CN107429269A - 通过在微生物中转化戊糖用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过在微生物中转化戊糖用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于，所述方法至少包括：(i)培养表达戊糖同化合成途径的重组微生物的操作，其至少包括以下步骤：a)在位置1磷酸化选自(D)‑木酮糖和/或(L)‑核酮糖的戊糖，b)裂解步骤a)结束时获得的戊糖‑1‑磷酸酯，从而获得乙醇醛和磷酸二羟基丙酮(DHAP)，和(ii)回收在培养操作(i)结束时获得的所述至少一种感兴趣的代谢物的操作。本发明还涉及相关的微生物。

Description

通过在微生物中转化戊糖用于生产至少一种感兴趣的代谢物 的方法
技术领域
本发明涉及一种在微生物中生产至少一种感兴趣的代谢物的方法。其更具体而言提供了在表达用于同化有利地来自可再生碳源的戊糖的人工/合成代谢途径的微生物中生物合成乙二醇和/或乙醇酸的方法。
背景技术
乙二醇(EG)和乙醇酸(GA)是用于石化行业广泛工业应用的化合物，作为基于EG的聚合物前体，如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，或基于GA，如一些热塑性树脂，以及对于EG，在汽车抗冻剂中作为冷却剂，和对于GA，在纺织工业中，在石油和天然气工业中以及大量化妆品中。这些化合物仍然以石油化学方式广泛生产。然而，代谢工程是一个高度发展超过15年的行业。这种方法包括设计人工生物合成途径和/或优化宿主生物体中的天然途径，并涉及所述生物体内的多个酶促步骤的转移，表达和功能偶联，从而产生感兴趣的分子。在宿主微生物中设计完全人工生物合成途径，更具体而言使之能够形成感兴趣的分子的自主代谢生产组。这些生产方法具有使用可再生碳源作为底物的优点，而此后代表化石能源的真正替代。在这方面中，描述了用于EG生物生产的各种代谢途径。具体而言，它们涉及糖酵解中间体。Genomatica公司在其专利申请WO2011130378和WO2012177983中特别描述了来自丝氨酸，3-磷酸羟丙酸酯，3-磷酸甘油酸酯或乙醛酸酯的EG合成的主要是厌氧的代谢途径。还描述了GA生物生产的技术。因此，Mitsui Chemicals Inc.描述了使用微生物从其末端具有羟基的脂族多元醇生产羟基羧酸的方法(EP 2 025 759和EP 2 025 760)。它是一种，如由Michihiko Kataoka在关于GA生产的论文(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2001)中描述的使用乙烯氧化微生物的生物转化方法。GA也可以通过使用具有增加的腈水解酶(nitrilase)活性的突变型腈水解酶从乙醇腈生物转化而进行生产，正如Dupont deNemours在专利申请WO2006/069110和US7,445,917中所述。
木质纤维素生物质是可持续的碳源，并也是化石碳源的替代品。对于工业感兴趣的代谢产物的生物合成产生了越来越大的兴趣。在这些碳材料中，D-木糖代表葡萄糖之后的第二最丰富的糖。然而，微生物并不会优先使用戊糖，而在它们如此而为时，产率也是极低的。因此，同化这种糖的代谢途径的开发是该行业研究的主要焦点。
对于通过微生物生产EG和GA的戊糖用途的主要来源目前是基于针对感兴趣的分子的生产进行优化和/或添加酶而使用这些天然途径的产物的天然途径的使用。
因此，在由Metabolic Explorer提交的专利申请WO2007140816和WO2007141336中描述了优化戊糖同化天然途径的GA生物生产方法。这些应用描述了以不同水平进行遗传工程化而提高乙醛酸途径的流动，提高乙醛酸转化为乙醇酸的转化率和/或降低乙醇酸及其中间体乙醛酸酯的代谢的生物体。Metabolic Explorer的后续申请(WO2010108909)描述了另外在乳酸生产途径上(通过对甲基乙二醛合酶和D-乳酸脱氢酶编码基因减效)，在有氧/厌氧代谢转化上通过对调节有氧呼吸途径控制的ArcA基因减效和/或通过对编码乙醇酸进口蛋白(importing protein)的基因减效而对于优化GA生产采取行动的机会。
最近，开发了基于戊糖同化的合成代谢途径的EG合成代谢途径。因此，Liu H等(Appl.Microbiol.Biotechnol.，2012，PMID：23233208)描述了表达从D-木糖合成乙二醇的代谢途径并涉及酶(D)-木糖脱氢酶，(D)-木糖脱水酶，2-脱氢-3-脱氧-D-戊二醛醛缩酶和乙醇醛还原酶的大肠杆菌菌株。然而，通过该方法获得的约275mg/g木糖的EG产率能够提高。
麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)(MIT)也在申请WO2013126721中描述了从戊糖生产EG的人工代谢途径。这种途径涉及在位置1磷酸化(D)-核酮糖或(L)-木酮糖循环。然而，为了同化诸如(D)-木糖和(L)-阿拉伯糖的最丰富的戊糖，这种途径需要几种容许将D-木糖转化为(D)-木酮糖并随后转化成(D)-核酮糖和将(L)-阿拉伯糖转化为(L)-核酮糖并随后转化为(L)-木酮糖的异构酶和差向异构酶的表达。
因此，现有技术中对于通过有利地从可再生碳源转化戊糖，而更具体而言，基于这些天然资源中最丰富的戊糖如(D)-木糖和(L)-阿拉伯糖的直接同化，生产感兴趣的代谢物，包括EG和/或GA的新而有效的方法仍存需要。
发明内容
本申请中描述的发明满足上述技术目的。它涉及一种通过同化微生物中的至少一种戊糖而在微生物中转化所述至少一种戊糖以生产至少一种感兴趣的代谢物的方法。更具体而言，它提供了一种简单而成本有效的生物合成方法，用于在微生物中由可再生碳源(例如，木质纤维素，且特别是半纤维素)自主生产感兴趣的代谢物，包括乙二醇和/或乙醇酸。
使用这种可再生碳底物为生产迄今为止仍被石化途径广泛生产的石化行业高附加值化合物的感兴趣的代谢物(如乙二醇和乙醇酸)提供了可持续的替代方案。
本发明中描述的新的戊糖同化途径构成了平行于天然戊糖同化途径却并非天然存在的途径。因此，它在很大程度上独立于对宿主细胞天然途径的控制限制。因此，它使其有可能规避天然途径及其对生产感兴趣的代谢物如乙二醇和/或乙醇酸的控制。
这种性质以广谱宿主微生物的简便方式使之具有便携性(适用性，portability)，因为其内源代谢不会干扰本发明的合成途径。
此外，本申请中对于生产乙二醇和乙醇酸描述的戊糖同化合成途径的理论产率的计算，相对于基于天然途径优化和/或实现以及生产简化的生物合成方法预估产率显著提高。
因此，本发明的方法特征在于其包括以下步骤：
(i)培养表达戊糖同化合成途径的重组微生物的操作，其至少包括以下反应步骤：
a)在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和/或(L)-核酮糖的戊糖，
b)裂解步骤a)结束时获得的戊糖-1-磷酸酯，从而获得乙醇醛和磷酸二羟基丙酮(DHAP)，和
(ii)回收培养操作(i)结束时获得的至少一种感兴趣的代谢物的操作。
优选戊糖同化的合成途径的步骤a)能够通过选自由酮基己糖激酶C(Khk-C)，鼠李酮糖激酶(鼠李树胶糖激酶，rhamnulose kinase，rhaB)和墨角藻糖激酶(fucK))组成的组中的重组表达酶进行催化。
还优选步骤b)通过优选I类的醛缩酶催化。根据本发明的I类醛缩酶通常选自由醛缩酶B(Aldo-B)和果糖-1,6-双磷酸酯醛缩酶(果糖1,6bP醛缩酶或FbaB)组成的组中。
根据一个实施方式，该生产方法的特征在于：
-步骤a)由KhkC催化，和
-步骤b)由醛缩酶B(Aldo-B)和/或果糖-1,6bP醛缩酶(FbaB)催化。
根据本发明的所述方法的一个具体实施方式提供了乙二醇(EG)和/或乙醇酸(GA)。
在此方法中，戊糖同化的合成途径进一步包括以下步骤：
c)将在步骤b)结束时获得的乙醇醛还原成乙二醇，和/或
c')将在步骤b)结束时获得的乙醇醛氧化为乙醇酸。
除非在本发明的方法中另外指出，否则下文描述的实施方式都能够彼此组合。
步骤c)能够由尤其选自由醛还原酶(YqhD)，甘油脱氢酶(GldA)和丙烷-1,2-二醇氧化还原酶(FucO))组成组中的乙醇醛还原酶进行催化。
步骤c')能够由乙醇醛脱氢酶，特别是乳醛脱氢酶(AldA)催化。
在本发明的方法中，微生物优先在含有(D)-木糖和/或(L)-阿拉伯糖的碳培养基上培养。
在本发明的方法的优选实施方式中，培养基包含含有半纤维素的生物质水解产物。
通常而言，根据本发明的方法的戊糖同化合成途径在步骤a)之前包括以下步骤中的至少之一：
-在微生物中转运(D)-木糖和/或(L)-阿拉伯糖的步骤；
-将(D)-木糖转化为(D)-木酮糖的步骤，和/或
-将(L)-阿拉伯糖转化为(L)-核酮糖的步骤。
(D)-木糖转化为(D)-木酮糖的转化能够通过(D)-木糖异构酶和/或通过(D)-木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的作用进行催化。
(L)-阿拉伯糖转化为(L)-核酮糖能够通过(L)-阿拉伯糖异构酶和/或通过(L)-阿拉伯糖还原酶和阿拉伯糖醇脱氢酶的作用进行催化。
根据本发明的生产方法，重组微生物可以是细菌，优先选自由肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，梭菌科(Clostridiaceae)，芽孢杆菌科(Bacillaceae)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链球菌科(Streptococcaceae)，甲基杆菌科(Methylobacteriacae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)组成的组中，优选大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。微生物也可以是酵母，优先选自酵母科(Saccharomycetaceae)，毕赤酵母科(Pichiaceae)和裂殖酵母科(Schizosaccharomycetaceae)，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，杰丁毕赤酵母(Pichia jadinii)，树干毕赤酵母(舍弗列斯氏菌，Scheffersomyces stipitis)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。本发明的微生物也可以是真菌，优先选自由青霉菌属(Penicillium)，曲霉菌属(Aspergillus)，金孢子菌属(Chrysosporium)或木霉属(Trichoderma)组成的组中。
优选本发明的方法中使用的(D)-木酮糖-5激酶和/或(L)-核酮糖-5激酶活性受到抑制。
本发明还涉及表达至少包含编码以下酶的核酸的戊糖同化合成途径的重组微生物：
i)适于在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和/或(L)-核酮糖的戊糖的酶，
ii)适于将在位置1磷酸化的所述戊糖裂解成乙醇醛和DHAP的酶。
有利的是，这种生物的戊糖同化天然途径受到抑制。
通常而言，表达本发明的合成同化途径的微生物的特征进一步在于(D)-木酮糖-5激酶和/或(L)-核酮糖-5激酶活性受到抑制，和/或在于它携带以下改变(modification，修饰)中的至少之一：
-编码乙醛酸还原酶的基因的过表达；
-编码异柠檬酸裂解酶的基因的过表达；
-编码苹果酸合酶的基因的缺失；
-编码乙醛酸聚醛酶的基因的缺失；
-编码乙醇酸氧化酶和/或乙醇酸脱氢酶的基因的缺失；
-编码2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶，包括恩特纳-杜德洛夫醛缩酶(Entner-Doudouroff Aldolase)和/或磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因的缺失；
-有氧反应的抑制子(repressor，抑制因子)基因，包括arcA基因的缺失；
-异柠檬酸脱氢酶表达的减效，且尤其是缺失；
-编码乙醇酸内化系统的基因的缺失；
-导致副产物如乙酸盐，乳酸盐或乙醇生成的代谢途径的减效；
-至少一个编码糖载体的基因的过表达。
优选重组微生物包含：
-至少一个编码酮基己糖激酶C的外源核酸，和
-至少一个编码醛缩酶B的外源核酸。
有利的是，微生物可以包含以下改变：
-编码主乙醇醛还原酶的基因的过表达；
-编码乙醇醛脱氢酶的基因的缺失。
或者，微生物可以包含以下改变中的至少之一以优化乙醇酸生产：
-编码乙醇醛脱氢酶的基因的过表达；
-编码至少一个乙醇酸氧化酶亚基的至少一个基因的缺失。
通常而言，适于优化乙醇酸生产的微生物包含以下改变：
-编码乙醛酸还原酶的基因的过表达；
-编码异柠檬酸裂解酶的基因(具有或不具有其转录抑制子缺失)的过表达；
-编码苹果酸合酶的基因的缺失；
-编码乙醛酸聚醛酶的基因的缺失；
-编码乙醇酸氧化酶和/或乙醇酸脱氢酶的基因的缺失；
-编码2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶，包括恩特纳-杜德洛夫醛缩酶和/或磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因的缺失；
-编码涉及呼吸代谢的基因的抑制子的基因，包括arcA基因的缺失；
-异柠檬酸脱氢酶表达的减效，且尤其是缺失；
-可选的是，编码糖载体的基因的过表达。
更优选的是，特别是在用于生产乙醇酸的重组微生物是大肠杆菌的情况下，该微生物包含以下改变：
-编码乙醇醛脱氢酶的aldA基因的过表达；
-ghrA基因的过表达；
-aceA基因的过表达，可选地连同编码乙醛酸途径的转录抑制子的iclR基因的缺失一起；
-aceB和glcB基因的缺失；
-至少一个glcDEFG基因的缺失；
-glc基因的缺失；
-edd-eda基因的缺失；
-arcA基因的缺失；
-icd基因的缺失；
-galP基因的过表达。
附图说明
图1.(D)-木糖和(L)-阿拉伯糖同化的天然途径和合成途径。由天然酶催化的反应用虚线表示。由合成酶催化的反应以实线表示。(1)(D)-木糖异构酶，(2)(D)-木酮糖-1激酶，(3)(D)-木酮糖-1-磷酸醛缩酶，(4)乙醇醛脱氢酶，(5)乙醇醛还原酶，(6)(L)-阿拉伯糖异构酶，(7)(L)-核酮糖-1激酶，(8)(L)-核酮糖-1-磷酸醛缩酶。反应之下的基因名称对应于编码具有相应活性的酶的大肠杆菌基因。
图2.通过(D)-木糖同化的合成途径的乙二醇体外合成。(A)10mM乙二醇溶液和在(B)由(D)-木酮糖-1激酶(Khk-C，0.005单位/mL)、(D)-木酮糖-1-磷酸醛缩酶(AldoB，1单位/mL(Sigma-Aldrich-A6338))和乙醇醛还原酶(GldA，1单位/mL(Sigma-Aldrich G3512-250U))构成的反应混合物中的或在(C)(D)-木酮糖-1激酶(Khk-C，0.005单位/mL))和乙醇醛还原酶(GldA，1单位/mL(Sigma-Aldrich G3512-250U))中的HPLC色谱图。在37℃将所述酶在含有100mM Hepes；85mM KCl；7.5mM MgCl2，pH＝7；2mM ATP；5mM ZnCl2；0.4mM NADH的Hepes反应缓冲液中温育3h。通过加入5mM(D)-木酮糖引发反应。
图例：强度(纵坐标)作为时间(以分钟计)(横坐标)的函数
图3.通过(L)-阿拉伯糖同化合成途径的乙二醇体外合成。(A)1mM乙二醇溶液和在(B)由(L)-核酮糖-1激酶，(L)-核酮糖-1-磷酸醛缩酶和乙醇醛还原酶组成的反应混合物中的HPLC色谱图。将酶在37℃在含有55mM Hepes；45mM KCl；4mM MgCl2，pH＝7；4mM ATP；0.4mM NADH的Hepes反应缓冲液中温育3小时。通过加入20mM(L)-核酮糖引发反应。
图例：强度(纵坐标)作为时间(以分钟计)(横坐标)的函数
图4.大肠杆菌菌株在含有(D)-木糖的基本培养基中的生长
图例：600nm处的OD(纵坐标)作为时间(以分钟计)(横坐标)的函数
图5.对大肠杆菌菌株MG1655ΔxylB pEXT20khk-C-aldoB的木糖进行监测的生长和代谢产物生产。
图例：600nm处的OD(左侧纵坐标)和以mM计的木糖，以mM计的乙二醇和以mM计的乙醇酸(右侧纵坐标)作为时间(以分钟计)(横坐标)的函数
图6.在10mM乙醇醛存在下温育12h后，通过候选乙醇醛还原酶突变体生产乙二醇(以mM计作为纵坐标)。
图7.表示为以mol/mol的木糖的收率(作为纵坐标)的经由(D)-木糖同化合成代谢途径的根据本发明的不同突变体中乙二醇生产的优化。
图8.表示为以mol/mol的木糖的收率(作为纵坐标)的经由(D)-木糖同化合成代谢途径的根据本发明的不同突变体中乙醇酸生产的优化。
图9.在葡萄糖和(D)-木糖存在下的基本培养基中菌株905的生长。图例：600nm处的OD(左侧纵坐标)和以mM计的葡萄糖，木糖，乙醇酸和乙酸盐(右侧纵坐标)作为时间(以小时计)(横坐标)的函数。
图10.在葡萄糖和(D)-木糖存在下的基本培养基中菌株979的生长。图例：600nm处的OD(左侧纵坐标)和以mM计的葡萄糖，木糖，乙醇酸和乙酸盐(右侧纵坐标)作为时间(以小时计)(横坐标)的函数。
图11.在作为CEN.PK-2-1菌株的唯一碳源的木糖存在下的基本培养基中的生长。图例：600nm处的OD(右侧纵坐标)和以mM计的木糖(左侧纵坐标)作为时间(以小时计)(横坐标)的函数。
图12.在基本培养基和作为TMB3001菌株唯一碳源的木糖中的生长。图例：600nm处的OD作为时间(以小时计)的函数。
图13.采用或不采用合成途径的ΔaraB菌株在基本培养基M9和(L)-阿拉伯糖中的生长。图例：600nm处的OD作为时间(以小时计)的函数。
定义：
除非另有说明，否则本申请中使用的技术和科学术语具有本领域技术人员理解的能够实现本发明的通常意义。
除非另有说明，否则下文中所描述的不同实施方式都能够在实现本发明时进行相互组合。
对于“戊糖同化途径”，根据本发明是指一种代谢途径，即在微生物中发生的一组化学反应，由一系列按序作用的酶催化，使用戊糖作为初始底物，并致使其转化而形成感兴趣的代谢物。
对于戊糖同化的天然途径，这是指涉及其在位置5上的磷酸化及其随后在天然存在于大多数真核细胞和原核细胞中的所谓磷酸戊糖代谢途径中的使用的戊糖同化。通常而言，(L)-阿拉伯糖被异构化为(L)-核酮糖，然后在位置5上被磷酸化。所获得的(L)-核酮糖-5-磷酸酯在碳C3上进行差向异构而产生(D)-木酮糖-5-磷酸酯，这是磷酸戊糖途径的一种底物。
短语“合成途径”或“合成代谢途径”根据本发明是指所述代谢途径不是由微生物天然进行的。当催化本发明的代谢途径的步骤a)或b)中的至少之一的所述微生物的至少一种酶不是天然表达时，或当所述至少一种酶在它被表达时并不催化所述至少一个步骤a)或b)时，这个条件就通常得到满足。
作为实例，(i)涉及通过非人细胞中而通常是微生物中的人源的Khk-C在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和(L)-核酮糖的戊糖的代谢途径，(ii)涉及通过微生物中的鼠李酮糖激酶RhaB在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和(L)-核酮糖的戊糖的代谢途径，和(iii)涉及通过微生物中的墨角藻糖激酶FucK在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和(L)-核酮糖的戊糖的代谢途径，都是根据本发明的合成途径。
酶RhaB和Fuck在大肠杆菌中的表达分别取决于其天然底物的存在：(L)-鼠李酮糖(rhamnulose，鼠李树胶糖)和(L)-海藻糖(fucose)。在不存在其天然底物的情况下(或当其浓度太低时)，这些酶在微生物，特别是大肠杆菌中的表达，能够以诱导型或组成型的方式在启动子的控制之下重组获得。
术语“转化”或“转染”是指在外源核酸引入后在细胞中获得新的功能基因。
关于由宿主细胞产生的蛋白或酶活性水平的术语“修饰”或“改变”是指在培养期间产生的蛋白或酶活性水平的控制，从而使这些水平根据需要增加或减少。
关于核酸或多核苷酸的术语“改变”是指相对于宿主细胞中包含的野生型对该核酸进行改变，包括通过所述核酸的部分或全部的取代，插入，缺失型突变，或者所述核酸可操作地连接到转录控制区。
对于“基因”，根据本发明是指涉及编码核糖体RNA，调控RNA，转运RNA，可操作地连接至肽、多肽或蛋白的表达的调控序列(通常包含启动子区)的DNA区段，包括先导或终止所述编码区的编码(转录成信使RNA)和非编码区域以及内含子(分隔所述编码区或外显子的非编码区)。
术语“可操作地连接”是指以其排布容许其可操作地连接的这样一种方式并列化元件。当其控制所述编码区的转录时，通常含有启动子区的调控序列会可操作地连接到编码区，并且核糖体结合位点在进行定位时会可操作地连接至编码区而使之容许进行mRNA的翻译。
术语“灭活”或“抑制”或“减效”是指基因的表达减少或降低或显著降低，或是指蛋白的，或基因产物的，通常是酶的活性减弱或降低。为此目的，能够使用本领域技术人员已知的不同方法，如：
-在基因中引入突变，导致所述基因的表达减少或活性降低的蛋白质的表达，
-通过具有低活性的启动子替代天然启动子，导致所述基因表达低，
-使用对应于蛋白的mRNA去稳定元件，或
-缺失所述基因。
通常而言，基因或蛋白的减效定义为通过所述基因表达的所述蛋白的活性降低至少50％，优选至少60％。
基因或蛋白的失活或缺失或抑制定义为所述基因的蛋白产物的残留活性小于20％，具体而言小于10％，特别是小于5％。
术语“表达”对应于基因转录和翻译成蛋白，所述基因的产物。
术语“过表达”对应于相对于同一宿主细胞中所述基因的天然表达的表达增加。通常而言，与其在宿主细胞中的天然表达相比，蛋白的过表达定义为所述蛋白的至少200％的活性。
蛋白的过表达可以通过本领域技术人员已知的各种技术获得，如：
-蛋白用于获得更具活性或耐受抑制的形式的突变，
-提高编码所述蛋白的基因的表达(例如，通过引入控制所述基因表达的特异性启动子)，
-在宿主细胞中加入基因的多个拷贝等。
与本发明相容的宿主细胞能够表达编码根据本发明的感兴趣的蛋白的一种或多种基因的内源拷贝，以及可选地表达所述基因的重组拷贝。
编码与本发明相关的酶的核酸能够通过本领域技术人员已知的任何标准技术引入宿主细胞中。例如，通过转化(化学或电穿孔)，转染，感染，转导等能够引入核酸。
编码与本发明相关的蛋白的基因能够在重组表达载体中进行染色体外表达，或能够整合到染色体内。
对于“载体”，根据本发明是指通过限制和扎结而插入了感兴趣的序列而使其可操作地连接至所述表达的调节序列作为宿主细胞中的mRNA转录物的核酸。载体由RNA或优选DNA构成，包括但不限于，质粒，噬菌粒，病毒基因组，噬菌体和细菌染色体。
根据本发明的载体可以包含用于识别用所述载体转化的细胞的一个或多个标记序列。这样的标记包括，例如，编码增加或降低对抗生素化合物的抗性或敏感性的蛋白的基因，编码其活性能够通过标准分析检测(例如，荧光素酶，半乳糖苷酶，碱性磷酸酶等)可检测的酶的基因，或改变所转化的细胞表型(例如，编码GFP，即：绿色荧光蛋白)的基因。
用于表达本发明的重组蛋白的调节序列(启动子)可以是内源性的(即，与其相关的基因的天然启动子)或外源性的调控序列。启动子能够是诱导型的或组成型的。
对于“宿主细胞”或“宿主”微生物，是指能够用核酸构建或包含一个或多个多核苷酸，具体而言，是一种或多种编码本申请中描述的酶的多核苷酸的表达载体进行转化，转染，转导等的任何类型的细胞。
激酶是通过向靶分子中加入磷酸根离子而催化磷酸化反应的转移酶组的酶。
氧化还原酶是通过转运H+离子和电子而催化氧化还原反应的酶。它们与氧化还原辅酶(NAD，FAD，FMN等)有关。
脱氢酶是通过将一种或多种离子(H+)转运到受体，通常是NAD+/NADP+型辅酶或作为FAD或FMN的辅酶而氧化底物的酶。
醛脱氢酶是催化醛氧化的脱氢酶类型的酶。
当本申请中提及的酶通过其比活性鉴定时，这种定义包括具有相同比活性并存在于不同细胞和尤其是不同微生物中的所有多肽。因此，本发明还涉及本申请中提及的具有与参考蛋白相同活性的所述参考蛋白的同源蛋白，以及编码所述同源蛋白的基因。
在不存在说明书的情况下，本申请中提及的基因和蛋白参照大肠杆菌(特别是所述MG1655株)进行鉴定。Khk-C和醛缩酶B参照智人(H.sapiens)进行鉴定。然而，在本申请中鉴定的蛋白质和由此与所述蛋白(以及编码它们的基因)同源的基因都能够在各种微生物中找到。
与根据本发明的参考蛋白同源的蛋白具有相同的功能，即，对于酶的情况，催化与参考酶相同的反应。与编码本发明的参考蛋白的基因同源的基因会编码如上所定义的同源蛋白。
通常而言，根据蛋白及其序列的名称，本领域技术人员能够在其他生物体中识别本申请中提及的蛋白的等同物。这种常规工作通常使用通过与来自不同生物体的其它蛋白的序列比对而识别的共有序列进行实施。
