは環状の形態を問うものではない。したがっ
て、本ＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡの他、これらのいずれ
かの態様のベクターの構成セグメントを備えることがで
きる。好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクタ
ー、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分
野において周知である。
【００２２】なお、プラスミドＤＮＡとしては、例え
ば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣ
ｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹ
Ｃｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２ま
たはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベ
クター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、
ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５な
どのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由
来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ
１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐ
ＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９
８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ
系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４
などのｐ１Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１
９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１
系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、
ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などを挙げることができ
る。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏ
ｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ
４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、
Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などを挙げることが
できる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子など
を挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２
などを挙げることができる。
ば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣ
ｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹ
Ｃｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２ま
たはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベ
クター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、
ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５な
どのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由
来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ
１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐ
ＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９
８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ
系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４
などのｐ１Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１
９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１
系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、
ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などを挙げることができ
る。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏ
ｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ
４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、
Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などを挙げることが
できる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子など
を挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２
などを挙げることができる。
【００２３】本ＤＮＡ構築物を作製するには、本ＤＮＡ
を含むフラグメントなどを適当な制限酵素で切断し、使
用するベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチク
ローニングサイトに挿入などすることによる。本ＤＮＡ
構築物の第１の態様は、本ＤＮＡからなるＤＮＡセグメ
ントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントを
備えている。すなわち、プロモーターにより制御可能に
そのプロモーターの下流側に本ＤＮＡセグメントが連結
されている。
を含むフラグメントなどを適当な制限酵素で切断し、使
用するベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチク
ローニングサイトに挿入などすることによる。本ＤＮＡ
構築物の第１の態様は、本ＤＮＡからなるＤＮＡセグメ
ントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントを
備えている。すなわち、プロモーターにより制御可能に
そのプロモーターの下流側に本ＤＮＡセグメントが連結
されている。
【００２４】本ＤＮＡ産物、すなわち、ＬＤＨ活性を備
えるタンパク質の発現にあっては、酵母における発現が
好ましいことから、酵母中で発現するプロモーターを使
用することが好ましい。かかるプロモーターとしては、
例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター、ｇ
ａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒート
ショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモータ
ー、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモ
ーターなどを使用することが好ましい。特に、サッカロ
マイセス属由来のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモ
ーターが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ由来
のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターを利用す
ることがより好ましい。これらのプロモーターは、サッ
カロマイセス属（セレビシエ）のエタノール発酵経路に
おいて高発現されているからである。なお、かかるプロ
モーター配列は、サッカロマイセス属酵母のピルビン酸
脱炭酸酵素１遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ
増幅法によって単離することができる。サッカロマイセ
ス・セレビシエ由来の当該プロモーターの塩基配列を、
配列番号２に示す。なお、本ＤＮＡ構築物におけるプロ
モーターセグメントには、この配列番号２記載の塩基配
列からなるＤＮＡの他、この塩基配列において１若しく
は数個の塩基が欠失,置換若しくは付加された塩基配列
からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ、配列
番号２で示される塩基配列の全部若しくは一部の配列か
ら調製されたＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズし、かつプロモーター活性
を有するＤＮＡ（換言すれば、当該プロモーターのホモ
ログ）を用いることができる。
えるタンパク質の発現にあっては、酵母における発現が
好ましいことから、酵母中で発現するプロモーターを使
用することが好ましい。かかるプロモーターとしては、
例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター、ｇ
ａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒート
ショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモータ
ー、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモ
ーターなどを使用することが好ましい。特に、サッカロ
マイセス属由来のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモ
ーターが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ由来
のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターを利用す
ることがより好ましい。これらのプロモーターは、サッ
カロマイセス属（セレビシエ）のエタノール発酵経路に
おいて高発現されているからである。なお、かかるプロ
モーター配列は、サッカロマイセス属酵母のピルビン酸
脱炭酸酵素１遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ
増幅法によって単離することができる。サッカロマイセ
ス・セレビシエ由来の当該プロモーターの塩基配列を、
配列番号２に示す。なお、本ＤＮＡ構築物におけるプロ
モーターセグメントには、この配列番号２記載の塩基配
列からなるＤＮＡの他、この塩基配列において１若しく
は数個の塩基が欠失,置換若しくは付加された塩基配列
からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ、配列
番号２で示される塩基配列の全部若しくは一部の配列か
ら調製されたＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズし、かつプロモーター活性
を有するＤＮＡ（換言すれば、当該プロモーターのホモ
ログ）を用いることができる。
【００２５】また、本ＤＮＡ構築物の他の態様である第
２のＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡの他、宿主染色体を相同
組換えのためのＤＮＡセグメントを備える。相同組換え
用ＤＮＡセグメントは、宿主染色体において本ＤＮＡを
導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相
同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメント
は、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えら
れている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメン
トを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤ
ＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメン
トの間に本ＤＮＡを連結することが好ましい。
２のＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡの他、宿主染色体を相同
組換えのためのＤＮＡセグメントを備える。相同組換え
用ＤＮＡセグメントは、宿主染色体において本ＤＮＡを
導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相
同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメント
は、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えら
れている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメン
トを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤ
ＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメン
トの間に本ＤＮＡを連結することが好ましい。
【００２６】相同組換えにより宿主染色体に本ＤＮＡを
導入する場合、宿主染色体上のプロモーターにより制御
可能な状態で本ＤＮＡを導入することができる。この場
合、本ＤＮＡの導入によって、同時に、本来当該プロモ
ーターによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、
この内在性遺伝子に替えて外来の本ＤＮＡを発現させる
ことができる。特に、当該プロモーターが、宿主細胞に
おいて高発現プロモーターである場合に有用である。
導入する場合、宿主染色体上のプロモーターにより制御
可能な状態で本ＤＮＡを導入することができる。この場
合、本ＤＮＡの導入によって、同時に、本来当該プロモ
ーターによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、
この内在性遺伝子に替えて外来の本ＤＮＡを発現させる
ことができる。特に、当該プロモーターが、宿主細胞に
おいて高発現プロモーターである場合に有用である。
【００２７】かかる発現系を宿主染色体上に創出するに
は、宿主染色体において高発現遺伝子をターゲットと
し、この遺伝子を制御するプロモーターの下流にプロモ
ーターにより制御を受けるように本ＤＮＡを導入するよ
うにすることが好ましい。酵母などのエタノール発酵性
微生物を宿主とする場合、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子
（特に、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）をターゲット
とし、内在性のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモータ
ーの制御下にＬＤＨ活性タンパク質をコードするＤＮＡ
を導入することができる。この場合、相同組換え用ＤＮ
Ａセグメントは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のＬＤ
Ｈの構造遺伝子領域あるいはその近傍の配列（開始コド
ンの近傍の配列、開始コドンの上流域の配列、構造遺伝
子内の配列などを含む）と相同とすることができる。好
ましくは、サッカロマイセス属（特にセレビシエ）を宿
主として、この宿主のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子を
ターゲットとするＤＮＡ構築物とする。かかるＤＮＡ構
築物によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の破壊と
この構造遺伝子部分のＬＤＨによる置換を一つのベクタ
ーで達成することができる。ピルビン酸脱炭酸酵素１
は、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの付加逆反応を
媒介する酵素であり、この遺伝子を破壊することによ
り、アセトアルデヒドを経たエタノール生産が抑制され
ることが期待されるとともに、ピルビン酸を基質とする
ＬＤＨによる乳酸生産が促進されることが期待できる。
は、宿主染色体において高発現遺伝子をターゲットと
し、この遺伝子を制御するプロモーターの下流にプロモ
ーターにより制御を受けるように本ＤＮＡを導入するよ
うにすることが好ましい。酵母などのエタノール発酵性
微生物を宿主とする場合、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子
（特に、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）をターゲット
