CN102365357A - 通过发酵产生大量乙醇酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过重组微生物将可发酵的碳源生物转化成为乙醇酸的改进方法，所述微生物携带新的遗传修饰如ΔldhA，ΔmgsA，ΔarcA和ΔlldP，ΔglcA，ΔyjcG和它们的组合，使生产的产率、效价和生产力更高。

Description

通过发酵产生大量乙醇酸的方法
发明领域
本发明涉及由携带新遗传修饰如ΔldhA，ΔmgsA，ΔarcA和ΔlldP，ΔglcA，ΔyjcG及其组合的重组微生物将可发酵碳源生物转化为乙醇酸的改进方法，所述修饰使微生物可以进行更高产率(yield)、效价(titer)和生产力的生产。
发明背景
乙醇酸(HOCH2COOH)是羧酸的α-羟基酸家族中最简单的成员。乙醇酸具有双重官能度，在非常小的分子上同时具有醇和中等强度的酸官能团。这导致了独特的化学属性以及典型的酸和醇化学。
乙醇酸使用羟基和羧酸基团与多价金属形成五元环复合物(螯合物)。这种金属离子复合能力在溶解坚硬的水垢和防止沉积中有用，特别是在酸清洁应用中，其中良好的清洗能力是关键的因素。它的性能使其在宽范围的消费和工业应用中成为理想材料，包括用于水井复原、皮革业、油气业、洗涤和纺织业，并且作为个人护理产品的成分。乙醇酸与有机醇和酸经过反应形成酯。低分子量的烷基乙醇酸酯具有不寻常的溶解性质，并可用作正丙醇和异丙醇、乙二胺、苯酚、m-甲酚、2-乙氧基乙酸乙酯(2-ethoxyethyl acetate)和乳酸乙酯和乳酸甲酯的替代物。更高分子量的烷基酯能用于个人护理产品配制物中。
乙醇酸还可以用来产生多种聚合材料，包括包含聚乙醇酸的热塑树脂。所述包含聚乙醇酸的树脂具有优异的阻气性质，并且此类包含聚乙醇酸的热塑树脂可以用于制成具有相同性质的包装材料(例如，饮料容器等)。聚酯聚合物在含水环境中以可控制的速率逐渐水解。这种性质使它们在生物医药应用中有用，如可溶解的缝合线，而且在需要酸的控制释放以降低pH的应用中有用。目前在美国每年消耗多于15000吨的乙醇酸。
由廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖生物产生乙醇酸，如图1所示，分别披露于WO 2007/140816和WO 2007/141316中，所述内容通过提述并入本文。这些应用中描述的微生物在不同水平进行了遗传工程改造：
-增强乙醛酸途径的流量，
-增加乙醛酸到乙醇酸的转化和，
-减少乙醇酸及其中间物乙醛酸的代谢。
修饰对于乙醇酸合成途径的终端反应或乙醇酸最接近的中间物具有直接影响。它们具有相同的目的，将碳流量定向于乙醇酸的生产并且防止其分解代谢。
乙醇酸的生物生产要求形成乙醛酸作为中间物，其通过由基因ycdW编码的NADPH依赖性氧化还原酶还原成乙醇酸(Nunez等，(2001)Biochemistry，354，707-715)。乙醛酸是乙醛酸循环的中间物，乙醛酸为TCA循环的支路(三羧酸循环和乙醛酸旁路，在Neidhardt，F.C.(主编)，R.Curtiss III，J.L.Ingraham，E.C.C.Lin，K.B.Low，B.Magasanik，W.S.Reznikoff，M.Riley，M.Schaechter，和H.E.Umbarger(编).1996.Escherichia coli and Salmonella：Cellular andMolecular Biology.American Society for Microbiology中综述)。在进入TCA循环之前，碳流量经过糖酵解，其中发生几个反应并且可以优化以改进期望化合物的生产。
糖酵解是十个反应的序列，其涉及十个中间化合物，将葡萄糖转化成为丙酮酸。中间物提供进入糖酵解的点并且还可为直接或间接有用的。例如，中间物磷酸二羟基丙酮(DHAP)是通过蛋白MgsA的乳酸的来源。这和通过乳酸脱氢酶LdhA将丙酮酸分子转化成为乳酸相同。这两种酶都消耗糖酵解途径的分子，即一部分碳流量，以产生乳酸，乳酸是不合意的副产物。在产生琥珀酸的过程中削弱基因ldhA，如在以高产率产生琥珀酸的大肠杆菌中或在瘤胃细菌菌株(WO 2008/0134051Al)中。相反，在合成乳酸的过程中过表达ldhA(US2007/116852A1)。对于mgsA也是如此，除其它遗传修饰外，将其缺失用于产生1，3-丙二醇(WO2004/033646A2)，但将其过表达用于合成1，2-丙二醇(WO2008/116852A1)。通过削弱这两种活性，可改进乙醇酸的生产，并且同时减少乳酸的合成。
用同样的方式，提高糖酵解和TCA流量、葡萄糖输入或糖酵解和TCA酶的催化活性的每种遗传修饰可以改进乙醇酸的生产。ArcA活性的削弱是这种突变之一。实际上，蛋白表现为与编码上述酶的基因的抑制有关。
Iuchi和Lin在1988年的文章(Iuchi和Lin，1988，PNAS；85：1888-1892)开始了对于Arc系统进行的全局调控的理解，文章描述了arcA基因的鉴定及其突变对于大肠杆菌中需氧代谢的影响。双组份信号转导系统ArcAB(需氧呼吸控制)在转录水平调节与能量代谢、运输、存活、分解代谢和细胞的氧化还原状态相关的100-150个操纵子的表达(Liu和DeWulf 2004，J Biol Chem，279：12588-12597；Lynch和Lin，1996 Responses to molecular oxygen；in Neidhardt FC，Curtiss III RJ，Ingraham L，LinECC，Low KB，Magasanik BW，Zeznikoff S，Riley M，Schaechter M，Umbarger HE(编)Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology，第2版.Washington，American Society for Microbiology，1996，vol 1，pp 1526-1538)。ArcAB信号转导对的主要功能是调节大肠杆菌中需氧到厌氧途径的转换。根据Shalel-Levanon和同事的工作可以获得对于需氧生活水平和全局调节发挥的调控之间的关联的进一步理解(Biotechnol.Bioeng.2005a；89：556-564和Biotechnol.Bioeng.2005b；92：147-159)。这些研究显示ArcA对TCA基因的抑制。对于在不同的氧可用性条件下ArcA对于大肠杆菌中葡萄糖分解代谢的影响的完整的生理学研究证实了这些结果。在ΔarcA突变体中并在微氧生活下观察到了几个变化；如呼吸增强，细胞色素-和d-末端氧化酶上的电子流分布改变，和胞内氧化还原状态的变化(Aleexeva等，2003，J.Bacteriol.185：204-209)。Perrenoud和Sauer在2005年的工作对于ArcAB调节提供了新见解，证明需氧和充分厌氧TCA循环流量的控制是由ArcA(独立于其同源传感激酶ArcB)进行(J.Bacteriol.2005，187：3171-3179)。