还优选的是，与参考蛋白同源的蛋白对应于与参考蛋白的序列具有至少30％的序列同一性，优选40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％的同一性。
为了测定本发明目的的两个氨基酸序列的同一性百分比，比对所述序列而进行最佳比较。在待比对的序列之一中引入间隙而使之容许进行最佳比对，并且对于所述比较能够忽略非同源序列。
两个比较的氨基酸序列的同一性百分比能够按照D.Vetet和J.G.Voet的书籍，生物化学(Biochimie)(第2版，De Boeck&Larcier，2005，第7.4章，B节)所述而获得。使用CLUSTAL W软件(版本1.82)以以下参数进行比对：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝《full》；(3)OUTPUT FORMAT＝《aln w/numbers》；(4)OUTPUT ORDER＝《aligned》；(5)COLOR ALIGNMENT＝《no》；(6)KTUP(word size)＝《default》；(7)WINDOWLENGTH＝《default》；(8)SCORE TYPE＝《percent》；(9)TOPDIAG＝《default》；(10)PAIRGAP＝《default》；(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE＝《none》；(12)MATRIX＝《default》；(13)GAP OPEN＝《default》；(14)END GAPS＝《default》；(15)GAP EXTENSION＝《default》；(16)GAP DISTANCES＝《default》；(17)TREE TYPE＝《cladogram》以及(18)TREE GRAPDISTANCES＝《hide》。
木质纤维素由不同比例的木质素，半纤维素和纤维素构成。半纤维素是木质纤维素生物质的三个主要组分之一，占所述生物质按重量计约20-40％。
对于“半纤维素”，根据本发明是指复合多糖群，其特征在于它们在碱性溶液(例如，KOH 1M)中的可溶性及其在水中的不溶性。半纤维素在结构上定义为多糖，其骨架由β-(1,4)-D-吡喃糖残基构成，其中O4处于赤道位置。短侧链连接于骨架上。半纤维素包括木聚糖(xylans)，阿拉伯木聚糖(arabinoxylans)，木葡聚糖(xyloglucans)，葡糖醛酸木糖(glucuronoxylans)和葡甘露聚糖(glucomannans)。其水解，例如，通过在高压和高温下使木质纤维素材料与稀硫酸接触，会导致单体糖形成。根据原料的性质和水解条件，木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的百分比基于木质纤维素水解产物的总重量分别为按重量计60-80％，10-30％和10-30％。
从硬木(通常是落叶树)，玉米芯，草，叶和报纸获得的木质纤维素特别富含半纤维素糖(Jorgensen H et al.,Enzymatic conversion of lignocellulose intofermentable sugars:Challenges and opportunities.Biofuels,Bioprod.Bioref.2007,1,119–134)。它们是根据本发明用于实施改变的微生物的优选原料来源。对于“引物”，是指与模板的起始互补的短DNA序列，其充当了通过DNA聚合酶合成所述模板的互补链的起始点的作用。
具体实施方式
戊糖同化的合成途径
本发明涉及一种用于在表达戊糖同化合成途径的重组微生物中转化戊糖而生产至少一种感兴趣的代谢物的方法。
根据本发明的这种方法包括：
(i)培养表达用于戊糖同化合成途径的重组微生物的操作，通常如图1中所示，其至少包括以下步骤：
a)在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和/或(L)-核酮糖的戊糖，从而分别获得(D)-木酮糖-1P和/或(L)-核酮糖-1P，
b)裂解在步骤a)结束时获得的戊糖-1-磷酸酯((D)-木酮糖-1P和/或(L)-核酮糖-1P)，从而获得乙醇醛和磷酸二羟基丙酮(DHAP)，
所述途径允许获得至少一种感兴趣的代谢物，和
(ii)回收在培养操作(i)结束时获得的所述至少一种感兴趣的代谢物的操作。
对于“磷酸化”，是指有利地加入磷酸酯基团，在本发明的情况下是磷酰基PO3 2-。
对于“感兴趣的代谢物”，具体而言是指乙醇醛和DHAP，但还包括其能够通过这些化合物的氧化或还原反应而获得的衍生物，特别是乙二醇(EG)，乙醇酸(AG)及其衍生物。
对于“乙醇酸衍生物”，具体而言是指：
-乙醇酸酯，如乙醇酸乙酯或乙醇酸甲酯，以及：
-含羟乙酸酯的聚合物，如聚乙醇酸，
-以及衍生自乙醇酸氧化的乙醛酸。
应当注意的是，在本申请中，术语“乙醇酸”和“乙醇酸酯”以及术语“乙醛酸”和“乙醛酸酯”用作同义词。
优选的是，由微生物表达的戊糖同化合成途径因此有利地进一步包括以下步骤：
c)将在步骤b)结束时获得的乙醇醛还原成乙二醇，或
c')将在步骤b)结束时得到的乙醇醛氧化成乙醇酸。
在这样的实施方式中，在根据本发明的戊糖同化合成途径结束时获得的感兴趣的代谢物是乙二醇和/或乙醇酸及其衍生物。
本发明的酶：
如图1所示，戊糖同化合成途径由一组酶进行催化。
催化根据本发明的戊糖同化合成途径的磷酸化步骤a)的重组酶是在位置1磷酸化(D)-木酮糖或所述(L)-阿拉伯糖的激酶。
这样的酶例如选自由以下酶组成的组中：
-酮基己糖激酶，优选酮基己糖激酶的同工型C(KhK-C)，
-鼠李酮糖激酶(RhaB)和
-墨角藻糖激酶(FucK)。
酮基己糖激酶C由通常在智人中发现的khk基因进行编码。在优选的实施方式中，使用编码序列SEQ ID NO:1的Khk-C的智人基因。
本发明的鼠李酮糖激酶以及墨角藻糖激酶分别由通常在大肠杆菌中发现的rhaB和fucK基因编码。因此，在一些实施方式中，使用编码序列SEQ ID NO:6的鼠李酮糖激酶B(RhaB)的大肠杆菌rhaB基因或编码序列SEQ ID NO:5的墨角藻糖激酶(FucK)的大肠杆菌fucK基因。
催化裂解步骤b)的酶是将(D)-木酮糖-1P或(L)-核酮糖-1P断裂成乙醇醛和DHAP的醛缩酶。
根据本发明的醛缩酶能够选自由通常在智人中发现的aldoB基因编码的醛缩酶B和由通常在大肠杆菌中发现的fbaB基因编码的大肠杆菌的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶B。
因此，在一些具体实施方式中，使用编码序列SEQ ID NO:2的醛缩酶B的智人基因aldoB，或编码序列SEQ ID NO:9的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶B的大肠杆菌基因fbaB。
催化还原步骤c)的酶是乙醇醛还原酶。
适用于本发明的乙醇醛(或醛)还原酶能够，例如，选自由以下编码的醛还原酶：
-yqhD基因，通常存在于大肠杆菌中，编码序列SEQ ID NO:4的醛还原酶YqhD，
-由通常存在于大肠杆菌中的gldA基因编码的甘油脱氢酶，编码序列SEQ ID NO:51的甘油脱氢酶GldA，和
-由通常存在于大肠杆菌中的FucO基因编码的L-1,2-丙二醇氧化还原酶，编码序列SEQ ID NO:52的L-1,2-丙二醇氧化还原酶FucO。
催化氧化步骤c')的酶是乙醇醛脱氢酶。
适用于本发明的乙醇醛脱氢酶例如是由编码乳醛脱氢酶AldA的大肠杆菌中通常存在的序列SEQ ID NO:3的aldA基因编码的乙醇醛脱氢酶。
所述酶有利地分别在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸酯)(NAD(P)H)，这种氧化还原辅酶的还原的或氧化的形式存在下，分别催化还原和氧化步骤。
在一些实施方式中，本发明中使用的微生物有利地天然或重组地表达至少一种以下酶：
-将(D)-木糖转化为(D)-木酮糖的木糖异构酶，如例如由大肠杆菌的xylA基因编码的酶，
-木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，如例如由酵母舍弗列斯酵母(Scheffersomycesstipitis)的XYL1和XYL2基因编码的酶，
-将(L)-阿拉伯糖转化为(L)-核酮糖的L-阿拉伯糖异构酶，如例如由大肠杆菌的araA基因编码的酶，和/或
-阿拉伯糖还原酶和阿拉伯糖醇脱氢酶。
甚至优选的是，本发明的微生物天然或重组地表达至少一种将戊糖转运到细胞中的蛋白，并且包括：
-转运(L)-阿拉伯糖的蛋白，如例如由大肠杆菌的araE，araF，araG或araH基因编码的酶；和/或
-转运(D)-木糖的蛋白，如例如由大肠杆菌的xylE，xylF，xylG或xylH基因编码的蛋白，或由编码所述糖的通透酶的galP基因编码的蛋白，或由酿酒酵母的gal-2a基因编码的蛋白。
重组微生物：
对于“微生物”，根据本发明是指选自原核细胞，包括古细菌，细菌或原核微藻，以及真核细胞，包括真菌，酵母和植物细胞以及真核微藻的宿主细胞。
对于“重组微生物”或“经遗传改变的微生物”或“经改变的微生物”，根据本发明是指在其基因组中，例如通过加入外源(或重组)核酸，或通过改变内源核酸进行改变的宿主细胞。
适用于本发明的细菌能够例如选自肠杆菌科，梭菌科，芽孢杆菌科，链霉菌科，链球菌科，甲基杆菌科和棒杆菌科。
特别适合本发明的细菌通常能够选自由大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，丙酮丁醇梭菌，扭脱甲基杆菌和乳酸乳球菌组成的组中。
适用于本发明的酵母能够，例如，选自由酵母科，毕赤酵母科和裂殖酵母科属。
特别适用于本发明的酵母通常能够选自由酿酒酵母菌，粟酒裂殖酵母菌，乳酸克鲁维酵母菌，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，杰丁毕赤酵母，树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)组成的组中。
适用于本发明的真菌属通常能够选自由青霉菌属，曲霉菌属，金孢子菌属和木霉属组成的组中。
在本发明的优选实施方式中，使用大肠杆菌，树干毕赤酵母或酿酒酵母作为宿主微生物。
有利的是，使用天然能够同化(D)-木糖和/或(L)-阿拉伯糖的微生物。
优选的是，根据本发明的戊糖同化合成途径涉及至少一种催化磷酸化a)、裂解b)，还原c)或氧化c')之一的酶由微生物进行重组表达。
通常而言，至少催化磷酸化步骤a)的酶和/或至少催化本发明方法的裂解步骤b)的酶是重组表达的。
在一个具体实施方式中，催化磷酸化a)、裂解b)和还原c)和/或氧化c')步骤的酶是重组酶。
在一些实施方式中，所述重组酶中的至少之一是由异源基因(即，非天然表达于参考宿主生物中)编码的酶，具体而言至少一种催化a)和b)步骤的酶由异源基因编码。
优选的是，微生物至少表达KhkC。
更优选的是，微生物重组表达：
-催化戊糖同化途径的步骤a)的KhkC(具体而言，KhkC，由序列SEQ ID NO:1的khkC基因编码的智人)，和
由aldo-B基因(具体而言，序列SEQ ID NO:2的aldoB基因)编码的醛缩酶B，或由fbaB基因(具体而言，序列SEQ ID NO:9的fbaB基因)编码的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶。
在一个具体实施方式中，分别催化本发明的戊糖同化合成途径的步骤c)和c')的乙醇醛还原酶和/或乙醇醛脱氢酶是由微生物天然表达的内源性酶。
在一些实施方式中，本发明的同化合成途径的内源性酶能够过表达，特别是编码还原c)或氧化c')步骤的酶。具体而言，乙醇醛脱氢酶能够经过过表达从而刺激氧化步骤c')。例如，在大肠杆菌中，能够过表达编码乙醇醛脱氢酶的aldA基因。
在本发明的一些实施方式中，分别将(D)-木糖或(L)-阿拉伯糖转化为(D)-木酮糖或(L)-核酮糖的酶，即如前所述的异构酶或差向异构酶，或在细胞中转运(D)-木糖或(L)-阿拉伯糖的蛋白，都过表达于生物中。
在本发明的一个实施方式中，编码催化步骤a)和b)的酶的核酸在相同启动子控制之下克隆到表达载体中的操纵子中。在一些实施方式中，编码催化步骤a)、b)和c)和/或c')的酶的核酸克隆到操纵子中。
重组蛋白表达受到诱导型或优选组成型启动子控制。
戊糖同化合成途径的优化：
在一些实施方式中，宿主细胞的一种或多种内源性酶的活性也能够进行改变从而使之优化乙二醇和/或乙醇酸的生产。
以下将描述对本发明的微生物能够作出一些改变。
A)优选的是，所使用的微生物经过遗传改变而减效或抑制参与戊糖磷酸化同化的天然途径的内源性酶，具体而言是催化戊糖循环的位置5上的磷酸化的酶，而更具体而言是(L)-核酮糖-5-激酶和/或(D)-木酮糖-5-激酶的活性。
举例而言，分别编码大肠杆菌中通常存在的核酮糖-5-激酶和木酮糖-5-激酶的araB和/或xylB基因能够进行减效或优选灭活。
这种改变提供用于将碳流优先引导至本发明的戊糖同化合成途径，并通过所述合成途径优化乙二醇和/或乙醇酸生产。
在本发明的一个实施方式中，使用了其中缺失xylB基因，特别是序列SEQ ID NO:53的编码木酮糖激酶的xylB基因的微生物。
B)乙醇醛还原酶和/或乙醇醛脱氢酶型酶的活性也能够进行改变从而使之将本发明的同化合成途径引导至乙醇酸或乙二醇生产。
举例而言，由编码乙醇醛脱氢酶的aldA基因编码的酶，以及编码乙醇醛还原酶的gldA，fucO和/或yqhD基因，能够显著地过表达从而促进乙二醇的生产，或减效或灭活从而促进乙醇酸的生产。
有利的是，通过使用其中关于内源性酶表达进一步进行了以下改变至少之一(而优选二者)的微生物优化乙二醇产生：
-编码由微生物表达的至少一种乙醇醛还原酶，优选主要乙醇醛还原酶的基因的过表达；
-编码催化步骤c'的乙醇醛脱氢酶的基因，例如，aldA基因的灭活或缺失。
有利的是，乙醇酸的生产通过使用其中关于内源性酶表达进行以下改变至少之一(而优选至少前两个)的微生物能够进行优化：
-编码乙醇醛脱氢酶，例如，由aldA基因编码的乙醇醛脱氢酶的基因的过表达；
-特别是通过减效或灭活乙醇酸氧化酶，例如，通过使编码至少一个乙醇酸氧化酶亚基的至少一个glcDEFG基因失活而降低乙醇酸降解；
-可选地灭活编码乙醇醛还原酶的基因。
优选的是，根据本发明的微生物进一步包含对于本发明的戊糖同化合成途径的表达很独特的，而对于这个途径的磷酸化a)和裂解b)步骤的催化尤其独特的改变，以上点A)和B)中描述的附加改变至少之一。
更优选的是，微生物至少包含在A)点中描述的改变。根据实施方式，这个改变能够与B)点的改变组合而优化乙二醇或乙醇酸的生产。
上述改变能够进行组合。
具体而言：
-为了优化乙二醇生产，催化位置5的戊糖磷酸化的酶的灭活，包括(L)-核酮糖-5-激酶和/或(D)-木酮糖-5-激酶(如xylB或araB基因)，能够与乙醇酸合成途径的灭活(特别是通过编码乙醇醛脱氢酶的基因，例如aldA基因的灭活)组合。这些灭活能够与编码催化本发明的方法的步骤c)的乙醇醛还原酶的基因的过表达进行组合；
-为了优化乙醇酸生产，催化位置5的戊糖磷酸化的酶，包括(L)-核酮糖-5-激酶和/或(D)-木酮糖-5-激酶(特别是由xylB或araB基因编码的)的灭活能够与通过使编码其亚基的至少一个glcDEGF基因灭活的乙醇酸氧化酶的灭活组合和/或与由aldA基因编码的乙醇醛脱氢酶的过表达组合。可选地，编码催化本发明方法的步骤c)的乙醇醛还原酶的基因也被灭活。
例如，经过改变而优化乙二醇生产的微生物至少表达对应于先前描述的步骤a)，b)和c)磷酸化，裂解和还原活性，优选酶KhkC，醛缩酶B(特别是由aldoB基因编码的)以及乙醇醛还原酶(作为醛还原酶YqhD或甘油脱氢酶GldA或甚至由fucO基因编码的酶)，并且包括以下改变：
-编码醛脱氢酶的基因，包括aldA基因的缺失；
-编码催化位置5处(D)-木酮糖和/或(L)-核酮糖的磷酸化的酶，更具体而言是(D)-木酮糖-5-激酶和/或(L)-核酮糖-5-激酶的基因，包括araB和/或xylB基因的缺失。
C)除了本发明的合成途径之外，还有可能使用经遗传改变的微生物从而促进通过天然途径的乙醇酸生产。
实际上，本发明人进一步发现，通过将根据本发明发挥功能的同化合成途径与导致平行于通过所谓的乙醛酸途径的乙醇酸生产的遗传改变进行组合，也可以进一步提高乙醇酸的生产。
因此，正如专利申请WO2010/108909中，根据本发明的微生物因此能够具有例如促进由乙醇酸的乙醛酸生产的改变。
因此，尤其是在裂解步骤b)结束时获得的磷酸二羟基丙酮(DHAP或磷酸甘油酮)能够包括糖酵解、三羧酸循环(CAT)和乙醛酸途径，CAT分流(shunt)的天然途径(参见Neidhardt，F.C.(主编)的综述，R.Curtiss III,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter,and H.E.Umbarger(eds).1996.Escherichia coli and Salmonella:Cellular and Molecular Biology.AmericanSociety for Microbiology)。
因此，乙醛酸途径的优化可以通过至少一个以下改变，优选通过以下改变的组合而获得：
i)编码乙醛酸还原酶的基因的过表达；
ii)编码异柠檬酸裂解酶的基因的过表达，可选地与编码其转录抑制子的基因的缺失一起；
iii)编码苹果酸合酶的基因的缺失；
iv)编码乙醛酸聚醛酶的基因的缺失；
v)编码乙醇酸氧化酶或乙醇酸脱氢酶的基因的缺失；
vi)编码2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶，包括恩特纳-杜德洛夫醛缩酶和/或磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因的缺失；
vii)有氧反应抑制子基因(即，编码参与呼吸代谢的基因的抑制子的基因)，特别是arcA基因的缺失；
viii)异柠檬酸脱氢酶表达的减效和尤其是缺失；
ix)可选地，编码乙醇酸内化系统的基因的缺失；和
x)可选地，导致副产物生产如乙酸盐、乳酸盐或乙醇生产的代谢途径的减效。
在生产乙醇酸的重组微生物是大肠杆菌的情况下，上述改变对应于
i)ghrA基因和/或ycdW基因的过表达；
ii)aceA基因的过表达，连同或不连同其转录抑制子，iclR的缺失一起；
iii)aceB和glcB基因的缺失；
iv)gcl基因的缺失；
v)选自glcD，glcE，glcF或glcG中至少一个基因的缺失；
vi)edd-eda基因的缺失；
vii)arcA基因的缺失；
viii)icd基因的表达的减效，优选缺失；
ix)glcA，lldP和/或yjcG基因的缺失；
x)ackA-pta，poxB，ldhA和/或adhE基因的缺失。
有利的是，进行以下改变从而优化根据本发明的微生物，例如大肠杆菌中的乙醇酸生产：
i)ghrA基因的过表达；
ii)aceA基因的过表达，可选地连同iclR基因的缺失一起；
iii)aceB和glcB基因的缺失；
iv)gcl基因的缺失；
v)选自glcD，glcE，glcF或glcG中的至少一种基因的缺失；
vi)edd-eda基因的缺失；
vii)arcA基因的缺失；
viii)icd基因的缺失。
在一个实施方式中，携带上述改变的微生物不表达催化位置5处磷酸化(L)-核酮糖和/或(D)-木酮糖的酶，更具体而言(L)-核酮糖-5-激酶和/或(D)-木酮糖-5-激酶。因此，在一些实施方式中，使用了缺失xylB和/或araB基因的微生物。
另外，微生物(有利地是大肠杆菌)表达一种或多种催化位置5处(L)-核酮糖和/或(D)-木酮糖磷酸化的酶，更具体而言(L)-核酮糖-5-激酶和/或(D)-木酮糖-5-激酶。通常而言，微生物表达xylB和/或araB基因。当其在含葡萄糖，特别是至少含有葡萄糖和木糖或木酮糖的培养基上培养时，这种微生物会提供优异的乙醇酸产率。优选培养基主要含有葡萄糖。
D)最后有可能的是，为了提高乙二醇或乙醇酸生产，使用至少一种编码糖载体的基因(例如，编码糖通透酶的galP基因和/或酿酒酵母的gal-2a基因)过表达的微生物。有利的是，这种基因按照组成型表达。
在本发明的最优选实施方式中，为了生产乙醇酸，使用组合上述段落A)至D)中描述的改变的微生物。具体而言，使用组合上述段落B)，C)和D)中报道的改变从而生产乙醇酸的微生物。
有利的是，这种微生物表达KhkC和醛缩酶B并且包含以下改变：
-编码乙醇醛脱氢酶的基因的过表达，例如，由aldA基因编码的乙醇醛脱氢酶；
-ghrA基因的过表达；
-aceA基因的过表达，可选地与iclR基因的缺失一起；
-aceB和glcB基因的缺失；
-gcl基因的缺失；
-选自glcD，glcE，glcF或glcG中的至少一个基因的缺失；
-edd-eda基因的缺失；
-arcA基因的缺失；
-icd基因的缺失；
-galP基因的过表达。
根据选择的培养基底物，这种微生物也可以携带或不携带xylB基因和/或araB基因的缺失。优选的是，当微生物培养于包含葡萄糖的底物上时，维持xylB基因和/或arab基因的表达。
类似地，取决于培养基底物，正如先前所述，使用重组或非重组表达分别将(D)-木糖或(L)-阿拉伯糖转化为(D)-木酮糖或(L)-核酮糖的酶的微生物，即(D)-木酮糖异构酶或(L)-阿拉伯糖异构酶，或(D)-木糖还原酶/(D)-木糖醇脱氢酶，或(L)-阿拉伯糖还原酶/(L)-阿糖醇脱氢酶。
通常而言，但不限于，本发明的方法的乙二醇理论产率为约1mol乙二醇/mol木糖或阿拉伯糖。
本发明方法的乙醇酸理论产率为约1mol乙醇酸/mol木糖或阿拉伯糖，而不会活化乙醛酸循环。当并行运行合成途径和乙醛酸循环时，理论产率为约2mol乙醇酸/mol木糖或阿拉伯糖。
微生物的培养：
根据本发明的微生物的培养条件可以根据本领域技术人员已知的常规技术进行调整。
通常而言，本发明中用作宿主细胞的细菌能够培养于所有类型和组成的培养基中。
培养基通常是包含，或补充各种化合物，特别是包含不同碳源，而特别是戊糖，如(D)-葡萄糖，(D)-木糖，(L)-阿拉伯糖和/或木质纤维素生物质水解物，特别是半纤维素，淀粉及其衍生物的碳培养基。
在一些实施方式中，培养基包含小于5％，特别是小于4％，小于3％，小于2％或小于1％的鼠李酮糖(rhamnulose)。
对于“生物质水解物”，具体而言是指木质纤维素水解产物，特别是基于水解产物的总重量计包含至少按重量计20％的木糖和/或至少5％，特别是至少10％的阿拉伯糖的水解产物。因此，在优选的实施方式中，因此使用了硬木、玉米芯和纸的木质纤维素水解产物。
与培养条件相关的其它参数，如pH或温度，能够通过常规实验进行优化。
在一些实施方式中，培养温度范围为25-43℃，并且基本上取决于宿主细胞和培养基类型。举例而言，当宿主细胞是大肠杆菌时，最适培养温度通常为30-38℃。
培养持续时间还取决于上述培养参数。通常而言，细胞能够培养6-300小时。
优选的是，从培养基中回收根据本发明的微生物培养结束时获得的感兴趣的代谢物。
本申请还涉及本申请中所描述的重组微生物。
具体而言，本发明涉及根据本发明的表达戊糖同化合成途径的微生物。
根据不同的实施方式，维持或灭活戊糖同化天然途径(例如，通过使编码木酮糖-5-激酶和/或核酮糖-5激酶的基因缺失)。
根据本发明的微生物至少表达：
-编码能够在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和/或(L)-核酮糖的戊糖的核酸，和
-编码能够将(D)-木酮糖-1-磷酸酯和/或(L)-核酮糖-1-磷酸酯裂解成乙醇醛和DHAP的醛缩酶型的酶的核酸，如前所述。
优选重组表达这些酶中至少之一。
在一些实施方式中，至少一种这些酶由外源核酸编码，并优选微生物至少表达：
-编码酮基己糖激酶的同工型C(通常存在于智人中)的核酸，和
-至少一种编码醛缩酶B的核酸。
在一些实施方式中，如上述点A)至E)所述进一步修饰微生物。
例如，适于生产乙醇酸的微生物可以有利地包括以下改变：
-编码乙醇醛脱氢酶，例如，由aldA基因编码的乙醇醛脱氢酶的基因的过表达；
-ghrA基因的过表达；
-aceA基因的过表达；
-可选地iclR基因的缺失；
-gcl基因的缺失；
-选自glcD，glcE，glcF或glcG基因中的至少一种基因的缺失；
-aceB和glcB基因的缺失；
-edd-eda基因的缺失；
-arcA基因的缺失；
-icd基因的缺失；
-可选地xylB和/或araB基因的缺失。
实施例
培养基组成
Luria-Bertani(LB)培养基
对于1L培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g在1升纯水中的氯化钠。使用前将培养基高压灭菌。为了在固体培养基中使用，在高压灭菌前将2％的琼脂加入到培养基中。
基本培养基M9
对于1升培养基：18g Na2HPO4*12H2O；3g KH2PO4；0.5g NaCl；2g NH4Cl；0.5gMgSO4*7H2O；0.015g CaCl2*2H2O；1mL微量元素溶液(每升含有0.04g NaEDTA*2H2O，0.18gCoCl2*6H2O；ZnCl2SO4*7H2O；0.04g Na2MoO4*2H2O，0.01g H3BO3，0.12g MnSO4*H2O，0.12gCuCl2*H2O)；文本中指定用量的(D)-葡萄糖，(D)-木糖和(L)-阿拉伯糖。培养基调节至pH 7并过滤。