とし、内在性のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモータ
ーの制御下にＬＤＨ活性タンパク質をコードするＤＮＡ
を導入することができる。この場合、相同組換え用ＤＮ
Ａセグメントは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のＬＤ
Ｈの構造遺伝子領域あるいはその近傍の配列（開始コド
ンの近傍の配列、開始コドンの上流域の配列、構造遺伝
子内の配列などを含む）と相同とすることができる。好
ましくは、サッカロマイセス属（特にセレビシエ）を宿
主として、この宿主のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子を
ターゲットとするＤＮＡ構築物とする。かかるＤＮＡ構
築物によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の破壊と
この構造遺伝子部分のＬＤＨによる置換を一つのベクタ
ーで達成することができる。ピルビン酸脱炭酸酵素１
は、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの付加逆反応を
媒介する酵素であり、この遺伝子を破壊することによ
り、アセトアルデヒドを経たエタノール生産が抑制され
ることが期待されるとともに、ピルビン酸を基質とする
ＬＤＨによる乳酸生産が促進されることが期待できる。
【００２８】なお、第１のＤＮＡ構築物であっても、宿
主染色体との相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備
えることにより、相同組換え用のＤＮＡ構築物とするこ
とができる。第１のＤＮＡ構築物にあっては、ＤＮＡ構
築物中のプロモーターセグメントを、宿主染色体との相
同組換え用のＤＮＡセグメントに兼用することもでき
る。例えば、宿主サッカロマイセス・セレビシエに対し
て、サッカロマイセス・セレビシエ宿主染色体にあるプ
ロモーター、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プ
ロモーターをプロモーターセグメントとして有するＤＮ
Ａ構築物は、当該遺伝子１をターゲット部位とするター
ゲティングベクターを構成する。この場合、ピルビン酸
脱炭酸酵素１遺伝子の構造遺伝子領域に対する相同配列
を備えることが好ましい。
主染色体との相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備
えることにより、相同組換え用のＤＮＡ構築物とするこ
とができる。第１のＤＮＡ構築物にあっては、ＤＮＡ構
築物中のプロモーターセグメントを、宿主染色体との相
同組換え用のＤＮＡセグメントに兼用することもでき
る。例えば、宿主サッカロマイセス・セレビシエに対し
て、サッカロマイセス・セレビシエ宿主染色体にあるプ
ロモーター、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プ
ロモーターをプロモーターセグメントとして有するＤＮ
Ａ構築物は、当該遺伝子１をターゲット部位とするター
ゲティングベクターを構成する。この場合、ピルビン酸
脱炭酸酵素１遺伝子の構造遺伝子領域に対する相同配列
を備えることが好ましい。
【００２９】なお、ＤＮＡ構築物には、ターミネーター
他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、
スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マ
ーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結するこ
とができる。選択マーカーとしては、特に限定しない
で、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めと
する公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例え
ば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺
伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を使用することができ
る。
他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、
スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マ
ーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結するこ
とができる。選択マーカーとしては、特に限定しない
で、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めと
する公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例え
ば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺
伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を使用することができ
る。
【００３０】（ＤＮＡ構築物による形質転換）一旦、Ｄ
ＮＡ構築物が構築されたら、適当な宿主細胞に、トラン
スフォーメーション法や、トランスフェクション法、接
合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション
法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティク
ルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウ
ム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の
各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入するこ
とができる。ＤＮＡ構築物の導入後、その受容細胞は、
選択培地で培養される。
ＮＡ構築物が構築されたら、適当な宿主細胞に、トラン
スフォーメーション法や、トランスフェクション法、接
合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション
法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティク
ルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウ
ム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の
各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入するこ
とができる。ＤＮＡ構築物の導入後、その受容細胞は、
選択培地で培養される。
【００３１】宿主細胞は、Eshrichia coli、Bacillus s
ubtilisなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シ
ゾサッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、
ｓｆ９、ｓｆ２１等の昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細
胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞などとすること
ができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行
う微生物あるいは耐酸性微生物であり、例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始
めとする酵母である。具体的には、サッカロマイセス・
セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株である。
ubtilisなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シ
ゾサッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、
ｓｆ９、ｓｆ２１等の昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細
胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞などとすること
ができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行
う微生物あるいは耐酸性微生物であり、例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始
めとする酵母である。具体的には、サッカロマイセス・
セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株である。
【００３２】ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質
転換体においては、ＤＮＡ構築物の構成成分が染色体上
あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在す
ることになる。なお、ＤＮＡ構築物が染色体外に維持さ
れている場合、あるいは、ランダムインテグレーション
により染色体に組み込まれている場合には、ＬＤＨの基
質であるピルビン酸を基質とする他の酵素、例えば、ピ
ルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子（サッカロマイセス属酵母
においては、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）は、ター
ゲティングベクターによりノックアウトされていること
が好ましい。上述のＤＮＡ構築物であって、相同組換え
を達成できるＤＮＡ構築物が導入されると、宿主染色体
上の所望のプロモーターあるいは当該プロモーターと置
換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロ
モーターによって制御可能に連結された本ＤＮＡである
ＤＮＡセグメントが存在することになる。サッカロマイ
セス属酵母の形質転換体にあっては、宿主染色体上にお
いて、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターある
いは当該プロモーターと置換された当該プロモーターの
ホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に
本ＤＮＡを備えることが好ましい。また、通常、相同組
換え体における本ＤＮＡの下流側には、選択マーカー遺
伝子や、破壊された構造遺伝子の一部（ＤＮＡ構築物上
の相同配列に対応する部位）が存在する。
転換体においては、ＤＮＡ構築物の構成成分が染色体上
あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在す
ることになる。なお、ＤＮＡ構築物が染色体外に維持さ
れている場合、あるいは、ランダムインテグレーション
により染色体に組み込まれている場合には、ＬＤＨの基
質であるピルビン酸を基質とする他の酵素、例えば、ピ
ルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子（サッカロマイセス属酵母
においては、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）は、ター
ゲティングベクターによりノックアウトされていること
が好ましい。上述のＤＮＡ構築物であって、相同組換え
を達成できるＤＮＡ構築物が導入されると、宿主染色体
上の所望のプロモーターあるいは当該プロモーターと置
換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロ
モーターによって制御可能に連結された本ＤＮＡである
ＤＮＡセグメントが存在することになる。サッカロマイ
セス属酵母の形質転換体にあっては、宿主染色体上にお
いて、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターある
いは当該プロモーターと置換された当該プロモーターの
ホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に
本ＤＮＡを備えることが好ましい。また、通常、相同組
換え体における本ＤＮＡの下流側には、選択マーカー遺
伝子や、破壊された構造遺伝子の一部（ＤＮＡ構築物上
の相同配列に対応する部位）が存在する。
【００３３】なお、所望のプロモーター下に本ＤＮＡが
導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリ
ダイゼーション法により行うことができる。例えば、形
質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマ
ーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動
において予期されるバンドを検出することによって確認
できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーで
ＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当
業者において周知である。
導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリ
ダイゼーション法により行うことができる。例えば、形
質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマ
ーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動
において予期されるバンドを検出することによって確認
できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーで
ＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当
業者において周知である。
【００３４】（乳酸の製造）ＤＮＡ構築物が導入されて
得られる形質転換体を培養することにより、培養物中に
外来遺伝子の発現産物である乳酸が生成する。培養物か
ら乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得
ることができる。なお、本発明において培養物とは、培
養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体
の破砕物を包含している。本発明の形質転換体の培養に
あたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択
することができる。このような培養条件は、当業者にお
いては周知である。大腸菌や酵母等の微生物を宿主とし
て得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物
が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形
質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれ
ば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができ
る。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スク
ロース、デンプン、セルロース等の炭水化物、酢酸、プ
ロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等の
アルコールを用いることができる。窒素源としては、ア
ンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは
有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の
他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を
用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリ
ウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カ
ルシウムなどを用いることができる。
得られる形質転換体を培養することにより、培養物中に
外来遺伝子の発現産物である乳酸が生成する。培養物か
ら乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得
ることができる。なお、本発明において培養物とは、培
養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体
の破砕物を包含している。本発明の形質転換体の培養に
あたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択
することができる。このような培養条件は、当業者にお
いては周知である。大腸菌や酵母等の微生物を宿主とし
て得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物
が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形
質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれ
ば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができ
る。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スク
