CN108718529A - 用于产生l-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生l-半胱氨酸的方法 - Google Patents

用于产生l-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生l-半胱氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于产生L‑半胱氨酸的突变微生物，其中引入有编码L‑半胱氨酸代谢途径相关酶的基因，且更具体地说，涉及一种用于产生L‑半胱氨酸的突变微生物，其中引入有L‑半胱氨酸代谢途径相关酶编码基因cysE、cysK以及cysR，以及一种使用突变微生物产生L‑半胱氨酸的方法。根据本发明，可通过控制与突变微生物的L‑半胱氨酸代谢途径相关的代谢通量以及L‑半胱氨酸所必需的硫源的供应系统来高效产生L‑半胱氨酸。

Description

用于产生L-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生L-半胱氨 酸的方法
技术领域
本发明涉及一种产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中将编码涉及L-半胱氨酸代谢途径的酶的基因引入具有产生L-半胱氨酸能力的微生物中，且更具体地说，涉及一种产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中已引入有编码涉及L-半胱氨酸代谢途径的酶的基因cysE、cysK以及cysR，且涉及一种使用突变微生物产生L-半胱氨酸的方法。
背景技术
近年来，在如食品、药品以及化妆品的各种行业中，对于将L-半胱氨酸在生物学上合成为原料的需求已增加，且对于环保生物材料的消费需求已增加。
L-半胱氨酸为含硫非必需氨基酸且已通过酸水解和电还原方法从人体或动物毛发中提取。然而，在工业上，这些常规方法具有待丢弃的废物量和生产成本增加的问题。社会方面，这些方法导致严重环境污染且造成与使用动物来源的原料相关的问题。
在目前全球市场中，L-半胱氨酸大部分在中国生产并出口海外。在韩国，对于L-半胱氨酸的需求和进口增加，但并没有生产L-半胱氨酸的公司。
由于L-半胱氨酸生产技术在所述国家的缺失，预期开发基于环保生物材料的L-半胱氨酸生产技术来替代中国物理化学处理方法，以使将L-半胱氨酸作为原料供应到各种工业领域成为可能，且对于所述技术的需求增加。
在使用微生物产生L-半胱氨酸的常规方法中，由于存在于氨基酸代谢路径和硫代谢路径中的反馈抑制调节，L-半胱氨酸的合成受限制，且因此，用于在生物学上产生L-半胱氨酸的技术具有如低产率的局限性(登克D和博克A.J.普通微生物学1987；133:515-525,1987；中森S等人,应用环境微生物学期刊1998；64:1607-1611,1998；高木H、小林C等人,欧洲生化学会联合会快报1999；452:323-327,1997；高木H等人,欧洲微生物学会联合会微生物学快报,179:453-459,1999；威尔茨M等人,氨基酸24:195-203,2003；中谷义雄T等人,微生物细胞工厂,11:62,2012)。
相应地，本发明人已作出大量努力来开发能够通过微生物发酵来产生大量L-半胱氨酸的技术，且结果已发现，在使用其中已引入涉及L-半胱氨酸代谢途径的酶的cysE、cysK以及cysR的产生L-半胱氨酸的突变微生物时，可持续地供应对于L-半胱氨酸在微生物中的合成所必需的硫源以极大地增加L-半胱氨酸生产，从而完成本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有改良的产生L-半胱氨酸能力的微生物。
本发明的另一个目的是提供一种使用突变微生物产生L-半胱氨酸的方法。
为实现以上目标，本发明提供一种产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中将编码涉及L-半胱氨酸代谢途径的酶的基因cysE、cysK以及cysR引入具有产生L-半胱氨酸能力的微生物中。
本发明还提供一种产生L-半胱氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养产生L-半胱氨酸的突变微生物；以及(b)回收所产生的L-半胱氨酸。
附图说明
图1绘示了与用于在谷氨酸棒状杆菌中的持续L-半胱氨酸产生的过表达以及硫源吸收系统的调节相关的代谢途径。
图2绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的组成型过表达的重组载体(pMT1-s)的结构。
图3绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的过表达的重组载体(pMT-tac)的结构。
图4绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的CysE过表达的重组载体pMT-tac::cysE的结构。
图5绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的CysK过表达的重组载体pMT-tac::cysK的结构。
图6绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的CysR过表达的重组载体pMT-tac::cysR的结构。
图7绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的CysEK过表达的重组载体pMT-tac::cysEK的结构。
图8绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的CysER过表达的重组载体pMT-tac::cysER的结构。
图9绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的CysKR过表达的重组载体pMT-tac::cysKR的结构。
图10绘示了用于谷氨酸棒状杆菌中的CysEKR过表达的重组载体(pMT-tac::cysEKR)的结构。
图11绘示了野生型谷氨酸棒状杆菌菌株和单重组型谷氨酸棒状杆菌菌株(pMT-tac::cysE、pMT-tac::cysK以及pMT-tac::cysR)的L-半胱氨酸生物合成活性。
图12绘示了野生型谷氨酸棒状杆菌菌株和双重组或三重组谷氨酸棒状杆菌菌株(pMT-tac::cysEK、pMT-tac::cysER、pMT-tac::cysKR以及pMT-tac::cysEKR)的L-半胱氨酸生物合成活性。
图13绘示了野生型谷氨酸棒状杆菌菌株和单重组、双重组或三重组谷氨酸棒状杆菌菌株(pMT-tac::cysR、pMT-tac::cysEK、pMT-tac::cysER、pMT-tac::cysKR、pMT-tac::cysEKR)中的每一个中的胞内硫化物积聚。
图14绘示了野生型谷氨酸棒状杆菌菌株(A)与最终三重谷氨酸棒状杆菌菌株(B,pMT-tac::cysEKR)之间的比较时间依赖性产生的结果。
图15绘示了分析硫源相关基因在野生型谷氨酸棒状杆菌菌株和过表达转录调节子CysR的谷氨酸棒状杆菌菌株(pMT-tac::cysR)中的mRNA表达水平的结果。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。一般来说，本文中所使用的命名法和将在下文所描述的实验方法是本领域中所熟知且通常采用的那些。
在使用微生物产生L-半胱氨酸的常规技术中，由于存在于氨基酸代谢路径和硫代谢路径中的反馈抑制调节，L-半胱氨酸的合成受限制，且因此，用于在生物学上产生L-半胱氨酸的技术具有如低产率的局限性。
在本发明中，为了显著地增加L-半胱氨酸在微生物发酵中的生产产率、生产速率以及生产力，通过过表达L-半胱氨酸合成相关基因来上调L-半胱氨酸代谢途径以用于通过转录活化因子来防止硫的流入途径中的反馈抑制和失调。
在本发明的一个实例中，将从谷氨酸棒状杆菌菌株导出且激活丝氨酸乙酰转移酶、乙酰丝氨酸硫化氢解酶以及硫供应基因的转录调节子基因克隆到包含诱导有力转录的tac启动子(其为lacUV5启动子与trp启动子的杂混物)的载体中，且随后将重组载体引入到谷氨酸棒状杆菌菌株中，从而诱导所述酶中的每一个的过表达。高度过表达的转录调节子(CysR)使外部硫源能够引入到谷氨酸棒状杆菌菌株细胞中且转化成硫化物。随后，高度过表达的丝氨酸乙酰转移酶(CysE)将由谷氨酸棒状杆菌菌株所产生的胞内丝氨酸转化成乙酰丝氨酸。随后，高度表达的乙酰丝氨酸硫化氢解酶(CysK)将由丝氨酸乙酰转移酶生物合成的乙酰丝氨酸转化成L-半胱氨酸。
因此，在一个方面，本发明涉及一种产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中将编码涉及L-半胱氨酸代谢途径的酶的基因cysE、cysK以及cysR引入具有产生L-半胱氨酸能力的微生物中。
在本发明中，cysE可具有由序列编号第1号表示的核苷酸序列，cysK可具有序列编号第2号表示的核苷酸序列，且cysR可具有序列编号第3号表示的核苷酸序列。
可在本发明中使用的具有产生L-半胱氨酸能力的微生物优选地是谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。
相信本发明的产生L-半胱氨酸的突变微生物将极有利地用于生产工业上有用的物质的工艺中，例如使用L-半胱氨酸作为前体的Co-A、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸以及甲硫氨酸。