YPD
YPD培养基用作酿酒酵母生长的富集培养基。对于1升而言，10g酵母提取物，20g细菌蛋白胨(bacto-peptone)。培养基在使用前进行高压灭菌，并加入20g过滤后的葡萄糖。为了在固体培养基中使用，在高压灭菌前将2％琼脂加入到培养基中。
酿酒酵母的基本培养基SCD
对于1升，1.7g无氨基酸的酵母氮源(Yeast Nitrogen Base)，5g无氨基酸硫酸铵，滴落0.940g除了用于证实营养缺陷型的那些之外的必需氨基酸，900mL水，并且然后整体高压灭菌。当在固体培养基中使用时，加入20g细菌琼脂。加入100mL 20％糖溶液。
M9培养基+木糖中的生长测试
所有培养在含有50mL培养基的250mL锥形瓶中进行，并以200RPM搅拌培养物。
在37℃将待测细胞在LB培养基中培养过夜。随后使用预培养物在M9培养基+10g/L葡萄糖中接种至OD600nm约0.2。在指数生长期(OD为0.6-1)，以1mM加入IPTG，而培养物温育16-18小时。在该温育期后，将细胞用无菌水洗涤两次，并按照文本中指定的量在M9培养基+1mM IPTG+葡萄糖和/或木糖和/或阿拉伯糖中重新接种至OD600nm约0.2。监测OD600nm，并等分试样取样，离心并注入HPLC进行代谢物分析。
菌株构建方法
细菌转化
在商业化学感受态细胞(chemo-competent cells)或实验室制备的细胞上实施细菌转化。根据氯化钙方案制备制成化学感受态的细胞(Dagert and Ehrlich,1979)。然后通过在20分钟期间使要转化的质粒与冰上的感受态细菌接触而实施转化，并随后在42℃进行45秒热休克(thermal shock)。将细胞在冰上置换5分钟，而随后加入1mL LB培养基之后在37℃温育1小时。随后将细胞散布于补充有相应选择标记的固体LB培养皿上。
通常，除了在本发明的上下文中开发的质粒之外，使用了以下质粒：pACT3(Dykxhoorn et al.,1996)，pEXT20(Dykxhoorn et al.,1997)，pGEM-T(Promega)，pET28a(Novagen)，pCP20(Cherepanov&Wackernagel,1995)，peX-A-aldoB(Eurofins)和pET11-KHK-C(Asipu et al.,2003)。
通过从KEIO菌株转导卡那霉素盒的基因缺失
为了将大肠杆菌KEIO菌株携带的基因缺失转移到大肠杆菌MG1655的给定受体菌株中，实施了转导。
从LB+50μM卡那霉素在37℃培养过夜的Keio菌株，产生噬菌体裂解物。在10ml由200μl过夜培养物在2g/L葡萄糖和5mM CaCl2存在下早上培养的预培养物上，加入200μl噬菌体P1。培养允许进行超过2小时足以进行噬菌体引起的细胞裂解。用200μl氯仿终止反应。将整个以4500×g离心10min，并回收9ml含有噬菌体的上清液，并在4℃用200μl氯仿储存。将受体菌株预培养过夜。由该培养物回收1.5ml并离心。沉淀颗粒物吸收于600μl 10mMMgSO4+5mM CaCl2中。通过将100μl细胞和100μl噬菌体裂解物合并一起而进行转导。将整体在30℃不搅拌温育30min。随后，加入100μl 1M柠檬酸钠以及1ml的LB。通过允许细胞在37℃搅拌1小时期间生长而发生整合卡那霉素盒的菌株的表型表达。然后将细胞铺展于含有选择标记的LB培养基培养皿上并允许生长过夜。第二天，通过PCR检测所形成的菌落的选择盒和缺失基因的不存在。
FRT序列侧接选择盒的切除方案
通过使用由质粒pCP20(Cherepanov&Wackernagel，1995)携带的FLP重组酶从染色体上切下盒，这会留下含有FRT位点的瘢痕区(scar region)。pCP20是携带氨苄青霉素和氯霉素抗性的质粒，这呈现了热敏复制和热诱导的FLP重组酶表达。因此含有盒的标记抗性突变体用pCP20转化，而携带质粒抗性的氨苄青霉素抗性转化体在30℃进行选择。然后，将它们在37℃培养于固体LB上，并随后测试氨苄青霉素抗性损失。随后通过采用用于将其用Taq聚合酶(NEB)扩增的引物的PCR验证选择盒的切除。通过重复操作而获得多个缺失。
酿酒酵母中质粒上的基因克隆
酿酒酵母中的基因克隆利用了酵母基因重组能力。要克隆的基因与启动子序列和终止子序列缔合，产生三个要在先前线性化的质粒中扎结的片段。为此，在引物上标识了40个核苷酸同源区。这40个核苷酸的同源性允许酵母的重组系统在转化后扎结所有片段。使用聚合酶PhusionTM通过PCR扩增每个片段。根据Gietz和Woods(2002)的方法，将所有片段和线性化的宿主载体转化到酿酒酵母感受态菌株中。在转化体生长后，根据Zeugin和Hartley(1985)的方法提取质粒。然后使用质粒转化大肠杆菌DH10B菌株。从大肠杆菌提取质粒，通过测序证实，并用于转化酿酒酵母受体菌株。
酿酒酵母中质粒的提取
在转化后，将所获得的菌落重新悬浮于水中，并随后离心而进行质粒提取。将细胞沉淀颗粒物重新悬浮于400μl含有50mM葡萄糖、10mM EDTA、25mM Tris-HCl pH8并补充有RnaseA 0.1mg/ml的4℃缓冲液中。使用400μl含有0.2M NaOH和1％SDS的溶液裂解细胞。然后以总体积的三分之一的量加入玻璃珠，并将细胞在4℃涡旋10min。该步骤之后是以13,000RPM离心60秒。取出700μl上清液，放入2ml的新管中。加入325μl 3M KAc的4℃pH 5.5溶液。将混合物在冰上培养10min，并随后在4℃以13,000RPM离心10min。取上清液700μl并置于新管中。加入700μl异丙醇，并将整个强烈搅拌之后在室温下培养10min。然后在室温下以13,000RPM离心30min。此后，除去上清液，并将沉淀颗粒重新悬浮于500μl-20℃的70％乙醇中，并随后离心5min。去除上清液。再次重复该步骤，随后将沉淀颗粒干燥直到乙醇消失。然后将沉淀颗粒置于30μl H2O中。
通常，用于大肠杆菌中途径表达的引物列于表3中，并且用于酿酒酵母中途径表达的引物列于表4中。
来自质粒pET28a的蛋白的表达和纯化
携带感兴趣的基因的含有pET28a的大肠杆菌菌株BL21(DE3)在200rpm的搅拌下，37℃过夜培养于500ml erlenmeyer中的100ml LB培养基中。
第二天，将10-50ml含有感兴趣的基因的这种含pET28a的大肠杆菌BL21(DE3)预培养物在37℃培养于补充有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中。
通过向达到OD600nm约0.7的培养物中加入1mM IPTG开始蛋白表达。37℃培养3h后，将细胞离心，并将获得的颗粒在-80℃冷冻。为了纯化如此表达的蛋白，在1ml裂解缓冲液(50mmol/L Hepes[pH7.5]，3mol/L NaCl，0.25mmol/l)中提取细胞，并保持于冰上1h。
然后将细胞超声处理，并在4℃以13,000RPM离心10min除去碎屑。此后，在3ml裂解缓冲液中用0.3ml树脂制备树脂TalonTM。然后将整个悬浮液载于树脂上，并在室温下培养20min之后在4℃以2500RPM离心5min。用裂解缓冲液以10倍树脂体积洗涤沉淀颗粒，并在室温下温育10min。用含有15mM咪唑的裂解缓冲液重复该过程。然后，用500μl200mM咪唑洗涤沉淀颗粒。整个在4℃5分钟内以2500RPM重新离心。回收上清液，产生洗脱液1。重复该过程，得到洗脱液2。纯化的蛋白存在于待测试的不同洗脱液中。
分析方法
为了测定来自培养物上清液的合成路径产物的量，使用了配备有自动进样器和烘箱(Shimadzu CTO-20A)并偶联于检测器RID-10A(Shimadzu)和UV SPD-20A(Shimadzu)的HPLC(Ultimate 3000，Dionex)。化合物在装有预柱(Aminex)的Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)柱上分离。分析测定在35℃的温度下完成，流速为0.5ml/min的1.25mM H2SO4。在装置中注入20μl样品。
实施例1：(D)-木酮糖-1-激酶和(L)-核酮糖-1-激酶活性的证明
pET28a中候选木酮糖激酶的克隆：khkC，rhaB和fucK
pET28a中的khkC(SEQ ID N°1)，rhaB(SEQ ID N°6)和fucK(SEQ ID N°5)基因的克隆如下文所示进行。通过NdeI/EcoRI从pET11a-khk-C(Asipu et al.,2003)消化khk-C基因。它通过由先前用相同酶消化的pET28a的标记-组氨酸后的连接酶T4(Biolabs)的扎结作用而插入。分别采用表3中所列的以下引物P1/P2，P3/P4从大肠杆菌基因组DNA中通过PCR扩增rhaB和fucK，实施rhaB和fucK克隆，然后将片段克隆到载体pGEM-T(Invitrogen)中。然后通过NcoI和BamHI将它们消化，并随后在预先用相同酶消化的MCS处扎结到质粒pET28a中。扎结产物转化于大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。由此获得的载体pET28-khk-C，pET28-rhaB和pET28-fucK通过测序验证它们是否含有具有正确序列的基因。
候选(D)-木酮糖激酶和(L)-核酮糖激酶动力学参数的测定
蛋白如前进行表达和纯化，并且基于以下原理通过丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶偶联反应测定酶的动力学参数(给定的实施例对应于(D)-木酮糖-1P醛缩酶活性的定量)：
木酮糖激酶：(D)-木酮糖+ATP→(D)-木酮糖-1P+ADP
丙酮酸激酶：磷酸烯醇丙酮酸+ADP→丙酮酸+ATP
乳酸脱氢酶：丙酮酸+NADH→乳酸+NAD
反应在以下混合物中进行：0.4mM NADH(Sigma)，2mM PEP(Sigma)，4mM ATP(Sigma)在Hepes缓冲液(90mM Hepes，77mM KCl，12mM MgCl2，用KOH溶液调节至pH 7)中。在250μl的总反应混合物中加入1.25μl体积的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合物(Sigma)。反应以加入100μl(D)-木酮糖(Carbosynth)或10mM(L)-核酮糖(Sigma)开始。NADH消耗通过荧光计在340nm下监测。
表1A.激酶关于其天然底物和(D)-木酮糖的动力学参数。Khk-C、RhaB和FucK的天然底物分别是果糖，鼠李糖和墨角藻糖。
这些结果表明，能够识别出具有位置1上磷酸化(D)-木酮糖的能力的激酶。
使用相同的方法对(L)-核酮糖表征这些参数：
表1B.激酶关于其天然底物和(L)-核酮糖的动力学参数
Lhk-C对(D)-木糖和(L)-核酮糖两者都具有功能，并具有适合用于合成途径的特性。
实施例2：(D)-木酮糖-1P-醛缩酶和(L)-核酮糖-1P-醛缩酶活性的证明
编码候选醛缩酶AldoB、FbaB和AgaY的基因的克隆
通过PCR(分别使用表3中列出的引物对P5/P6，P7/P8和P11/P12)扩增aldoB，fbaB和agaY克隆候选醛缩酶。从携带aldoB的质粒peX-A-aldoB采用密码子优化(Eurofins)或从大肠杆菌基因组DNA对于fbaB和agaY分别实施这种扩增。然后将片段克隆到pGEM(Invitrogen)中。然后将它们用BamHI和HindIII(对于aldoB)或NdeI和BamHI(对于fbaB和agaY)消化，并随后在先前由BamHI和HindIII或NdeI和BamHI消化的MCS处扎结于质粒pET28a中而分别克隆aldoB(SEQ ID N°2)或fbaB(SEQ ID N°9)和agaY(SEQ ID N°8)。将扎结产物转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。通过测序验证由此获得的载体pET28-aldoB，pET28-fbaB和pET28-agaY是否含有具有正确序列的基因。
候选(D)-木酮糖-1-磷酸醛缩酶和(L)-核酮糖-1-磷酸醛缩酶动力学参数的测定
蛋白如前进行表达和纯化，而酶的动力学参数关于(D)-果糖-1,6bP，(D)-木酮糖-1P和(L)-核酮糖-1P基于以下原理(给定实施例对应于(L)-核酮糖-1P醛缩酶活性的定量)进行测定。
(L)-核酮糖-1激酶：(L)-核酮糖+ATP→(L)-核酮糖-1P+ADP
(L)-核酮糖-1P醛缩酶：(L)-核酮糖-1P→DHAP+乙醇醛
甘油-3P脱氢酶：DHAP+NADH→甘油-3P+NAD
反应在以下混合物中进行：0.4mM NADH，2mM PEP，4mM ATP(均来自Sigma)在Hepes缓冲液(90mM Hepes，77mM KCl，6.8mM MgCl2，用KOH溶液调节至pH 7)中。纯化的Khk-C酶和GldA(来自纤维单胞菌属的甘油脱氢酶，Sigma)对于250μl的总反应混合物以15μl的Khk-C(0.005U)和4μl的84U/mg GldA浓溶液的量加入。通过加入100μl D-木酮糖或20mM(L)-核酮糖(Sigma)开始反应。NADH消耗通过荧光计在340nm处监测。
表2A.醛缩酶关于(D)-果糖-1,6二磷酸酯和关于(D)-木酮糖-1-磷酸酯的动力学参数
表2B.醛缩酶关于(D)-果糖-1,6二磷酸酯和关于(L)-核酮糖-1-磷酸酯的动力学参数
AldoB具有关于(D)-木酮糖-1-P的活性，因此能够用于木糖同化的合成途径。FbaB具有关于(D)-木酮糖-1P和(L)-核酮糖-1P的活性，因此能够用于构建(D)-木糖或(L)-阿拉伯糖同化的合成途径。
实施例3：戊糖同化合成代谢途径的体外功能
(D)-木糖同化合成代谢途径的体外功能
在体外使用纯化的酶(市售的和从大肠杆菌表达并随后纯化的)重构(D)-木酮糖同化的代谢途径，而通过生产乙二醇证实其功能(图1)。
用于实施合成代谢途径的酶如下：
-Khk-C(酮基己糖激酶/智人)，由序列SEQ ID NO:1的khkC基因或KHK-A(Prospecbio)编码；
-醛缩酶B(AldoB/智人)，由SEQ ID NO:2的aldoB基因或兔醛缩糖(Sigma-Aldrich-A2714)编码；
-甘油脱氢酶纤维单胞菌属(Sigma-aldrich/G3512-250U)。
反应介质包含pH＝7的Hepes缓冲液(90mM Hepes；77mM KCl；6.8mM MgCl2)；4mMATP；0.4mM NADH；0.005单位/ml Khk-A(Prospecbio)或Khk-C(由pET28a纯化)；1单位/ml醛缩酶(AldoB，Sigma A6338)和1单位/ml GldA(Sigma-G3512-250U)。通过加入5mM D-木酮糖(Cabosynth)开始反应。培养3小时后，通过HPLC定量反应期间产生的乙二醇(图2)。
含有(D)-木酮糖-1-激酶，(D)-木酮糖-1P醛缩酶和乙醇醛还原酶的反应中出现乙二醇，证明了合成途径的功能。
(L)-阿拉伯糖同化的代谢途径的体外功能
(L)-阿拉伯糖同化的代谢途径使用纯化的酶(市售的和从大肠杆菌表达并随后纯化的)由(L)-核酮糖进行重构。
通过所生产的乙二醇的HPLC测定验证途径功能。
用于实施合成代谢途径的酶如下：
-Khk-C(酮基己糖激酶/智人)，由序列SEQ ID NO:1的khkC基因编码；
-由序列SEQ ID NO:9的fbaB基因编码的FbaB(果糖1,6-二磷酸酯醛缩酶，大肠杆菌)；
-GldA(甘油脱氢酶纤维单胞菌属(Sigma-aldrich/G3512-250U)。
将酶培养于对于终体积500μl含有0.4mM NADH，4mM ATP，Hepes缓冲液pH 7(55mMHepes，45mM KCl，4mM MgCl2，用KOH调节至pH 7)的反应介质中。以0.005单位/ml加入Khk-C，而同时以100μg/ml加入FbaB。GldA以1U/ml加入。通过加入20mM L-核酮糖(Sigma-Aldrich)开始反应。培养3小时后，通过HPLC定量反应期间产生的乙二醇。结果如图3所示。
含有(L)-核酮糖-1-激酶、(L)-核酮糖-1P醛缩酶和乙醇醛还原酶的反应中出现乙二醇，证明了合成途径功能。
实施例4：(D)-木糖同化的合成代谢途径的体内功能
合成途径基因克隆至操纵子中
编码序列SEQ ID NO:1的酮基己糖激酶酶(Khk)的C同工型的智人基因khk-C，和编码序列SEQ ID NO:2的果糖-1,6-醛缩酶的B同工型的aldoB在如下构建的IPTG诱导型启动子的控制之下克隆到质粒pEXT20(Dykxhoorn，(1996))上的操纵子中。人khk-C基因由Asipu博士(Asipu et al.，2003)提供，并用引物P13和P14(表3)扩增。通过EurofinsTM对于大肠杆菌采用密码子优化而合成醛缩酶，并采用引物P15和P16(表3)通过PCR扩增。通过加入与相邻片段具有17nt同源性的尾部，设计用于两个基因扩增的引物而提供能够与ClonetechIn-Fusion试剂盒一起使用的PCR片段。将标准RBS(AGGAGG)加入到khk-C和aldoB序列中。质粒pEXT20用BamHI和SacI限制酶消化。将Clonetech In-Fusion试剂盒用于通过重组和线性化的pEXT20扎结两个PCR片段，提供质粒pEXT20-khk-C-aldoB。通过测序验证由此获得的pEXT20-khk-C-aldoB载体是否含有正确序列的基因。将该质粒转化于大肠杆菌MG1655的ΔxylB菌株中，其中缺失了编码木酮糖-5-激酶的序列SEQ ID NO:53的xylB。通过首先分别以P60和P61，和P62和P63扩增，并随后通过BamHI和SalI酶的限制扎结于pEXT20中而将两个基因khk-c和aldoB也各自克隆到pEXT20上，获得质粒pEXT20-khk-C和pEXT20-aldoB。
通过监测(D)-木糖上的ΔxylB菌株生长的合成途径试验
在IPTG存在下，在包含120mM(D)-木糖作为唯一碳源的液体培养基M9中测试细菌生长以及乙二醇生产。
为了控制在(D)-木糖存在下不具有(D)-木糖的天然同化途径的菌株生长的能力，测试了携带pEXT20-khk-C、pEXT20-aldoB或pEXT20-khk-C-aldoB的菌株MG1655，MG1655ΔxylB和MG1655ΔxylB。
无合成途径，仅仅野生株生长于这些条件下。XylB的缺失不允许在木糖上生长。此外，Khk-C的存在和AldoB的存在都不能通过使用木糖同化天然途径而恢复生长(图4)。相比之下，携带质粒pEXT20-khkC-aldoB的MG1655ΔxylB菌株能够在木糖上生长。
通过在生长期间以HPLC监测代谢物的生产，经由合成途径鉴定出乙二醇为木糖发酵的主要产物，产率为0.45mol/mol木糖(0.19gEG/g木糖)(图5)。
因此，(D)-木糖同化的合成途径因此在体内是可运行的并在该糖中恢复了突变体ΔxylB的生长。
实施例5：主要乙醇醛还原酶的识别
乙二醇生产的优化取决于负责将乙醇醛转化成乙二醇的乙醇醛还原酶的识别和过表达。确定了几种在大肠杆菌中天然存在的具有对乙醇醛活性的氧化还原酶，GldA，YqhD，FucO，DkgA，DkgB，YghZ，YeaE，YajO(Lee et al.,2013)。从KEIO采样中回收这些基因的突变体而确定这些基因之一是否编码主要乙醇醛还原酶。为此目的，测试了这些突变体由乙醇醛产生乙二醇的能力。这些菌株在133mM木糖存在下在M9培养基中生长，而当OD600nm达到1时，将细胞暴露于10mM乙醇醛。然后在培养12小时后通过HPLC测测定乙二醇的量。
YqhD的缺乏显著降低了由乙醇醛的乙二醇生产(图6)，间接表明它是在我们的培养条件下大肠杆菌中的主要乙醇醛还原酶。
实施例6：菌株通过本发明的合成途径的乙二醇生产的优化
为了改进乙二醇生产，主要乙醇醛还原酶在质粒pACT3上进行过表达。为此，用P11和P12扩增yqhD(SEQ ID NO:4)，并随后通过In-Fusion在预先用PstI和HindIII消化的pACT3中克隆。通过使用In-Fusion试剂盒(Clonetech)的重组实施线性化的pACT3中的yqhD插入，获得了质粒pACT3-yqhD。通过测序检查由此获得的载体pACT3-yqhD。然后将扎结产物转化到感兴趣的MG1655菌株中。类似地，通过In-Fusion在预先用PstI和HindIII消化的pACT3中克隆gldA(SEQ ID 51)和fucO(SEQ ID 52)(分别由P24和P25；和P26和P27扩增)，而测试其作用。
在我们的培养条件下，乙醇醛的主要还原酶是YqhD，但其过表达和其他还原酶GldA和FucO的过表达都不会增加乙二醇生产。实际上，产率仅为0.45mol/mol木糖(0.19gEG/g木糖)，产率与表达质粒pEXT20-khkC-aldoB的MG1655ΔxylB菌株的产率相当(图7)。
为了增加乙二醇生产，必须阻断乙醇醛氧化成乙醇酸的氧化途径。为此，测试了醛脱氢酶基因AldA(SEQ ID NO:3)缺失的影响。为了量化乙醇酸的残留量，通过其GlcD亚基(由序列SEQ ID NO:7的基因编码)的缺失而灭活乙醇酸脱氢酶(参见实施例7)以阻断该酸的再次消耗。因此，通过从KEIO菌株转导而实施ΔxylB菌株中的aldA和/或glcD缺失。这些构建提供了随后通过pEXT20-khkC-aldoB转化的MG1655 ΔxylB ΔaldA和MG1655 ΔxylBΔaldA ΔglcD菌株。
通过aldA的缺失，EG产率大大增加。实际上，携带质粒pEXT20-khkC-aldoB的MG1655 ΔxylB ΔaldA菌株会生产乙二醇，产率为0.88mol/mol木糖(0.36g EG/g木糖)(图7)。YqhD和FucO在这些条件下的过表达分别提供了0.9和0.94mol/mol的产率(分别为0.38和0.39g EG/g木糖)。这非常接近于1mol/mol的预期最大理论产率。
实施例7：菌株通过D-木糖同化合成途径的乙醇酸生产的优化
为了提高通过戊糖同化合成途径的乙醇酸生产，过表达大肠杆菌乙醇醛脱氢酶AldA。为此，通过使用引物对(P17和P18，表3)由大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增aldA，并将所获得的片段根据制造商的说明书扎结于pGEM-T(Promega)中。然后将该片段用KpnI和HindIII酶消化，并随后扎结于由相同酶自身线性化的pACT3中。通过测序验证由此获得的pACT3-aldA载体是否含有正确序列的基因。此后，将pACT3-aldA转化到产生ΔxylBpEXT20-khk-C-aldoB pACT3-aldA菌株的MG1655 ΔxylB pEXT20-khk-C-aldoB菌株中。当在M9培养基+10g/木糖上培养该菌株时，乙二醇生产显著降低(产率为0.2mol/mol)，但乙醇酸的生产仅短暂增加，表明所产生的乙醇酸发生了再次消耗(图8)。
为了防止乙醇酸的再次消耗，使由glcDEF编码的乙醇酸氧化酶减效。为此，通过经由从KEIO采样的菌株转导而缺失glcD(SEQ ID NO:7)，构建MG1655 ΔxylB ΔglcD菌株。用pEXT20-khkC-aldoB或pEXT20-aldA-khkC-aldoB质粒转化MG1655 ΔxylB ΔglcD菌株。该质粒由用通过In-Fusion方法将具有上游RBS的aldA基因克隆于其中的EcoRI和SmaI限制酶裂解的pEXT20-khkC-aldoB构建。该基因本身通过使用P24和P25引物的PCR进行扩增。当在培养基M9-木糖(10g/L)上培养含有pEXT20-khkC-aldoB的这种菌株时，乙醇酸生产显著增加，并达到0.35mol/mol(0.19g AG/g木糖)(图8)。当aldA由pEXT20过表达时，产率达到0.92mol/mol木糖(0.47g AG/g木糖)。
通过使用衍生自木糖的C2部分的92％的碳流，由于aldA的过表达，glcD缺失会允许乙醇酸累积。
实施例8：菌株经由乙醛酸循环的乙醇酸生产的优化
通过将如上描述的优化的合成途径的功能与专利：US20090155867(Soucaille,2009)和US20120315682(Dischert et al.,2012)中描述的导致经由乙醛酸途径生产乙醇酸的遗传干预组合，能够进一步提高乙醇酸产生。基于这些公布的数据，通过P1噬菌体转导方案在MG1655株中检测编码苹果酸合酶的aceB和glcB基因、编码乙醛酸聚糖酶的glc基因、编码有氧响应的抑制子的arcA基因和编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因。编码乙醇酸氧化酶的glcDEFG操纵子、分别编码磷酸葡萄糖酸脱氢酶和恩特纳-杜德洛夫醛缩酶的edd-eda以及编码乙醛酸途径的转录抑制子的ic1R通过Datsenko的缺失方法(Datsenko et al.,2000)，分别使用P52和P53和P54和P55和64和65引物进行检测。构建由aceA编码异柠檬酸裂解酶和由ghrA(或ycdW)编码的乙醛酸还原酶平行过表达的质粒，而提高经由科尔伯(Krebs)和乙醛酸循环的乙醇酸生产。为此，用BamHI和HindIII酶消化pACT3质粒。如前，使用引物对P40和P41通过PCR扩增ghrA基因，而同时通过引物对P21和P22扩增aceA基因。将两个扩增的片段和线性化的质粒通过In-Fusion试剂盒(Clonetech)扎结至一起。这种构建产生了质粒pACT3-ghrA-aceA。
