CN104862352A

CN104862352A - 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法

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Publication number: CN104862352A
Application number: CN201510065315.9A
Authority: CN
Inventors: 申秀安; 严惠媛; 张真淑; 裵贤爱; 全成后; 赵宰贤; 宋秉哲; 李京珉; 梁殷彬; 申容旭; 金蕙园; 金率
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2010-10-20
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2031-10-18
Also published as: JP5805202B2; LT2444481T; US20120190083A1; BR112013009746A2; US20120190081A1; AU2011318810A1; JP2013543723A; RU2536250C1; CN104862352B; KR101381048B1; US8557549B2; RU2013122805A; MX2013004495A; MX343756B; CN102906272A; DK2444481T3; CN102906272B; BR112013009746A8; AU2011318810B2; MY159614A

Abstract

本发明涉及用O-磷酸丝氨酸作为中间体生产半胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物。

Description

生产O-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由O-磷酸丝氨酸生产L-半胱氨酸或其衍生物的方法

本申请要求2010年10月20日提交的韩国专利申请No.10-2010-0102664和2011年8月26日提交的韩国专利申请No.10-2011-0086081的优先权；本申请是国际申请日为2011年10月18日的中国专利申请No.201180002042.3的分案申请。

技术领域

本发明涉及用O-磷酸丝氨酸作为中间体生产胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物。

背景技术

L-半胱氨酸是在所有生物体的硫代谢中起着重要作用的氨基酸。它用于生物合成蛋白质，如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代谢物以及作为辅酶A的前体。此外，半胱氨酸的生物合成已知与其它氨基酸的生物合成密切相关，包括L-丝氨酸、L-甘氨酸和L-蛋氨酸。工业上，发现L-半胱氨酸及其衍生物应用于各种领域，包括制药业(用于治疗支气管疾病)、化妆品工业(在洗发液中、用于烫发的组合物)和食品工业(抗氧化剂、增味剂、面团助剂(dough aids)等)。

L-半胱氨酸曾通过将人头发或动物羽毛进行酸水解工业性地获得(氨基酸生产的生物技术(Biotechnology of the Amino AcidsProduction)Ko Aida编,p 217-223,1986)。然而，不仅从头发或羽毛获得的半胱氨酸的产量低至7～8％，而且盐酸或硫酸的使用产生大量的废水，引起环境污染。此外，从头发或羽毛中进行提取可诱发使用者对其强烈的厌恶感。这些问题导致迫切需要开发环境友好型L-半胱氨酸的生产方法。现代主要途径包含用微生物发酵。

在微生物生产L-半胱氨酸中，代表性的为1)用微生物对D、L-ATC进行生物转化(Ryu OH,Ju JY和Shin CS,Process Biochem.,32:201-209,1997)。然而，由于前体D、L-ATC的低溶解度，这种转化方法在难以工业上应用。2)另一种生产L-半胱氨酸的方法为用大肠杆菌直接发酵(专利号EP0885962B；Wada M和Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006)。微生物体内的L-半胱氨酸的过度积累导致细胞内毒性，限制了L-半胱氨酸的高浓度生产。为了克服这种缺陷，使用了L-半胱氨酸-输出蛋白，但在生产率上也没有显著的改善。

至于微生物和植物体内的L-半胱氨酸的生物合成途径，O-乙酰基-丝氨酸(OAS)作为一种中间前体物，提供L-半胱氨酸的碳骨架(Kredich NM和Tomkins GM,J.Biol.Chem.,241:4955-4965,1966)。O-乙酰基丝氨酸巯解酶(OASS)，用硫化氢作为硫供体，催化乙酰基丝氨酸向半胱氨酸的转化。或者，在半胱氨酸的生产中，可将SO₄还原成硫代硫酸盐作为硫供体(Nakamura T,Kon Y,Iwahashi H和Eguchi Y,J.Bacteriol.,156:656-662,1983)。因此，可用各种硫供体，用微生物积累OAS和OASS生产半胱氨酸(US6,579,705)。通过OAS的半胱氨酸生物合成途径使用两种酶，丝氨酸乙酰转移酶(CysE)催化丝氨酸向OAS的转化，半胱氨酸合成酶(CysK)催化OAS向半胱氨酸的转化。这其中，丝氨酸乙酰基转移酶(CysE)对最终产物半胱氨酸的反馈抑制作用高度敏感(Wada M and Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006)。

发明内容

技术问题

本发明的发明人通过深入研究完成本发明，发现在超嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)中存在用于合成L-半胱氨酸的O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)，其采用O-磷-L-丝氨酸(OPS)-特异性途径，而非OAS-特异性途径(Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003；Burns KE,Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H,McLafferty FW和Begley TP,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005；Westrop GD,Goodall G,Mottram JC and Coombs GH,J.Biol.Chem.,281:25062-25075,2006)，以及当结核分支杆菌的OPSS的5个C-末端氨基酸残基被去除后，即使不存在额外的酶，其也可利用Na₂S作为硫供体，将OPS转化成半胱氨酸(Argen D,Schnell R和Schneider G,FEBS letters,583:330-336,2009)。本发明中，将微生物进行突变，从而在其体内积累OPS，接下来用OPSS酶进行孵育，从而将OPS转化成半胱氨酸。该方法之前在任何地方都没有公开过。