在本发明的一个实例中，所构建的谷氨酸棒状杆菌CysEKR于2015年12月23日保藏于韩国生命工学研究院韩国典型培养物保藏中心，保藏编号为：KCTC12970BP。
在另一方面，本发明涉及一种产生L-半胱氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过培养突变微生物来产生L-半胱氨酸，由此；以及(b)回收所产生的L-半胱氨酸。
在一个实例中，已表明，与野生型谷氨酸棒状杆菌菌株和其中已引入有丝氨酸乙酰转移酶基因、乙酰丝氨酸硫化氢解酶基因以及硫供应基因组激活转录调节子基因中的一个或两个的谷氨酸棒状杆菌菌株相比，其中已引入有所述基因的谷氨酸棒状杆菌菌株展示出相对较高的产生L-半胱氨酸能力(图11和图12)。
如本文中所使用，术语“载体(vector)”意指含有可操作地连接到能够实现使所述DNA在适当宿主中表达的适当控制序列的DNA序列的DNA构建体。载体可以是质粒、噬菌体粒子或仅仅是潜在基因组插入物。一旦并入到适当宿主中，那么载体便可独立于宿主基因组进行复制和起作用，或在一些情况下，其自身可整合到基因组中。在本说明书中，“质粒(plamid)”和“载体(vector)”有时可互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包含具有为本领域中将已知或已知的相同功能的其它类型的载体。哺乳动物细胞培养表达的典型表达载体是基于例如pRK5(EP 307,247号)、pSV16B(WO91/08291号)以及pVL1392(Pharmingen)。
如本文中所使用，术语“扩增”意欲涵盖：靶向基因的一个或多个碱基的突变、取代或缺失，将一个或多个碱基引入到基因中，或引入编码相同酶的另一微生物基因，以便增加相应酶的活性。
如本文所使用，术语“表达控制序列(expression control sequence)”指对于可操作地连接在具体宿主生物体中的编码序列的表达所必需的DNA序列。这类控制序列包含用于执行转录的启动子、用于控制这类转录的任何操纵序列、用于编码适当mRNA核糖体结合位点的序列以及用于控制转录与翻译的终止的序列。举例来说，适用于原核生物的控制序列包含启动子、任何操纵序列以及核糖体结合位点。真核细胞包含启动子、聚腺苷酸化信号以及强化子。对质体中的基因的表达水平具有最大作用的因素是启动子。SRα启动子、巨细胞病毒启动子(cytomegalovirus)和类似物优选地用作用于高表达的启动子。
为表达本发明的DNA序列，可在载体中使用广泛多种表达控制序列中的任一种。适用的表达控制序列的实例包含SV40或腺病毒的早期启动子和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统或TRC、T3启动子或T7启动子、噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd鞘蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖解酶的启动子、磷酸酶的启动子Pho5、酵母交配系统的启动子以及已知用以控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列，以及其各种组合。T7RNA聚合酶启动子Φ10可在大肠杆菌中有效地用以表达蛋白NSP。
核酸在被放在与另一核酸序列的功能关系中时其“可操作地连接(operablylinked)”。核苷酸序列可以是连接成能够在适当分子(例如转录激活蛋白)与控制序列结合时表达基因的基因和控制序列。举例来说，在表达为参与多肽分泌的前体蛋白(pre-sequence)时，用于序列前或分泌前导子(leader)的DNA可操作地连接到编码多肽的DNA；在影响序列的转录时，启动子或强化子可操作地连接到编码序列；且在影响序列的转录时，核糖体结合位点可操作地连接到编码序列或在布置成促进翻译时连接到编码序列。一般来说，术语“可操作地连接”意指DNA连接的序列是连续的，且就分泌前导子而言是连续的且存在于读取范围中。然而，强化子(enhancer)不必为连续的。这些序列之间的键联通过在适宜的限制酶位点处的接合来执行。然而，当所述位点不存在时，根据常规方法使用合成寡核苷酸衔接子(oligonucleotide adaptor)或连接子(linker)。
如本文中所使用，术语“表达载体”一般意指充当插入有异源DNA片段的重组载体(recombinant carrier)的双链DNA片段。此处，异源DNA意指异型DNA，所述异型DNA并不天然存在于宿主细胞中。当在宿主细胞中时，表达载体不管宿主染色体DNA如何都可以自我复制，且可产生其中所插入的载体和(异源)DNA的若干复本。
如本领域中所熟知，为了提高已转染基因在宿主细胞中的表达水平，相应基因应可操作地连接到在所选择表达宿主中操作的转录表达控制序列和翻译表达控制序列。优选地，表达控制序列和相应基因包含在与细菌选择标记和复制起点(replication origin)一起的一个表达载体中。当表达宿主为真核细胞时，表达载体应在真核表达细胞中进一步包含适用的表达标记物。
由前述表达载体转化或转染的宿主细胞构成本发明的另一方面。如本文中所使用，术语“转化”意指DNA可作为染色体外部的因素或借助于通过将DNA作为宿主引入来完成整个染色体而复制。如本文中所使用，术语“转染”意指表达载体由宿主细胞接受而不管任何编码序列实际上是否表达。
用于本发明中的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。另外，一般使用其中高效引入DNA且其中所引入的DNA高效表达的宿主。可用于本发明中的宿主细胞的实例包含已知原核宿主和真核宿主，例如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、真菌或酵母菌。
当然，应理解，所有载体和表达控制序列并不同等地用以表达根据本发明的DNA序列。类似地，所有宿主并不同等地相对于相同表达系统起作用。然而，在不背离本发明的范围或承受过量实验负担的情况下，本领域技术人员可从各种载体、表达控制序列以及宿主当中恰当地选择。举例来说，必须考虑宿主细胞来选择载体，因为载体必须在宿主细胞中复制。确切地说，还应考虑载体的复本数目、调节复本数目的能力以及由相应载体所编码的其它蛋白的表达，例如抗生素标记物的表达。并且，可对若干因素加以考虑来选择表达控制序列。举例来说，应尤其相对于可能的二级结构来讨论所述序列的相对强度、控制容量以及与本发明的DNA序列的相容性。此外，可在与所选择载体的相容性、由DNA序列所编码产物的毒性、产物的分泌性质、正确折叠多肽的能力、发酵需要或培养需要、确保由DNA序列所编码产物的易于提纯或类似物的考虑之下作出对宿主细胞的选择。
实例
在下文中，将参考实例进一步详细地描述本发明。对本领域普通技术人员将显而易见的是，这些实例仅出于说明性目的且不应解释为限制本发明的范围。
实例1：用于转化谷氨酸棒状杆菌的重组过表达载体的构建
为了从用于转化谷氨酸棒状杆菌的重组载体pMT-s(图2)中移除组成型表达p-out启动子基因和促进表达蛋白的胞外分泌的信号肽序列，使用限制酶XhoI消化5'末端，且使用限制酶ClaI消化3'末端。tac启动子基因为由lacUV5启动子基因与trp启动子基因的杂混物组成的高度表达杂混物启动子基因，和编码表达调节抑制因子的lacI基因经历PCR和重叠PCR(Overlap-PCR)。产物彼此接合，使用上述限制酶消化，且随后插入到载体pMT1-s中，从而构建用于在谷氨酸棒状杆菌中的过表达的重组载体pMT-tac(图3)。pMT-tac的核苷酸序列由序列编号第4号表示。
实例2：编码涉及L-半胱氨酸代谢路径的酶的谷氨酸棒状杆菌源基因的制备
为将来源于谷氨酸棒状杆菌菌株的丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysK)以及硫供应基因组激活转录调节子(cysR)基因分别相对于用于所述基因的核苷酸序列序列编号第1～3号克隆到实例1中所构建以用于转化谷氨酸棒状杆菌的重组过表达载体pMT-tac中，合成引子以使得限制酶ClaI识别序列插入正向引子(Forward primer)的5'末端中且使得限制酶NotI识别序列插入反向引子(Reverse primer)的5'末端中。
为构建丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysEK)、丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomal bindingsite)-硫供应基因组激活转录调节子(cysER)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-硫供应基因组激活转录调节子(cysKR)以及丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-乙酰丝氨酸硫化氢解酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-硫供应基因组激活转录调节子(cysEKR)，合成正向引子和反向引子(Forward和reverse primer)以使得核糖体结合位点(Ribosomal binding site)序列插入每一连接位点中。随后，使用所合成的引子，执行PCR和重叠PCR(Overlap-PCR)。所使用引子的序列展示在下表1中。
[表1]
*限制酶位点(斜体)、5-末端核苷酸延伸位点(带下划线)、