ロース、デンプン、セルロース等の炭水化物、酢酸、プ
ロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等の
アルコールを用いることができる。窒素源としては、ア
ンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは
有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の
他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を
用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリ
ウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カ
ルシウムなどを用いることができる。
【００３５】培養は、通常、振とう培養または通気攪拌
培養等の好気条件下、３０℃で６〜２４時間行う。培養
期間中、ｐＨは２．０〜６．０に保持することが好まし
い。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカ
リ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に
応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質
を培地に添加することができる。
培養等の好気条件下、３０℃で６〜２４時間行う。培養
期間中、ｐＨは２．０〜６．０に保持することが好まし
い。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカ
リ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に
応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質
を培地に添加することができる。
【００３６】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する倍地としては、一般に使用されているＲＰＭ
Ｉ１６４０倍地、ＤＭＥＭ倍地またはこれらの培地にウ
シ胎児血清などを添加した培地を用いることができる。
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日
行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン
などの抗生物質を培地に添加してもよい。
を培養する倍地としては、一般に使用されているＲＰＭ
Ｉ１６４０倍地、ＤＭＥＭ倍地またはこれらの培地にウ
シ胎児血清などを添加した培地を用いることができる。
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日
行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン
などの抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３７】培養は、回分式であっても連続式であって
もよい。培養方式としては、アンモニアやカルシウム塩
などのアルカリにより中和しつつ乳酸アンモニウムや乳
酸カルシウムなどの乳酸塩として得る方式のほか、フリ
ーの乳酸として得る方式も採用できる。培養終了後、培
養物から遺伝子産物である乳酸を分離するには、通常の
精製手段などを各種組み合わせて使用することができ
る。例えば、形質転換細胞内に生産された場合は、常法
により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加圧破砕など
に細胞を破壊して,遺伝子産物を細胞と分離することが
できる。この場合、必要に応じてプロテアーゼを添加す
る。また、培養上清に乳酸が生産された場合には、この
溶液を、ろ過、遠心分離などにより固形分を除去する。
もよい。培養方式としては、アンモニアやカルシウム塩
などのアルカリにより中和しつつ乳酸アンモニウムや乳
酸カルシウムなどの乳酸塩として得る方式のほか、フリ
ーの乳酸として得る方式も採用できる。培養終了後、培
養物から遺伝子産物である乳酸を分離するには、通常の
精製手段などを各種組み合わせて使用することができ
る。例えば、形質転換細胞内に生産された場合は、常法
により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加圧破砕など
に細胞を破壊して,遺伝子産物を細胞と分離することが
できる。この場合、必要に応じてプロテアーゼを添加す
る。また、培養上清に乳酸が生産された場合には、この
溶液を、ろ過、遠心分離などにより固形分を除去する。
【００３８】例えば、培養工程終了後は、培養液をベル
トプレス、遠心分離、フィルタープレスなどの少なくと
も１種の固液分離処理によって固液分離工程を実施する
ことができる。分離したろ液については、精製工程を実
施することが好ましい。精製工程においては、例えば、
乳酸を含むろ液を電気透析によって乳酸以外の有機酸や
糖類を除去して乳酸あるいは乳酸アンモニウム水溶液と
することができる。乳酸アンモニウム液の場合、バイポ
ーラ膜等によってアンモニアを分解し、乳酸水溶液とア
ンモニア水とすることができる。該ろ液中の乳酸以外の
有機酸や糖類の含量が比較的少ない場合には、電気透析
をせず、必要に応じて水分を蒸発させて濃縮し、バイポ
ーラ膜の処理を行うこともできる。なお、培養液、粗抽
出画分に対しては、上記方法に限られず、有機溶剤によ
る分離抽出、蒸留等の各種精製分離法等を利用して、乳
酸あるいはその塩を精製することができる。また、必要
に応じて、培養液、粗抽出画分及びその精製物に対して
エステル化、ラクチド化、オリゴマーあるいはプレポリ
マー化等の処理を行うことにより、各種の乳酸誘導体を
得ることができる。必要に応じて、乳酸発酵液から乳
酸、その塩及びその誘導体の１種あるいは２種以上を採
取することができる。
トプレス、遠心分離、フィルタープレスなどの少なくと
も１種の固液分離処理によって固液分離工程を実施する
ことができる。分離したろ液については、精製工程を実
施することが好ましい。精製工程においては、例えば、
乳酸を含むろ液を電気透析によって乳酸以外の有機酸や
糖類を除去して乳酸あるいは乳酸アンモニウム水溶液と
することができる。乳酸アンモニウム液の場合、バイポ
ーラ膜等によってアンモニアを分解し、乳酸水溶液とア
ンモニア水とすることができる。該ろ液中の乳酸以外の
有機酸や糖類の含量が比較的少ない場合には、電気透析
をせず、必要に応じて水分を蒸発させて濃縮し、バイポ
ーラ膜の処理を行うこともできる。なお、培養液、粗抽
出画分に対しては、上記方法に限られず、有機溶剤によ
る分離抽出、蒸留等の各種精製分離法等を利用して、乳
酸あるいはその塩を精製することができる。また、必要
に応じて、培養液、粗抽出画分及びその精製物に対して
エステル化、ラクチド化、オリゴマーあるいはプレポリ
マー化等の処理を行うことにより、各種の乳酸誘導体を
得ることができる。必要に応じて、乳酸発酵液から乳
酸、その塩及びその誘導体の１種あるいは２種以上を採
取することができる。
【００３９】
【実施例】以下に、本発明の具体例を記載するが、本発
明は以下の具体例に限定する趣旨ではない。
明は以下の具体例に限定する趣旨ではない。
【００４０】（実施例１：Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子の
ＤＮＡ配列の設計）高等真核生物であるウシ由来のタン
パク質であるＬ−乳酸脱水素酵素を、酵母サッカロマイ
セス・セレビシエ属において効率的に生産するために、
ウシ由来Ｌ−乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡに対して、以下の項目を設計指針として、天然
にない新規な遺伝子配列を設計した。 １）サッカロマイセス・セレビシエにおいて多用されて
いるコドンを用いた。 ２）開始コドンをはさんでコザック配列（ＡＮＮＡＴＧ
Ｇ）を付加した。 ３）ｍＲＮＡの不安定配列や繰り返し配列をできる限り
排除した。 ４）全領域にわたってＧＣ含量の偏りに差がでないよう
にした。 ５）設計した配列中に遺伝子クローニングに不適当な制
限酵素部位ができないようにした。 ６）染色体導入型ベクターに組み込むための両末端に有
用な制限酵素EcoRI、XhoI、AflIII部位を付加した。 酵母におけるコドンの使用頻度は、コドンユーセージデ
ータベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/）から得
られるサッカロマイセス・セレビシエのコドンユーセー
ジを図２に示す。この図において特定アミノ酸に対応し
て多用されているコドンを特定した（下線をしたコド
ン）。
ＤＮＡ配列の設計）高等真核生物であるウシ由来のタン
パク質であるＬ−乳酸脱水素酵素を、酵母サッカロマイ
セス・セレビシエ属において効率的に生産するために、
ウシ由来Ｌ−乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡに対して、以下の項目を設計指針として、天然
にない新規な遺伝子配列を設計した。 １）サッカロマイセス・セレビシエにおいて多用されて
いるコドンを用いた。 ２）開始コドンをはさんでコザック配列（ＡＮＮＡＴＧ
Ｇ）を付加した。 ３）ｍＲＮＡの不安定配列や繰り返し配列をできる限り
排除した。 ４）全領域にわたってＧＣ含量の偏りに差がでないよう
にした。 ５）設計した配列中に遺伝子クローニングに不適当な制
限酵素部位ができないようにした。 ６）染色体導入型ベクターに組み込むための両末端に有
用な制限酵素EcoRI、XhoI、AflIII部位を付加した。 酵母におけるコドンの使用頻度は、コドンユーセージデ
ータベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/）から得
られるサッカロマイセス・セレビシエのコドンユーセー
ジを図２に示す。この図において特定アミノ酸に対応し
て多用されているコドンを特定した（下線をしたコド
ン）。
【００４１】図１に示すコドンユーセージにおける多用
コドンの適用の他、上記２）〜５）の設計指針に基づい
て得られたＬＤＨ活性を有するタンパク質をコードする
新規なＤＮＡ配列（９９９ｂｐ）（以下、ＬＤＨＫＣＢ
遺伝子と称す。）を配列番号３に示す。また、配列番号
３に示すＤＮＡ配列とその開始コドンの上流側および終
止コドンの下流側とを含むＤＮＡ配列（１０５２ｂｐ）
（以下、ＬＤＨＫＣＢ配列と称す。）を配列番号４に示
す。
コドンの適用の他、上記２）〜５）の設計指針に基づい
て得られたＬＤＨ活性を有するタンパク質をコードする
新規なＤＮＡ配列（９９９ｂｐ）（以下、ＬＤＨＫＣＢ
遺伝子と称す。）を配列番号３に示す。また、配列番号
３に示すＤＮＡ配列とその開始コドンの上流側および終
止コドンの下流側とを含むＤＮＡ配列（１０５２ｂｐ）
（以下、ＬＤＨＫＣＢ配列と称す。）を配列番号４に示
す。
【００４２】配列番号３に記載のＤＮＡ配列において
は、メチオニン以外の全てのアミノ酸において、もとの
ＤＮＡ配列で使用したのと異なるコドンを使用してい
た。なお、新たに採用されたコドンは、全て図１に示す
多用コドンであった。さらに、もとのウシ由来のＬＤＨ
遺伝子とＬＤＨＫＣＢ遺伝子とについて、コンピュータ
ーによるホモロジー解析を行った結果を図２に示す。図
２から明らかなように、ＤＮＡ配列のほぼ全域にわたっ
て多数の置換を要することがわかった。
は、メチオニン以外の全てのアミノ酸において、もとの
ＤＮＡ配列で使用したのと異なるコドンを使用してい
た。なお、新たに採用されたコドンは、全て図１に示す
多用コドンであった。さらに、もとのウシ由来のＬＤＨ
遺伝子とＬＤＨＫＣＢ遺伝子とについて、コンピュータ
ーによるホモロジー解析を行った結果を図２に示す。図
２から明らかなように、ＤＮＡ配列のほぼ全域にわたっ
て多数の置換を要することがわかった。
【００４３】（実施例２：ＬＤＨＫＣＢ配列の全合成）
本実施例では、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られてい
る藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物
細胞工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、
１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を用いた。この方
法の原理は、１００ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを３’末端に１０〜１２ｍｅｒ程度のオーバー
ラップを持つように作製し、お互いのオリゴヌクレオチ
ドプライマーのオーバーラップ領域を利用して、欠損部
分を伸張させ、さらに両末端のプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行うことによって増幅するというものである。この
操作を順次繰り返し、目的とする長鎖ＤＮＡを合成す
る。ＰＣＲ増幅装置には、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓ
ｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を使用した。具体的には、最初に連結さ
せたい２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを混合
し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（東洋紡）存在下で、９６℃、２分、６８℃２分、５４
℃２分、７２℃３０分の反応条件でＤＮＡ伸張反応を行
った。次に、本試料の１／１０量を鋳型にして、両末端
のプライマー存在下で、９６℃２分後、９６℃で３０
秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルと
し、これを２５サイクル行い、その後４℃とするＰＣＲ
反応をおこなった。反応におけるバッファ、ｄＮＴＰｍ
ｉｘなどは、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに附属のも
のを使用した。一連のオーバーラップＰＣＲ法を図３に
従って順次行っていき、最終目的とすつ遺伝子断片を作
製した。図３に示す各種プライマー（BA、B01、BB、B0
2、BC、B03、BD、B04、BE、B05、BF、B06、BG、B07、B
H、B08、BI、B09、BJ、B10、BK、B11、BL、B12、BM、B1
3、BN、B14の全２８種のプライマーのＤＮＡ配列を配列
番号５〜３２にそれぞれ示す。合成したＬＤＨＫＣＢ配
列について、塩基配列を確認した後、ＥｃｏＲＩにて制
限酵素処理し、同様にＥｃｏＲＩにて酵素処理したｐＣ
Ｒ２．１ ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｉｒｏｇ
ｅｎ）に常法により連結した。このベクターをｐＢＴＯ
ＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターと称した。
本実施例では、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られてい
る藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物
細胞工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、
１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を用いた。この方
法の原理は、１００ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを３’末端に１０〜１２ｍｅｒ程度のオーバー
ラップを持つように作製し、お互いのオリゴヌクレオチ
ドプライマーのオーバーラップ領域を利用して、欠損部
分を伸張させ、さらに両末端のプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行うことによって増幅するというものである。この
操作を順次繰り返し、目的とする長鎖ＤＮＡを合成す
る。ＰＣＲ増幅装置には、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓ
ｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を使用した。具体的には、最初に連結さ
せたい２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを混合
し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（東洋紡）存在下で、９６℃、２分、６８℃２分、５４
℃２分、７２℃３０分の反応条件でＤＮＡ伸張反応を行
った。次に、本試料の１／１０量を鋳型にして、両末端
のプライマー存在下で、９６℃２分後、９６℃で３０
秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルと
し、これを２５サイクル行い、その後４℃とするＰＣＲ
反応をおこなった。反応におけるバッファ、ｄＮＴＰｍ
ｉｘなどは、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに附属のも
のを使用した。一連のオーバーラップＰＣＲ法を図３に
従って順次行っていき、最終目的とすつ遺伝子断片を作
製した。図３に示す各種プライマー（BA、B01、BB、B0
2、BC、B03、BD、B04、BE、B05、BF、B06、BG、B07、B
H、B08、BI、B09、BJ、B10、BK、B11、BL、B12、BM、B1
3、BN、B14の全２８種のプライマーのＤＮＡ配列を配列
番号５〜３２にそれぞれ示す。合成したＬＤＨＫＣＢ配
列について、塩基配列を確認した後、ＥｃｏＲＩにて制