这使ArcA成为大肠杆菌中的全局调控子。在几项专利中描述了该基因的缺失，所述专利要求保护所需分子的需氧生活或厌氧生活生产。例如，ΔarcA改进需氧生活以及厌氧生活中琥珀酸和1，2-丙二醇的生产(US2006/0073577A1；WO2006/020663和WO2008/116848)。在味之素(Ajinomoto)的L-氨基酸如L-赖氨酸和L-谷氨酸生产(EP 1382686A1)和DuPont deNemours and Co.的1，3-丙二醇的生产(WO2004/033646)等专利中还披露了除其它遗传修饰外ArcA活性的降低。
在文献中表征了三个名为GlcA、LldP和YjcG的蛋白作为乙醇酸和乳酸的输入蛋白(Nunez，F.等，2001 Microbiology，147，1069-1077；Nunez，F.等，2002 Biochem.And Biophysical research communications 290，824-829；Gimenez，R.等，2003 J.of Bacteriol.185，21，6448-6455)。根据上述出版物，GlcA似乎对于乙醇酸更具有特异性，而LldP对于乳酸分子更具亲和力。其中三个乙醇酸通透酶都缺失的菌株完全不能输入外源的乙醇酸(Gimenez，R.等，2003 J.of Bacteriol.185，21，6448-6455)。产生乙醇酸的菌株中乙醇酸输入的削弱将改进细胞抗高浓度乙醇酸的能力并且因此改进生产的效价。
本发明要解决的问题是改善由廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖生物产生乙醇酸。本文描述了其它遗传修饰，特别是它们的组合，从而通过发酵获得乙醇酸生产的更高的产率和效价。
发明概述
本发明提供改进的方法，用于以高产率和效价将可发酵碳源直接生物转化为乙醇酸。
在本发明的一个方面，先前经过修饰以产生乙醇酸的重组微生物进一步包含几种修饰，如：
-编码乳酸脱氢酶(ldhA)和/或丙酮醛合成酶(mgsA)的基因的削弱，
-需氧呼吸控制调控子(arcA)的削弱，
-基因glcA、lldP和yjcG中至少一个基因的削弱，所述基因编码乙醇酸输入蛋白。
根据本发明，本方法中使用的微生物先前经过遗传工程改造以产生乙醇酸。之前向所述微生物导入了几种修饰，和特别是允许发生下述代谢变化的修饰：
i)通过失活编码苹果酸合成酶(aceB和glcB)、乙醛酸聚醛酶(gcl)和2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)的基因，使微生物不能将乙醛酸代谢成为乙醇酸之外的其它化合物，
ii)通过削弱基因glcDEFG和aldA，使微生物不能代谢乙醇酸，
iii)通过削弱icd、acek、pta、ackA、poxB、iclR或fadR和/或通过过表达aceA，增加乙醛酸途径流量，
iv)通过使用内源编码基因如ycdW而增加乙醛酸到乙醇酸的转化，
v)通过削弱基因pgi、udhA和edd而增加NADPH的可用性。
在另一个实施方案中，本发明还提供用于由重组微生物生产乙醇酸的法法，所述方法包括：
(a)使本发明的重组微生物接触选自下组的至少一种碳源：单糖、寡糖、多糖，和能产生乙醇酸的单碳底物；任选地
(b)通过聚合成至少乙醇酸二聚体的步骤回收产生的乙醇酸和
(c)通过从乙醇酸二聚体、寡聚体和/或多聚体解聚合回收乙醇酸。
附图简述
并入本说明书且构成本说明书一部分的附图例示了本发明，并且与说明书一起用来解释本发明的原理。
图1描绘在从碳水化合物形成乙醇酸的产生系统的开发中，糖酵解、TCA循环和乙醛酸途径的遗传工程。
图2是显示载体pMEl01-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01的构建的图，所述质粒称为pAG25。
图3是乳酸和乙酸途径的放大图。涉及这些途径中的一些基因在本发明中进行了修饰。
发明详述
除非本文特别说明，本文使用的所有技术术语和科学术语与本领域技术人员所通常理解的意义相同。
在本发明中，术语“微生物”和“细菌”可以互换使用，指革兰氏阴性细菌。在一个本发明的优选实施方案中，微生物属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。肠杆菌科具体包含但不专指埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)和泛菌属(Pantoea)。
术语“突变菌株”指非野生型菌株。
如本文所使用的，术语“重组的”或“遗传修饰的”或“修饰微生物”指具有基因组修饰的宿主细胞，例如，通过加入生物体中非天然存在的核苷酸或者修饰宿主细胞中天然存在的核苷酸。术语“转化”或“转染”指在并入外源核酸后，在细胞中获得新基因。术语“转化体”指转化的产物。
术语“修饰(modification)”或“修饰(modifying)”由宿主细胞产生的蛋白或酶活性的水平指控制培养过程中产生的蛋白或酶活性的水平，使该水平根据需要增加或减少。在指核酸或多核苷酸时，术语“修饰的”表示核酸与野生型核酸相比已经以某种方式发生了改变，如通过突变；部分或全部核酸的取代、插入、缺失；或者通过与转录调控区的可操作连接。突变的实例包括但不限于点突变、移框突变，和所述基因的部分或全部缺失。
通过“基因”表示与编码调控RNA的、转运RNA的、核糖体RNA的启动子区有关的DNA片段，所述DNA片段与肽、多肽或蛋白的表达可操作地连接，包括编码区、编码域之前(“前导序列”)和之后(“尾部”)的非编码域，以及各个编码片段(“外显子”)之间的介入非编码序列(“内含子”)。编码指用三个碱基“三联体”代码表示氨基酸、起始和终止信号。
术语“可操作地连接”指并置，其中元件的排列使它们在功能上相关联。如果启动子控制序列的转录，其则与编码序列可操作地连接，并且如果核糖体结合位点的位置使得允许翻译mRNA，其则与编码序列可操作地连接。
术语“失活”或“削弱”指降低基因的表达或降低蛋白(即，基因产物)的活性。本领域的技术人员知道大量手段以获得这种结果，且例如：
-将突变引入基因中，降低这个基因的表达水平，或所编码的蛋白质的活性水平。
-用低强度启动子替换基因的天然启动子，导致较低的表达。
-使用使相应的信使RNA或蛋白质去稳定化的元件。
-如果不需要表达则缺失基因。
术语“表达”指从基因转录并翻译成蛋白质(即，基因的产物)。
术语“过表达”在本文定义为与适当的对照菌种相比蛋白质活性至少为150％。可以通过突变蛋白质产生活性更强的形式或抗抑制的形式，通过去除抑制子，或者加入活化子等，实现过表达。也可以通过去除抑制子(repressor)，向细胞加入基因的多个拷贝，或者上调内源基因等实现过表达。
本文所使用的术语“质粒”或“载体”指经常携带基因且通常为环状双链DNA分子形式的染色体外元件，所述基因不是细胞中心代谢的部分。
术语“碳底物”、“碳源”或“可发酵碳源”表示能由微生物代谢的任何碳源，其中底物包含至少一个碳原子。
术语“ATCC”代表美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，Md.20852，U.S.A.。
术语“乙醛酸”(glyoxylate)和“乙醛酸”(glyoxylic acid)可以互换使用。