实例3：插入有cysE基因、cysK基因、cysR基因、cysEK基因、cysER基因、cysKR基因以及cysEKR基因中的每一个的重组载体的构建以及载体到谷氨酸棒状杆菌的转化
使来源于谷氨酸棒状杆菌菌株且在实例2中所获得的丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysK)、硫供应基因组激活转录调节子(cysR)基因、丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysEK)、丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-硫供应基因组激活转录调节子(cysER)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-硫供应基因组激活转录调节子(cysKR)以及丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomalbinding site)-乙酰丝氨酸硫化氢解酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-硫供应基因组激活转录调节子(cysEKR)基因在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用凝胶提取套组(GeneAll)回收琼脂糖凝胶上的DNA片段。
随后，将丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysK)、硫供应基因组激活转录调节子(cysR)基因、丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomal bindingsite)-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysEK)、丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomalbinding site)-硫供应基因组激活转录调节子(cysER)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-硫供应基因组激活转录调节子(cysKR)以及丝氨酸乙酰转移酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-乙酰丝氨酸硫化氢解酶-核糖体结合位点(Ribosomal binding site)-硫供应基因组激活转录调节子(cysEKR)基因中的每一个使用限制酶NotI和限制酶ClaI消化，且随后接合(litigation)到使用限制酶NotI和限制酶ClaI消化的重组过表达载体pMT-tac以用于转化谷氨酸棒状杆菌。接合(litigation)产物转化成大肠杆菌DH5α。随后，将重组质粒DNA从转化体分离。已分离重组质粒DNA转化成谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
名为pMT-tac::cysE、pMT-tac::cysK、pMT-tac::cysR、pMT-tac::cysEK、pMT-tac::cysER、pMT-tac::cysKR以及pMT-tac::cysEKR的重组载体绘示在图4到图10中。
谷氨酸棒状杆菌转化体分别名为谷氨酸棒状杆菌CysE、谷氨酸棒状杆菌CysK、谷氨酸棒状杆菌CysR、谷氨酸棒状杆菌CysEK、谷氨酸棒状杆菌CysER、谷氨酸棒状杆菌CysKR以及谷氨酸棒状杆菌CysEKR。谷氨酸棒状杆菌CysEKR于2015年12月23日保藏于韩国生命工学研究院韩国典型培养物保藏中心，保藏编号为KCTC12970BP。
实例4：半胱氨酸在cysE转化体、cysK转化体以及cysR转化体中的产生的分析
将在实例3中所获得的半胱氨酸在谷氨酸棒状杆菌CysE转化体、谷氨酸棒状杆菌CysK转化体以及谷氨酸棒状杆菌CysR转化体中的产生与半胱氨酸在野生型谷氨酸棒状杆菌菌株中的产生进行比较。
在30℃和200转/分钟下，将谷氨酸棒状杆菌转化体和野生型谷氨酸棒状杆菌菌株中的每一个在含有CGXII液体介质的烧瓶中培养10小时，且通过IPTG来诱导丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysK)以及硫供应基因组激活转录调节子(cysR)蛋白的表达。随后，将培养物收集并离心，且通过甲醇淬灭法来溶解细胞。使已溶解细胞干燥，且随后通过使用沃特世AccQ-标记氨基酸分析套组(沃特世，美国)的HPLC来分析。
结果，如在图11中可见，相较于在野生型中，L-半胱氨酸在谷氨酸棒状杆菌CysE转化体、谷氨酸棒状杆菌CysK转化体或谷氨酸棒状杆菌CysR转化体中产生得更多。
实例5：半胱氨酸在cysEK转化体、cysER转化体、cysKR转化体以及cysEKR转化体中的产生的分析
将在实例3中所获得的半胱氨酸在谷氨酸棒状杆菌CysEK转化体、谷氨酸棒状杆菌CysER转化体、谷氨酸棒状杆菌CysKR以及谷氨酸棒状杆菌CysEKR转化体中的产生与半胱氨酸在野生型菌株中的产生进行比较。
在30℃和200转/分钟下，将谷氨酸棒状杆菌转化体和野生型谷氨酸棒状杆菌菌株中的每一个在含有CGXII液体介质的烧瓶中培养10小时，且通过IPTG来诱导丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysK)以及硫供应基因组激活转录调节子(cysR)蛋白的表达。随后，将培养物收集并离心，且通过甲醇淬灭法来溶解细胞。使已溶解细胞干燥，且随后通过使用沃特世AccQ-标记氨基酸分析套组的HPLC来分析。
结果，如在图12中可见，与野生型菌株相比，谷氨酸棒状杆菌CysEK转化体、谷氨酸棒状杆菌CysER转化体、谷氨酸棒状杆菌CysKR转化体以及谷氨酸棒状杆菌CysEKR转化体全部展现增加的生物合成L-半胱氨酸的能力。具体地说，与CysEK转化体、CysER转化体以及CysKR转化体相比，CysEKR转化体展现显著较高的生物合成L-半胱氨酸的能力。
实例6：cysR转化体、cysEK转化体、cysER转化体、cysKR转化体以及cysEKR转化体与野生型菌株的胞内硫积聚的分析
将在实例3中所获得的谷氨酸棒状杆菌CysR转化体、谷氨酸棒状杆菌CysEK转化体、谷氨酸棒状杆菌CysER转化体、谷氨酸棒状杆菌CysKR转化体以及谷氨酸棒状杆菌CysEKR转化体的胞内硫化物积聚与野生型菌株中的胞内硫化物积聚进行比较。
在30℃和200转/分钟下，将谷氨酸棒状杆菌转化体和野生型菌株中的每一个在含有CGXII液体介质的烧瓶中培养10小时，且通过IPTG来诱导丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysK)以及硫供应基因组激活转录调节子(cysR)蛋白的表达。随后，将培养物收集并离心，且仅收集细胞且使用6％(重量/体积)NaOH在95℃下溶解15分钟。通过亚甲蓝法来确定已溶解细胞样品中的胞内硫积聚且使用分光光度计来确定吸收率测量值。
为了定量硫，测量在标准硫酸钠的每一浓度下的吸收率以绘制标准曲线，从而获得线性方程。随后，通过将吸收率代入到线性方程中来定量所有硫含量。
结果，如在图13中可见，谷氨酸棒状杆菌CysR菌株中的胞内硫浓度最高。
实例7：半胱氨酸在CysEKR转化体中的产生的分析
将在实例3中所获得的谷氨酸棒状杆菌CysEKR转化体和野生型谷氨酸棒状杆菌菌株中的每一个中的细胞生长、葡萄糖消耗以及半胱氨酸产生作为时间的函数进行分析。
在30℃和200转/分钟下，将谷氨酸棒状杆菌转化体和野生型菌株中的每一个在含有CGXII液体介质的烧瓶中培养15小时，以使得通过IPTG来诱导丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysK)以及硫供应基因组激活转录调节子(cysR)蛋白的表达。
随后，在如图14中所示的指定时间点处收集培养物继而离心，且通过HPLC来分析上清液以测量葡萄糖的量。在离心之后，通过甲醇淬灭法来溶解所收集细胞。使已溶解细胞样品干燥，且随后通过使用沃特世AccQ-标记氨基酸分析套组的HPLC来分析。对于细胞生长的分析，在如图14中所示的指定时间点处收集培养物且使用分光光度计来测量培养物的吸收率。结果展示在图14中。
实例8：通过CysR过表达对硫源供应相关基因的mRNA表达水平进行分析
将在实例6中所证实的谷氨酸棒状杆菌CysR中的硫供应相关基因的mRNA表达水平与在野生型谷氨酸棒状杆菌菌株中的mRNA表达水平进行比较。
在30℃和200转/分钟下，将野生型谷氨酸棒状杆菌菌株和谷氨酸棒状杆菌CysR菌株中的每一个在含有CGXII液体介质的烧瓶中培养10小时，且通过IPTG来诱导转录调节子(cysR)蛋白的表达。随后，将培养物收集并离心，且使用Tri-RNA试剂(惠晶生物科技有限公司，台湾)溶解细胞。使用三氯甲烷离心已溶解细胞样品，且收集含有总RNA的上清液。使用异丙醇提纯总RNA并干燥，在其之后使用逆转录主预混合(厄普思生物公司，韩国)和HiPi实时PCR 2×主混合(SYBR green)(厄普思生物公司，韩国)在StepOnePlus热循环仪(赛默飞世尔科技公司，美国)中分析mRNA表达水平。所使用引子的序列展示在下表2中。
使用谷氨酸棒状杆菌16S rRNA(NCBI基因ID：444304238)基因的mRNA水平将野生型谷氨酸棒状杆菌和谷氨酸棒状杆菌CysR的相关mRNA水平归一化为内部参考。