然后将该质粒转化到携带ΔaceB ΔglcDEFGB Δgcl Δedd-edaΔiclR ΔarcAΔicd缺失的菌株中。获得的菌株是菌株1054。当该菌株培养于M9+葡萄糖上时，产生1.17mol/mol乙醇酸(0.49g AG/g葡萄糖)，而没有乙酸盐生成(表6)。
表6.具有其它突变的ΔaceB ΔglcDEFGB Δgcl Δedd-eda ΔiclR大肠杆菌菌株在M9培养基+1％葡萄糖的乙醇酸和乙酸盐的生产
实施例9：菌株对于关于葡萄糖和D-木糖经由乙醛酸循环和(D)-木糖同化合成途径的共同利用生产乙醇酸的优化
为了应用本文中描述的木糖同化合成途径，优选关于通常含有不同百分比的葡萄糖和木糖的纤维素或半纤维素水解物进行乙醇酸生产。为了证明乙醇酸关于同时含有葡萄糖和木糖糖的底物的产率可以通过经由合成途径和乙醛酸循环的乙醇酸同时生产提高，构建了同时共表达两条途径的菌株。通过质粒pACT3-ghrA-aceA和pEXT20-khk-c-aldoB-aldA共转化大肠杆菌ΔxylB ΔaceB ΔglcDEFGB Δgcl Δedd-eda ΔiclR ΔarcA Δicd菌株。由此获得的菌株是菌株905。通过HPLC监测的乙醇酸生产在该菌株在矿物培养基M9+0.1％酵母提取物+0.2％胰蛋白胨上生长期间和在0.25％葡萄糖和0.5％木糖存在下进行实施(图9)。
表7.大肠杆菌菌株在M9培养基+2.5g/L葡萄糖+5g/L(D)-木糖+1g/L酵母提取物+2g/L胰蛋白胨上的乙醇酸生产。proD：galP-galP采用组成型启动子proD的过表达(Daviset al.,2011)(**)基于所消耗的总糖量计算的产率。
尽管不存在XylB，菌株首先消耗葡萄糖，并随后消耗木糖，表明即使在这些条件下合成途径也是活性的。在培养100小时后，通过菌株产生了2.35g/L的乙醇酸，这个产率关于所用的总糖量为0.51g/g(表7)。该产率比采用不具有(D)-木糖同化合成途径(表7，菌株1054)，或不携带编码催化进入(D)-木糖同化天然途径入口的酶的xylB基因的缺失(表7，菌株1044)的准同源性菌株获得的产率更高。
葡萄糖的总消耗后的木糖同化率保持相对较低，其值为约0.19mmol/(l h)。为了加速木糖同化，通过使用以下方法使糖通透酶galP的表达变成组成型：编码由Davis(Daviset al.，2011)描述的并由Eurofins(SEQ ID 90)合成的组成型启动子proD的DNA片段，采用P56和P57引物扩增。使用P58和P59引物和作为模板的质粒pKD4(SEQ ID 95)扩增kan基因的表达盒。通过使用P59和P57引物的重叠延伸PCR而融合两个PCR片段。这样获得的PCR产物采用Datsenko和Wanner的方法(Datsenko et al.，2000)转化到菌株905中。回收卡那霉素抗性克隆体，并验证为galP之前含有合成型和组成型启动子。
由此获得的新菌株通过pACT3 aceA-ghrA和pEXT20-khk-C-aldoB-aldA共转化，产生菌株979。通过HPLC监测的其生长和乙醇酸生产在矿物培养基M9+0.1％酵母提取物+0.2％胰蛋白胨，并在0.25％葡萄糖和0.5％木糖存在下进行实施(图10)。
菌株生产累积了3.84g/L乙醇酸，收率关于总糖量为0.66g/g。葡萄糖总消耗后的木糖同化率通过GalP的过表达而提高，并达到了0.32mmol/L(1h)的值。
实施例10：酿酒酵母中木糖同化合成途径的表达
为了测试木糖同化合成途径的便利性，我们测试了其在感兴趣的另一微生物，酿酒酵母酵母中的表达。
酿酒酵母不具有将(D)-木糖转化为(D)-木酮糖的天然酶系统，因此不能在该糖上生长。通常在这种酵母中会异源表达两种代谢途径而实现(D)-木糖转化为(D)-木酮糖的转化并增强其在木糖上的生长。木糖异构酶(XI)直接以氧化还原中性的方式催化木糖转化为木酮糖。另外，木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的顺序作用也能够分别通过使用NADPH和NAD辅因子将木糖转化成木酮糖。为了证明酵母中木糖同化合成途径的功能，该合成途径由木糖异构酶或由XR/XDH系统补充。
为了用XI补充木糖同化合成途径，使用了由Eckhard Boles团队(Brat et al.，2009)设计的酿酒酵母密码子优化梭状芽孢杆菌(Clostridium phytofermentans)的XI。在磷酸丙糖异构酶Tpi启动子(Ptpi：SEQ ID NO:15)控制之下表达khk-C，并使用了Trk1终止子(SEQ ID NO:12)。
醛缩酶AldoB基因置于酿酒酵母天然醛缩酶启动子(pFab：SEQ ID NO:14)的控制之下，并也使用终止子Tlk1(SEQ ID NO:13)。
这些基因通过酵母中的重组克隆于用KpnI和HindIII线性化的质粒p425中，通过使用以下引物(也参见表4)产生p425-khk-aldoB：对于Ptpi的P1'和P2'，对于khk-C的P3'和P4'，对于Trk1的P5’和P6’，对于pFab的P7’和P8’，对于aldoB的p'9和p'10和对于tlk1的p'11和p'12。
然后将质粒p425-khk-aldoB用于不能在木糖上生长的感受态菌株中，因为它对于其天然木酮糖激酶Xks1(SEQ ID 89)发生突变。
因此，在菌株CEN.PK-2 xks1-中实施采用同时含有木酮糖异构酶和转运体木糖Gal-2的由Eckhard Boles团队构建的质粒的共转化。
测试了菌株在仅含木糖的基本培养基中生长的能力(图11)。
在这种情况下，当突变体xks1不能生长于D-木糖上时，携带合成途径的突变体xks1恢复了his生长，表明该途径在酵母中可运行。
使用XI不是通过将木糖转化成木酮糖而同化木糖的唯一可能途径。实际上，由于木糖还原酶(XR)催化的还原反应和由木糖醇脱氢酶(XDH)催化的由此获得的木糖醇的脱氢反应，获得了木酮糖。因此，我们使用了表达XR/XDH系统的TMB3001菌株(Eliasson et al.，2000)而测试合成途径是否能够用于这些条件而同化木糖。在通过转化含有与xks1的非编码端同源的侧接边缘的PCR片段而通过同源重组产生缺失的TMB3001菌株中构建突变体xks1-。PCR片段由酵母集敲除(YKO)的BY菌株(Winzeler et al.，1999)采用引物P26'和P27'扩增，并含有用于重组选择的kanMX盒。合成途径在如下构建的质粒pYCP-khk-C-aldoB中表达。用AgeI和XbaI消化质粒pYCP-TPS1(SEQ ID NO:80)而从中提取TPS1盒。Fw pTpi和rev Tlk1引物经过设计而具有与40个用AgeI和XbaI线性化的质粒pYCP同源的核苷酸的漂浮尾，以便在质粒中重组至一起。然后，我们在磷酸丙糖异构酶Tpi的启动子(P13'和P14'扩增)和终止子Trk1(由P17'和P18'扩增)控制之下，表达了对于由P15'和P16'扩增的酵母(SEQ ID NO:83)进行优化的khk-C密码子，并在酿酒酵母天然醛缩酶pFbaB1的启动子(由P19'和P20'扩增)和终止子Tlk1(由P23'和P24'扩增)的控制之下表达了对于由P21'和P22'扩增的酵母(SEQ ID NO:84)进行优化的醛缩酶aldoB密码子。通过在酵母中的重组将这些结构克隆到质粒pYCP中，获得了pYCP-khk-C-aldoB。随后将该质粒用于不能在木糖上生长的TMB3001 xks1-菌株中，因为它对于木酮糖激酶Xks1发生了突变。
虽然突变体TMB3001 xks1-与TMB3001菌株不一样失去了其在木糖上生长的能力，但携带pYCP-khk-C-aldoB的TMB3001 xks1-菌株恢复了其在木糖上的生长(图12)。这表明合成途径在经由XR/XDH系统同化木糖的菌株中也是可运行的。
实施例11：(L)-阿拉伯糖同化的合成代谢途径的体内功能
合成途径基因克隆到操纵子中
在如下构建的IPTG诱导型启动子的控制之下，将编码序列SEQ ID NO:1的酮基己糖激酶(Khk)的C同工型的智人基因khk-C和编码序列SEQ ID NO:9的大肠杆菌果糖-1,6-二磷酸醛缩酶B同工型的fbaB克隆到质粒pEXT20(Dykxhoorn et al.，1996)上的操纵子中。人khk-C基因由Asipu博士(Asipu et al.，2003)提供，并用引物P13和P14(表3)扩增。醛缩酶用引物P28和P29从MG1655株的大肠杆菌基因组DNA进行扩增。
通过加入与相邻片段具有17个核苷酸同源的尾部，设计用于扩增这两个基因的引物而提供能够与Clonetech In-Fusion试剂盒一起使用的PCR片段。使用软件RBS计算器(Salis et al.，2011)选择RBS。因此，fbaB基因处于预测而提供最大表达的序列(TTAGGAGGTATACT)的RBS之后，并且khk-C处于预测而最小化表达的序列(ACAGCTTTTAATTATACACTTTAAGGAGGACAGAC)的RBS之后。通过加入与相邻片段具有15个核苷酸同源性的尾，设计出用新RBS扩增两个基因的引物(P30和P22用于khk-C而P31和P32用于fbaB)而提供能够与融合试剂盒一起使用的PCR片段。质粒pEXT20用限制酶BamHI和SalI消化。使用Clonetech In-Fusion试剂盒通过重组扎结两个PCR片段和线性化的pEXT20而提供质粒pEXT20-khk-C-RBSmax-fbaB。质粒pEXT20-khk-C-RBSmax-fbaB转化于MG1655 ΔaraB中。通过测序检查由此获得的载体pEXT20-khk-C-RBSmax-fbaB。类似地，通过In-Fusion使用引物83/84和33/34(表3)构建质粒pEXT20-khk-C和pEXT20-fbaB。将这些质粒转化到大肠杆菌MG1655 ΔaraB菌株中，其中缺失了编码核酮糖-5激酶的序列SEQ ID88的araB。
通过在(L)-阿拉伯糖上监测的ΔaraB菌株生长测试合成途径
在IPTG存在下，在含有60mM(L)-阿拉伯糖作为唯一碳源的M9液体培养基中测试细菌生长。为了控制缺乏阿拉伯糖同化天然途径的菌株在(L)-阿拉伯糖存在下生长于M9培养基中的能力，测试了以下菌株：MG1655ΔaraB和携带质粒pEXT20-khk-C、pEXT20-fbaB或pEXT20-khk-C-RBSmax-fbaB的MG1655 ΔaraB。在LB+100μM IPTG+2％L-阿拉伯糖中进行预培养过夜，并随后将细胞以OD600nm＝0.2和随后以OD600nm＝1转移到M9培养基+2％葡萄糖+2％阿拉伯糖+100μM IPTG上，将细胞以OD600nm＝0.2转移到M9培养基+2％L-阿拉伯糖+100μMIPTG中。仅分别具有(L)-核酮糖-1激酶和(L)-核酮糖-1P醛缩酶活性的同时表达KhkC和FbaB酶的菌株生长于这些条件中(图13)。这些结果证明了(L)-阿拉伯糖同化合成代谢途径的功能。
表3.用于大肠杆菌中的途径表达的引物
表4.用于酿酒酵母中的所述途径表达的引物
表5：基因序列表
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atggaagaga agcagatcct gtgcgtgggg ctagtggtgc tggacgtcat cagcctggtg 60
gacaagtacc ctaaggagga ctcggagata aggtgtttgt cccagagatg gcagcgcgga 120
ggcaacgcgt ccaactcctg caccgttctc tccctgctcg gagccccctg tgccttcatg 180
ggctcaatgg ctcctggcca tgttgctgac ttcctggtgg ccgacttcag gcggcggggc 240
gtggacgtgt ctcaggtggc ctggcagagc aagggggaca cccccagctc ctgctgcatc 300
atcaacaact ccaatggcaa ccgtaccatt gtgctccatg acacgagcct gccagatgtg 360
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<210> 2
<211> 1095
<212> DNA
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<400> 2
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gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240
gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300
accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360
caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420
gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480
caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540
tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600
gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660
ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720
cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780
ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840
cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900
cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960
gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020
acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080
gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140
cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164
<210> 5
<211> 1419
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 5
atgaaacaag aagttatcct ggtactcgac tgtggcgcga ccaatgtcag ggccatcgcg 60
gttaatcggc agggcaaaat tgttgcccgc gcctcaacgc ctaatgccag cgatatcgcg 120
atggaaaaca acacctggca ccagtggtct ttagacgcca ttttgcaacg ctttgctgat 180
tgctgtcggc aaatcaatag tgaactgact gaatgccaca tccgcggtat cgccgtcacc 240
acctttggtg tggatggcgc tctggtagat aagcaaggca atctgctcta tccgattatt 300
agctggaaat gtccgcgaac agcagcggtt atggacaata ttgaacggtt aatctccgca 360
cagcggttgc aggctatttc tggcgtcgga gcctttagtt tcaatacgtt atataagttg 420
gtgtggttga aagaaaatca tccacaactg ctggaacgcg cgcacgcctg gctctttatt 480
tcgtcgctga ttaaccaccg tttaaccggc gaattcacta ctgatatcac gatggccgga 540
accagccaga tgctggatat ccagcaacgc gatttcagtc cgcaaatttt acaagccacc 600
ggtattccac gccgactctt ccctcgtctg gtggaagcgg gtgaacagat tggtacgcta 660
cagaacagcg ccgcagcaat gctcggctta cccgttggca taccggtgat ttccgcaggt 720
cacgataccc agttcgccct ttttggcgct ggtgctgaac aaaatgaacc cgtgctctct 780
tccggtacat gggaaatttt aatggttcgc agcgcccagg ttgatacttc gctgttaagt 840
cagtacgccg gttccacctg cgaactggat agccaggcag ggttgtataa cccaggtatg 900
caatggctgg catccggcgt gctggaatgg gtgagaaaac tgttctggac ggctgaaaca 960
ccctggcaaa tgttgattga agaagctcgt ctgatcgcgc ctggcgcgga tggcgtaaaa 1020
atgcagtgtg atttattgtc gtgtcagaac gctggctggc aaggagtgac gcttaatacc 1080
acgcgggggc atttctatcg cgcggcgctg gaagggttaa ctgcgcaatt acagcgcaat 1140
ctacagatgc tggaaaaaat cgggcacttt aaggcctctg aattattgtt agtcggtgga 1200
ggaagtcgca acacattgtg gaatcagatt aaagccaata tgcttgatat tccggtaaaa 1260
gttctcgacg acgccgaaac gaccgtcgca ggagctgcgc tgttcggttg gtatggcgta 1320
ggggaattta acagcccgga agaagcccgc gcacagattc attatcagta ccgttatttc 1380
tacccgcaaa ctgaacctga atttatagag gaagtgtga 1419
<210> 6
<211> 1470
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 6
atgacctttc gcaattgtgt cgccgtcgat ctcggcgcat ccagtgggcg cgtgatgctg 60
gcgcgttacg agcgtgaatg ccgcagcctg acgctgcgcg aaatccatcg ttttaacaat 120
gggctgcata gtcagaacgg ctatgtcacc tgggatgtgg atagccttga aagtgccatt 180
cgccttggat taaacaaggt gtgcgaggaa gggattcgta tcgatagcat tgggattgat 240
acctggggcg tggactttgt gctgctcgac caacagggtc agcgtgtggg cctgcccgtt 300
gcttatcgcg atagccgcac caatggccta atggcgcagg cacaacaaca actcggcaaa 360
cgcgatattt atcaacgtag cggcatccag tttctgccct tcaatacgct ttatcagttg 420
cgtgcgctga cggagcaaca acctgaactt attccacaca ttgctcacgc tctgctgatg 480
ccggattact tcagttatcg cctgaccggc aagatgaact gggaatatac caacgccacg 540
accacgcaac tggtcaatat caatagcgac gactgggacg agtcgctact ggcgtggagc 600
ggggccaaca aagcctggtt tggtcgcccg acgcatccgg gtaatgtcat aggtcactgg 660
atttgcccgc agggtaatga gattccagtg gtcgccgttg ccagccatga taccgccagc 720
gcggttatcg cctcgccgtt aaacggctca cgtgctgctt atctctcttc tggcacctgg 780
tcattgatgg gcttcgaaag ccagacgcca tttaccaatg acacggcact ggcagccaac 840
atcaccaatg aaggcggggc ggaaggtcgc tatcgggtgc tgaaaaatat tatgggctta 900
tggctgcttc agcgagtgct tcaggagcag caaatcaacg atcttccggc gcttatctcc 960
gcgacacagg cacttccggc ttgccgcttc attatcaatc ccaatgacga tcgctttatt 1020
aatcctgaga cgatgtgcag cgaaattcag gctgcgtgtc gggaaacggc gcaaccgatc 1080
ccggaaagtg atgctgaact ggcgcgctgc attttcgaca gtctggcgct gctgtatgcc 1140
gatgtgttgc atgagctggc gcagctgcgc ggtgaagatt tctcgcaact gcatattgtc 1200
ggcggaggct gccagaacac gctgctcaac cagctatgcg ccgatgcctg cggtattcgg 1260
gtgatcgccg ggcctgttga agcctcgacg ctcggcaata tcggcatcca gttaatgacg 1320
ctggatgaac tcaacaatgt ggatgatttc cgtcaggtcg tcagcaccac cgcgaatctg 1380
accaccttta cccctaatcc tgacagtgaa attgcccact atgtggcgca gattcactct 1440
acacgacaga caaaggagct ttgcgcatga 1470
<210> 7
<211> 1500
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 7
atgagcatct tgtacgaaga gcgtcttgat ggcgctttac ccgatgtcga ccgcacatcg 60
gtactgatgg cactgcgtga gcatgtccct ggacttgaga tcctgcatac cgatgaggag 120
atcattcctt acgagtgtga cgggttgagc gcgtatcgca cgcgtccatt actggttgtt 180
ctgcctaagc aaatggaaca ggtgacagcg attctggctg tctgccatcg cctgcgtgta 240
ccggtggtga cccgtggtgc aggcaccggg ctttctggtg gcgcgctgcc gctggaaaaa 300
ggtgtgttgt tggtgatggc gcgctttaaa gagatcctcg acattaaccc cgttggtcgc 360
cgcgcgcgcg tgcagccagg cgtgcgtaac ctggcgatct cccaggccgt tgcaccgcat 420
aatctctact acgcaccgga cccttcctca caaatcgcct gttccattgg cggcaatgtg 480