限酵素処理し、同様にＥｃｏＲＩにて酵素処理したｐＣ
Ｒ２．１ ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｉｒｏｇ
ｅｎ）に常法により連結した。このベクターをｐＢＴＯ
ＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターと称した。
【００４４】（実施例３：酵母染色体導入用ベクターの
構築）実施例２において全合成したＬＤＨＫＣＢ配列を
用いて、酵母染色体導入型ベクターを構築した。このベ
クターを、pBTRP-PDC1-LDHKCBと称し、このプラスミド
マップを図４に示す。 １．ｐBTrp-PDC１-LDHKCB構築のためのPDC1P断片の単離 PDC1P断片は、サッカロマイセス・セレビシエYPH株（St
ratagene社）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したPCR
増幅法によって単離を行った。
構築）実施例２において全合成したＬＤＨＫＣＢ配列を
用いて、酵母染色体導入型ベクターを構築した。このベ
クターを、pBTRP-PDC1-LDHKCBと称し、このプラスミド
マップを図４に示す。 １．ｐBTrp-PDC１-LDHKCB構築のためのPDC1P断片の単離 PDC1P断片は、サッカロマイセス・セレビシエYPH株（St
ratagene社）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したPCR
増幅法によって単離を行った。
【００４５】サッカロマイセス・セレビシエYPH株のゲ
ノムＤＮＡは、ゲノム調製キットであるFast DNA Kit
（Bio 101社）を用い、詳細は、附属のプロトコールに
従い、調製した。ＤＮＡ濃度は分光光度計Ｕｌｔｒｏ
ｓｐｅｃ ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にて測定した。
ノムＤＮＡは、ゲノム調製キットであるFast DNA Kit
（Bio 101社）を用い、詳細は、附属のプロトコールに
従い、調製した。ＤＮＡ濃度は分光光度計Ｕｌｔｒｏ
ｓｐｅｃ ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にて測定した。
【００４６】PCR反応には、増幅酵素として、増幅断片
の正確性が高いとされるPyrobest DNA Polymerase（宝
酒造）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマイ
セス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡ５０ｎｇ／サ
ンプル、プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ／サンプル、及
びＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．
２ユニット／サンプルを合計で５０μｌの反応系に調製
した。反応溶液を、ＰＣＲ増幅装置 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ
ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｌｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）によってＤＮＡ増幅を行つた。
ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９６℃で２分の後、９６
℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイ
クルとし、これを２５サイクル行い、その後４℃とし
た。ＰＣＲ増幅断片を１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳
動にて遺伝子増幅断片の確認を行つた。なお反応に使用
したプライマーＤＮＡは、合成ＤＮＡ（サワデーテクノ
ロジー社）を用い、このプライマーのＤＮＡ配列は以下
の通りであった。
の正確性が高いとされるPyrobest DNA Polymerase（宝
酒造）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマイ
セス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡ５０ｎｇ／サ
ンプル、プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ／サンプル、及
びＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．
２ユニット／サンプルを合計で５０μｌの反応系に調製
した。反応溶液を、ＰＣＲ増幅装置 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ
ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｌｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）によってＤＮＡ増幅を行つた。
ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９６℃で２分の後、９６
℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイ
クルとし、これを２５サイクル行い、その後４℃とし
た。ＰＣＲ増幅断片を１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳
動にて遺伝子増幅断片の確認を行つた。なお反応に使用
したプライマーＤＮＡは、合成ＤＮＡ（サワデーテクノ
ロジー社）を用い、このプライマーのＤＮＡ配列は以下
の通りであった。
【００４７】・ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ−Ｕ（３１ｍｅｒ，
Ｔｍ値５８．３℃）未端に制限酵素ＢａｍH1サイトを付
加：ＡＴＡ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＧ ＴＴＴ ＡＴ
Ｔ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＣＴＣ （配列番号３３） ・ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．
４℃）末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＴＴ
ＧＡＣ ＴＧＴＧ （配列番号３４）
Ｔｍ値５８．３℃）未端に制限酵素ＢａｍH1サイトを付
加：ＡＴＡ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＧ ＴＴＴ ＡＴ
Ｔ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＣＴＣ （配列番号３３） ・ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．
４℃）末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＴＴ
ＧＡＣ ＴＧＴＧ （配列番号３４）
【００４８】２．プロモーター及び目的遺伝子を含む組
換えベクターの構築 サッカロマイセス・セレビシエ由来のビルビン酸脱炭酸
酵素１遺伝子（ＰＤＣ１）プロモーター配列の制御下
で、目的遺伝子としてウシ由来のL-乳酸脱水素酵素遺伝
子（ＬＤＨ遺伝子）を使用した。
換えベクターの構築 サッカロマイセス・セレビシエ由来のビルビン酸脱炭酸
酵素１遺伝子（ＰＤＣ１）プロモーター配列の制御下
で、目的遺伝子としてウシ由来のL-乳酸脱水素酵素遺伝
子（ＬＤＨ遺伝子）を使用した。
【００４９】本組換えベクター構築のために新たに構築
した染色体導入型ベクターをｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−Ｌ
ＤＨＫＣＢと名付けた。以下に本ベクター構築例の詳細
を記す。なお本実施例の概要を図５〜８に示す。但し、
ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。
ベクターの構築にあたって、必要な遺伝子断片であるＰ
ＤＣｌ遺伝子のプロモーター断片（ＰＤＣ１Ｐ）９７１
ｂｐと、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片（ＰＤＣ１Ｄ）５
１８ｂｐは、上述のように、サッカロマイセス・セレビ
シエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣ
Ｒ増幅法によって単離を行った。ＰＣＲ増幅の手順は上
記の通りであるが、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片の増幅
には、以下のプライマーを使用した。 ・ＰＤＣ１Ｄ−ＬＤＨ−Ｕ（３４ｍｅｒ、Ｔｍ値５５．
３℃）未端に制限酵素ＸｈｏＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＣＴＴ
ＣＴＴ ＧＧＴＣＧＡ Ｃ （配列番号３５） ・ＰＤＣ１Ｄ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．
４℃）末端に制限酵素ＡｐａＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＴＴ
ＧＡＣ ＴＧＴＧ （配列番号３６）
した染色体導入型ベクターをｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−Ｌ
ＤＨＫＣＢと名付けた。以下に本ベクター構築例の詳細
を記す。なお本実施例の概要を図５〜８に示す。但し、
ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。
ベクターの構築にあたって、必要な遺伝子断片であるＰ
ＤＣｌ遺伝子のプロモーター断片（ＰＤＣ１Ｐ）９７１
ｂｐと、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片（ＰＤＣ１Ｄ）５
１８ｂｐは、上述のように、サッカロマイセス・セレビ
シエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣ
Ｒ増幅法によって単離を行った。ＰＣＲ増幅の手順は上
記の通りであるが、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片の増幅
には、以下のプライマーを使用した。 ・ＰＤＣ１Ｄ−ＬＤＨ−Ｕ（３４ｍｅｒ、Ｔｍ値５５．
３℃）未端に制限酵素ＸｈｏＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＣＴＴ
ＣＴＴ ＧＧＴＣＧＡ Ｃ （配列番号３５） ・ＰＤＣ１Ｄ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．
４℃）末端に制限酵素ＡｐａＩサイトを付加：ＡＴＡ
ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＴＴ
ＧＡＣ ＴＧＴＧ （配列番号３６）
【００５０】上記反応にて取得したＰＤＣ１Ｐ及びＰＤ
Ｃ１Ｄ各遺伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処
理によって精製した後、ＰＤＣ１Ｐ増幅断片を制限酵素
ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ及びＰＤＣ１Ｄ増幅断片を制限
酵素ＸｈｏＩ／ＡｐａＩにて制限酵素反応処理を行っ
た。なお、以下に用いた酵素類はすべて宝酒造社製のも
のを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限酵素処理
の一連操作の詳細なマニュアルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｌｏｎ （Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ．１９８９）に従っ
た。
Ｃ１Ｄ各遺伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処
理によって精製した後、ＰＤＣ１Ｐ増幅断片を制限酵素
ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ及びＰＤＣ１Ｄ増幅断片を制限
酵素ＸｈｏＩ／ＡｐａＩにて制限酵素反応処理を行っ
た。なお、以下に用いた酵素類はすべて宝酒造社製のも
のを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限酵素処理
の一連操作の詳細なマニュアルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｌｏｎ （Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ．１９８９）に従っ
た。
【００５１】ベクターの構築における一連の反応操作
は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行っ
た。すなわち、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（宝酒
造社）及び脱リン酸化酵素Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ、宝酒造社）を施したｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）に、
上記ＰＣＲ法にて増幅し制限酵素処理を施したＰＤＣ１
Ｐ断片をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応によって連結さ
せた（図５上段）。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応に
は、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付
属のプロトコールに従った。
は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行っ
た。すなわち、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（宝酒
造社）及び脱リン酸化酵素Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ、宝酒造社）を施したｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）に、
上記ＰＣＲ法にて増幅し制限酵素処理を施したＰＤＣ１
Ｐ断片をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応によって連結さ
せた（図５上段）。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応に
は、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付
属のプロトコールに従った。
【００５２】次にＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った溶液を
用いて、コンピテント細胞への形質転換を行った。コン
ピテント細胞は大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社）を用
い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。得られ
た培養液は抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含
有したＬＢプレートにまいて一晩培養した。生育したコ
ロニーにつき、インサート断片のプライマーＤＮＡを用
いたコロニーＰＣＲ法による確認、及びミニプレップに
よるプラスミドＤＮＡ調製溶液に対する制限酵素処理に
よる確認を行い、目的とするベクターｐＢＰＤＣ１Ｐベ
クターを単離した（図５中段）。
用いて、コンピテント細胞への形質転換を行った。コン
ピテント細胞は大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社）を用
い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。得られ
た培養液は抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含
有したＬＢプレートにまいて一晩培養した。生育したコ
ロニーにつき、インサート断片のプライマーＤＮＡを用
いたコロニーＰＣＲ法による確認、及びミニプレップに
よるプラスミドＤＮＡ調製溶液に対する制限酵素処理に
よる確認を行い、目的とするベクターｐＢＰＤＣ１Ｐベ
クターを単離した（図５中段）。
【００５３】ついで、図５の中段に示すように、株式会
社豊田中央研究所によって構築されたｐＢＴＯＰＯ−Ｌ
ＤＨＫＣＢベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理及び末端
修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理するこ
とで得られるＬＤＨＫＣＢ遺伝子断片を、同じく制限酵
素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中
に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢ
ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを作製した（図５下
段）。