结果，如在图15中可见，与在野生型菌株中的那些相比，硫源供应相关基因组fpr2-cysIXHDNYZ(同化硫酸盐同化还原集群，NCBI基因ID：21325585-21325591)、ssuR(转录调节子，NCBI基因ID：21322774)、ssuI-seuABC-ssuD2以及ssuD1CBA(磺酸盐和磺酸酯同化还原集群，NCBI基因ID：21323778-21323785以及21323987-21323990)在谷氨酸棒状杆菌CysR转化体中的mRNA表达水平全部提高。这表明，转录调节子(cysR)蛋白实际上触发硫供应相关基因的组。
[表2]
引子序列
引子 序列
16S rRNA F(序列编号第23号) GTAATCGCAGATCAGCAACGC
16S rRNA R(序列编号第24号) AGAAAGGAGGTGATCCAGCC
ssuR F(序列编号第25号) GTTGTCGACCCCGAAGCC
ssuR R(序列编号第26号) CACAAATGCCAACGGATCTTGAC
fpr2 F(序列编号第27号) TTGAAGCTCCAAAGCACCAGG
fpr2 R(序列编号第28号) GACAATTGCTGGAGCTTCGC
cysI F(序列编号第29号) GCGTTGAAGGTTTCCAGGTTC
cysI R(序列编号第30号) CACCAAATCTTCCTCAGCGG
cysX F(序列编号第31号) ACTGCCCATACTGCGCGG
cysX R(序列编号第32号) GTTGCGACTCACCTCTTTTGTGT
cysH F(序列编号第33号) CTCCAATTATCACCTGGTCATTGG
cysH R(序列编号第34号) GAGTGAAGTCCGCATTCTGTCT
cysD F(序列编号第35号) AGGAGATCGTCACCAAGACTG
cysD R(序列编号第36号) GAAGTAGCCTTCCTTCTTGCG
cysN F(序列编号第37号) TCAACGACAACGAAGCACCAG
cysN R(序列编号第38号) GATCGACCAGTTATTGCGTAGG
cysY F(序列编号第39号) AACACAAGGCCGTCCACATC
cysY R(序列编号第40号) GCAGCGTGGTAACGGGCT
cysZ F(序列编号第41号) GTCACACTGAACCTGCCAAAG
cysZ R(序列编号第42号) CCCTTTGGTTCGGAGACAAC
ssuD1F(序列编号第43号) ACAGCCCTTGTGGGCTCG
ssuD1R(序列编号第44号) CCCAACAGGTTCCAAAACTCGT
ssuC F(序列编号第45号) CCGCCTGGCTCTCACTGA
ssuC R(序列编号第46号) GTAGCGGAAGGTGTGACGTTC
ssuB F(序列编号第47号) ACACCCGAAACTTGGGAGTTC
ssuB R(序列编号第48号) GGCAGGTGTGGTGATTTCGA
ssuA F(序列编号第49号) ATGAATGGGCGACGATTTTCAGC
ssuA R(序列编号第50号) GCCCTCAAATCGGGTGTCTA
ssuI F(序列编号第51号) GCTTTGAAAACCTTGGGTGGG
ssuI R(序列编号第52号) GCGAGGACACCTGTGAGC
seuA F(序列编号第53号) GTGCCTGAGCTGCAAAAACTTAG
seuA R(序列编号第54号) GAGTGGGCTCCCTGGGAA
seuB F(序列编号第55号) AACTGGATCTTGTCGTCGATAAGG
seuB R(序列编号第56号) GACAAGGATCCGATCGTGTATTG
seuC F(序列编号第57号) CCAACGTTTTCGATGCGGTG
seuC R(序列编号第58号) GCTGCTTAGGCTCACCGG
ssuD2F(序列编号第59号) CTATGAGCAAGTCGCGCAAG
ssuD2R(序列编号第60号) CTGGAAATAAACGGAGTCGCTAC
微生物的保藏
保藏单位：韩国典型培养物保藏中心
保藏编号：KCTC 12970BP
保藏日期：20151223
工业实用性
根据本发明，通过调节与L-半胱氨酸代谢途径相关的代谢通量且调节用于供应对于突变微生物的L-半胱氨酸的合成所必需的硫源的系统，可高效产生L-半胱氨酸。
尽管已参考特定特征详细地描述本发明，但本领域技术人员将明白，本说明书仅针对优选实施例且并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质性范围将由随附权利要求及其等效物界定。
自由文本
附上序列表提交。
序列表
<110> 高丽大学校产学协力团
<120> 用于产生L-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生L-半胱氨酸的方法
<130> PF-B2002
<140> PCT/KR2016/014282
<141> 2016-12-07
<150> KR 10-2016-0005378
<151> 2016-01-15
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
atgctctcga caataaaaat gatccgtgaa gatctcgcaa acgctcgtga acacgatcca 60
gcagcccgag gcgatttaga aaacgcagtg gtttactccg gactccacgc catctgggca 120
catcgagttg ccaacagctg gtggaaatcc ggtttccgcg gccccgcccg cgtattagcc 180
caattcaccc gattcctcac cggcattgaa attcaccccg gtgccaccat tggtcgtcgc 240
ttttttattg accacggaat gggaatcgtc atcggcgaaa ccgctgaaat cggcgaaggc 300
gtcatgctct accacggcgt caccctcggc ggacaggttc tcacccaaac caagcgccac 360
cccacgctct gcgacaacgt gacagtcggc gcgggcgcaa aaatcttagg tcccatcacc 420
atcggcgaag gctccgcaat tggcgccaat gcagttgtca ccaaagacgt gccggcagaa 480
cacatcgcag tcggaattcc tgcggtagca cgcccacgtg gcaagacaga gaagatcaag 540
ctcgtcgatc cggactatta cattcaccac caccaccacc actaa 585
<210> 2
<211> 954
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
atgggcaatg tgtacaacaa catcaccgaa accatcggcc acaccccact ggtaaagctg 60
aacaagctca ccgaaggcct cgacgcaact gtcctggtca agcttgagtc attcaaccca 120
gcaaactccg tcaaggaccg tatcggtctg gccatcgttg aagatgcaga gaagtccggt 180
gcactgaagc caggcggcac catcgttgaa gcaacctccg gcaacaccgg tatcgcactg 240
gcaatggtcg gcgctgcacg cggatacaac gttgttctca ccatgccgga gaccatgtcc 300
aacgagcgtc gcgttctcct ccgcgcttac ggtgcagaga tcgttcttac cccaggtgca 360
gcaggcatgc agggtgcaaa ggacaaggca gacgaaatcg tcgctgaacg cgaaaacgca 420
gtccttgctc gccagttcga gaacgaggca aacccacgcg tccaccgcga caccaccgcg 480
aaggaaatcc tcgaagacac cgacggcaac gttgatatct tcgttgcaag cttcggcacc 540
ggcggaaccg tcaccggcgt tggccaggtc ctgaaggaaa acaacgcaga cgtacaggtc 600
tacaccgtcg agccagaagc gtccccactt ctgaccgctg gcaaggctgg tccacacaag 660
atccagggca tcggcgcaaa cttcatcccc gaggtcctgg accgcaaggt tctcgacgac 720
gtgctgaccg tctccaacga agacgcaatc gcattctccc gcaagctcgc taccgaagag 780
ggcatcctcg gcggtatctc caccggcgca aacatcaagg cagctcttga ccttgcagca 840
aagccagaga acgctggcaa aaccatcgtc accgttgtca ccgacttcgg cgagcgctac 900
gtctccaccg ttctttacga agacatccgc gaccatcatc atcaccacca ctaa 954
<210> 3