gctgaaaatg ccggcggcgt ccactgcctg aaatatggtc tgaccgtaca taacctgctg 540
aaaattgaag tgcaaacgct ggacggcgag gcactgacgc ttggatcgga cgcgctggat 600
tcacctggtt ttgacctgct ggcgctgttc accggatcgg aaggtatgct cggcgtgacc 660
accgaagtga cggtaaaact gctgccgaag ccgcccgtgg cgcgggttct gttagccagc 720
tttgactcgg tagaaaaagc cggacttgcg gttggtgaca tcatcgccaa tggcattatc 780
cccggcgggc tggagatgat ggataacctg tcgatccgcg cggcggaaga ttttattcat 840
gccggttatc ccgtcgacgc cgaagcgatt ttgttatgcg agctggacgg cgtggagtct 900
gacgtacagg aagactgcga gcgggttaac gacatcttgt tgaaagcggg cgcgactgac 960
gtccgtctgg cacaggacga agcagagcgc gtacgtttct gggccggtcg caaaaatgcg 1020
ttcccggcgg taggacgtat ctccccggat tactactgca tggatggcac catcccgcgt 1080
cgcgccctgc ctggcgtact ggaaggcatt gcccgtttat cgcagcaata tgatttacgt 1140
gttgccaacg tctttcatgc cggagatggc aacatgcacc cgttaatcct tttcgatgcc 1200
aacgaacccg gtgaatttgc ccgcgcggaa gagctgggcg ggaagatcct cgaactctgc 1260
gttgaagttg gcggcagcat cagtggcgaa catggcatcg ggcgagaaaa aatcaatcaa 1320
atgtgcgccc agttcaacag cgatgaaatc acgaccttcc atgcggtcaa ggcggcgttt 1380
gaccccgatg gtttgctgaa ccctgggaaa aacattccca cgctacaccg ctgtgctgaa 1440
tttggtgcca tgcatgtgca tcacggtcat ttacctttcc ctgaactgga gcgtttctga 1500
<210> 8
<211> 861
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 8
atgagcatta tctccactaa atatctgtta caggacgccc aggccaatgg ctacgcggtg 60
cctgctttta acattcataa cgccgagacg atccaagcga tcctcgaagt gtgcagtgaa 120
atgcgatcgc cggtgatcct cgccggaacg ccggggacct ttaaacacat cgcgctggaa 180
gagatctacg ccctgtgtag cgcctattcc acaacctaca acatgccact ggcgctgcat 240
ctcgaccacc acgaatcgct ggatgatatt cgccgtaaag tccacgcagg tgtgcgcagt 300
gcgatgatcg acggcagcca cttcccgttt gccgagaacg tgaagctggt gaaatcggtt 360
gttgacttct gccactcaca agattgcagc gtggaagcag aactgggccg cctgggcggt 420
gttgaagatg acatgagcgt tgacgccgaa agtgcattcc tgaccgatcc acaagaagct 480
aaacgctttg tcgaactgac tggcgtcgac agcctggcgg tagcgattgg tacggcgcac 540
ggcttataca gcaaaacgcc gaagattgat ttccagcggc tggcggaaat tcgtgaagtg 600
gtggatgttc ctctggtgct gcatggtgcc agcgatgttc cggatgaatt tgtccgtcgc 660
actattgaac ttggcgtcac aaaagtgaac gttgccacag aattaaaaat agccttcgct 720
ggcgcggtta aagcctggtt tgcggaaaat ccgcagggta atgatcctcg ttattatatg 780
cgcgtcggaa tggatgcgat gaaagaagtt gtcagaaata aaattaatgt ctgtggttca 840
gcgaatcgaa tttcagcata a 861
<210> 9
<211> 1053
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 9
atgacagata ttgcgcagtt gcttggcaaa gacgccgaca accttttaca gcaccgttgt 60
atgacaattc cttctgacca gctttatctc cccggacatg actacgtaga ccgcgtaatg 120
attgacaata atcgcccgcc agcggtgtta cgtaatatgc agacgttgta caacaccggg 180
cgtctggctg gcacaggata tctttctatt ctgccggttg accagggcgt tgagcactct 240
gccggagctt catttgctgc taacccgctc tactttgacc cgaaaaacat tgttgaactg 300
gcgatcgaag cgggctgtaa ctgtgtggcg tcaacttacg gcgtgctggc gtcggtatcg 360
cggcgttatg cgcatcgcat tccattcctc gtcaaactta atcacaacga gacgctaagt 420
tacccgaata cctacgatca aacgctgtat gccagcgtgg agcaggcgtt caacatgggc 480
gcggttgcgg ttggtgcgac tatctatttt ggctcggaag agtcacgtcg ccagattgaa 540
gaaatttctg cggcttttga acgtgcgcac gagctgggta tggtgacagt gctgtgggcc 600
tatttgcgta actccgcctt taagaaagat ggcgttgatt accatgtttc cgccgacctg 660
accggtcagg caaaccatct ggcggcaacc atcggtgcag atatcgtcaa acaaaaaatg 720
gcggaaaata acggcggcta taaagcaatt aattacggtt acaccgacga tcgtgtttac 780
agcaaattga ccagcgaaaa cccgattgat ctggtgcgtt atcagttagc taactgctat 840
atgggtcggg ctgggttgat aaactccggc ggtgctgcgg gcggtgaaac tgacctcagc 900
gatgcagtgc gtactgcggt tatcaacaaa cgcgcaggcg gaatggggct gattcttgga 960
cgtaaagcgt tcaagaaatc gatggctgac ggcgtgaaac tgattaacgc cgtgcaggac 1020
gtttatctcg atagcaaaat tactatcgcc tga 1053
<210> 10
<211> 939
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 10
atggatatca tcttttatca cccaacgttc gatacccaat ggtggattga ggcactgcgc 60
aaagctattc ctcaggcaag agtcagagca tggaaaagcg gagataatga ctctgctgat 120
tatgctttag tctggcatcc tcctgttgaa atgctggcag ggcgcgatct taaagcggtg 180
ttcgcactcg gggccggtgt tgattctatt ttgagcaagc tacaggcaca ccctgaaatg 240
ctgaaccctt ctgttccact ttttcgcctg gaagataccg gtatgggcga gcaaatgcag 300
gaatatgctg tcagtcaggt gctgcattgg tttcgacgtt ttgacgatta tcgcatccag 360
caaaatagtt cgcattggca accgctgcct gaatatcatc gggaagattt taccatcggc 420
attttgggcg caggcgtact gggcagtaaa gttgctcaga gtctgcaaac ctggcgcttt 480
ccgctgcgtt gctggagtcg aacccgtaaa tcgtggcctg gcgtgcaaag ctttgccgga 540
cgggaagaac tgtctgcatt tctgagccaa tgtcgggtat tgattaattt gttaccgaat 600
acccctgaaa ccgtcggcat tattaatcaa caattactcg aaaaattacc ggatggcgcg 660
tatctcctca acctggcgcg tggtgttcat gttgtggaag atgacctgct cgcggcgctg 720
gatagcggca aagttaaagg cgcaatgttg gatgttttta atcgtgaacc cttaccgcct 780
gaaagtccgc tctggcaaca tccacgcgtg acgataacac cacatgtcgc cgcgattacc 840
cgtcccgctg aagctgtgga gtacatttct cgcaccattg cccagctcga aaaaggggag 900
agggtctgcg ggcaagtcga ccgcgcacgc ggctactaa 939
<210> 11
<211> 1305
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 11
atgaaaaccc gtacacaaca aattgaagaa ttacagaaag agtggactca accgcgttgg 60
gaaggcatta ctcgcccata cagtgcggaa gatgtggtga aattacgcgg ttcagtcaat 120
cctgaatgca cgctggcgca actgggcgca gcgaaaatgt ggcgtctgct gcacggtgag 180
tcgaaaaaag gctacatcaa cagcctcggc gcactgactg gcggtcaggc gctgcaacag 240
gcgaaagcgg gtattgaagc agtctatctg tcgggatggc aggtagcggc ggacgctaac 300
ctggcggcca gcatgtatcc ggatcagtcg ctctatccgg caaactcggt gccagctgtg 360
gtggagcgga tcaacaacac cttccgtcgt gccgatcaga tccaatggtc cgcgggcatt 420
gagccgggcg atccgcgcta tgtcgattac ttcctgccga tcgttgccga tgcggaagcc 480
ggttttggcg gtgtcctgaa tgcctttgaa ctgatgaaag cgatgattga agccggtgca 540
gcggcagttc acttcgaaga tcagctggcg tcagtgaaga aatgcggtca catgggcggc 600
aaagttttag tgccaactca ggaagctatt cagaaactgg tcgcggcgcg tctggcagct 660
gacgtgacgg gcgttccaac cctgctggtt gcccgtaccg atgctgatgc ggcggatctg 720
atcacctccg attgcgaccc gtatgacagc gaatttatta ccggcgagcg taccagtgaa 780
ggcttcttcc gtactcatgc gggcattgag caagcgatca gccgtggcct ggcgtatgcg 840
ccatatgctg acctggtctg gtgtgaaacc tccacgccgg atctggaact ggcgcgtcgc 900
tttgcacaag ctatccacgc gaaatatccg ggcaaactgc tggcttataa ctgctcgccg 960
tcgttcaact ggcagaaaaa cctcgacgac aaaactattg ccagcttcca gcagcagctg 1020
tcggatatgg gctacaagtt ccagttcatc accctggcag gtatccacag catgtggttc 1080
aacatgtttg acctggcaaa cgcctatgcc cagggcgagg gtatgaagca ctacgttgag 1140
aaagtgcagc agccggaatt tgccgccgcg aaagatggct ataccttcgt atctcaccag 1200
caggaagtgg gtacaggtta cttcgataaa gtgacgacta ttattcaggg cggcacgtct 1260
tcagtcaccg cgctgaccgg ctccactgaa gaatcgcagt tctaa 1305
<210> 12
<211> 323
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 12
tgcagatcaa aggcaaagac agaaaccgta gtaaaggttg acttttcaca acagtgtctc 60
cattttttat attgtattat taaagctatt tagttatttg gatactgttt tttttccaga 120
agttttcttt ttagtaaagt acaatccagt aaaaatgaag gatgaacaat cggtgtatgc 180
agattcaaca ccaataaatg caatgtttat ttctttggaa cgtttgtgtt gttcgaaatc 240
caggataatc cttcaacaag accctgtccg gataaggcgt tactaccgat gacacaccaa 300
gaaccacaca tctatttcct tat 323
<210> 13
<211> 311
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 13
tattctgatc gtagatcatc agatttgata tgatattatt tgtgaaaaaa tgaaataaaa 60
ctttatacaa cttaaataca acttttttta taaacgatta agcaaaaaaa tagtttcaaa 120
cttttaacaa tattccaaac actcagtcct tttccttctt atattatagg tgtacgtatt 180
atagaaaaat ttcaatgatt actttttctt tctttttcct tgtaccagca catggccgag 240
cttgaatgtt aaacccttcg agagaatcac accattcaag tataaagcca ataaagaata 300
taaaaaatta t 311
<210> 14
<211> 514
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 14
atgggtcatt acgtaaataa tgataggaat gggattcttc tatttttcct ttttccattc 60
tagcagccgt cgggaaaacg tggcatcctc tctttcgggc tcaattggag tcacgctgcc 120
gtgagcatcc tctctttcca tatctaacaa ctgagcacgt aaccaatgga aaagcatgag 180
cttagcgttg ctccaaaaaa gtattggatg gttaatacca tttgtctgtt ctcttctgac 240
tttgactcct caaaaaaaaa aaatctacaa tcaacagatc gcttcaatta cgccctcaca 300
aaaacttttt tccttcttct tcgcccacgt taaattttat ccctcatgtt gtctaacgga 360
tttctgcact tgatttatta taaaaagaca aagacataat acttctctat caatttcagt 420
tattgttctt ccttgcgtta ttcttctgtt cttctttttc ttttgtcata tataaccata 480
accaagtaat acatattcaa aaagaaacat aaat 514
<210> 15
<211> 391
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 15
tatttaaact gtgaggacct taatacattc agacacttct gcggtatcac cctacttatt 60
cccttcgaga ttatatctag gaacccatca ggttggtgga agattacccg ttctaagact 120
tttcagcttc ctctattgat gttacacctg gacacccctt ttctggcatc cagtttttaa 180
tcttcagtgg catgtgagat tctccgaaat taattaaagc aatcacacaa ttctctcgga 240
taccacctcg gttgaaactg acaggtggtt tgttacgcat gctaatgcaa aggagcctat 300
atacctttgg ctcggctgct gtaacaggga atataaaggg cagcataatt taggagttta 360
gtgaacttgc aacatttact attttccctt c 391
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 16
catatgacct ttcgcaattg tgt 23
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 17
ggatcctcat gcgcaaagct cctttg 26
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 18
ccatggatgc accatcacca tcaccatatg ttatccggct atattgcagg ag 52
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 19
ggatccgtcg acattaacgg cgaaattgtt tcagcatt 38
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 20
ttggatccag gaggattcat atggcacatc gctttccggc 40
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 21
ttaagctttt aatacgtgta acaggccg 28
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 22
catatgacag atattgcgca gttgcttgg 29
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 23
ggatcctcag gcgatagtaa ttttgctat 29
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 24
catatgagca ttatctccac taaatatct 29
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 25
ggatccttat gctgaaattc gattcgctg 29
<210> 26
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 26
cctctagagt cgacctgcag aggaggattc atatgaacaa ctttaatctg cacacc 56
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 27
gccaaaacag aagcttttag cgggcggctt cgta 34
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 28
cggtacccgg ggatcaggag gcacacgatg gaagaagcag at 42
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 29
tcacacgatg ccatcaaagc cctgc 25
<210> 30
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 30
cctctagagt cgacctgcag aggaggattc atatggcaca tcgctttccg gctc 54
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 31
gccaaaacag aagcttttaa tacgtgtaac aggccg 36
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 32
ttggtaccaa gaaggagaat tcatatgtca gtacccgttc aaca 44
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 33
ttaagctttt aagactgtaa ataaacca 28
<210> 34
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 34
gagctcggta cccggggatc caggaggcac acgatggata tcatctttta tcacc 55
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 35
ctcatccgcc aaaacagaag cttttagtag ccgcgtgcgc ggtcgactt 49
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 36
gcacgcggct actaaaggag gaaccgtatg aaaacccgta cacaacaaat tg 52
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 37
ctcatccgcc aaaacagaag cttttagaac tgcgattctt cagtgga 47
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 38
tcatacggtt cctcctttag tagccgcgtg cgcggtcgac tt 42
<210> 39