术语“乙醇酸”(glycolate)和“乙醇酸”(glycolic acid)可以互换使用。术语“乙醇酸、其衍生物或前体”表示乙醇酸的形成和降解的代谢途径中所有的中间化合物。乙醇酸的前体是，特别地：柠檬酸、异柠檬酸、乙醛酸和通常乙醛酸循环中的所有化合物(参见图1)。乙醇酸的衍生物特别是乙醇酸酯如乙醇酸乙酯、乙醇酸甲酯和包含乙醇酸的聚合物如聚乙醇酸。
在本发明的描述中，通过酶的比活性鉴定酶。因而这种定义包括也存在于其它生物体中，更具体在其它微生物中的具有限定的比活性的所有多肽。经常可通过归类于某些定义为PFAM或COG的家族来鉴定具有相似活性的酶。
PFAM(比对和隐藏Markov模型的蛋白质家族数据库；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表蛋白序列比对的大集合。每个PFAM可能显示多个比对，看到蛋白域，评价在生物体中的分布，访问其它数据库，并显示已知的蛋白结构。
通过比较来自代表30个主要的种系发生系(phylogenic line)的43个完全测序的基因组的蛋白质序列而获得COGs(蛋白质的正向同源组的簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)。从至少三个系定义每个COG，这允许鉴定以前的保守域。
鉴别同源序列和它们的百分比同源性的方法为本领域技术人员所熟知，具体包括BLAST程序，其可从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/以该网站上指示的默认参数来使用。然后可使用，例如，程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/ clustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)，以这些网站上指示的默认参数来利用(例如比对)获得的序列。
使用GenBank上对于已知基因给出的参考，本领域的那些技术人员能确定其它生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。使用共有序列可以有优势地完成这种常规工作，所述共有序列可以通过下述步骤确定：用源自其它微生物的基因进行序列比对，并设计简并探针以克隆另一种生物体中的相应基因。这些分子生物学的常规方法为本领域的那些技术人员所熟知，并在例如Sambrook等(1989 Molecular Cloning：a Laboratory Manual.第2版.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)中描述。
参考大肠杆菌，可以在所有革兰氏阴性细菌中发现本申请中鉴定的基因。
本发明提供使用单一重组革兰氏阴性细菌将可发酵碳源直接生物转化成为乙醇酸的改进方法，所述细菌先前经过修饰以产生乙醇酸，并经进一步基因工程改造使其包括下述修饰中的至少一个：
-基因ldhA和mgsA的削弱
-基因arcA的削弱
-基因glcA、lldP和yjcG中至少一个基因的削弱，以削弱乙醇酸的膜输入，和它们的组合。
可以是这些修饰的所有组合，和特别是：
-基因ldhA和mgsA的削弱和基因arcA的削弱；
-基因ldhA和mgsA的削弱和乙醇酸的膜输入的削弱；
-基因arcA的削弱和乙醇酸的膜输入的削弱；
-基因ldhA和mgsA的削弱和基因arcA的削弱和乙醇酸的膜输入的削弱。
基因的缩写如下：乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮醛还原酶(mgsA)、需氧呼吸控制调控子A(arcA)、L-乳酸通透酶(lldP)、乙醇酸通透酶(glcA)和乙酸输入蛋白(yjcG)。
这些额外修饰的主要优势是改进工程改造的微生物的乙醇酸生产。实际上，所有这些修饰导致生产的产率提高2％-36％(由0.39g/g至0.52g/g，与0.38g/g相比)以及/或乙醇酸效价提高9％-28％(由4.36g/L至5.14g/L，与4.0g/L相比)。
在专利申请WO 2007/140816和WO 2007/141316中描述了已经过修饰通过发酵产生乙醇酸的微生物。
在本发明的一个实施方案中，先前经过修饰以产生乙醇酸的微生物包含下述遗传修饰中的至少一个：
-低的除产生乙醇酸以外的乙醛酸转化能力，原因是削弱了编码消耗乙醛酸(乙醇酸的关键前体)的酶的基因：编码苹果酸合成酶的aceB和gclB基因、编码乙醛酸聚醛酶的gcl和编码2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶的eda。
-以这样的方式修饰微生物使得其基本上不能代谢乙醇酸。可以通过削弱编码消耗乙醇酸的酶的基因(编码乙醇酸氧化酶的glcDEFG和编码乙醇醛脱氢酶的aldA)中的至少一个而实现这种结果。可以通过低强度启动子或通过使相应的信使RNA或蛋白质去稳定化的元件替代天然的启动子，来削弱基因。如果需要，也可以通过缺失相应的DNA序列来实现基因的完全削弱。
可以通过不同的手段增加乙醛酸途径流量，具体为：
i)降低酶异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的活性，
ii)通过削弱基因而降低下述酶中至少一种的活性：
·磷酸-转乙酰酶，由pta基因编码
·乙酸激酶，由ackA基因编码
·丙酮酸氧化酶，由poxB基因编码
iii)增加酶异柠檬酸裂合酶的活性，其由aceA基因编码。
iv)降低酶异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶AceK的活性。
可以通过引入驱动icd基因(其编码异柠檬酸脱氢酶)表达的人工启动子，或者通过在icd基因中引入降低蛋白的酶活性的突变，来降低异柠檬酸脱氢酶的水平。
因为通过磷酸化降低蛋白ICDH的活性，所以还可以通过引入突变的aceK基因控制其活性，所述基因与野生型的AceK酶相比，具有增加的激酶活性或者降低的磷酸酶活性。
可以通过削弱编码乙醛酸途径抑制子的iclR或fadR基因的水平，或通过刺激aceA基因的表达，例如通过引入驱动基因表达的人工启动子，或通过在aceA基因中引入增加编码蛋白的活性的突变，来增加异柠檬酸裂合酶的活性。
-通过表达至少一个编码催化所述反应的多肽的基因而使催化乙醛酸到乙醇酸的转化的活性增加。具体地，在需氧条件下，存在编码NADPH依赖性乙醛酸还原酶的基因以将有毒的乙醛酸中间物转化成低毒性的终产物乙醇酸。基因可以是外源或内源的，并可以为染色体表达的或染色体外表达的。可以从大肠杆菌MG1655的基因组中的ycdW或yiaE基因中得到NADPH依赖性乙醛酸还原酶编码基因。在一个优选的实施方案中，增加至少一个所述基因的表达。如果需要，可以通过使用基因组上一个或几个拷贝，从染色体定位的基因获得高水平的NADPH依赖性乙醛酸还原酶活性，所述基因组上的拷贝可以通过本领域的专家已知的重组方法引入。对于染色体外的基因，可以使用因为复制起点不同从而细胞中拷贝数不同的不同类型质粒。对应于具有严紧复制的低拷贝数质粒(pSC101、RK2)，低拷贝数质粒(pACYC，pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)，它们可以作为1-5个拷贝，例如20或者高达500个拷贝存在。可以使用不同强度的启动子表达ycdW或yiaE基因，所述启动子需要或者不需要诱导子分子诱导。实例是启动子Ptrc、Ptac、Plac、λ启动子cI或本领域专家已知的其它启动子。也可以通过使相应的信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)或蛋白质(例如GST标签，Amersham Biosciences)稳定化的元件促进基因的表达。