<211> 1185
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 3
atgattggct atggtttacc tatgcccaat caggcccact tctctgcgtc ctttgcccgc 60
ccctctaccc cggctgcaaa gtgcatgcac catatccgcc tcggccagca actcattaga 120
aatgagctgg tcgaggccac aggtctgtcc caaccgactg tcacccgcgc agtcaccgct 180
ttaatgcagg caggtttggt tcgtgaacgc cctgatctca cactctcatc gggccctggt 240
cgtcccaata ttcctctaga actcgctcca agtccatgga ttcatgcagg cgtggcaatc 300
ggcaccaagt cttcctacgt cgctttgttt gataccaagg gtcgcaccct tcgtgatgcc 360
atgctggaaa tctcagcagc tgatttagat ccagacactt tcatcgaaca cctcattgct 420
ggtgtcaacc gcctcaccac tggtcttgat ctaccactgg taggtattgg tgttgccacc 480
tcaggaaaag tcaccaacgc aggcgttgtc accgcaagca acttgggctg ggatggcgtt 540
gatatcgctg gccgcctgaa ctaccaattc agcgttccag caaccgtggc atcagcaatt 600
cctgccatcg cagcttctga actgcaggct tccccacttc cccaccctga gcagccaact 660
cccatcacct tgaccttcta cgccgatgac tctgtgggcg cggcctacag caatgatttg 720
ggagtacatg tcattggacc actggctaca actcgtggat caggtttgga tactttgggc 780
atggctgccg aagatgcgct gagcacccaa ggtttcttaa gcagggtttc tgatcagggt 840
atctttgcca acagccttgg tgagctagtc accattgcta aagacaatga aaccgcacgg 900
gaattcctca acgatcgcgc gaccctgctg gctcacactg ccgcagaagc tgccgaaaca 960
gttaagccat ccaccctggt tctctcggga tcggcgtttt ccgaagatcc acaaggtcgg 1020
tcggtgttcg cttcccaatt gaagaaggaa tacgacgcag acattgagct ccggttgatc 1080
cccacccacc gggaaaacgt ccgcgcagca gctcgagcag tcgcacttga tcgactactc 1140
aacgagccac ttactctcgt accccatcat catcatcatc attag 1185
<210> 4
<211> 8211
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagtttgttg aagattagat gctataattg ttattaaaag gattgaagga tgcttaggaa 60
gacgagttat taatagctga ataagaacgg tgctctccaa atattcttat ttagaaaagc 120
aaatctaaaa ttatctgaaa agggaatgag aatagtgaat ggaccaataa taatgactag 180
agaagaaaga atgaagattg ttcatgaaat taaggaacga atattggata aatatgggga 240
tgatgttaag gctattggtg tttatggctc tcttggtcgt cagactgatg ggccctattc 300
ggatattgag atgatgtgtg tcatgtcaac agaggaagca gagttcagcc atgaatggac 360
aaccggtgag tggaaggtgg aagtgaattt tgatagcgaa gagattctac tagattatgc 420
atctcaggtg gaatcagatt ggccgcttac acatggtcaa tttttctcta ttttgccgat 480
ttatgattca ggtggatact tagagaaagt gtatcaaact gctaaatcgg tagaagccca 540
aacgttccac gatgcgattt gtgcccttat cgtagaagag ctgtttgaat atgcaggcaa 600
atggcgtaat attcgtgtgc aaggaccgac aacatttcta ccatccttga ctgtacaggt 660
agcaatggca ggtgccatgt tgattggtct gcatcatcgc atctgttata cgacgagcgc 720
ttcggtctta actgaagcag ttaagcaatc agatcttcct tcaggttatg accatctgtg 780
ccagttcgta atgtctggtc aactttccga ctctgagaaa cttctggaat cgctagagaa 840
tttctggaat gggattcagg agtggacaga acgacacgga tatatagtgg atgtgtcaaa 900
acgcatacca ttttgaacga tgacctctaa taattgttaa tcatgttggt tacgtattta 960
ttaacttctc ctagtattag taattatcat ggctgtcatg gcgcattaac ggaataaagg 1020
gtgtgcttaa atcgggctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 1080
tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 1140
gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta 1200
gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 1260
gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 1320
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 1380
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 1440
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 1500
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 1560
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 1620
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 1680
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 1740
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 1800
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 1860
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 1920
gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 1980
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 2040
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 2100
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 2160
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 2220
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 2280
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 2340
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 2400
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 2460
