JP5800795B2 - 発酵により高い量のグリコール酸を生産する方法 - Google Patents
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Description
−グリオキシレート経路のフラックス(flux)を増強し、
−グリオキシレートのグリコレートへの変換を増大させ、かつ
−グリコレートおよびその中間体であるグリオキシレートの代謝を低減する
ように遺伝的に改変されている。
−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ldhA)および/またはメチルグリオキサールシンターゼをコードする遺伝子(mgsA)の減衰、
−好気呼吸制御レギュレーター(arcA)の減衰、
−グリコレート輸送体タンパク質をコードする遺伝子glcA、lldPおよびyjcGの少なくとも1つの減衰
などのいくつかの改変をさらに含んでなる。
i)該微生物は、リンゴ酸シンターゼ(aceBおよびglcB)、グリオキシレートカルボリガーゼ(gcl)および2−ケト−3−デオキシグルコン酸6リン酸アルドラーゼ(eda)をコードする遺伝子を不活性化することによって、グリオキシレートをグリコレート以外の化合物へ代謝することができない、
ii)該微生物は遺伝子glcDEFGおよびaldAを減衰することによって、グリコレートを代謝することができない、
iii)グリオキシレート経路フラックスがicd、acek、pta、ackA、poxB、iclRまたはfadRの減衰および/またはaceAの過剰発現によって増大される、
iv)ycdWのような内在コード遺伝子を用いることによってグリオキシレートのグリコレートへの変換が増強される、
v)遺伝子pgi、udhAおよびeddの減衰によってNADPHのアベイラビリティが増大される、
のいずれかを可能とする改変が事前に導入されていた。
(a)本発明の組換え微生物を、単糖類、オリゴ糖類、多糖および単一炭素基質からなる群から選択される少なくとも1つの炭素源と接触させ、それにより、グリコレートを生産すること;場合により
(b)生産されたグリコール酸を少なくともグリコール酸二量体への重合工程を介して回収すること、および
(c)グリコール酸二量体、オリゴマーおよび/またはポリマーから脱重合によってグリコール酸を回収すること
を含んでなる方法も提供する。
−この遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性レベルを低下させる突然変異の導入、
−遺伝子の天然プロモーターの、低い発現をもたらす低強度プロモーターでの置換、
−対応するメッセンジャーRNAまたはタンパク質を脱安定化させるエレメントの使用、
−発現が必要とされない場合には、遺伝子の欠失
が挙げられる。
−遺伝子ldhAおよびmgsAの減衰
−遺伝子arcAの減衰
−グリコレートの膜輸送を減衰するための遺伝子glcA、lldPおよびyjcGの少なくとも1つの減衰
およびそれらの組合せ
の少なくとも1つを含むようにさらに遺伝的に操作された単一の組換えグラム陰性菌を用いて、発酵性炭素源を直接グリコール酸に生物変換する改良された方法を提供する。
−遺伝子ldhAおよびmgsAの減衰と遺伝子arcAの減衰;
−遺伝子ldhAおよびmgsAの減衰とグリコレートの膜輸の減衰;
−遺伝子arcAの減衰とグリコレートの膜輸送の減衰;
−遺伝子ldhAおよびmgsAの減衰と遺伝子arcAの減衰とグリコレートの膜輸送の減衰
が挙げられる。
−グリコレートの重要な前駆体であるグリオキシレートを消費する酵素をコードする遺伝子、すなわち、マレート酸シンターゼをコードするaceBおよびgclB遺伝子、グリオキシレートカルボリガーゼをコードするgcl、および2−ケト−3−デオキシグルコン酸6リン酸アルドラーゼをコードするedaの減衰による、グリコレートを生産する以外のグリオキシレート変換能力の低減。
−微生物が実質的にグリコレートを代謝することができないような改変。この結果は、グリコレートを消費する酵素をコードする遺伝子(グリコール酸オキシダーゼをコードするglcDEFGおよびグリコアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするaldA)の少なくとも1つの減衰によって達成することができる。遺伝子の減衰は、天然プロモーターを低強度プロモーターに置換することによるか、または対応するメッセンジャーRNAもしくはタンパク質を脱安定化するエレメントによって行うことができる。必要であれば、対応するDNA配列の欠失によって、遺伝子の完全な減衰も行うことができる。
i)酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(ICDH)の活性を低減すること、
ii)遺伝子の減衰による以下の酵素:
・pta遺伝子によりコードされているホスホトランスアセチラーゼ
・ackA遺伝子によりコードされている酢酸キナーゼ
・poxB遺伝子によりコードされているピルビン酸オキシダーゼ
の少なくとも1つの活性を低減すること、
iii)aceA遺伝子によりコードされている酵素イソクエン酸リアーゼの活性を増強すること、
iv)酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ/ホスファターゼAceKの活性を低減することによる
グリオキシル酸経路のフラックスの増強。
−反応を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子を発現させることによる、グリオキシレートのグリコレートへの変換を触媒する活性の増強。特に、NADPH依存性グリオキシル酸レダクターゼ酵素をコードする遺伝子は、好気条件下で、有毒なグリオキシル酸中間体を毒性の低い最終産物であるグリコレートに変換するために存在する。該遺伝子は、外来のものでも内在するものでもよく、染色体上でも、あるいは染色体外でも発現することができる。NADPH依存性グリオキシル酸レダクターゼをコードする遺伝子は、大腸MG1655のゲノムからycdWまたはyiaE遺伝子で取り出すことができる。好ましい実施形態では、該遺伝子の少なくとも1つの発現が増強される。必要であれば、高レベルのNADPH依存性グリオキシル酸レダクターゼ活性は、当業者に知られている組換えの方法によって導入され得るゲノム上の1コピーまたは数コピーを用いることによって、染色体に位置する遺伝子から取得することができる。染色体外遺伝子については、それらの複製起点および従って細胞内でのそれらのコピー数が異なる種々のタイプのプラスミドが使用可能である。それらは、厳格な複製の低コピー数プラスミド(pSC101、RK2)、低コピー数プラスミド(pACYC、pRSF1010)または高コピー数プラスミド(pSK bluescript II)に対応する、1〜5コピー、およそ20コピー、最高500コピーとして存在し得る。ycdWまたはyiaE遺伝子は、インデューサー分子によって誘発される必要があるまたはその必要がない強度の異なるプロモーターを用いて発現させることができる。例えば、プロモーターPtrc、Ptac、Plac、ラムダプロモーターcIまたは当業者に知られている他のプロモーターが挙げられる。遺伝子の発現は、対応するメッセンジャーRNA(Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64)またはタンパク質(例えば、GSTタグ、Amersham Biosciences)を安定化するエレメントによってもまた増強され得る。