社豊田中央研究所によって構築されたｐＢＴＯＰＯ−Ｌ
ＤＨＫＣＢベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理及び末端
修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理するこ
とで得られるＬＤＨＫＣＢ遺伝子断片を、同じく制限酵
素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中
に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢ
ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを作製した（図５下
段）。
【００５４】一方、図６に示すように、トヨタ自動車
（株）によって構築されたｐＹＬＤｌベクターを制限酵
素ＥｃｏＲＩ／ＡａｔＩＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４
ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬ
ＤＨ遺伝子（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来）断
片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ
４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤ
Ｃ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニ
ングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ１ベクターを作製
した（図６）。なお、上記のｐＹＬＤｌベクターは大腸
菌に導入され（名称： 「Ｅ．ｃｏｌｌ ｐＹＬＤ
１」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目
１番地１ 中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４
２３としてブダベスト条約に基づき国際寄託されている
（原寄託日：平成１１（１９９９）年１０月２６日）。
（株）によって構築されたｐＹＬＤｌベクターを制限酵
素ＥｃｏＲＩ／ＡａｔＩＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４
ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬ
ＤＨ遺伝子（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来）断
片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ
４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤ
Ｃ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニ
ングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ１ベクターを作製
した（図６）。なお、上記のｐＹＬＤｌベクターは大腸
菌に導入され（名称： 「Ｅ．ｃｏｌｌ ｐＹＬＤ
１」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目
１番地１ 中央第６）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４
２３としてブダベスト条約に基づき国際寄託されている
（原寄託日：平成１１（１９９９）年１０月２６日）。
【００５５】続いて、図７に示すように、このベクター
をＸｈｏＩ／ＡｐａＩ処理し、同様に制限酵素処理を施
した増幅ＰＤＣ１Ｄ断片を連結させてｐＢＰＤＣ１Ｐ−
ＬＤＨベクターを作製した（図７上段）。最後にｐＢＰ
ＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＩＩベクターをＥｃｏＲＶ処理したも
のに、ｐＲＳ４０４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）をＡａｔＩＩ／ＳｓｐＩ処理、Ｔ４ ＤＮＡｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ処理して得られたＴｒｐマーカー断片を
連結させて、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨベクターを
構築した。
をＸｈｏＩ／ＡｐａＩ処理し、同様に制限酵素処理を施
した増幅ＰＤＣ１Ｄ断片を連結させてｐＢＰＤＣ１Ｐ−
ＬＤＨベクターを作製した（図７上段）。最後にｐＢＰ
ＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＩＩベクターをＥｃｏＲＶ処理したも
のに、ｐＲＳ４０４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社）をＡａｔＩＩ／ＳｓｐＩ処理、Ｔ４ ＤＮＡｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ処理して得られたＴｒｐマーカー断片を
連結させて、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨベクターを
構築した。
【００５６】次に、図８に示すように、ｐＢＰＤＣ１Ｐ
−ＬＤＨＫＣＢベクターをＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩにて制
限酵素処理し、一方、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨベ
クターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｔｕＩで処理した
Ｔｒｐマーカーを含む断片に処理し、増幅させた断片を
連結させて、最終コンストラクトである染色体導入型ｐ
ＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築し
た。
−ＬＤＨＫＣＢベクターをＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩにて制
限酵素処理し、一方、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨベ
クターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｔｕＩで処理した
Ｔｒｐマーカーを含む断片に処理し、増幅させた断片を
連結させて、最終コンストラクトである染色体導入型ｐ
ＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築し
た。
【００５７】構築した染色体導入型ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ
１−ＬＤＨＫＣＢベクターの確認の為に塩基配列決定を
行った。塩基配列解析装置としてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３
１０Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、試料の調
製法、及び機器の使用方法等の詳細は本装置付属のマニ
ュアルに従った。試料となるベクターＤＮＡはアルカリ
抽出法により調製したものを用い、これをＧＦＸ ＤＮ
Ａ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｌｏｔｅｃｈ社）にてカラム
精製した後、分光光度計Ｕｌｔｒｏ ｓｐｅｃ ３０００
（Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｌｏｔｅｃ
ｈ社）にてＤＮＡ濃度を測定したものを用いた。
１−ＬＤＨＫＣＢベクターの確認の為に塩基配列決定を
行った。塩基配列解析装置としてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３
１０Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、試料の調
製法、及び機器の使用方法等の詳細は本装置付属のマニ
ュアルに従った。試料となるベクターＤＮＡはアルカリ
抽出法により調製したものを用い、これをＧＦＸ ＤＮ
Ａ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｌｏｔｅｃｈ社）にてカラム
精製した後、分光光度計Ｕｌｔｒｏ ｓｐｅｃ ３０００
（Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｌｏｔｅｃ
ｈ社）にてＤＮＡ濃度を測定したものを用いた。
【００５８】（実施例４：酵母の形質転換）酵母への遺
伝子導入法は、Ｉｔｏらの手法（Ito, H., Y. Fukuda,
K.Murata and A. Kimura, Transformation of intact y
east cells treated with alkali cations J. Bacterio
l. Vol.153, p163-168）に従った。すなわち、宿主であ
る酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録さ
れている菌株）のトリプトファン合成能を欠損した株
を、１０ｍｌＹＰＤ培地にて３０℃で対数増殖期まで培
養を行い、集菌およびＴＥバッファによる洗浄を行っ
た。次に、０．５ｍｌ ＴＥバッファと０．５ｍｌ ０．
２Ｍの酢酸リチウムを加え、３０℃にて１時間の振とう
培養を行った後に、実施例３の手法を用いて構築した染
色体導入型ベクターｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣ
Ｂベクターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳａｃＩ（いず
れも宝酒造）で処理して、これを添加した。
伝子導入法は、Ｉｔｏらの手法（Ito, H., Y. Fukuda,
K.Murata and A. Kimura, Transformation of intact y
east cells treated with alkali cations J. Bacterio
l. Vol.153, p163-168）に従った。すなわち、宿主であ
る酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録さ
れている菌株）のトリプトファン合成能を欠損した株
を、１０ｍｌＹＰＤ培地にて３０℃で対数増殖期まで培
養を行い、集菌およびＴＥバッファによる洗浄を行っ
た。次に、０．５ｍｌ ＴＥバッファと０．５ｍｌ ０．
２Ｍの酢酸リチウムを加え、３０℃にて１時間の振とう
培養を行った後に、実施例３の手法を用いて構築した染
色体導入型ベクターｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨＫＣ
Ｂベクターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳａｃＩ（いず
れも宝酒造）で処理して、これを添加した。
【００５９】本酵母懸濁液を３０℃で３０分振とう培養
後、１５０μｌの７０％ポリエチレングリコール４００
０（和光純薬）を加え、よく攪拌した。さらに、３０℃
にて１時間振とう培養した後、４２℃にて５分間ヒート
ショックを与え、菌体を洗浄した後、２００μｌの水に
懸濁したものをトリプトファン選択培地に塗沫した。
後、１５０μｌの７０％ポリエチレングリコール４００
０（和光純薬）を加え、よく攪拌した。さらに、３０℃
にて１時間振とう培養した後、４２℃にて５分間ヒート
ショックを与え、菌体を洗浄した後、２００μｌの水に
懸濁したものをトリプトファン選択培地に塗沫した。
【００６０】得られたコロニーを新たなトリプトファン
選択培地に画線培養し、安定性が確認できた選抜株につ
いて、遺伝子導入の有無をＰＣＲ解析によって確認し
た。ＰＣＲに鋳型として用いる酵母のゲノムＤＮＡは、
シングルコロニーを２ｍｌＹＰＤ培地で一晩振とう培養
を行った後、集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０
０μｌおよびガラスビーズ（４２５〜６００μｍ、Aｃ
ｉｄ ｗａｓｈｅｄ、ＳＩＧＭＡ）を加え、４℃で１５
分間ボルテックスを行うことにより調製した。本溶液の
上清を用いてエタノール沈殿を行い、滅菌水５０μｌに
溶解した、調製したゲノムＤＮＡ５μｌを鋳型として、
５０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ＤＮＡ増幅酵素と
しては、ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造）を用い、ＰＣＲ増幅装置Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｐ
ＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲ増幅装置の反
応条件は、９６℃２分の後、９６℃で３０秒、５５℃で
３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとし、これを３０
サイクル行い、その後４℃とした。使用したプライマー
の配列は以下の通りであった。 ＬＤＨ−ＫＣＢ−Ｕ：ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＴＡ Ｔ
ＧＧ ＡＡＧ ＡＴ（２０ｍｅｒ）（配列番号３７） ＬＤＨ−ＫＣＢ−Ｄ：ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＴＡ ＣＡＴ Ａ
ＡＡ ＡＣＣ ＣＡＧ（２１ｍｅｒ）（配列番号３８） ＰＤＣ１Ｐ−Ｕ３：ＧＴＡ ＡＴＡ ＡＡＣ ＡＣＡ ＣＣ
Ｃ ＣＧＣ Ｇ（１９ｍｅｒ）（配列番号３９）
選択培地に画線培養し、安定性が確認できた選抜株につ
いて、遺伝子導入の有無をＰＣＲ解析によって確認し
た。ＰＣＲに鋳型として用いる酵母のゲノムＤＮＡは、
シングルコロニーを２ｍｌＹＰＤ培地で一晩振とう培養
を行った後、集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０
０μｌおよびガラスビーズ（４２５〜６００μｍ、Aｃ
ｉｄ ｗａｓｈｅｄ、ＳＩＧＭＡ）を加え、４℃で１５
分間ボルテックスを行うことにより調製した。本溶液の
上清を用いてエタノール沈殿を行い、滅菌水５０μｌに
溶解した、調製したゲノムＤＮＡ５μｌを鋳型として、
５０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ＤＮＡ増幅酵素と
しては、ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（宝酒造）を用い、ＰＣＲ増幅装置Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｐ
ＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＰＣＲ増幅装置の反
応条件は、９６℃２分の後、９６℃で３０秒、５５℃で
３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとし、これを３０
サイクル行い、その後４℃とした。使用したプライマー
の配列は以下の通りであった。 ＬＤＨ−ＫＣＢ−Ｕ：ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＴＡ Ｔ
ＧＧ ＡＡＧ ＡＴ（２０ｍｅｒ）（配列番号３７） ＬＤＨ−ＫＣＢ−Ｄ：ＧＡＣ ＡＡＧ ＧＴＡ ＣＡＴ Ａ
ＡＡ ＡＣＣ ＣＡＧ（２１ｍｅｒ）（配列番号３８） ＰＤＣ１Ｐ−Ｕ３：ＧＴＡ ＡＴＡ ＡＡＣ ＡＣＡ ＣＣ
Ｃ ＣＧＣ Ｇ（１９ｍｅｒ）（配列番号３９）
【００６１】安定したトリプトファン合成能を有し、か
つ、これらのプライマーのもとでＰＣＲ増幅が確認でき
たものを、ＬＤＨＫＣＢ遺伝子が適切に導入された形質
転換株であると判断した。本実施例においては、かかる
形質転換株として、ＫＣＢ−２７株、ＫＣＢ−２１０
株、およびＫＣＢ−２１１株の３種の菌株を取得するこ
とができた。これら酵母サッカロマイセス・セレビシエ
形質転換体のゲノム染色体上の構造を図９に示す。
つ、これらのプライマーのもとでＰＣＲ増幅が確認でき
たものを、ＬＤＨＫＣＢ遺伝子が適切に導入された形質
転換株であると判断した。本実施例においては、かかる
形質転換株として、ＫＣＢ−２７株、ＫＣＢ−２１０
株、およびＫＣＢ−２１１株の３種の菌株を取得するこ
とができた。これら酵母サッカロマイセス・セレビシエ
形質転換体のゲノム染色体上の構造を図９に示す。
【００６２】（実施例５：形質転換体におけるＬ−乳酸
生産量の測定）作製した３種の形質転換株について発酵
試験を行った。前培養として、グルコース濃度２％のＹ
ＰＤ液体培地で一晩培養を行い、これを集菌および洗浄
後、グルコース濃度１５％のＹＰＤ液体培地に菌体濃度
が１％（０．５ｇ／５０ｍｌ）になるように植菌し、３
０℃の静置培養にて数日間発酵を行った。本発酵液を２
４時間ごとに採取し、溶液中に含まれるＬ−乳酸量を想
定した。生産量の測定は、バイオセンサＢＦ−４（王子
計測機器）を用い、測定方法の詳細は、附属の取り扱い
説明書に従った。
生産量の測定）作製した３種の形質転換株について発酵
試験を行った。前培養として、グルコース濃度２％のＹ
ＰＤ液体培地で一晩培養を行い、これを集菌および洗浄
後、グルコース濃度１５％のＹＰＤ液体培地に菌体濃度
が１％（０．５ｇ／５０ｍｌ）になるように植菌し、３
０℃の静置培養にて数日間発酵を行った。本発酵液を２
４時間ごとに採取し、溶液中に含まれるＬ−乳酸量を想
定した。生産量の測定は、バイオセンサＢＦ−４（王子