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 2520
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc 2580
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 2640
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 2700
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 2760
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 2820
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac 2880
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 2940
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 3000
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 3060
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 3120
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 3180
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 3240
aaaagtgcca cctgatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc gtgctgctag 3300
cgctatatgc gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct 3360
ttggccgccg cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgac tacgcgatca 3420
tggcgaccac acccgtcctg tggatcgccg tagagcgatt gaagaccgtc aaccaaaggg 3480
gaagcctcca atcgacgcga cgcgcgctct acggcgatcc tgacgcagat ttttagctat 3540
ctgtcgcagc gccctcaggg acaagccacc cgcacaacgt cgcgagggcg atcagcgacg 3600
ccgcagtact gatcaagtcg gtcaagccaa gcgcaaccag cggcaccgcc gcgagcaacg 3660
tcgcaagggc gatcagggga cgatttttgc gaagaatttc cacggtaaga atccaatctc 3720
tcgaatttag ggtgaaagaa gcttggcata ggggtgtgca cgaactcggt ggaggaaatt 3780
tccgcggggc aaggcttcgc gaagcggagt cgcggcagtg gctttgaaga tctttgggag 3840
cagtccttgt gcgcttacga ggtgagccgg tggggaaccg ttatctgcct atggtgtgag 3900
cccccctaga gagcttcaag agcaatcagc ccgacctaga aaggaggcca agagagagac 3960
ccctacgggg ggaaccgttt tctgcctacg agatggcaca tttactggga agctttacgg 4020
cgtcctcgtg gaagttcaat gcccgcagac ttaagtgctc tattcacggt ctgacgtgac 4080
acgctaaatt cagacatagc ttcattgatt gtcggccacg agccagtctc tccctcaaca 4140
gtcataaacc aacctgcaat ggtcaagcga tttcctttag ctttcctagc ttgtcgttga 4200
ctggacttag ctagtttttc tcgctgtgct cgggcgtact cactgtttgg gtctttccag 4260
cgttctgcgg cctttttacc gccacgtctt cccatagtgg ccagagcttt tcgccctcgg 4320
ctgctctgcg tctctgtctg acgagcaggg acgactggct ggcctttagc gacgtagccg 4380
cgcacacgtc gcgccatcgt ctggcggtca cgcatcggcg gcagatcagg ctcacggccg 4440
tctgctccga ccgcctgagc gacggtgtag gcacgctcgt aggcgtcgat gatcttggtg 4500
tcttttaggc gctcaccagc cgcttttaac tggtatccca cagtcaaagc gtggcgaaaa 4560
gccgtctcat cacgggcggc acgccctgga gcagtccaga ggacacggac gccgtcgatc 4620
agctctccag acgcttcagc ggcgctcggc aggcttgctt caagcgtggc aagtgctttt 4680
gcttccgcag tggcttttct tgccgcttcg atacgtgccc gtccgctaga aaactcctgc 4740
tcatagcgtt ttttaggttt ttctgtgcct gagatcatgc gagcaacctc cataagatca 4800
gctaggcgat ccacgcgatt gtgctgggca tgccagcggt acgcggtggg atcgtcggag 4860
acgtgcagtg gccaccggct cagcctatgt gaaaaagcct ggtcagcgcc gaaaacgcgg 4920
gtcatttcct cggtcgttgc agccagcagg cgcatattcg ggctgctcat gcctgctgcg 4980
gcatacaccg gatcaatgag ccagatgagc tggcatttcc cgctcagtgg attcacgccg 5040
atccaagctg gcgctttttc caggcgtgcc cagcgctcca aaatcgcgta gacctcgggg 5100
tttacgtgct cgattttccc gccggcctgg tggctcggca catcaatgtc caggacaagc 5160
acggctgcgt gctgcgcgtg cgtcagagca acatactggc accgggcaag cgattttgaa 5220
ccaactcggt ataacttcgg ctgtgtttct cccgtgtccg ggtctttgat ccaagcgctg 5280
gcgaagtcgc gggtcttgct gccctggaaa ttttctctgc ccaggtgagc gaggaattcg 5340
cggcggtctt cgctcgtcca gccacgtgat cgcagcgcga gctcgggatg ggtgtcgaac 5400
agatcagcgg aaaatttcca ggccggtgtg tcaatgtctc gtgaatccgc tagagtcatt 5460
tttgagcgct ttctcccagg tttggactgg gggttagccg acgccctgtg agttaccgct 5520
cacggggcgt tcaacatttt tcaggtattc gtgcagctta tcgcttcttg ccgcctgtgc 5580
gctttttcga cgcgcgacgc tgctgccgat tcggtgcagg tggtggcggc gctgacacgt 5640
cctgggcggc cacggccaca cgaaacgcgg catttacgat gtttgtcatg cctgcgggca 5700
ccgcgccacg atcgcggata attctcgctg ccgcttccag ctctgtgacg accatggcca 5760
aaatttcgct cgggggacgc acttccagcg ccatttgcga cctagccgcc tccagctcct 5820
cggcgtggcg tttgttggcg cgctcgcggc tggctgcggc acgacacgca tctgagcaat 5880
attttgcgcg ccgtcctcgc gggtcaggcc ggggaggaat caggccaccg cagtaggcgc 5940
aactgattcg atcctccact actgtgcgtc ctcctggcgc tgccgagcac gcagctcgtc 6000
agccagctcc tcaagatccg ccacgagagt ttctaggtcg ctcgcggcac tggcccagtc 6060