−NADPH依存性グリオキシル酸レダクターゼに対するNADPHアベイラビリティの増強。この微生物の特徴の改変は、以下:グルコース−6−リン酸イソメラーゼをコードするpgi、可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードするudhAおよび6−ホスホグルコン酸デヒドレート活性をコードするeddの中から選択される少なくとも1つの遺伝子の減衰によって得ることができる。このような遺伝子改変がある場合には、グルコース−6−リン酸は総てペントースリン酸経路を介して解糖に入らなければならず、グルコース−6−リン酸が代謝されるたびに2つのNADPHが生産される。
(a)本発明の組換え生物を、グルコース、スクロース、単糖類(フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノースなど)、オリゴ糖類(ガラクトース、セロビオースなど)、多糖類(セルロースなど)、デンプンもしくはその誘導体、グリセロールおよび単一炭素基質からなる群から選択される少なくとも1つの炭素源と接触させ、それにより、グリオキシル酸を生産すること、
(b)場合により、該プロセスは細菌中または培地中においてグリコレートを濃縮する工程、ならびに発酵培養液および/またはバイオマスから、場合により最終産物中に一部または全量(0〜100%)残留するグリコール酸を単離する工程を含んでもよく、
場合により、該プロセスは工程(a)で生産されたグリコール酸を少なくともグリコール酸二量体への重合工程を通して回収する工程を含んでなってもよく、
(c)発酵培養液および/またはバイオマスから、場合により最終産物中に一部または全量残留するグリコール酸を、グリコール酸二量体、オリゴマーおよび/またはポリマーからの脱重合によって単離および回収すること
を含む方法を提供する。
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表1に示されたオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドpKD3由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドpKD4由来のカナマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたPCR産物をエレクトロポレーションによって、発現されるλ Red系(γ、β、exo)が相同組換えに極めて好都合であるプラスミドpKD46を担持するレシピエント株に導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表2に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。
クロラムフェニコールおよび/またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび/またはカナマイシン耐性カセットのFRT部位に作用するFLPレコンビナーゼを有するプラスミドpCP20をエレクトロポレーションによってこの株に導入した。42℃で連続培養を行った後、抗生物質耐性カセットの欠失を表2に示されるオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。
レシピエント大腸菌株における遺伝子を耐性カセット(カナマイシンまたはクロラムフェニコール)で置換することによる選択遺伝子の欠失を、P1ファージを用いた形質導入法によって行った。このプロトコールは、(i)一遺伝子欠失を有するドナー株でのファージライゼートの調製と(ii)このファージライゼートによるレシピエント株の形質導入の二段階であった。
10mlのLB+Cm30μg/ml+グルコース0.2%+CaCl2 5mMに、一遺伝子欠失を有するMG1655株の一晩培養物100μlを播種する。
振盪しながら37℃で30分間インキュベートする。
ドナー株MG1655で調製したP1ファージライゼート100μlを加える(およそ1×109ファージ/ml)。
37℃で3時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。
200μlのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
4500gで10分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
上清を無菌試験管に移し、200μlのクロロホルムを加える。
ライゼートを4℃で保存する。
LB培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物5mlを1500gで10分間遠心分離する。
細胞ペレットを2.5mlのMgSO4 10mM、CaCl2 5mMに懸濁させる。
対照試験管:細胞100μl
一遺伝子欠失を有するMG1655株のP1ファージ100μl
供試試験管:細胞100μl+一遺伝子欠失を有するMG1655株のP1ファージ100μl
振盪しながら30℃で30分間インキュベートする。
各試験間に1Mクエン酸ナトリウム100μlを加え、ボルテックスにかける。
1mlのLBを加える。
振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。
7000rpmで3分間遠心分離した後にLB+Cm30μg/mlのディッシュにプレーティングする。
37℃で一晩インキュベートする。