-增加对NADPH依赖性乙醛酸还原酶的NADPH的可用性。可以通过削弱选自下组的基因中的至少一种获得对微生物性质的这种修饰：编码6-磷酸葡萄糖异构酶的pgi，编码可溶性转氢酶的udhA和编码6-磷酸葡糖酸脱水酶活性的edd。通过这些遗传修饰，所有6-磷酸葡萄糖将必须通过磷酸戊糖途径进入糖酵解，而且每代谢一个6-磷酸葡萄糖将产生2个NADPH。
在本发明的另一个实施方案中，先前经过修饰以产生乙醇酸的微生物包含，特别是基因aceK的削弱。乙醛酸旁路酶ICL直接与Krebs循环酶异柠檬酸脱氢酶(ICDH)竞争其常用的底物，并且尽管ICDH对于异柠檬酸的亲和性高得多，但是通过高胞内水平的柠檬酸和大部分ICDH可逆的磷酸化/失活而确保通过ICL的碳通量。可逆的失活是由于ICDH激酶/磷酸酶(名为AceK)催化的可逆磷酸化，所述酶携带对于相同的多肽的催化活性(Laporte DC 1989，BiochimieSep-Oct；71(9-10)：1051-7；Ikeda TP，1992，J Bacteriol.Feb；174(4)：1414-6.；Cozzone AJ，El-Mansi M.2005，J Mol Microbiol Biotechnol.9(3-4)：132-46)。
对于本发明的方法有利的是通过由细胞去除包括aceK在内的所有已知调控而完全控制ICDH的活性。aceK缺失可以导致ICDH活性增加。然而，通过对其启动子的遗传修饰使icd基因的人工表达更低可以构建生产菌株，所述菌株具有确定的低水平ICDH，允许产生乙醛酸并且因此在ΔaceK背景中产生乙醇酸。
在本发明特定的实施方案中，起初经过修饰以产生乙醇酸的微生物进一步包含基因ldhA和mgsA的削弱。基因ldhA编码可将糖酵解的终产物丙酮酸转化成为乳酸的乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)。基因mgsA编码可将磷酸二羟基丙酮(DHAP)转化成丙酮醛的丙酮醛合酶(EC 4.2.3.3)。
两种酶都消耗在糖酵解代谢途径中起主要生化作用的分子，从而产生乳酸。为了节省产生乙醇酸所需的碳，并且避免积累乳酸为副产物，在本发明的方法中使用的菌株中缺失ldhA和mgsA。这种缺失的目的是提高乙醇酸生产的产率并且使产物更容易纯化。
本发明进一步的实施方案提供方法，其中起初经过修饰以产生乙醇酸的微生物另外包含基因arcA的削弱。如本文所使用的，“ArcA”和“arcA”分别指多肽和编码区。
ArcA是双组份调节ArcAB系统的一个多肽。双组份信号转导系统使细菌能感觉、响应并适应各种环境、压力和生长条件。在原型的双组份系统中，传感器组氨酸激酶，催化其自磷酸化并且之后将磷酰基转移至响应调节子，其之后使细胞生理发生变化，通常是通过调节基因表达来起作用。例如，ArcB是膜结合组氨酸激酶并且ArcA是响应调节子(Georgellis等，1999)。调节系统使大肠杆菌可响应各种氧浓度-从完全需氧到微氧到完全厌氧条件。
ArcA控制大肠杆菌和其它革兰氏阴性细菌中很多操纵子的表达。包括在ArcA调控子中的主要是与由糖底物产生细胞能量的途径有关的因子：黄素蛋白质类的几种脱氢酶，末端氧化酶，三羧酸循环酶，乙醛酸支路的酶，涉及发酵代谢的酶(Iuchi，S.和Lin，E.C.C.(1993)Mol.Microbiol.9，9-15；Bauer，C.E.，Elsen，S.和Bird，T.H.(1999)Annu.Rev.Microbiol.53，495-523)。ArcA在厌氧生长过程中和高生长速率的需氧条件下(例如，指数生长)引起很多这种操纵子的表达下降(S.Iuchi等，Cell，66，5-7(1991)。已知ArcA蛋白负调控三羧酸循环(TCA)酶的基因的表达。在arcA-阻断的菌株中，TCA循环的基因的表达增加(http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext？Exp_DB+-n+Bget-bin/get_htext？Exp_DB+-n+B)。
为了提高乙醇酸合成的生产力和产率，在本发明的方法中使用的菌株中缺失基因arcA。事实上，ΔarcA与此前在菌株中进行的遗传修饰组合将增加TCA循环和乙醛酸支路中朝向乙醇酸生产的流量。
此外，证明了ArcA与响应细胞氧化还原状态而调节PTS表达有关(Jeong，J-Y.等，2004，Journal of Bio.Chem.)。ArcA的磷酸化形式抑制来自P1启动子的ptsG转录。即使ArcA主要在厌氧条件下磷酸化；ArcB在无氧条件下自磷酸化，我们也不能排除由另一种双组份系统的激酶(交叉-反应)在需氧条件下将ArcA磷酸化的可能(Laub，M.T.和Goulian，M.Annu.Rev.Genet.(2007)；41：121-45)。因此，我们不能排除ArcA-P在需氧条件下抑制ptsG表达的可能。这是在本发明中所述方法中使用的乙醇酸生产菌株中缺失arcA基因的另一个原因。
在本发明的另一个实施方案中，起初经过修饰以产生乙醇酸酸的微生物进一步包含乙醇酸膜输入的削弱。特别是将编码乙醇酸输入蛋白的基因glcA、lldP和yjcG中至少一个基因削弱。
膜输入蛋白(或简称输入蛋白)是与离子、小分子或大分子的移动，如另一种蛋白跨过生物膜有关的蛋白。输入蛋白是整体膜蛋白；即它们存在于膜中并且跨越经由其输入物质的膜。蛋白可以通过加快扩散或活性输入而辅助物质移动。上述三个蛋白都表征为乙醇酸和乳酸的输入蛋白(Nunez，F.等，2001Microbiology，147，1069-1077；Nunez，F.等，2002 Biochem.And Biophysicalresearch communications 290，824-829；Gimenez，R.等，2003 J.of Bacteriol.185，21，6448-6455)。在每个乙醇酸通透酶上都突变的菌株不能在作为碳源的乙醇酸上生长，说明所述菌株不能输入乙醇酸(Gimenez，R.等，2003)。通过削弱向用于产生乙醇酸使用的细胞中输入乙醇酸，其目的是改进菌株耐受和积累乙醇酸的能力并且由此改进生产的效价。
在本发明的特定实施方案中，削弱三个基因，glcA、lldP和yjcG。
也有优势的是增加这种乙醇酸生产微生物中乙醇酸的输出。本领域技术人员知道大量方法来获得特定代谢物输出的这种增加，特别是增强输出蛋白的活性和/或表达，其能将乙醇酸从微生物输出至培养基。
本发明的特定实施方案提供从重组生物体发酵产生乙醇酸的方法，所述方法包括：
(a)用本发明的重组生物体接触选自下组的至少一种碳源：葡萄糖、蔗糖、单糖(如果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖)、寡糖(如半乳糖、纤维二糖......)、多糖(如纤维素)、淀粉或其衍生物、甘油和可产生乙醇酸的单碳底物，