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 39
ggaacaaaag ctggagctcg taggaacaat ttcgggcctt aaactgtgag gaccttaata 60
cattc 65
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 40
atctgcttct cttccatttt tagtttatgt atgtgttttt tg 42
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 41
cacatacata aactaaaaat ggaagagaag cagatcctgt gcgt 44
<210> 42
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 42
tgtctttgcc tttgatctgc tcacacgatg ccatcaaagc cc 42
<210> 43
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 43
gatggcatcg tgtgagcaga tcaaaggcaa agacagaaac cgtag 45
<210> 44
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 44
attcctatca ttatttacgt aatgacccat cttggtgtgt catcggtagt aacgcc 56
<210> 45
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 45
ccgatgacac accaagatgg gtcattacgt aaataatgat aggaatggg 49
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 46
tgcgtcagag ccggaaagcg atgtgccatt ttgaatatgt attacttggt tatgg 55
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 47
ccaagtaata catattcaaa atggcacatc gctttccggc tctg 44
<210> 48
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 48
ctgatgatct acgatcagaa tttaatacgt gtaacaggcc gtaaac 46
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 49
gttacacgta ttaaattctg atcgtagatc atcagatttg atatg 45
<210> 50
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 / 引物
<400> 50
cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggatattc tttattggct ttatacttga 60
<210> 51
<211> 1104
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 51
atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60
ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 120
ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa 180
attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg 240
gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc 300
aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc 360
gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat 420
ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca 480
cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt 540
gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg 600
gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct 660
gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatttg 720
agcggtgttg gttttgaaag tggtggtctg gctgcggcgc acgcagtgca taacggcctg 780
accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg 840
acgcagctgg ttctggaaaa tgcgccggtg gaggaaatcg aaaccgtagc tgcccttagc 900
catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg 960
aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1020
ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1080
cgtttcctgc aagagtggga ataa 1104
<210> 52
<211> 1149
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 52
atggctaaca gaatgattct gaacgaaacg gcatggtttg gtcggggtgc tgttggggct 60
ttaaccgatg aggtgaaacg ccgtggttat cagaaggcgc tgatcgtcac cgataaaacg 120
ctggtgcaat gcggcgtggt ggcgaaagtg accgataaga tggatgctgc agggctggca 180
tgggcgattt acgacggcgt agtgcccaac ccaacaatta ctgtcgtcaa agaagggctc 240
ggtgtattcc agaatagcgg cgcggattac ctgatcgcta ttggtggtgg ttctccacag 300
gatacttgta aagcgattgg cattatcagc aacaacccgg agtttgccga tgtgcgtagc 360
ctggaagggc tttccccgac caataaaccc agtgtaccga ttctggcaat tcctaccaca 420
gcaggtactg cggcagaagt gaccattaac tacgtgatca ctgacgaaga gaaacggcgc 480
aagtttgttt gcgttgatcc gcatgatatc ccgcaggtgg cgtttattga cgctgacatg 540
atggatggta tgcctccagc gctgaaagct gcgacgggtg tcgatgcgct cactcatgct 600
attgaggggt atattacccg tggcgcgtgg gcgctaaccg atgcactgca cattaaagcg 660
attgaaatca ttgctggggc gctgcgagga tcggttgctg gtgataagga tgccggagaa 720
gaaatggcgc tcgggcagta tgttgcgggt atgggcttct cgaatgttgg gttagggttg 780
gtgcatggta tggcgcatcc actgggcgcg ttttataaca ctccacacgg tgttgcgaac 840
gccatcctgt taccgcatgt catgcgttat aacgctgact ttaccggtga gaagtaccgc 900
gatatcgcgc gcgttatggg cgtgaaagtg gaaggtatga gcctggaaga ggcgcgtaat 960
gccgctgttg aagcggtgtt tgctctcaac cgtgatgtcg gtattccgcc acatttgcgt 1020
gatgttggtg tacgcaagga agacattccg gcactggcgc aggcggcact ggatgatgtt 1080
tgtaccggtg gcaacccgcg tgaagcaacg cttgaggata ttgtagagct ttaccatacc 1140
gcctggtaa 1149
<210> 53
<211> 1455
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 53
atgtatatcg ggatagatct tggcacctcg ggcgtaaaag ttattttgct caacgagcag 60
ggtgaggtgg ttgctgcgca aacggaaaag ctgaccgttt cgcgcccgca tccactctgg 120
tcggaacaag acccggaaca gtggtggcag gcaactgatc gcgcaatgaa agctctgggc 180
gatcagcatt ctctgcagga cgttaaagca ttgggtattg ccggccagat gcacggagca 240
accttgctgg atgctcagca acgggtgtta cgccctgcca ttttgtggaa cgacgggcgc 300
tgtgcgcaag agtgcacttt gctggaagcg cgagttccgc aatcgcgggt gattaccggc 360
aacctgatga tgcccggatt tactgcgcct aaattgctat gggttcagcg gcatgagccg 420
gagatattcc gtcaaatcga caaagtatta ttaccgaaag attacttgcg tctgcgtatg 480
acgggggagt ttgccagcga tatgtctgac gcagctggca ccatgtggct ggatgtcgca 540
aagcgtgact ggagtgacgt catgctgcag gcttgcgact tatctcgtga ccagatgccc 600
gcattatacg aaggcagcga aattactggt gctttgttac ctgaagttgc gaaagcgtgg 660
ggtatggcga cggtgccagt tgtcgcaggc ggtggcgaca atgcagctgg tgcagttggt 720
gtgggaatgg ttgatgctaa tcaggcaatg ttatcgctgg ggacgtcggg ggtctatttt 780
gctgtcagcg aagggttctt aagcaagcca gaaagcgccg tacatagctt ttgccatgcg 840
ctaccgcaac gttggcattt aatgtctgtg atgctgagtg cagcgtcgtg tctggattgg 900
gccgcgaaat taaccggcct gagcaatgtc ccagctttaa tcgctgcagc tcaacaggct 960
gatgaaagtg ccgagccagt ttggtttctg ccttatcttt ccggcgagcg tacgccacac 1020
aataatcccc aggcgaaggg ggttttcttt ggtttgactc atcaacatgg ccccaatgaa 1080
ctggcgcgag cagtgctgga aggcgtgggt tatgcgctgg cagatggcat ggatgtcgtg 1140
catgcctgcg gtattaaacc gcaaagtgtt acgttgattg ggggcggggc gcgtagtgag 1200
tactggcgtc agatgctggc ggatatcagc ggtcagcagc tcgattaccg tacggggggg 1260
gatgtggggc cagcactggg cgcagcaagg ctggcgcaga tcgcggcgaa tccagagaaa 1320
tcgctcattg aattgttgcc gcaactaccg ttagaacagt cgcatctacc agatgcgcag 1380
cgttatgccg cttatcagcc acgacgagaa acgttccgtc gcctctatca gcaacttctg 1440
ccattaatgg cgtaa 1455
<210> 54
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 54
cctctagagt cgacctgcag aggaggattc atatggaccg catta 45
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 55
gccaaaacag aagcttttat tcccactctt gcagg 35
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 56
ttggatccag gaggattcat atggctaaca gaatgattct 40
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 57
ttaagctttt accaggcggt atggtaa 27
<210> 58
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gatggcatcg tgtgaaggag gaaccgtatg acagatattg cgcagttgct tg 52
<210> 59
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 59
atgcctgcag gtcgacaatt gtcaggcgat agtaattttg ctat 44
<210> 60
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 60
cggtacccgg ggatcggaaa tactataaac ggttaaataa acaaaccata atggaagaga 60
agcagatc 68
<210> 61
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 61
gatggcatcg tgtgaacagc ttttaattat acactttaag gaggacagac atgacagata 60
ttgcgcagtt 70
<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 62
atgcctgcag gtcgagcgat agtaattttg ctatc 35
<210> 63
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 63
cggtacccgg ggatccagga ggattcatat gacagatatt gcgcag 46
<210> 64
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 64
tccgccaaaa cagaagcttt caggcgatag taattttgc 39
<210> 65
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 65
ctcatccgcc aaaacagaag cttttagaac tgcgattctt cagtgga 47
<210> 66
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 66
gaagaatcgc agttctaaag gaggcacacg atggatatca tcttttatc 49
<210> 67
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 67
catccgccaa aacagaagct ttctagatta gtagccgcgt gcgcggtcga ctt 53
<210> 68
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 68
catccgccaa aacagaagct ttctagatta gtagccgcgt gcgcggtcga ctt 53
<210> 69
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 69
gcgtcttgat ggcgctttac ccgatgtcga ccgcacatcg gtactgatgg cactgcgtga 60
gcatgtccct ggacttgaga tcgtgtaggc tggagctgct tc 102
<210> 70
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 70
cgcgtaaacg ccaggcgtgt aataacggtt cggtatagcc gtttggctgt ttcacgccga 60
ggaagattaa atcgctggcc atatgaatat cctccttag 99
<210> 71
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 71
cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc 60
atcgttcgca gttggcatgc gggtgtaggc tggagctgct tc 102
<210> 72
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 72
gcttagcgcc ttctacagct tcacgcgcca gcttagtaat gcggtcgtaa tcgcccgctt 60
ccagcgcatc tgccggaacc catatgaata tcctccttag 100
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 73
cacagctaac accacgtcgt 20
<210> 74
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 74
acgtcattgc cttgtttgac cgcccctgtt ttttagcgtc aggcatataa tacctcctaa 60
agttaaacaa aattatttgt ag 82
<210> 75
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 75
ccgcccgcac aataacatca ttcttcctga tcacgtttca ccgcagatta gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 76
gatagggacg acgtggtgtt agctgtgcat atgaatatcc tccttag 47
<210> 77
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 77
ggatccgtcg acaggaggta acatatggaa gagaagcaga tcctgtg 47
<210> 78
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 78
ctgcagtcta gaagatctca cacgatgcca tcaaa 35
<210> 79
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 79
ttggatccaa gaaggagaat tcatatggca catcgctttc cggc 44
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 80
ttaatacgtg taacaggccg t 21
<210> 81
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 81
cgcacccatt cccgcgaaac gcggcagaaa acccgccgtt gccaccgcac cagcgactgg 60
acaggttcag tctttaacgc gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210> 82
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 82
gcgcattcca ccgtacgcca gcgtcacttc cttcgccgct ttaatcacca tcgcgccaaa 60
ctcggtcacg cggtcatcgg catatgaata tcctccttag 100
<210> 83
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 83
gaattgctgg cccgctgcgg cataaaaatt aattggtacc ggttatttaa actgtgagga 60
cct 63
<210> 84
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 84
gatttgcttt tcttccattt ttagtttatg tatgtgtttt tttgta 46
<210> 85
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 85
cacatacata aactaaaaat ggaagaaaag caaatcttgt 40
<210> 86
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 86
gtttctgtct ttgcctttga tctgcttaaa cgataccgtc gaaac 45
<210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 87
ggtatcgttt aagcagatca aaggcaaaga cagaaaccgt ag 42
<210> 88
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 88
attcctatca ttatttacgt aatgacccat cttggtgtgt catcggtagt aacgcc 56
<210> 89
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 89
ccgatgacac accaagatgg gtcattacgt aaataatgat aggaatggg 49
<210> 90
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 90
gctgggaatc tgtgagccat tttgaatatg tattacttgg ttatg 45
<210> 91
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 91
tgatctacga tcagaattta gtaagtgtaa caagcagtga ac 42
<210> 92
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 92
gtaatacata ttcaaaatgg ctcacagatt cccagctttg ac 42
<210> 93