次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、欠失の挿入を、表2に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表1に示されたオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドloxP−cm−loxP(Gene Bridges)由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドloxP−PGK−gb2−neo−loxP(Gene Bridges)由来のネオマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した。次に、得られたPCR産物をエレクトロポレーションによって、発現されるλ Red系(γ、β、exo)が相同組換えに極めて好都合であるプラスミドpKD46を担持するレシピエント株に導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表2に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。
クロラムフェニコールおよび/またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび/またはカナマイシン耐性カセットのCre−LOX部位に作用するCreレコンビナーゼを有するプラスミドpJW168(Palmeros B. et al (2000), Gene 247:255-264)をエレクトロポレーションによってこの株に導入した。42℃で連続培養を行った後、抗生物質耐性カセットの欠失を表2に示されるオリゴヌクレオチドを用いたPCR分析によって確認した。
プラスミドpME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01(図2)の構築
プラスミドpME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01をプラスミドpME101−ycdW(特許出願PCT/EP2006/063046およびPCT/EP2007/055625に記載がある)およびプラスミドpJB137−aceAから3段階で構築した。
発酵によってグリコール酸を生産することができる株:MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101−ycdW−TT01−PaceA−aceA−TT01)の構築
大腸菌MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta株を、特許出願PCT/EP2006/063046およびPCT/EP2007/055625に示されている記載に従って構築した。
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株:MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA(pME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01)の構築
大腸菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pKD46)株において遺伝子ldhAを、表1に示されるオリゴ番号3および4を用いて行ったPCR産物による組換えによって不活性化した(プロトコール1参照)。得られた株は、MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA::Kmであり、これに最終段階でプラスミドpME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01(実施例1)を導入した。
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株:MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA(pME101−ycdW−TT01−PaceA−aceA−TT01)の築物
大腸菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta株において遺伝子mgsAを、プロトコール3に記載されているP1ファージによる形質導入法によって不活性化した。ドナー株MG1655 ΔmgsA::Kmは、MG1655(pKD46)株にPCR断片を導入することによって構築した。この構築に用いたオリゴヌクレオチドを表1に示す。この株を配列決定によって確認した。
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株:MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔarcA(pME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01)の構築
大腸菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta株において遺伝子arcAを、プロトコール3に記載されているP1ファージによる形質導入法によって不活性化した。ドナー株MG1655 ΔarcA::Kmは、MG1655(pKD46)株にPCR断片を導入することによって構築した。この構築に用いたオリゴヌクレオチドを表1に示す。この株を配列決定によって確認した。
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株:MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsA(pME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01)の構築
第一段階において、欠失ΔmgsA::Cmは、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta株へのファージ形質導入(プロトコール3)によって行い、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB株 ΔackA+pta ΔmgsA::Cm株を得た。ドナー株MG1655 ΔmgsA::Cmは、MG1655(pKD46)株にPCR断片を導入することによって構築した。この構築に用いたオリゴヌクレオチドを表1に示す。この株を配列決定によって確認した。
発酵によるグリコール酸生産を改良するための株:MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsA ΔarcA(pME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01)の構築