tcgtgatgct ggcgcgtccg tcgtatcgag agctcggaaa aatccgatca ccgtttttaa 6120
atcgacggca gcatcgagcg cgtcggactc cagcgcgaca tcagagagat ccatagctga 6180
tgattcgggc caattttggt acttcgtcgt gaaggtcatg acaccattat aacgaacgtt 6240
cgttaaagtt tttggcggaa aatcacgcgg cacgaaaatt ttcacgaagc gggactttgc 6300
gcagctcagg ggtgctaaaa attttgtatc gcacttgatt ttccgaaaga cagatatctg 6360
caaacggtgt gtcgtattct ggcttggttt taaaaatctg gaatcgaaat tgcggggcga 6420
ccgagaagtt tttacaaaag gcaaaaactt ttcgggatct cgagagcctg gggtgcctaa 6480
tgagtgagct aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 6540
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 6600
gggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac 6660
cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa 6720
atcctgtttg atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta 6780
tcccactacc gagatatccg caccaacgcg cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc 6840
gcccagcgcc atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag 6900
catttgcatg gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag tcgccttccc gttccgctat 6960
cggctgaatt tgattgcgag tgagatattt atgccagcca gccagacgca gacgcgccga 7020
gacagaactt aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg 7080
ctccacgccc agtcgcgtac cgtcttcatg ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg 7140
gtcagagaca tcaagaaata acgccggaac attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc 7200
atcctggtca tccagcggat agttaatgat cagcccactg acgcgttgcg cgagaagatt 7260
gtgcaccgcc gctttacagg cttcgacgcc gcttcgttct accatcgaca ccaccacgct 7320
ggcacccagt tgatcggcgc gagatttaat cgccgcgaca atttgcgacg gcgcgtgcag 7380
ggccagactg gaggtggcaa cgccaatcag caacgactgt ttgcccgcca gttgttgtgc 7440
cacgcggttg ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt 7500
cgcagaaacg tggctggcct ggttcaccac gcgggaaacg gtctgataag agacaccggc 7560
atactctgcg acatcgtata acgttactgg tttcacattc accaccctga attgactctc 7620
ttccgggcgc tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcac cattccatgg tgtcttgaca 7680
attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag 7740
atatcatatc gatggatccc gggtaccgcg gccgcctgtt ttggcggatg agagaagatt 7800
ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct 7860
ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 7920
agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 7980
aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 8040
cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 8100
cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 8160
catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt ctagagtcga c 8211
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccattccatg gtgtcttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgt 47
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggatcgata tgatatctcc tgtgtgaaat tgttatccg 39
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggctcgaga gcctggggtg cctaatgag 29
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacaccatgg aatggtgcaa aacc 24
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgcgcggat ccatgctctc gacaataaaa atgatc 36
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggtacctt agtggtggtg gtggtggtga atgtaatagt ccggatcga 49
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgcggatcc atgggcaatg tgtacaacaa 30
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagaggtacc ttagtggtgg tgatgatgat ggtcgcggat gtcttcgta 49
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcgcgcggat ccatgattgg ctatggttta cc 32
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgcggtaccc taatgatgat gatgatgatg gggtacgaga gtaagtgg 48
<210> 15
<211> 49
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctaaaaggag atatagatgg gcaatgtgta caacaacatc accgaaacc 49
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catctatatc tccttttagt ggtggtggtg gtggtgaatg taatagtcc 49
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaaggagat atagatgatt ggctatggtt tacctatgcc caatcaggc 49
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 18
catctatatc tccttttagt ggtggtggtg gtggtgaatg taatagtcc 49
<210> 19
<211> 49
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaaggagat atagatgatt ggctatggtt tacctatgcc caatcaggc 49