(b)任选地，该方法包括将细菌或培养基中的乙醇酸浓缩的步骤和从任选地以部分或全部量(0-100％)保留在终产物中的生物量和/或发酵液中分离乙醇酸的步骤，
任选地，该方法包括通过聚合为至少乙醇酸二聚体的步骤回收步骤(a)中产生的乙醇酸的步骤和
(c)通过从乙醇酸二聚体、寡聚体和/或多聚体解聚合，从以部分或全部量(0-100％)保留在终产物中的生物量和/或发酵液中分离和回收乙醇酸。
本领域技术人员能定义根据本发明的微生物的培养条件。具体地，在20℃-55℃，优选在25℃-40℃的温度发酵革兰氏阴性细菌，而且更特定地，对大肠杆菌为约37℃。
通常在发酵罐中进行发酵，所述发酵罐中具有适合于所用细菌的已知确定组成的无机培养基，其包含至少一种简单碳源，而且如果需要，包含用于产生代谢物所必需的共同底物。
本发明还涉及如前所述的微生物。优选地，所述微生物属于肠杆菌科。更优选地，微生物来自埃希氏菌属，并且甚至更优选为大肠杆菌。
实施例
使用几种方案建立下述实施例中所述的产生乙醇酸的菌株。方案详述如下。
方案1：导入PCR产物用于重组和选择重组体(FRT系统)
使用表1中为替换基因或基因间区域而选择并给出的寡核苷酸从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒或从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.(2000))。然后通过电转化将获得的PCR产物导入携带质粒pKD46的受体菌株中，其中表达的系统λRed(γ，β，.exo)非常利于同源重组。然后选择抗生素抗性转化体，并用表2中所示合适的寡核苷酸通过PCR分析检查抗性盒是否插入。
方案2：抗性盒的消除(FRT系统)
根据下述技术去除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。通过电转化将携带可作用于氯霉素和/卡那霉素抗性盒的FRT位点上的FLP转化酶的质粒pCP20导入菌株。在42℃系列培养后，用表2中所示寡核苷酸通过PCR分析检查抗生素抗性盒的丢失。
方案3：用噬菌体P1转导用于缺失该基因
通过利用噬菌体P1的转导技术进行受体大肠杆菌菌株中通过用抗性盒(卡那霉素或氯霉素)替代基因而缺失所选基因。方案为两步，(i)在缺失单个基因的供体菌株上制备噬菌体裂解物和(ii)通过这个噬菌体裂解物转导受体菌株。
噬菌体裂解物的制备
-用单个基因缺失的菌株MG1655的100μl过夜培养物接种10mlLB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl2 5mM。
-在37℃振荡温育30分钟。
-向供体菌株MG1655中加入制备的100μl噬菌体裂解物P1(约1x109个噬菌体/ml)。
-37℃振荡3小时，直至所有细胞裂解。
-加入200μl氯仿，并漩涡振荡。
-在4500g离心10分钟以去除细胞碎片。
-将上清转移到无菌管中，并加入200μl氯仿。
-4℃保存裂解液。
转导
-将5ml大肠杆菌受体菌株在LB培养基中的过夜培养物在1500g离心10分钟。
-将细胞沉淀悬浮于2.5ml MgSO4 10mM和CaCl2 5mM中。
-对照管：100μl细胞
100μl单个基因缺失的菌株MG1655的噬菌体P1。
-管测试：100μl细胞+100μl单个基因缺失的菌株MG1655的噬菌体P1。
-在30℃不振荡温育30分钟。
-每管加入100μl柠檬酸钠1M，并漩涡振荡。
-加入1ml LB。
-在37℃振荡温育1小时。
-将管以7000rpm离心3分钟后涂布在LB+Cm 30μg/ml平板上。
-在37℃过夜温育。
然后选择有抗生素抗性的转化体，并用表2中给出的适当的寡核苷酸通过PCR分析检查缺失的插入。
方案4：引入PCR产物用于重组和重组体的选择(Cre-LOX系统)
使用表1中给出和选择的用于替代基因或基因间区域的寡核苷酸，从质粒loxP-cm-loxP(Gene Bridges)扩增氯霉素抗性盒或从质粒loxP-PGK-gb2-neo-loxP(Gene Bridges)扩增新霉素抗性盒。然后通过电转化将获得的PCR产物引入携带质粒pKD46的受体菌株中，在所述菌株中表达的系统λRed(γ，β，.exo)非常有利于同源重组。然后选择有抗生素抗性的转化体，并用表2中给出的适当的寡核苷酸通过PCR分析检查抗性盒的插入。
方案5：抗性盒的消除(Cre-LOX系统)
根据下述技术消除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。将携带作用于氯霉素和/或卡那霉素抗性盒的Cre-LOX位点的Cre重组酶的质粒pJW168(Palmeros B.等(2000)，Gene 247：255-264)通过电转化引入菌株。在42℃系列培养后，用表2中给出的寡核苷酸通过PCR分析检查抗生素抗性盒的丢失。
表1：用于下述实例中所述构建的寡核苷酸
Figure BDA0000094313330000141
Figure BDA0000094313330000151
Figure BDA0000094313330000161
表2：用于检查抗性盒的插入或抗性盒的丢失的寡核苷酸
Figure BDA0000094313330000162
Figure BDA0000094313330000171
实施例1
构建质粒pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01(图2)
通过三个步骤由质粒pME101-ycdW和质粒pJB137-aceA建立质粒pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01，在专利申请PCT/EP2006/063046和PCT/EP2007/055625中给出了质粒pME101-ycdW的描述。
-第一步是通过向ycdW的末端加入终止子而建立质粒pME101-ycdW-TT07。通过用寡核苷酸(其序列包括TT07并示于表1中)，对基因组DNA进行PCR而扩增基因ycdW的末端。将用AgeI/SmaI消化的PCR片段克隆入用相同限制性酶剪切的质粒pME101-ycdW中，得到质粒pME101-ycdW-TT7。
-通过将PCR片段克隆入用SmaI/HindIII消化的质粒pJB137(EMBL登录号U75326)而建立质粒pJB137-aceA。用由专利申请PCT/EP2006/063046和PCT/EP2007/055625中所述的MG1655ΔaceB菌株纯化的基因组DNA，和表1中所述寡核苷酸(Oag0037和Oag0038)，获得PCR片段。扩增基因aceA及其自身启动子然后克隆入质粒中。
-最后一步是剪切质粒pJB137-aceA，得到片段PaceA-aceA-TT01，TT01是pJB137的终止子。用HindIII剪切质粒pJB137-aceA，用Klenow酶处理，并且最后用PstI限制性酶消化。然后将得到的DNA片段克隆入质粒pME101-ycdW-TT07中，所述质粒顺序用SmaI和PstI切开。得到的质粒是pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01，名为pAG025。