実施例6に記載されている株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhAへの形質導入によって、欠失ΔarcA::Kmを導入し、MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔarcA::Km株を得た。この形質導入実験に用いたドナー株MG1655 ΔarcA::Kmは実施例5に記載されている。
グリコレートを輸送することができない株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔglcA ΔlldP ΔyjcG(pME101−ycdW−TT01−PaceA−aceA−TT01)の構築
第一段階において、構築物ΔyjcG::Nm(Cre/Lox)を、PCR産物(プロトコール4参照)によって、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pKD46)株に導入し、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG::Nm株を得た。用いたオリゴヌクレオチドを表1に示す。得られた株を配列決定によって確認した。
ネオマイシン耐性カセットをプロトコール5に記載されている技術に従って除去し、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG株を得た。
ネオマイシン耐性カセットをプロトコール5に記載されている技術に従って除去し、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA株を得た。
発酵によるグリコール酸生産を改良し、かつ、グリコレートを輸送することができない株:MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsA ΔglcA ΔlldP ΔyjcG (pME101−ycdW−TT01−PaceA−aceA−TT01)の構築
第一段階において、構築物ΔyjcG::Nmを、PCR産物(プロトコール4)によって、実施例6に記載されているMG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA(pKD46)株に導入し、MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG::Nm株を得た。
エルレンマイヤーフラスコでのグリコール酸生産株の発酵
まず、株の性能を、40g/lのMOPSおよび10g/lのグルコースを添加し、pH6.8に調整した改変M9培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)を用いた250mlバッフルエルレンマイヤーフラスコ培養にて評価した。必要であれば、スペクチノマイシンを50mg/lの濃度で加えた。72時間前培養物を用いて、50ml培養物にOD600nmが約0.3となるまで接種した。培養物を30℃にて200rpmのシェーカー上で培養培地中のグルコースが消耗するまで維持した。培養の終了時に、分離用にBiorad HPX 97Hカラム、検出用に屈折計を用いたHPLCによって、グルコースおよびグリコール酸を分析した。
流加発酵槽でのグリコール酸生産株の発酵
上記の実施例に記載されている株を、流加プロトコールを用いる600ml発酵槽での生産条件下で評価した。
Claims (13)
- 炭素源を含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養すること、およびその培養培地からグリコール酸を回収すること、によるグリコール酸、その誘導体または前駆体の発酵生産方法であって、該改変微生物が、グリコール酸を生産するために遺伝的に改変されたグラム陰性菌であって、遺伝子mgsAの減衰および遺伝子ldhAの減衰をさらに含んでなる、方法。
- 初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、以下の改変:
−遺伝子arcAの減衰
−遺伝子glcA、lldPおよびyjcGの少なくとも1つの減衰
およびそれらの組合せ
の少なくとも1つをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、以下の改変:
−グリオキシレートのグリコレート以外の産物への変換の減衰(aceB、glcB、gcl、edaの減衰)
−実質的にグリコレートを代謝することができない(glcDEFG、aldAの減衰)−グリオキシレート経路フラックスの増大(icd、aceK、pta、ackA、poxB、iclRもしくはfadRの減衰および/またはaceAの過剰発現)
−グリオキシレートのグリコレートへの変換の増大(ycdWの過剰発現)
−NADPHのアベイラビリティの増大(pgi、udhA、eddの減衰)
の少なくとも1つを含んでなる、請求項1または2に記載の方法。 - 初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、遺伝子arcAの減衰をさらに含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 初めにグリコール酸を生産するために改変された微生物が、遺伝子glcA、lldPおよびyjcGの少なくとも1つの減衰をさらに含んでなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 3つの遺伝子glcA、lldPおよびyjcGが減衰された、請求項5に記載の方法。
- 炭素源が、以下:グルコース、スクロース、単糖もしくはオリゴ糖、デンプンもしくはその誘導体、またはグリセロールの少なくとも1つである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のグリコレートの発酵生産方法であって、以下の工程:
a)初めにグリコレートを生産するために改変された改変微生物の発酵、
b)細菌中または培地中におけるグリコレートの濃縮、および
c)発酵培養液および/またはバイオマスからの、場合により最終産物中に一部または全量(0〜100%)残留するグリコール酸の単離
を含んでなる、方法。 - グリコレートが、少なくともグリコレート二量体へ重合する工程を通して単離される、請求項8に記載の方法。
- グリコレートが、グリコレート二量体、オリゴマーおよび/またはポリマーからの脱重合によって回収される、請求項9に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項で定義される改変微生物。
- 腸内細菌科に属する、請求項11に記載の微生物。
- エシェリキア属に属する、請求項12に記載の微生物。
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