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 93
gcttgttaca cttactaaat tctgatcgta gatcatcaga tttgatatg 49
<210> 94
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 94
ggtgacccgg cggggacgag gcaagctaaa cagatctcta gaataatttt ttatattctt 60
tattgg 66
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 95
gagattttgt tcttctgagc ttctg 25
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物/引物
<400> 96
gaaattgcac ttagcatttt tgaat 25
<210> 97
<211> 897
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 97
atggaagaaa agcaaatctt gtgtgttggt ttggttgttt tggacgttat ctctttggtt 60
gacaagtacc caaaggaaga ctctgaaatc agatgtttgt ctcaaagatg gcaaagaggt 120
ggtaacgctt ctaactcttg tactgttttg tctttgttgg gtgctccatg tgctttcatg 180
ggttctatgg ctccaggtca cgttgctgac ttcttggttg ctgacttcag aaggagaggt 240
gttgacgttt ctcaagttgc ttggcaatct aagggtgaca ctccatcttc ttgttgtatc 300
atcaacaact ctaacggtaa cagaactatc gttttgcacg acacttcttt gccagacgtt 360
tctgctactg acttcgaaaa ggttgacttg actcaattca agtggatcca catcgaaggt 420
agaaacgctt ctgaacaagt taagatgttg caaagaatcg acgctcacaa cactagacaa 480
ccaccagaac aaaagatcag agtttctgtt gaagttgaaa agccaagaga agaattgttc 540
caattgttcg gttacggtga cgttgttttc gtttctaagg acgttgctaa gcacttgggt 600
ttccaatctg ctgaagaagc tttgagaggt ttgtacggta gagttagaaa gggtgctgtt 660
ttggtttgtg cttgggctga agaaggtgct gacgctttgg gtccagacgg taagttgttg 720
cactctgacg ctttcccacc gccaagagtt gttgacactt tgggtgctgg tgacactttc 780
aacgcttctg ttatcttctc tttgtctcaa ggtagatctg ttcaagaagc tttgagattc 840
ggttgtcaag ttgctggtaa gaagtgtggt ttgcaaggtt tcgacggtat cgtttaa 897
<210> 98
<211> 1095
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 98
atggctcaca gattcccagc tttgactcaa gaacaaaaga aggaattgtc tgaaatcgct 60
caatctatcg ttgctaacgg taagggtatc ttggctgctg acgaatctgt tggtactatg 120
ggtaacagat tgcaaagaat caaggttgaa aacactgaag aaaacagaag acaattcaga 180
gaaatcttgt tctctgttga ctcttctatc aaccaatcta tcggtggtgt tatcttgttc 240
cacgaaactt tgtaccaaaa ggactctcaa ggtaagttgt tcagaaacat cttgaaggaa 300
aagggtatcg ttgttggtat caagttggac caaggtggtg ctccattggc tggtactaac 360
aaggaaacta ctatccaagg tttggacggt ttgtctgaaa gatgtgctca atacaagaag 420
gacggtgttg acttcggtaa gtggagagct gttttgagaa tcgctgacca atgtccatct 480
tctttggcta tccaagaaaa cgctaacgct ttggctagat acgcttctat ctgtcaacaa 540
aacggtttgg ttccaatcgt tgaaccagaa gttatcccag acggtgacca cgacttggaa 600
cactgtcaat acgttactga aaaggttttg gctgctgttt acaaggcttt gaacgaccac 660
cacgtttact tggaaggtac tttgttgaag ccaaacatgg ttactgctgg tcacgcttgt 720
actaagaagt acactccaga acaagttgct atggctactg ttactgcttt gcacagaact 780
gttccagctg ctgttccagg tatctgtttc ttgtctggtg gtatgtctga agaagacgct 840
actttgaact tgaacgctat caacttgtgt ccattgccaa agccatggaa gttgtctttc 900
tcttacggta gagctttgca agcttctgct ttggctgctt ggggtggtaa ggctgctaac 960
aaggaagcta ctcaagaagc tttcatgaag agagctatgg ctaactgtca agctgctaag 1020
ggtcaatacg ttcacactgg ttcttctggt gctgcttcta ctcaatcttt gttcactgct 1080
tgttacactt actaa 1095
<210> 99
<211> 10023
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 99
ggtaccttta cgatagagcc agagacgatg ccgacgaaga tgaagaagat cccgacacaa 60
gaagctccgg taagaagaag gacgccagcc aagaagaatc tctaatctaa gaggacggtt 120
gctgaagaaa aaggcttttt ttattttgtc cgtttttttt ttgtaaaacc caaagatctg 180
aatctaaagc ttttttaaac gtatatagat gtctacatgt gtgtttttgt ttttttacgt 240
acgtataccc acctatatat gcataatccg taattgaaaa aaaaaaaaga aaaagatcaa 300
ggaacacatc accctgggca catcaagcgt gaggaatgcc gtccaactgg tggagacgct 360
tgatttgctc tttttgttct gggtccaacc cggtctcgaa gaacatcagc accacgcccg 420
caacgacaaa gaacattgca atacacttgc atatgtgagc atagtcgagc ggtccgttct 480
gtggttgatg ctgttgttct ttcttctgtt tgtcaggggt gatagccata tcttcgtgct 540
cttgttgcga ttgttctgtt ccatctgcac cagaacaaag aacaaaagaa caaggaacaa 600
agtccaagca cgtcagcgct gtttataagg ggattgacga gggatcgggc ctagagtgcc 660
agcgcgccag ggagagggag ccccctgggc cctcatccgc aggctgatag gggtcacccc 720
gctgggcagg tcagggcagg ggctctcagg ggggcgccat ggacaaactg cactgaggtt 780
ctaagacaca tgtattattg tgagtatgta tatatagaga gagattaagg cgtacagccg 840
ggtggtagag attgattaac ttggtagtct tatcttgtca attgagtttc tgtcagtttc 900
ttcttgaaca agcacgcagc taagtaagca acaaagcagg ctaacaaact aggtactcac 960
atacagactt attaagacat agaactatga ctacggataa cgctaaggcg caactgacct 1020
cgtcttcagg gggtaacatt attgtggtgt ccaacaggct tcccgtgaca atcactaaaa 1080
acagcagtac gggacagtac gagtacgcaa tgtcgtccgg agggctggtc acggcgttgg 1140
aagggttgaa gaagacgtac actttcaagt ggttcggatg gcctgggcta gagattcctg 1200
acgatgagaa ggatcaggtg aggaaggact tgctggaaaa gtttaatgcc gtacccatct 1260
tcctgagcga tgaaatcgca gacttacact acaacgggtt cagtaattct attctatggc 1320
cgttattcca ttaccatcct ggtgagatca atttcgacga gaatgcgtgg ttggcataca 1380
acgaggcaaa ccagacgttc accaacgaga ttgctaagac tatgaaccat aacgatttaa 1440
tctgggtgca tgattaccat ttgatgttgg ttccggaaat gttgagagtc aagattcacg 1500
agaagcaact gcaaaacgtt aaggtcgggt ggttcctgca cacaccattc ccttcgagtg 1560
aaatttacag aatcttacct gtcagacaag agattttgaa gggtgttttg agttgtgatt 1620
tagtcgggtt ccacacatac gattatgcaa gacatttctt gtcttccgtg caaagagtgc 1680
ttaacgtgaa cacattgcct aatggggtgg aataccaggg cagattcgtt aacgtagggg 1740
ccttccctat cggtatcgac gtggacaagt tcaccgatgg gttgaaaaag gaatccgtac 1800
aaaagagaat ccaacaattg aaggaaactt tcaagggctg caagatcata gttggtgtcg 1860
acaggctgga ttacatcaaa ggtgtgcctc agaagttgca cgccatggaa gtgtttctga 1920
acgagcatcc agaatggagg ggcaaggttg ttctggtaca ggttgcagtg ccaagtcgtg 1980
gagatgtgga agagtaccaa tatttaagat ctgtggtcaa tgagttggtc ggtagaatca 2040
acggtcagtt cggtactgtg gaattcgtcc ccatccattt catgcacaag tctataccat 2100
ttgaagagct gatttcgtta tatgctgtga gcgatgtttg tttggtctcg tccacccgtg 2160
atggtatgaa cttggtttcc tacgaatata ttgcttgcca agaagaaaag aaaggttcct 2220
taatcctgag tgagttcaca ggtgccgcac aatccttgaa tggtgctatt attgtaaatc 2280
cttggaacac cgatgatctt tctgatgcca tcaacgaggc cttgactttg cccgatgtaa 2340
agaaagaagt taactgggaa aaactttaca aatacatctc taaatacact tctgccttct 2400
ggggtgaaaa tttcgtccat gaattataca gtacatcatc aagctcaaca agctcctctg 2460
ccaccaaaaa ctgatgaacc cgatgcaaat gagacgatcg tctattcctg gtccggtttt 2520
ctctgccctc tcttctattc acttttttta tactttatat aaaattatat aaatgacata 2580
actgaaacgc cacacgtcct ctcctattcg ttaacgcctg tctgtagcgc tgttactgaa 2640
gctgcgcaag tagttttttc accgtatagg atgacaaccc ttaatataac ttcgtataat 2700
gtatgctata cgaagttatt aggtctagag atctgtttag cttgcctcgt ccccgccggg 2760
tcacccggcc agcgacatgg aggcccagaa taccctcctt gacagtcttg acgtgcgcag 2820
ctcaggggca tgatgtgact gtcgcccgta catttagccc atacatcccc atgtataatc 2880
atttgcatcc atacattttg atggccgcac ggcgcgaagc aaaaattacg gctcctcgct 2940
gcagacctgc gagcagggaa acgctcccct cacagacgcg ttgaattgtc cccacgccgc 3000
gcccctgtag agaaatataa aaggttagga tttgccactg aggttcttct ttcatatact 3060
tccttttaaa atcttgctag gatacagttc tcacatcaca tccgaacata aacaaccatg 3120
ggtaaggaaa agactcacgt ttcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta 3180
tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg 3240
tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat 3300
gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc 3360
atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggc 3420
aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg 3480
ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc 3540
gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg 3600
agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat 3660
aagcttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac 3720
cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca 3780
gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta 3840
cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt 3900
catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca gtactgacaa taaaaagatt cttgttttca 3960
agaacttgtc atttgtatag tttttttata ttgtagttgt tctattttaa tcaaatgtta 4020
gcgtgattta tatttttttt cgcctcgaca tcatctgccc agatgcgaag ttaagtgcgc 4080
agaaagtaat atcatgcgtc aatcgtatgt gaatgctggt cgctatactg ctgtcgattc 4140
gatactaacg ccgccatcca gtgtcgaaaa cgagctctcg agaaccctta atataacttc 4200
gtataatgta tgctatacga agttattagg tgatatcgga tccggatcct cagcagcgaa 4260
acgttgttct gggaaaccat ggagaaactg aaagcgcttg gcgccagctc gattctggta 4320
ctgccgatcg agaagatgat ggagtgagca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 4380
gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 4440
aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 4500
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 4560
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 4620
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 4680
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 4740
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 4800
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 4860
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4920
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 4980
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 5040
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 5100
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 5160
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 5220
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 5280
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 5340
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 5400
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 5460
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 5520
ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 5580
tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 5640
accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 5700
atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 5760
cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 5820
tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 5880
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 5940
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 6000
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 6060
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 6120
gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 6180
tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 6240
gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 6300
tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 6360
aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 6420
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 6480
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat 6540
tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga 6600
attagctttt caattcaatt catcattttt tttttattct tttttttgat ttcggtttct 6660
ttgaaatttt tttgattcgg taatctccga acagaaggaa gaacgaagga aggagcacag 6720
acttagattg gtatatatac gcatatgtag tgttgaagaa acatgaaatt gcccagtatt 6780
cttaacccaa ctgcacagaa caaaaacatg caggaaacga agataaatca tgtcgaaagc 6840
tacatataag gaacgtgctg ctactcatcc tagtcctgtt gctgccaagc tatttaatat 6900
catgcacgaa aagcaaacaa acttgtgtgc ttcattggat gttcgtacca ccaaggaatt 6960
actggagtta gttgaagcat taggtcccaa aatttgttta ctaaaaacac atgtggatat 7020
cttgactgat ttttccatgg agggcacagt taagccgcta aaggcattat ccgccaagta 7080