实施例2
构建能通过发酵产生乙醇酸的菌株：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
根据专利申请PCT/EP2006/063046和PCT/EP2007/055625中的描述建立菌株大肠杆菌MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta。
在菌株大肠杆菌MG1655ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta中通过用携带氯霉素抗性盒的称为Ptrc50/RBSB/TTG的人工启动子替代天然icd启动子，实现icd转录的削弱。根据方案1中所述的技术以表1中给出的各个寡核苷酸(Seq.N°1和N°2)进行构建。未消除氯霉素盒。
首先通过电转化将PCR片段Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm引入菌株MG1655(pKD46)，得到菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm，并通过测序确证。
在第二步，将削弱icd构建体通过转导(参见方案3)引入菌株MG1655ΔaceBΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta，得到菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd ::CmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta。
然后将质粒pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01(实施例1)引入菌株，得到MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME 101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)，名为AG0662。
实施例3
构建改进乙醇酸的发酵生产的菌株：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
通过用表1所示的寡核苷酸N°3和N°4得到的PCR产物进行重组，失活菌株大肠杆菌MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pKD46)中的基因ldhA(参见方案1)。得到的菌株是MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA::Km，其中在最后一步将质粒pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01(实施例1)引入。最后的菌株命名为AG0708。
实施例4
构建改进乙醇酸的发酵生产的菌株：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
通过方案3所述的用噬菌体P1进行的转导技术，失活菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta中的基因mgsA。通过将PCR片段引入菌株MG1655(pKD46)而建立供体菌株MG1655 ΔmgsA::Km。用于构建的寡核苷酸列于表1中。通过测序确认菌株。
然后将质粒pAG025引入菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA::Km，得到最后的名为AG0819：MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA::Km(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)的菌株。
实施例5
构建改进乙醇酸的发酵生产的菌株：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔarcA(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
通过方案3所述的用噬菌体P1进行的转导技术，失活菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta中的基因arcA。通过将PCR片段引入菌株MG1655(pKD46)而建立供体菌株MG1655ΔarcA::Km。用于构建的寡核苷酸列于表1中。通过测序确认菌株。
然后将质粒pAG025引入菌株大肠杆菌MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔarcA::Km，得到最后的名为AG0956的菌株：MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔarcA::Km(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)。
实施例6
构建改进乙醇酸的发酵生产的菌株：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsA(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
在第一步中，通过噬菌体转导(方案3)入菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEF GB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta而缺失ΔmgsA::Cm，得到菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta ΔmgsA::Cm。通过将PCR片段引入用菌株MG1655(pKD46)而建立供体菌株MG1655 ΔmgsA::Km。用于构建的寡核苷酸列于表1中。通过测序确认菌株。
在第二步中，通过由供体菌株MG1655 ΔldhA::Km(实施例3中所述)转导入菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta ΔmgsA::Cm而缺失ΔldhA::Km，得到菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA::CmΔldhA::Km。根据方案2中所述技术消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。通过表2中所示寡核苷酸进行PCR而验证菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA。