計測機器）を用い、測定方法の詳細は、附属の取り扱い
説明書に従った。
【００６３】グルコース濃度１５％で発酵３日目におけ
る培養液中のＬ−乳酸量およびエタノール量を測定した
結果を図１０および表１に示す。また、ＫＣＢ−２７株
については、０〜５日目のＬ−乳酸量とエタノール量と
の経緯を図１１と表２に示す。
る培養液中のＬ−乳酸量およびエタノール量を測定した
結果を図１０および表１に示す。また、ＫＣＢ−２７株
については、０〜５日目のＬ−乳酸量とエタノール量と
の経緯を図１１と表２に示す。
【表１】
【表２】
ＬＤＨＫＣＢ遺伝子が導入された形質転換体（ＫＣＢ−
２７株、ＫＣＢ−２１０株、ＫＣＢ−２１１株）では、
それぞれＬＤＨＫＣＢ遺伝子が１コピーしか導入されて
いないのにもかかわらず、培養液１Ｌあたり、４．５〜
５．０％（４５．０〜５０．０ｇ）のＬ−乳酸生産が認
められた。一方、これらの形質転換体では、エタノール
生産量は５％となり、形質転換前の親株であるＩＦＯ２
２６０株と対比すると、２．５％程度減少していた。本
結果は、過去に報告されているサッカロマイセス・セレ
ビシエにおけるＬ−乳酸生産と比較して飛躍的な生産量
の増大であることは明らかであった。また、かかる生産
量の増大は、酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素の対ピル
ビン酸基質親和性よりも、同等かあるいは高い基質親和
性を有するＬＤＨを導入したことによるものと考えられ
る。また、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の
プロモーターの制御下に導入したことによるものと考え
られる。以上の結果からすると、１コピーによってもか
かる生産量の増大を得られることから、２コピー以上が
導入された場合には、さらなる生産量の増大を確保でき
ることが推測される。
２７株、ＫＣＢ−２１０株、ＫＣＢ−２１１株）では、
それぞれＬＤＨＫＣＢ遺伝子が１コピーしか導入されて
いないのにもかかわらず、培養液１Ｌあたり、４．５〜
５．０％（４５．０〜５０．０ｇ）のＬ−乳酸生産が認
められた。一方、これらの形質転換体では、エタノール
生産量は５％となり、形質転換前の親株であるＩＦＯ２
２６０株と対比すると、２．５％程度減少していた。本
結果は、過去に報告されているサッカロマイセス・セレ
ビシエにおけるＬ−乳酸生産と比較して飛躍的な生産量
の増大であることは明らかであった。また、かかる生産
量の増大は、酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素の対ピル
ビン酸基質親和性よりも、同等かあるいは高い基質親和
性を有するＬＤＨを導入したことによるものと考えられ
る。また、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の
プロモーターの制御下に導入したことによるものと考え
られる。以上の結果からすると、１コピーによってもか
かる生産量の増大を得られることから、２コピー以上が
導入された場合には、さらなる生産量の増大を確保でき
ることが推測される。
【００６４】（実施例６：各種真核生物由来のＬ−乳酸
脱水素酵素の対ピルビン酸基質親和性（ミカエリス定
数、Ｋｍ値）の測定 ウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素の対ピルビン酸基質親和
性（ミカエリス定数、Ｋｍ値）を以下に示す手法により
測定した。また、乳酸菌由来のＬ−乳酸脱水素酵素の対
ピルビン酸基質親和性との比較を行った。なお、対ピル
ビン酸基質親和性（Ｋｍ値）の測定においては、最初
に、精製されたＬ−乳酸脱水素酵素にピルビン酸、及び
ＮＡＤＨ、ＦＢＰを添加して酵素反応を行い、ＮＡＤＨ
の減少率を分光光度計（Ubest-55、日本分光）ABS：340
nmにて測定し、各Ｌ−乳酸脱水素酵素活性を求めた。次
に、各ピルビン酸濃度におけるＬ−乳酸脱水素酵素活性
の値をもとに、ピルピン酸飽和曲線及び各逆数から算出
されるLineweaver-Burkプロットを作製し、Ｌ−乳酸脱
脂水素酵素における対ピルビン酸基質親和性（ミカエリ
ス定数、Ｋｍ値）を求めた。
脱水素酵素の対ピルビン酸基質親和性（ミカエリス定
数、Ｋｍ値）の測定 ウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素の対ピルビン酸基質親和
性（ミカエリス定数、Ｋｍ値）を以下に示す手法により
測定した。また、乳酸菌由来のＬ−乳酸脱水素酵素の対
ピルビン酸基質親和性との比較を行った。なお、対ピル
ビン酸基質親和性（Ｋｍ値）の測定においては、最初
に、精製されたＬ−乳酸脱水素酵素にピルビン酸、及び
ＮＡＤＨ、ＦＢＰを添加して酵素反応を行い、ＮＡＤＨ
の減少率を分光光度計（Ubest-55、日本分光）ABS：340
nmにて測定し、各Ｌ−乳酸脱水素酵素活性を求めた。次
に、各ピルビン酸濃度におけるＬ−乳酸脱水素酵素活性
の値をもとに、ピルピン酸飽和曲線及び各逆数から算出
されるLineweaver-Burkプロットを作製し、Ｌ−乳酸脱
脂水素酵素における対ピルビン酸基質親和性（ミカエリ
ス定数、Ｋｍ値）を求めた。
【００６５】精製されたウシ筋肉由来Ｌ−乳酸脱水素酵
素０．０５μｇ（ＳＩＧＭＡ社製）にｐＨ７．０に調製
した５０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ナラカイ）、０．１５ｍ
ＭＮＡＤＨ（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ ＦＢＰ（ＳＩ
ＧＭＡ）を加えた溶液を、３７℃下で２〜３分保温し
た。次に、濃度調製した０．０１〜１００ｍＭのピルビ
ン酸（和光純薬）を加え、すばやく混和後、分光光度計
（Ubset-55、日本分光）にセットし、ABS：340nmにおけ
る１分間の吸光度変化を求めた。なお、ＬＤＨ活性は、
以下の式（数５）により求めた。
素０．０５μｇ（ＳＩＧＭＡ社製）にｐＨ７．０に調製
した５０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ナラカイ）、０．１５ｍ
ＭＮＡＤＨ（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ ＦＢＰ（ＳＩ
ＧＭＡ）を加えた溶液を、３７℃下で２〜３分保温し
た。次に、濃度調製した０．０１〜１００ｍＭのピルビ
ン酸（和光純薬）を加え、すばやく混和後、分光光度計
（Ubset-55、日本分光）にセットし、ABS：340nmにおけ
る１分間の吸光度変化を求めた。なお、ＬＤＨ活性は、
以下の式（数５）により求めた。
【数５】
なお、本手法は、1. Minowa T., Iwata S., Sakai H.,
and Ohta T. Sequenceand characteristics of the Bif
idobacterium longum gene encoding L-lactate dehydr
ogenase and primary struture of the enzyme; a new
feature of the allosteric site. Gene, 1989,Vol.8
5, 161-168及び2. SIGMA、LACTATE DEHYDROGENASE(LDH/
LD)付属の取り扱い説明書に記載の方法に準じて行っ
た。
and Ohta T. Sequenceand characteristics of the Bif
idobacterium longum gene encoding L-lactate dehydr
ogenase and primary struture of the enzyme; a new
feature of the allosteric site. Gene, 1989,Vol.8
5, 161-168及び2. SIGMA、LACTATE DEHYDROGENASE(LDH/
LD)付属の取り扱い説明書に記載の方法に準じて行っ
た。
【００６６】得られたＬＤＨ活性をもとに、縦軸に[Ｖ]
＝ＬＤＨ酵素活性（Ｕ／ｍｇ）、横軸に[Ｓ]=ピルビン
酸濃度（ｍＭ）で示したピルビン酸飽和曲線を作成し
た。このグラフを図１２に示す。さらに、縦軸に１／
[Ｖ]、横軸に１／[Ｓ]と、各値の逆数から算出されるLi
neweaver-Burkプロットを作製した。本酵素についての
本プロットを図１３に示す。Lineweaver-Burkプロット
における１／[Ｖ]軸との交点が１／Ｖmax、１／[Ｓ]軸
との交点が−１／Ｋｍとなることを利用して、対ピルビ
ン酸濃度基質親和性（Ｋｍ値）を算出した。
＝ＬＤＨ酵素活性（Ｕ／ｍｇ）、横軸に[Ｓ]=ピルビン
酸濃度（ｍＭ）で示したピルビン酸飽和曲線を作成し
た。このグラフを図１２に示す。さらに、縦軸に１／
[Ｖ]、横軸に１／[Ｓ]と、各値の逆数から算出されるLi
neweaver-Burkプロットを作製した。本酵素についての
本プロットを図１３に示す。Lineweaver-Burkプロット
における１／[Ｖ]軸との交点が１／Ｖmax、１／[Ｓ]軸
との交点が−１／Ｋｍとなることを利用して、対ピルビ
ン酸濃度基質親和性（Ｋｍ値）を算出した。
【００６７】各Lineweaver-Burkプロットにより、ウシ
筋肉由来のＬ−乳酸脱水素酵素の対ピルビン酸基質親和
能は、０．１ｍＭであった。なお、本発明者らは、乳酸
菌ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＬ−乳酸脱水
素酵素の対ピルビン酸基質親和性は１．０ｍＭであると
いう知見を有している。
筋肉由来のＬ−乳酸脱水素酵素の対ピルビン酸基質親和
能は、０．１ｍＭであった。なお、本発明者らは、乳酸
菌ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＬ−乳酸脱水
素酵素の対ピルビン酸基質親和性は１．０ｍＭであると
いう知見を有している。
【００６８】ここで、乳酸菌ビフィドバクテリウム・ロ
ンガム（Bifidobacterium longum）由来のＬ−乳酸脱水
素酵素をコードするＤＮＡを宿主に導入して高発現させ
た組換え酵母におけるＬ−乳酸とアルコールの生産量を
以下のとおりであった（発酵条件は、グルコース１５％
を含むＹＰＤ培地中での３０℃、３日間であった）。な
お、当該乳酸菌由来の組換え酵母を得るためのベクター
（ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ；７．１１ｋｂ）及
びその構築工程を図１４及び図１５に示す。なお、当該
形質転換酵母においては、当該遺伝子は、宿主染色体上
のＰＤＣ遺伝子座にノックインによりＰＤＣ１プロモー
ターにより制御可能に導入された。なお、この形質転換
酵母は、当該Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子が宿主染色体上
の一対のＰＤＣ遺伝子座にそれぞれ導入された２コピー
体であることが確認されている。なお、当該ベクターの
構築及び酵母の形質転換の操作は、図１４及び図１５に
示す事項以外は、実施例３及び４に準じて行った。
ンガム（Bifidobacterium longum）由来のＬ−乳酸脱水
素酵素をコードするＤＮＡを宿主に導入して高発現させ
た組換え酵母におけるＬ−乳酸とアルコールの生産量を
以下のとおりであった（発酵条件は、グルコース１５％
を含むＹＰＤ培地中での３０℃、３日間であった）。な
お、当該乳酸菌由来の組換え酵母を得るためのベクター
（ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ；７．１１ｋｂ）及
びその構築工程を図１４及び図１５に示す。なお、当該
形質転換酵母においては、当該遺伝子は、宿主染色体上
のＰＤＣ遺伝子座にノックインによりＰＤＣ１プロモー
ターにより制御可能に導入された。なお、この形質転換
酵母は、当該Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子が宿主染色体上
の一対のＰＤＣ遺伝子座にそれぞれ導入された２コピー
体であることが確認されている。なお、当該ベクターの
構築及び酵母の形質転換の操作は、図１４及び図１５に
示す事項以外は、実施例３及び４に準じて行った。
【００６９】表３に示すように、この結果と実施例５に
おいて試験したウシ筋肉由来のＬ−乳酸脱水素酵素によ
る結果と対比すると、ウシ筋肉由来ＬＤＨ導入酵母によ
るＬ−乳酸生産量は、乳酸菌由来ＬＤＨ導入酵母の約２
倍であった。
おいて試験したウシ筋肉由来のＬ−乳酸脱水素酵素によ
る結果と対比すると、ウシ筋肉由来ＬＤＨ導入酵母によ
るＬ−乳酸生産量は、乳酸菌由来ＬＤＨ導入酵母の約２
倍であった。
【表３】
【００７０】（実施例７：酵母由来のピルビン酸脱炭酸
酵素の対ピルビン酸基質親和性（ミカエリス定数、Ｋｍ
値）の測定 酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素活性及び対ピルビン酸
基質親和性（Ｋｍ値）の測定においては、最初に、精製
されたピルビン酸脱炭酸酵素にピルビン酸、及びＮＡＤ
Ｈ、チアミンを添加して酵素反応を行い、ＮＡＤＨの減
少率を分光光度計（Ubest-55、日本分光）ABS：340nmに
て測定し、酵母由来ピルビン酸脱炭酸酵素活性を求め
た。次に、各ピルビン酸濃度におけるピルビン酸脱炭酸
酵素活性の値をもとに、ピルピン酸飽和曲線及び各逆数
から算出されるLineweaver-Burkプロットを作製し、ピ
ルビン酸脱炭酸酵素における対ピルビン酸基質親和性
（ミカエリス定数、Ｋｍ値）を求めた。
酵素の対ピルビン酸基質親和性（ミカエリス定数、Ｋｍ
値）の測定 酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素活性及び対ピルビン酸
基質親和性（Ｋｍ値）の測定においては、最初に、精製
されたピルビン酸脱炭酸酵素にピルビン酸、及びＮＡＤ
Ｈ、チアミンを添加して酵素反応を行い、ＮＡＤＨの減
少率を分光光度計（Ubest-55、日本分光）ABS：340nmに
て測定し、酵母由来ピルビン酸脱炭酸酵素活性を求め
た。次に、各ピルビン酸濃度におけるピルビン酸脱炭酸
酵素活性の値をもとに、ピルピン酸飽和曲線及び各逆数
から算出されるLineweaver-Burkプロットを作製し、ピ
ルビン酸脱炭酸酵素における対ピルビン酸基質親和性
（ミカエリス定数、Ｋｍ値）を求めた。
【００７１】精製された酵母由来ピルビン酸脱炭酸酵素
０．０５μｇ（ＳＩＧＭＡ社製）にｐＨ７．０に調製し
た３４ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（和光純薬）、
０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ（ＳＩＧＭＡ社製）、０．２ｍ
Ｍ Tiamine Pyrophosphate (SIGMA)を加えた溶液を３
７℃下で２〜３分保温した。次に、濃度調製した０．０
１〜１００ｍＭのピルビン酸（和光純薬）を加え、すば
やく混和後、分光光度計（Ubset-55、日本分光）にセッ
トし、ABS：340nmにおける１分間の吸光度変化を求め
た。なお、ＰＤＣ活性は、以下の式（数６）により求め
た。
０．０５μｇ（ＳＩＧＭＡ社製）にｐＨ７．０に調製し
た３４ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（和光純薬）、
０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ（ＳＩＧＭＡ社製）、０．２ｍ
Ｍ Tiamine Pyrophosphate (SIGMA)を加えた溶液を３
７℃下で２〜３分保温した。次に、濃度調製した０．０
１〜１００ｍＭのピルビン酸（和光純薬）を加え、すば
やく混和後、分光光度計（Ubset-55、日本分光）にセッ
トし、ABS：340nmにおける１分間の吸光度変化を求め
た。なお、ＰＤＣ活性は、以下の式（数６）により求め
た。
【数６】
なお、本手法は、Pronk, J. T., Steensma, H. Y. and
Dijken, J.P. Pyruvate, Metabolism in Sccharomyces
serevisiae. YEAST, 1996, Vol.12, 1607-1633に記載
される方法に準じた。
Dijken, J.P. Pyruvate, Metabolism in Sccharomyces
serevisiae. YEAST, 1996, Vol.12, 1607-1633に記載
される方法に準じた。
【００７２】得られたＰＤＣ活性をもとに、縦軸に[Ｖ]
＝ＰＤＣ酵素活性（Ｕ／ｍｇ）、横軸に[Ｓ]=ピルビン
酸濃度（ｍＭ）で示したピルビン酸飽和曲線を作成し
た。本グラフを図１６に示す。さらに、縦軸に１／
[Ｖ]、横軸に１／[Ｓ]と、各値の逆数から算出されるLi
neweaver-Burkプロットを作製した。これらのグラフを
図１７に示す。Lineweaver-Burkプロットにおける１／
[Ｖ]軸との交点が１／Ｖmax、１／[Ｓ]軸との交点が−
１／Ｋｍとなることを利用して、対ピルビン酸濃度基質
親和能（Ｋｍ値）を算出した。
＝ＰＤＣ酵素活性（Ｕ／ｍｇ）、横軸に[Ｓ]=ピルビン
酸濃度（ｍＭ）で示したピルビン酸飽和曲線を作成し
た。本グラフを図１６に示す。さらに、縦軸に１／
[Ｖ]、横軸に１／[Ｓ]と、各値の逆数から算出されるLi
neweaver-Burkプロットを作製した。これらのグラフを
図１７に示す。Lineweaver-Burkプロットにおける１／
[Ｖ]軸との交点が１／Ｖmax、１／[Ｓ]軸との交点が−
１／Ｋｍとなることを利用して、対ピルビン酸濃度基質
親和能（Ｋｍ値）を算出した。
【００７３】Lineweaver-Burkプロットから、酵母由来
のピルビン酸脱炭酸酵素の対ピルビン酸Ｋｍ値は、０．
３４６ｍＭであった。実施例６におけるウシ由来Ｌ−乳
酸脱水素酵素の対ピルビン酸Ｋｍ値０．１ｍＭと比較す
ると、３．４６倍高かった。換言すれば、ウシ由来Ｌ−
乳酸脱水素酵素は、酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素よ
りも３．４６倍高い基質親和性を有していることがわか