caatttttta ctcttcgaag acagaaaatt tgctgacatt ggtaatacag tcaaattgca 7140
gtactctgcg ggtgtataca gaatagcaga atgggcagac attacgaatg cacacggtgt 7200
ggtgggccca ggtattgtta gcggtttgaa gcaggcggca gaagaagtaa caaaggaacc 7260
tagaggcctt ttgatgttag cagaattgtc atgcaagggc tccctatcta ctggagaata 7320
tactaagggt actgttgaca ttgcgaagag cgacaaagat tttgttatcg gctttattgc 7380
tcaaagagac atgggtggaa gagatgaagg ttacgattgg ttgattatga cacccggtgt 7440
gggtttagat gacaagggag acgcattggg tcaacagtat agaaccgtgg atgatgtggt 7500
ctctacagga tctgacatta ttattgttgg aagaggacta tttgcaaagg gaagggatgc 7560
taaggtagag ggtgaacgtt acagaaaagc aggctgggaa gcatatttga gaagatgcgg 7620
ccagcaaaac taaaaaactg tattataagt aaatgcatgt atactaaact cacaaattag 7680
agcttcaatt taattatatc agttattacc caattctcat gtttgacagc ttatcatcga 7740
tcgtccaact gcatggagat gagtcgtggc aagaatacca agagttcctc ggtttgccag 7800
ttattaaaag actcgtattt ccaaaagact gcaacatact actcagtgca gcttcacaga 7860
aacctcattc gtttattccc ttgtttgatt cagaagcagg tgggacaggt gaacttttgg 7920
attggaactc gatttctgac tgggttggaa ggcaagagag ccccgagagc ttacatttta 7980
tgttagctgg tggactgacg ccagaaaatg ttggtgatgc gcttagatta aatggcgtta 8040
ttggtgttga tgtaagcgga ggtgtggaga caaatggtgt aaaagactct aacaaaatag 8100
caaatttcgt caaaaatgct aagaaatagg ttattactga gtagtattta tttaagtatt 8160
gtttgtgcac ttgcctgcaa gccttttgaa aagcaagcat aaaagatcta aacataaaat 8220
ctgtaaaata acaagatgta aagataatgc taaatcattt ggctttttga ttgattgtac 8280
aggaaaatat acatcgcagg gggttgactt ttaccatttc accgcaatgg aatcaaactt 8340
gttgaagaga atgttcacag gcgcatacgc tacaatgacc cgattcttgc tagccttttc 8400
tcggtcttgc aaacaaccgc cggcagctta gtatataaat acacatgtac atacctctct 8460
ccgtatcctc gtaatcattt tcttgtattt atcgtctttt cgctgtaaaa actttatcac 8520
acttatctca aatacactta ttaaccgctt ttactattat cttctacgct gacagtaata 8580
tcaaacagtg acacatatta aacacagtgg tttctttgca taaacaccat cagcctcaag 8640
tcgtcaagta aagatttcgt gttcatgcag atagataaca atctatatgt tgataattag 8700
cgttgcctca tcaatgcgag atccgtttaa ccggacccta gtgcacttac cccacgttcg 8760
gtccactgtg tgccgaacat gctccttcac tattttaaca tgtggaatta attctcatgt 8820
ttgacagctt atcatcgaac tctaagaggt gatacttatt tactgtaaaa ctgtgacgat 8880
aaaaccggaa ggaagaataa gaaaactcga actgatctat aatgcctatt ttctgtaaag 8940
agtttaagct atgaaagcct cggcattttg gccgctccta ggtagtgctt tttttccaag 9000
gacaaaacag tttctttttc ttgagcaggt tttatgtttc ggtaatcata aacaataaat 9060
aaattatttc atttatgttt aaaaataaaa aataaaaaag tattttaaat ttttaaaaaa 9120
gttgattata agcatgtgac cttttgcaag caattaaatt ttgcaatttg tgattttagg 9180
caaaagttac aatttctggc tcgtgtaata tatgtatgct aaagtgaact tttacaaagt 9240
cgatatggac ttagtcaaaa gaaattttct taaaaatata tagcactagc caatttagca 9300
cttctttatg agatatatta tagactttat taagccagat ttgtgtatta tatgtattta 9360
cccggcgaat catggacata cattctgaaa taggtaatat tctctatggt gagacagcat 9420
agataaccta ggatacaagt taaaagctag tactgttttg cagtaatttt tttctttttt 9480
ataagaatgt taccacctaa ataagttata aagtcaatag ttaagtttga tatttgattg 9540
taaaataccg taatatattt gcatgatcaa aaggctcaat gttgactagc cagcatgtca 9600
accactatat tgatcaccga tatatggact tccacaccaa ctagtaatat gacaataaat 9660
tcaagatatt cttcatgaga atggcccagc gatatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 9720
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 9780
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caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 9900
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gccgtttaag cgatgattca cgagaattgc tggcccgctg cggcataaaa attaattggt 10020
acc 10023
<210> 100
<211> 1701
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 100
atggcgattg caattggcct cgattttggc agtgattctg tgcgagcttt ggcggtggac 60
tgcgctaccg gtgaagagat cgccaccagc gtagagtggt atccccgttg gcagaaaggg 120
caattttgtg atgccccgaa taaccagttc cgtcatcatc cgcgtgacta cattgagtca 180
atggaagcgg cactgaaaac cgtgcttgca gagcttagcg tcgaacagcg cgcagctgtg 240
gtcgggattg gcgttgacag taccggctcg acgcccgcac cgattgatgc cgacggaaac 300
gtgctggcgc tgcgcccgga gtttgccgaa aacccgaacg cgatgttcgt attgtggaaa 360
gaccacactg cggttgaaga agcggaagag attacccgtt tgtgccacgc gccgggcaac 420
gttgactact cccgctacat tggtggtatt tattccagcg aatggttctg ggcaaaaatc 480
ctgcatgtga ctcgccagga cagcgccgtg gcgcaatctg ccgcatcgtg gattgagctg 540
tgcgactggg tgccagctct gctttccggt accacccgcc cgcaggatat tcgtcgcgga 600
cgttgcagcg ccgggcataa atctctgtgg cacgaaagct ggggcggcct gccgccagcc 660
agtttctttg atgagctgga cccgatcctc aatcgccatt tgccttcccc gctgttcact 720
gacacttgga ctgccgatat tccggtgggc accttatgcc cggaatgggc gcagcgtctc 780
ggcctgcctg aaagcgtggt gatttccggc ggcgcgtttg actgccatat gggcgcagtt 840
ggcgcaggcg cacagcctaa cgcactggta aaagttatcg gtacttccac ctgcgacatt 900
ctgattgccg acaaacagag cgttggcgag cgggcagtta aaggtatttg cggtcaggtt 960
gatggcagcg tggtgcctgg atttatcggt ctggaagcag gccaatcggc gtttggtgat 1020
atctacgcct ggtttggtcg cgtactcggc tggccgctgg aacagcttgc cgcccagcat 1080
ccggaactga aaacgcaaat caacgccagc cagaaacaac tgcttccggc gctgaccgaa 1140
gcatgggcca aaaatccgtc tctggatcac ctgccggtgg tgctcgactg gtttaacggc 1200
cgccgcacac cgaacgctaa ccaacgcctg aaaggggtga ttaccgatct taacctcgct 1260
accgacgctc cgctgctgtt cggcggtttg attgctgcca ccgcctttgg cgcacgcgca 1320
atcatggagt gctttaccga tcaggggatc gccgttaata acgtgatggc actgggcggc 1380
atcgcgcgga aaaaccaggt cattatgcag gcctgctgcg acgtgctgaa tcgcccgctg 1440
caaattgttg cctctgacca gtgctgtgcg ctcggtgcgg cgatttttgc tgccgtcgcc 1500
gcgaaagtgc acgcagacat cccatcagct cagcaaaaaa tggccagtgc ggtagagaaa 1560
accctgcaac cgtgcagcga gcaggcacaa cgctttgaac agctttatcg ccgctatcag 1620
caatgggcga tgagcgccga acaacactat cttccaactt ccgccccggc acaggctgcc 1680
caggccgttg cgactctata a 1701
<210> 101
<211> 1803
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 101
atgttgtgtt cagtaattca gagacagaca agagaggttt ccaacacaat gtctttagac 60
tcatactatc ttgggtttga tctttcgacc caacaactga aatgtctcgc cattaaccag 120
gacctaaaaa ttgtccattc agaaacagtg gaatttgaaa aggatcttcc gcattatcac 180
acaaagaagg gtgtctatat acacggcgac actatcgaat gtcccgtagc catgtggtta 240
gaggctctag atctggttct ctcgaaatat cgcgaggcta aatttccatt gaacaaagtt 300
atggccgtct cagggtcctg ccagcagcac gggtctgtct actggtcctc ccaagccgaa 360
tctctgttag agcaattgaa taagaaaccg gaaaaagatt tattgcacta cgtgagctct 420
gtagcatttg caaggcaaac cgcccccaat tggcaagacc acagtactgc aaagcaatgt 480
caagagtttg aagagtgcat aggtgggcct gaaaaaatgg ctcaattaac agggtccaga 540
gcccatttta gatttactgg tcctcaaatt ctgaaaattg cacaattaga accagaagct 600
tacgaaaaaa caaagaccat ttctttagtg tctaattttt tgacttctat cttagtgggc 660
catcttgttg aattagagga ggcagatgcc tgtggtatga acctttatga tatacgtgaa 720
agaaaattca gtgatgagct actacatcta attgatagtt cttctaagga taaaactatc 780
agacaaaaat taatgagagc acccatgaaa aatttgatag cgggtaccat ctgtaaatat 840
tttattgaga agtacggttt caatacaaac tgcaaggtct ctcccatgac tggggataat 900
ttagccacta tatgttcttt acccctgcgg aagaatgacg ttctcgtttc cctaggaaca 960
agtactacag ttcttctggt caccgataag tatcacccct ctccgaacta tcatcttttc 1020
attcatccaa ctctgccaaa ccattatatg ggtatgattt gttattgtaa tggttctttg 1080
gcaagggaga ggataagaga cgagttaaac aaagaacggg aaaataatta tgagaagact 1140
aacgattgga ctctttttaa tcaagctgtg ctagatgact cagaaagtag tgaaaatgaa 1200
ttaggtgtat attttcctct gggggagatc gttcctagcg taaaagccat aaacaaaagg 1260
gttatcttca atccaaaaac gggtatgatt gaaagagagg tggccaagtt caaagacaag 1320
aggcacgatg ccaaaaatat tgtagaatca caggctttaa gttgcagggt aagaatatct 1380
cccctgcttt cggattcaaa cgcaagctca caacagagac tgaacgaaga tacaatcgtg 1440
aagtttgatt acgatgaatc tccgctgcgg gactacctaa ataaaaggcc agaaaggact 1500
ttttttgtag gtggggcttc taaaaacgat gctattgtga agaagtttgc tcaagtcatt 1560
ggtgctacaa agggtaattt taggctagaa acaccaaact catgtgccct tggtggttgt 1620
tataaggcca tgtggtcatt gttatatgac tctaataaaa ttgcagttcc ttttgataaa 1680
tttctgaatg acaattttcc atggcatgta atggaaagca tatccgatgt ggataatgaa 1740
aattgggatc gctataattc caagattgtc cccttaagcg aactggaaaa gactctcatc 1800
taa 1803
<210> 102
<211> 160
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 102
ttctagagca cagctaacac cacgtcgtcc ctatctgctg ccctaggtct atgagtggtt 60
gctggataac tttacgggca tgcataaggc tcgtataata tattcaggga gaccacaacg 120
gtttccctct acaaataatt ttgtttaact tttactagag 160

Claims (16)

1.一种通过在微生物中转化戊糖用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于，所述方法至少包括：
(i)培养表达戊糖同化合成途径的重组微生物的操作，其至少包括以下步骤：
a)在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和/或(L)-核酮糖的戊糖，
b)裂解步骤a)结束时获得的戊糖-1-磷酸酯，从而获得乙醇醛和磷酸二羟基丙酮(DHAP)，以及
(ii)回收培养操作(i)结束时获得的所述至少一种感兴趣的代谢物的操作。
2.根据权利要求1所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于：
-所述戊糖同化合成途径的磷酸化步骤a)由选自由酮基己糖激酶C(KhkC)、鼠李酮糖激酶(rhaB)和墨角藻糖激酶(fucK)组成的组中的重组表达酶催化，和/或
-所述戊糖同化合成途径的裂解步骤b)由选自由醛缩酶B(Aldo-B)和果糖-1,6二磷酸醛缩酶(FbaB)组成的组中的醛缩酶催化。
3.根据权利要求2所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于：
-步骤a)由酮基己糖激酶C催化，并且
-步骤b)由醛缩酶B(Aldo-B)和/或果糖1,6二磷酸醛缩酶B催化。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，所述感兴趣的代谢物选自乙二醇和/或乙醇酸，其特征在于，所述戊糖同化合成途径进一步包括以下步骤：
c)将步骤b)结束时获得的乙醇醛还原成乙二醇，和/或
c')将步骤b)结束时获得的乙醇醛氧化成乙醇酸。
5.根据权利要求4所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，用于生产乙二醇和/或乙醇酸，其特征在于：
-还原步骤c)由选自由醛还原酶(YqhD)、甘油脱氢酶(GldA)和丙烷-1,2-二醇氧化还原酶(FucO)组成的组中的乙醇醛还原酶催化，和/或
-氧化步骤c')通过由乳醛脱氢酶(AldA)组成的乙醇醛脱氢酶催化。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于，所述微生物培养于含有(D)-木糖和/或(L)-阿拉伯糖的碳培养基上。
7.根据权利要求6所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于，所述培养基包括含有半纤维素的生物质水解产物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于，所述戊糖同化合成途径包括，在步骤a)之前：
-将(D)-木糖转化为(D)-木酮糖的步骤，和/或
-将(L)-阿拉伯糖转化为(L)-核酮糖的步骤。
9.根据前述权利要求中任一项所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于，所述重组微生物选自大肠杆菌、酿酒酵母和树干毕赤酵母。
10.根据前述权利要求中任一项所述的用于生产至少一种感兴趣的代谢物的方法，其特征在于，所述重组微生物包括(D)-木糖-5激酶和/或(L)-核酮糖-5激酶活性受抑制的微生物。
11.一种表达戊糖同化合成途径并且至少包含编码以下酶的核酸的重组微生物：
i)能够在位置1磷酸化选自(D)-木酮糖和/或(L)-核酮糖的戊糖的酶，
ii)能够裂解步骤(i)结束时获得的戊糖-1-磷酸酯从而获得乙醇醛和磷酸二羟基丙酮(DHAP)的酶，
其特征在于，所述微生物的(D)-木酮糖-5激酶和/或(L)-核酮糖-5激酶活性受到抑制，和/或所述微生物携带以下改变中的至少一种：
-编码乙醛酸还原酶的基因的过表达；
-编码具有或不具有其转录抑制子缺失的异柠檬酸裂解酶的基因的过表达；
-编码苹果酸合酶的基因的缺失；
-编码乙醛酸聚醛酶的基因的缺失；
-编码乙醇酸氧化酶和/或乙醇酸脱氢酶的基因的缺失；
-编码2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶、包括恩特纳-杜德洛夫醛缩酶和磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因的缺失；
-编码参与呼吸代谢的基因的抑制子的基因、包括arcA基因的缺失；
-异柠檬酸脱氢酶表达的减效，并且特别是缺失；
-编码乙醇酸内化系统的基因的缺失；
-导致副产物如乙酸盐、乳酸盐或乙醇生成的代谢途径的减效；
-至少一个编码糖载体的基因的过表达。
12.根据权利要求11所述的重组微生物，其特征在于，其包含：
-至少一个编码酮基己糖激酶C的外源核酸，和
-至少一个编码醛缩酶B的外源核酸。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的微生物，进一步包含以下改变中的至少一种：
-编码主要乙醇醛还原酶的基因的过表达；
-编码乙醇醛脱氢酶的基因的缺失。
14.根据权利要求11或12中任一项所述的微生物，进一步包含以下改变中的至少一种：
-编码乙醇醛脱氢酶的基因的过表达；
-至少一个编码至少一个乙醇酸氧化酶亚基的基因的失活。
15.根据权利要求14所述的微生物，包含以下改变：
-编码乙醛酸还原酶的基因的过表达；
-编码异柠檬酸裂解酶的具有或不具有其转录抑制子缺失的基因的过表达；
-编码苹果酸合酶的基因的缺失；
-编码乙醛酸聚醛酶的基因的缺失；
-编码乙醇酸氧化酶和/或乙醇酸脱氢酶的基因的缺失；
-编码2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶、包括恩特纳-杜德洛夫醛缩酶和磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因的缺失；
-编码参与呼吸代谢的基因的抑制子的基因、包括arcA基因的缺失；
-异柠檬酸脱氢酶表达的减效，并且特别是缺失；
-可选地，编码糖载体的基因的过表达。
16.根据权利要求15所述的微生物，包括以下改变：
-编码乙醇醛脱氢酶的aldA基因的过表达；
-ghrA基因的过表达；
-aceA基因的过表达；
-iclR基因的缺失；
-gcl基因的缺失；
-aceB和glcB基因的缺失；
-选自glcD、glcE、glcF或glcG中的至少一种基因的缺失；
-edd-eda基因的缺失；
-arcA基因的缺失；
-icd基因的缺失；
-galP基因的过表达。
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