在第三步中，通过由实施例2所述的菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm转导而引入构建体Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm。得到的菌株是MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGBΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA。
最后，将质粒pAG25(实施例1)引入菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA得到名为AG0873的菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)。
实施例7
构建改进乙醇酸的发酵生产的菌株：MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsAΔarcA(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
通过转导将缺失ΔarcA::Km引入实施例6所述的菌株，MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA，得到菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔarcA::Km。转导实验中使用的供体菌株MG1655 ΔarcA::Km如实施例5中所述。
然后将质粒pAG025引入菌株，得到名为AG1099的菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔarcA::Km(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)。
实施例8
构建不能输入乙醇酸的菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceBΔgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔglcA ΔlldP ΔyjcG(pME101-yedW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
在第一步中，通过PCR产物(参见方案4)将构建体ΔyjcG::Nm(Cre/Lox)引入菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta(pKD46)，得到菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG::Nm。使用的寡核苷酸如表1所示。通过测序验证得到的菌株。
根据方案5所述技术消除新霉素抗性盒，得到菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG。
在第二步中，通过PCR产物(参见方案4)将构建体ΔglcA::Nm引入菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+ptaΔyjcG(pKD46)，得到菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA::Nm。使用的寡核苷酸如表1所示。通过测序验证得到的菌株。
根据方案5中所述技术消除新霉素抗性盒，得到菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEF GB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA。
在第三步中，通过转导将缺失ΔlldP::Km引入菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA，得到菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+ptaΔyjcG ΔglcA ΔlldP::Km。通过将PCR片段重组引入MG1655(pKD46)而建立转导实验中使用的供体菌株MG1655ΔlldP::Km。寡核苷酸如表1所示。通过测序验证菌株MG1655ΔlldP::Km。
下一步是通过转导将削弱Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm由实施例2中所述的菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm转导入菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA ΔlldP::Km，得到菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔedd+edaΔpoxBΔackA+ptaΔyjcGΔglcAΔlldP::Km。
最后一步是引入质粒pAG25(实施例1)，得到名为AG1056的菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA ΔlldP::Km(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)。
实施例9
构建改进乙醇酸发酵生产并且不能引入乙醇酸的菌株：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsA ΔglcA ΔlldP ΔyjcG(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
在第一步中，通过PCR产物(方案4)将构建体ΔyjcG::Nm引入实施例6中所述菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta ΔmgsAΔldhA(pKD46)，得到菌株MG1655ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGBΔaldAΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG::Nm。
根据方案5所述技术消除抗性盒，得到菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsAΔldhA ΔyjcG。
在第二步中，通过PCR产物将缺失ΔglcA::Nm(Cre/Lox)引入菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+ptaΔmgsA ΔldhA ΔyjcG(pKD46)，得到菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGBΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA::Nm。
根据方案5中所述技术消除抗性盒，得到菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcGΔglcA。