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccaatcatc tatatctcct tttagtggtg gtgatgatga tggtcgcgg 49
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatcctcgaa gacaccgacg gcaac 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gttgccgtcg gtgtcttcga ggatt 25
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtaatcgcag atcagcaacg c 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agaaaggagg tgatccagcc 20
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gttgtcgacc ccgaagcc 18
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cacaaatgcc aacggatctt gac 23
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttgaagctcc aaagcaccag g 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gacaattgct ggagcttcgc 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgttgaagg tttccaggtt c 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caccaaatct tcctcagcgg 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 31
actgcccata ctgcgcgg 18
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gttgcgactc acctcttttg tgt 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctccaattat cacctggtca ttgg 24
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gagtgaagtc cgcattctgt ct 22
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aggagatcgt caccaagact g 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaagtagcct tccttcttgc g 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcaacgacaa cgaagcacca g 21
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gatcgaccag ttattgcgta gg 22
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aacacaaggc cgtccacatc 20
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gcagcgtggt aacgggct 18
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtcacactga acctgccaaa g 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccctttggtt cggagacaac 20
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acagcccttg tgggctcg 18
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cccaacaggt tccaaaactc gt 22
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccgcctggct ctcactga 18
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtagcggaag gtgtgacgtt c 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acacccgaaa cttgggagtt c 21
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggcaggtgtg gtgatttcga 20
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atgaatgggc gacgattttc agc 23
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gccctcaaat cgggtgtcta 20
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gctttgaaaa ccttgggtgg g 21
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gcgaggacac ctgtgagc 18
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gtgcctgagc tgcaaaaact tag 23
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gagtgggctc cctgggaa 18
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aactggatct tgtcgtcgat aagg 24
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gacaaggatc cgatcgtgta ttg 23
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccaacgtttt cgatgcggtg 20
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gctgcttagg ctcaccgg 18
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctatgagcaa gtcgcgcaag 20
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ctggaaataa acggagtcgc tac 23

Claims (6)

1.一种用于产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中将编码涉及所述L-半胱氨酸代谢途径的酶的基因cysE、cysK以及cysR引入具有产生L-半胱氨酸能力的微生物中。
2.根据权利要求1所述的用于产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中所述cysE具有由序列编号第1号表示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的用于产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中所述cysK具有由序列编号第2号表示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的用于产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中所述cysR具有由序列编号第3号表示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的用于产生L-半胱氨酸的突变微生物，其中具有产生L-半胱氨酸能力的所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
6.一种产生L-半胱氨酸的方法，包括以下步骤：
(a)通过培养根据权利要求1到5中任一项所述的用于产生L-半胱氨酸的突变微生物来产生L-半胱氨酸；以及
(b)回收所产生的所述L-半胱氨酸。
CN201680079541.5A 2016-01-15 2016-12-07 用于产生l-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生l-半胱氨酸的方法 Active CN108718529B (zh)

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