った。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来Ｌ−
乳酸脱水素酵素の対ピルビン酸Ｋｍ値１．０ｍＭと比較
すると、０．３４６倍であった。換言すれば、当該乳酸
菌由来のＬ−乳酸脱水素酵素は、酵母由来ピルビン酸脱
炭酸酵素の０．３４６倍の基質親和性しか有していない
ことがわかった。
のピルビン酸脱炭酸酵素の対ピルビン酸Ｋｍ値は、０．
３４６ｍＭであった。実施例６におけるウシ由来Ｌ−乳
酸脱水素酵素の対ピルビン酸Ｋｍ値０．１ｍＭと比較す
ると、３．４６倍高かった。換言すれば、ウシ由来Ｌ−
乳酸脱水素酵素は、酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素よ
りも３．４６倍高い基質親和性を有していることがわか
った。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来Ｌ−
乳酸脱水素酵素の対ピルビン酸Ｋｍ値１．０ｍＭと比較
すると、０．３４６倍であった。換言すれば、当該乳酸
菌由来のＬ−乳酸脱水素酵素は、酵母由来ピルビン酸脱
炭酸酵素の０．３４６倍の基質親和性しか有していない
ことがわかった。
【００７４】
【発明の効果】本発明によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素
遺伝子を有する宿主生物中でエタノール生産を制御し乳
酸を安定的に大量生産させるための技術を提供すること
ができる。
遺伝子を有する宿主生物中でエタノール生産を制御し乳
酸を安定的に大量生産させるための技術を提供すること
ができる。
【００７５】「配列表フリーテキスト」
配列番号３：Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする修飾DNA
配列番号４：Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする修飾DNA
配列番号５〜３９：プライマー
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho
Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
<120> Method of Controling Ethanol production
<130> 030083
<140>
<141>
<150> JP2002-65880
<151> 2002-03-11
<160> 39
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 332
<212> PRT
<213> Bovine
<400> 1
Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu
1 5 10 15
His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly
20 25 30
Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val
35 40 45
Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp
50 55 60
Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly
65 70 75 80
Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala
85 90 95
Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg
100 105 110
Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser
115 120 125
Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr
130 135 140
Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly
145 150 155 160
Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu
165 170 175
Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu
180 185 190
His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly
195 200 205
Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys
210 215 220
Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu
225 230 235 240
Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val
245 250 255
Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro
260 265 270
Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe
275 280 285
Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val
290 295 300
Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala
305 310 315 320
Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe
325 330
<210> 2
<211> 971
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
aagggtagcc tccccataac ataaactcaa taaaatatat agtcttcaac ttgaaaaagg 60
aacaagctca tgcaaagagg tggtacccgc acgccgaaat gcatgcaagt aacctattca 120
aagtaatatc tcatacatgt ttcatgaggg taacaacatg cgactgggtg agcatatgct 180
ccgctgatgt gatgtgcaag ataaacaagc aagacggaaa ctaacttctt cttcatgtaa 240
taaacacacc ccgcgtttat ttacctatct ttaaacttca acaccttata tcataactaa 300
tatttcttga gataagcaca ctgcacccat accttcctta aaagcgtagc ttccagtttt 360
tggtggttcc ggcttccttc ccgattccgc ccgctaaacg catatttttg ttgcctggtg 420
gcatttgcaa aatgcataac ctatgcattt aaaagattat gtatgctctt ctgacttttc 480
gtgtgatgaa gctcgtggaa aaaatgaata atttatgaat ttgagaacaa ttctgtgttg 540
ttacggtatt ttactatgga ataattaatc aattgaggat tttatgcaaa tatcgtttga 600
atatttttcc gaccctttga gtacttttct tcataattgc ataatattgt ccgctgcccg 660
tttttctgtt agacggtgtc ttgatctact tgctatcgtt caacaccacc ttattttcta 720
actatttttt ttttagctca tttgaatcag cttatggtga tggcacattt ttgcataaac 780
ctagctgtcc tcgttgaaca taggaaaaaa aaatatatta acaaggctct ttcactctcc 840
ttgcaatcag atttgggttt gttcccttta ttttcatatt tcttgtcata ttcctttctc 900
aattattatt ttctactcat aaccacacgc aaaataacac agtcaaatca atcaaagatc 960
ccccaattct c 971
<210> 3
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Modified DNA
coding lactate dehydrogenase
<400> 3
atggctactt tgaaagatca attgattcaa aatttgttga aagaagaaca tgttccacaa 60
aataaaatta ctattgttgg tgttggtgct gttggtatgg cttgtgctat ttctattttg 120
atgaaagatt tggctgatga agttgctttg gttgatgtta tggaagataa attgaaaggt 180
gaaatgatgg atttgcaaca tggttctttg tttttgagaa ctccaaaaat tgtttctggt 240
aaagattata atgttactgc taattctaga ttggttatta ttactgctgg tgctagacaa 300
caagaaggtg aatctagatt gaatttggtt caaagaaatg ttaatatttt taaatttatt 360
attccaaata ttgttaaata ttctccaaat tgtaaattgt tggttgtttc taatccagtt 420
gatattttga cttatgttgc ttggaaaatt tctggttttc caaaaaatag agttattggt 480
tctggttgta atttggattc tgctagattt agatatttga tgggtgaaag attgggtgtt 540
catccattgt cttgtcatgg ttggattttg ggtgaacatg gtgattcttc tgttccagtt 600
tggtctggtg ttaatgttgc tggtgtttct ttgaaaaatt tgcatccaga attgggtact 660
gatgctgata aagaacaatg gaaagctgtt cataaacaag ttgttgattc tgcttatgaa 720
gttattaaat tgaaaggtta tacttcttgg gctattggtt tgtctgttgc tgatttggct 780
gaatctatta tgaaaaattt gagaagagtt catccaattt ctactatgat taaaggtttg 840
tatggtatta aagaagatgt ttttttgtct gttccatgta ttttgggtca aaatggtatt 900
tctgatgttg ttaaagttac tttgactcat gaagaagaag cttgtttgaa aaaatctgct 960
gatactttgt ggggtattca aaaagaattg caattttaa 999
<210> 4
<211> 1052
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Modified DNA
coding lactate dehydrogenase
<400> 4
acagaattca caatggctac tttgaaagat caattgattc aaaatttgtt gaaagaagaa 60
catgttccac aaaataaaat tactattgtt ggtgttggtg ctgttggtat ggcttgtgct 120
atttctattt tgatgaaaga tttggctgat gaagttgctt tggttgatgt tatggaagat 180
aaattgaaag gtgaaatgat ggatttgcaa catggttctt tgtttttgag aactccaaaa 240
attgtttctg gtaaagatta taatgttact gctaattcta gattggttat tattactgct 300
ggtgctagac aacaagaagg tgaatctaga ttgaatttgg ttcaaagaaa tgttaatatt 360
tttaaattta ttattccaaa tattgttaaa tattctccaa attgtaaatt gttggttgtt 420
tctaatccag ttgatatttt gacttatgtt gcttggaaaa tttctggttt tccaaaaaat 480
agagttattg gttctggttg taatttggat tctgctagat ttagatattt gatgggtgaa 540
agattgggtg ttcatccatt gtcttgtcat ggttggattt tgggtgaaca tggtgattct 600
tctgttccag tttggtctgg tgttaatgtt gctggtgttt ctttgaaaaa tttgcatcca 660
gaattgggta ctgatgctga taaagaacaa tggaaagctg ttcataaaca agttgttgat 720
tctgcttatg aagttattaa attgaaaggt tatacttctt gggctattgg tttgtctgtt 780
gctgatttgg ctgaatctat tatgaaaaat ttgagaagag ttcatccaat ttctactatg 840
attaaaggtt tgtatggtat taaagaagat gtttttttgt ctgttccatg tattttgggt 900
caaaatggta tttctgatgt tgttaaagtt actttgactc atgaagaaga agcttgtttg 960
aaaaaatctg ctgatacttt gtggggtatt caaaaagaat tgcaatttta ataactcgag 1020
cttggttgaa cacgttgcca aggcttaagt ga 1052
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 5
acagaattca caatggctac tttgaaagat caattgattc aaaatttgtt gaaagaagaa 60
catgttccac aaaataaaat tactattgtt ggtgttggtg 100
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 6
acagaattca caatggctac 20
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 7
atgataacaa ccacaaccac gacaaccata ccgaacacga taaagataaa actactttct 60
aaaccgacta cttcaacgaa accaactaca ataccttcta 100
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 8
atgataacaa ccacaaccac 20
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 9
tggttgatgt tatggaagat aaattgaaag gtgaaatgat ggatttgcaa catggttctt 60
tgtttttgag aactccaaaa attgtttctg gtaaagatta 100
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 10
tggttgatgt tatggaagat 20
<210> 11
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 11
taacaaagac catttctaat attacaatga cgattaagat ctaaccaata ataatgacga 60
ccacgatctg ttgttcttcc acttagatct aacttaaacc 100
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 12
taacaaagac catttctaat a 21
<210> 13
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 13
tgaatctaga ttgaatttgg ttcaaagaaa tgttaatatt tttaaattta ttattccaaa 60
tattgttaaa tattctccaa attgtaaatt gttggttgtt 100
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 14
tgaatctaga ttgaatttgg t 21
<210> 15
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 15
taacatttaa caaccaacaa agattaggtc aactataaaa ctgaatacaa cgaacctttt 60
aaagaccaaa aggtttttta tctcaataac caagaccaac 100
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 16
taacatttaa caaccaacaa a 21
<210> 17
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 17