第三步是通过转导将ΔlldP::Km由实施例8中所述菌株MG1655ΔlldP::Km引入菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA，得到菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcGΔglcA ΔlldP::Km。
然后将片段Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm导入菌株MG1655 ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcGΔglcA ΔlldP::Km，得到菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcGΔglcA ΔlldP::Km。实施例2中所述菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm是转导实验的供体菌株。
最后，将质粒pAG25通过电转化引入菌株，得到名为AG0960：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA ΔlldP::Km(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)的菌株。
本领域技术人员知道用于遗传工程改造微生物的技术，并且知道存在不同的方法获得缺失。
实施例10
产生乙醇酸的菌株在锥形瓶中的发酵
起初使用经过修正的M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128)，所述培养基中补加40g/l MOPS和10g/l葡萄糖，并调至pH 6.8，在250ml带挡板的锥形瓶培养中评价菌株的性能。如果需要，加入浓度为50mg/l的壮观霉素。使用72小时的预培养物接种50ml培养物至OD600nm为约0.3。将培养液于30℃和200rpm置于摇床上，直至培养基中的葡萄糖耗尽。在培养结束时，使用Biorad HPX 97H柱用于分离和折射计用于检测，通过HPLC分析葡萄糖和乙醇酸。
下面的表3中给出了对不同菌株的性能的比较。实施例2中所述菌株可以当作参考。每个数值均为n次重复的平均值(n＝1至n＝6)。
表3：上述不同菌株的乙醇酸生产性能
实施例11
产生乙醇酸的菌株在补料分批发酵罐中的发酵
使用补料分批方法，在600ml发酵罐在生产条件下评价上述实施例所述菌株。
在30℃在补充以40g/l MOPS、10g/l葡萄糖的50ml合成培养基(用于摇瓶培养的相同培养基)和10％LB培养基的500ml三角瓶中，进行3天独特的预培养。使用此预培养物接种发酵罐。
以约2的初始光密度接种发酵罐，所述发酵罐中装有200ml补充以20g/l葡萄糖、50mg/l壮观霉素的合成培养基。在37℃进行培养，调节搅拌和通气以保持溶解氧高于30％饱和度。通过加入碱将pH调至6.8。以分批模式进行培养直至葡萄糖耗尽。此时，加入补充以硫酸镁、寡-元素(oligo-elements)和壮观霉素的700g/l葡萄糖溶液(葡萄糖的脉冲)，使培养基中葡萄糖的浓度恢复为20g/l。在第5次脉冲的补料后，将pH调至7.4直至培养结束。
通常地，实施例5中所述菌株比实施例2中所述菌株在发酵罐中给出更好的生产性能。
下面给出使用实施例5的菌株(AG0956)产生乙醇酸的发酵的代表性时间过程。
表5：在发酵罐Multifors(600mL)中用菌株AG0956发酵产生乙醇酸的时间过程
Figure BDA0000094313330000242
获得的最终效价是52.2g/l乙醇酸，对葡萄糖的产率是0.38g/g，生产力为1.33g/l/h。
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Figure IDA0000094313380000011
Figure IDA0000094313380000021
Figure IDA0000094313380000031
Figure IDA0000094313380000041
Figure IDA0000094313380000051
Figure IDA0000094313380000071

Claims (14)

1.通过在包含碳源的适当的培养基中培养修饰的微生物，并从培养基回收乙醇酸而发酵生产乙醇酸、其衍生物或前体的方法，
其中所述修饰的微生物是革兰氏阴性细菌，其经过遗传修饰以产生乙醇酸，所述微生物进一步包含下述修饰中的至少一种：
-基因ldhA和mgsA的削弱
-基因arcA的削弱
-基因glcA、lldP和yjcG中至少一个的削弱，
和它们的组合。
2.权利要求1的方法，其中起初经过修饰以产生乙醇酸的微生物包含下述修饰中的至少一种：
-将乙醛酸到乙醇酸之外的产物的转化的削弱(aceB、glcB、gcl、eda的削弱)
-基本上不能代谢乙醇酸(glcDEFG、aldA的削弱)
-乙醛酸途径流量的增加(icd、aceK、pta、ackA、poxB、iclR或fadR的削弱，和/或aceA的过表达)
-由乙醛酸到乙醇酸的转化的增加(ycdW的过表达)
-NADPH的可用性的增加(pgi、udhA、edd的削弱)。
3.权利要求2的方法，其中起初经过修饰以产生乙醇酸的所述微生物包含基因aceK的削弱。
4.权利要求1-3的方法，其中起初经过修饰以产生乙醇酸的所述微生物进一步包含基因ldhA和mgsA的削弱。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中起初经过修饰以产生乙醇酸的所述微生物进一步包含基因arcA的削弱。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中起初经过修饰以产生乙醇酸的所述微生物进一步包含基因glcA、lldP和yjcG中至少一个的削弱。
7.权利要求6的方法，其中将三个基因glcA、lldP和yjcG削弱。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述碳源是下述中的至少一种：葡萄糖、蔗糖、单糖或寡糖、淀粉或其衍生物或甘油。
9.权利要求1-8中任一项的发酵制备乙醇酸的方法，所述方法包含下述步骤：
a)发酵修饰的微生物，其起初经过修饰以产生乙醇酸，
b)浓缩细菌或培养基中的乙醇酸，和
c)从任选地以部分或全部量(0-100％)保留在终产物中的生物质和/或发酵液中分离乙醇酸。
10.权利要求9的方法，其中通过聚合成至少乙醇酸二聚物的步骤而分离乙醇酸。
11.权利要求10的方法，其中通过从乙醇酸二聚物、寡聚物和/或多聚物解聚而回收乙醇酸。
12.权利要求1-7中任一项所定义的修饰的微生物。
13.权利要求12的微生物，其中所述微生物属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。
14.权利要求13的微生物，其中所述微生物属于埃希氏菌属(Escherichia)。
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