agagttattg gttctggttg taatttggat tctgctagat ttagatattt gatgggtgaa 60
agattgggtg ttcatccatt gtcttgtcat ggttggattt 100
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 18
agagttattg gttctggttg t 21
<210> 19
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 19
cagaacagta ccaacctaaa acccacttgt accactaaga agacaaggtc aaaccagacc 60
acaattacaa cgaccacaaa gaaacttttt aaacgtaggt 100
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 20
cagaacagta ccaacctaaa a 21
<210> 21
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 21
ctttgaaaaa tttgcatcca gaattgggta ctgatgctga taaagaacaa tggaaagctg 60
ttcataaaca agttgttgat tctgcttatg aagttattaa 100
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 22
ctttgaaaaa tttgcatcca g 21
<210> 23
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 23
agacgaatac ttcaataatt taactttcca atatgaagaa cccgataacc aaacagacaa 60
cgactaaacc gacttagata atacttttta aactcttctc 100
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 24
agacgaatac ttcaataatt t 21
<210> 25
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 25
tatgaaaaat ttgagaagag ttcatccaat ttctactatg attaaaggtt tgtatggtat 60
taaagaagat gtttttttgt ctgttccatg tattttgggt 100
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 26
atgaaaaatt tgagaagagt 20
<210> 27
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 27
gacaaggtac ataaaaccca gttttaccat aaagactaca acaatttcaa tgaaactgag 60
tacttcttct tcgaacaaac ttttttagac gactatgaaa 100
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 28
gacaaggtac ataaaaccca g 21
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 29
aaaaaatctg ctgatacttt gtggggtatt caaaaagaat tgcaatttta ataactcgag 60
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 30
aaaaaatctg ctgatacttt g 21
<210> 31
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 31
acgttaaaat tattgagctc gaaccaactt gtgcaacggt tccgaattca ct 52
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 32
acgttaaaat tattgagctc g 21
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 33
atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c 31
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 34
atatatgaat tctttgattg atttgactgt g 31
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 35
atatatctcg aggccagcta acttcttggt cgac 34
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 36
atatatgaat tctttgattg atttgactgt g 31
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 37
tggttgatgt tatggaagat 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 38
gacaaggtac ataaaaccca g 21
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 39
gtaataaaca caccccgcg 19
【図１】サッカロマイセス・セレビシエにおけるコドン
用法と使用頻度を示す図である。
用法と使用頻度を示す図である。
【図２】ウシ由来のＬＤＨの塩基配列とこれを改変設計
した塩基配列とのホモロジー解析結果を示す図である。
上段がウシ由来のＬＤＨ塩基配列であり、下段が改変塩
基配列であり、改変塩基配列においてウシ由来の塩基配
列と異なる塩基が記号（Ａ，Ｔ，ＣあるいはＧ）で記載
されている。
した塩基配列とのホモロジー解析結果を示す図である。
上段がウシ由来のＬＤＨ塩基配列であり、下段が改変塩
基配列であり、改変塩基配列においてウシ由来の塩基配
列と異なる塩基が記号（Ａ，Ｔ，ＣあるいはＧ）で記載
されている。
【図３】実施例１で用いたＰＣＲによる長鎖ＤＮＡ合成
に使用したプライマー構成と、合成ステップ（ステップ
１〜４）を示す図である。
に使用したプライマー構成と、合成ステップ（ステップ
１〜４）を示す図である。
【図４】構築されたベクターｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−Ｌ
ＤＨＫＣＢのプラスミドマップを示す図である。
ＤＨＫＣＢのプラスミドマップを示す図である。
【図５】図４に示すベクターの構築工程の一部を示す図
である。
である。
【図６】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築工程の一
部を示す図である。
部を示す図である。
【図７】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築工程の一
部を示す図である。
部を示す図である。
【図８】図５に示すベクターの構築工程の一部（最終工
程）を示す図である。
程）を示す図である。
【図９】実施例において得られた形質転換体における染
色体ＤＮＡ上のターゲット部位の構造変化を示す図であ
る。
色体ＤＮＡ上のターゲット部位の構造変化を示す図であ
る。
【図１０】実施例における乳酸生産量とエタノールを示
す図である。
す図である。
【図１１】実施例における乳酸生産量とエタノール生産
量との経緯を示す図である。
量との経緯を示す図である。
【図１２】ウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素のピルビン酸
飽和曲線を示す図である。
飽和曲線を示す図である。
【図１３】ウシ由来のＬ−乳酸脱水素酵素のLineweaver
-Burkプロットを示す図である。
-Burkプロットを示す図である。
【図１４】乳酸菌Bifidobacterium longum由来のＬ−乳
酸脱水素酵素をコードするＤＮＡセグメントを有するを
ベクター（ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ；７．１１
ｋｂ）の構築工程の一部を示す図である。
酸脱水素酵素をコードするＤＮＡセグメントを有するを
ベクター（ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ；７．１１
ｋｂ）の構築工程の一部を示す図である。
【図１５】乳酸菌Bifidobacterium longum由来のＬ−乳
酸脱水素酵素をコードするＤＮＡセグメントを有するを
ベクター（ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ；７．１１
ｋｂ）の構築工程の一部を示す図であって、図１４に示
す工程の後段の工程を示す図である。
酸脱水素酵素をコードするＤＮＡセグメントを有するを
ベクター（ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ；７．１１
ｋｂ）の構築工程の一部を示す図であって、図１４に示
す工程の後段の工程を示す図である。
【図１６】酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素のピルビン
酸飽和曲線を示す図である。
酸飽和曲線を示す図である。
【図１７】酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素のLineweav
er-Burkプロットを示す図である。
er-Burkプロットを示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 平井 正名
愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番
地の１ 株式会社豊田中央研究所内
(72)発明者 今枝 孝夫
愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番
地の１ 株式会社豊田中央研究所内
(72)発明者 宮崎 力
愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番
地の１ 株式会社豊田中央研究所内
(72)発明者 徳弘 健郎
愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番
地の１ 株式会社豊田中央研究所内
(72)発明者 齋藤 聡志
愛知県豊田市トヨタ町一番地 トヨタ自動
車株式会社内
(72)発明者 早乙女 理
愛知県豊田市トヨタ町一番地 トヨタ自動
車株式会社内
(72)発明者 保谷 典子
愛知県豊田市トヨタ町一番地 トヨタ自動
車株式会社内
(72)発明者 松尾 康生
愛知県豊田市トヨタ町一番地 トヨタ自動
車株式会社内
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA02 DA12 EA04
GA11 GA19
4B064 AD33 CA06 CA19 CC24 CD09
DA16
4B065 AA21Y AA26X AA80X AA90Y
AB01 AC14 BA02 BB15 BC03
CA10
Claims (13)
- 【請求項１】 宿主生物に内在するピルビン酸脱炭酸酵
素の対ピルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれを超
える対ピルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱水素
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入
されている形質転換体。 - 【請求項２】 前記外来タンパク質をコードするＤＮＡ
は、宿主染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロ
モーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プ
ロモーターのホモログによって制御可能に導入されてい
る、請求項１記載の形質転換体。 - 【請求項３】前記宿主生物は、サッカロマイセス属であ
る、請求項１または２に記載の形質転換体。 - 【請求項４】前記宿主生物は、サッカロマイセス・セレ
ビシエである、請求項１または２に記載の形質転換体。 - 【請求項５】前記外来タンパク質は、ウシ由来の乳酸脱
水素酵素あるいはそのホモログである、請求項１〜４の
いずれかに記載の形質転換体。 - 【請求項６】 宿主生物に内在するピルビン酸脱炭酸酵
素の対ピルビン酸基質親和性と同等かあるいはそれを超
える対ピルビン酸基質親和性を備える外来の乳酸脱水素
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入
されており、 前記外来タンパク質をコードするＤＮＡは、宿主染色体
上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターあるい
は当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホ
モログによって制御可能に導入されている形質転換体。 - 【請求項７】前記宿主染色体上のプロモーターは、ピル
ビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターである、請求項
６記載の形質転換体。 - 【請求項８】前記宿主生物は、サッカロマイセス属であ
る、請求項６または７に記載の形質転換体。 - 【請求項９】前記宿主生物は、サッカロマイセス・セレ
ビシエである、請求項６または７に記載の形質転換体。 - 【請求項１０】前記外来タンパク質は、ウシ由来の乳酸
脱水素酵素あるいはそのホモログである、請求項６〜９
のいずれかに記載の形質転換体。 - 【請求項１１】ウシ由来の乳酸脱水素酵素あるいはその
ホモログをコードするＤＮＡが、サッカロマイセス属の
宿主染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモ
ーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロ
モーターのホモログによって制御可能に導入されている
形質転換体。 - 【請求項１２】前記宿主は、サッカロマイセス・セレビ
シエである、請求項１１記載の形質転換体。 - 【請求項１３】請求項１〜１２のいずれかに記載の形質
転換体を培養する工程と、 前記工程で得られる培養物から乳酸を分離する工程、と
を備える、乳酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003065349A JP2003334092A (ja) | 2002-03-11 | 2003-03-11 | エタノール生産制御方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002065880 | 2002-03-11 | ||
| JP2002-65880 | 2002-03-11 | ||
| JP2003065349A JP2003334092A (ja) | 2002-03-11 | 2003-03-11 | エタノール生産制御方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003334092A true JP2003334092A (ja) | 2003-11-25 |
Family
ID=29713995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003065349A Pending JP2003334092A (ja) | 2002-03-11 | 2003-03-11 | エタノール生産制御方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003334092A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006020602A (ja) * | 2004-07-09 | 2006-01-26 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 乳酸生産方法 |
| US7964382B2 (en) | 2003-05-22 | 2011-06-21 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | DNA encoding a protein having D-lactate dehydrogenase activity and uses thereof |
-
2003
- 2003-03-11 JP JP2003065349A patent/JP2003334092A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7964382B2 (en) | 2003-05-22 | 2011-06-21 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | DNA encoding a protein having D-lactate dehydrogenase activity and uses thereof |
| JP2006020602A (ja) * | 2004-07-09 | 2006-01-26 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 乳酸生産方法 |
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