技术方案

本发明的一个目的在于提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法。

本发明的另一个目的在于提供用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物。

有益效果

本发明的方法通过重组微生物高产量地生产O-磷酸丝氨酸并将其转化成半胱氨酸，事实上，这更加环保，并且确保比化学合成方法更高效地生产半胱氨酸。本发明通过发酵和生物转化而生产的半胱氨酸及其衍生物可广泛应用于生产动物和人类食品和食品添加剂。

附图说明

图1为通过微生物发酵积累O-磷酸丝氨酸和积累的O-磷酸丝氨酸酶转化成L-半胱氨酸的示意图。

图2所示为根据温度的OPS巯解酶的活性。

图3为一组表示OPS巯解酶pH敏感性的图表。

图4所示为通过SDS-PAGE分析的pET系统和pCL-Pcj1系统中Msm-T表达水平的照片。

图5所示为将纯化的OPS发酵培养液(fermentation broth)转化成半胱氨酸的OPS巯解酶的酶活性的图。

图6所示为将OPS发酵培养液转化成半胱氨酸的OPS巯解酶的酶活性的图。

具体实施方式

如本申请中所使用的，术语“半胱氨酸转化”是指O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)的催化反应，其引起底物O-磷酸丝氨酸(OPS)转化成产物半胱氨酸，即，它是指将OPS转化成半胱氨酸的催化反应。

如本申请中所使用的，术语“半胱氨酸转化率”是指产物半胱氨酸的量和起始原料OPS的百分比。在最佳的反应条件下，1摩尔OPS被转化成1摩尔半胱氨酸。例如，如果100摩尔的OPS被转化成100摩尔的半胱氨酸，那么半胱氨酸转化率为100％。

根据其一个方面，本发明提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括：

1)培养经过修饰降低了内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性的重组微生物，以生产O-磷酸丝氨酸(OPS)；以及2)O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物存在下，将步骤1)的OPS和硫化物进行反应，以生产半胱氨酸或其衍生物。

该方法中，步骤1)与培养内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性降低的重组微生物有关。

SerB是具有将OPS水解成L-丝氨酸的活性的蛋白质。因此，内源SerB活性降低的重组微生物的特征在于其积累OPS。SerB可包括但不限于任何表现SerB活性的氨基酸序列，并且优选可具有SEQ IDNO:1或2所示的氨基酸序列。然而，只要表现出SerB活性，可使用任意氨基酸序列，优选与SEQ ID NO:1或2具有90％或以上，更优选96％或以上，还更优选98％或以上，最优选99％或以上的同源性。降低的SerB活性是指与修饰之前的菌株相比，SerB活性降低包括SerB的裂解。降低SerB活性的方法是本领域公知的。示例性实例包括染色体serB的缺失、向染色体serB中引入突变以降低内源SerB活性、向serB的调控区引入突变以降低内源SerB活性、用突变基因取代染色体serB以降低内源SerB活性，以及引入与serB转录本互补的反义寡核苷酸以抑制mRNA的反义，但降低SerB活性的方法不限于此。这些方法可用于降低本发明中其它酶的活性。

内源SerB的裂解导致向重组微生物引入丝氨酸营养缺陷型，因而培养基必须添加甘氨酸或丝氨酸。甘氨酸可以纯甘氨酸、含甘氨酸酵母提取物或蛋白胨的形式提供。甘氨酸所含的浓度为0.1～10g/L，优选浓度为0.5～3g/L。至于丝氨酸，它可以纯丝氨酸、含丝氨酸酵母提取物或蛋白胨的形式提供。它在培养基中的浓度范围为0.1～5g/L，优选0.1～1g/L。

在本发明的一个实施方案中，当其内源SerB活性受到破坏的(disrupted)突变谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(E.coli)培养于含甘氨酸或丝氨酸培养基时，发现其与野生型相比生产出更大量的OPS(见表2、3、6和7)。

此外，本发明的重组微生物可具有增强的磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)活性。SerA为具有将3-磷酸甘油酸转化成3-磷酸羟基丙酮酸的活性的蛋白质。SerA可具有野生型氨基酸或抗丝氨酸反馈抑制的突变氨基酸序列，但不限于这些。优选地，SerA可具有选自SEQ ID NOS:3～7中的一种氨基酸序列。只要它表现出野生型的SerA的活性或抗丝氨酸反馈抑制的突变SerA活性，可使用任意氨基酸序列，但其优选与SEQ ID NO:3～7中的一种具有90％或以上，更优选96％或以上，还更优选98％或以上，最优选99％或以上的同源性。“抗反馈抑制的突变SerA”是指不管对丝氨酸或甘氨酸的反馈抑制，该突变表现出维持或增强的SerA活性。抗反馈突变体是本领域公知的(Grant GA等人,J.Biol.Chem.,39:5357-5361,1999；Grant GA等人,Biochem.,39:7316-7319,2000；Grant GA等人,J.Biol.Chem.,276:17844-17850,2001；Peters-Wendisch P等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,60:437-441,2002；EP0943687B)。在本发明的一个实施方案中，当进一步向具有受到破坏的serB的谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌中导入抗反馈serA时，发现其与野生型相比生产更大量的OPS(见表4和9)。

SerC为具有将3-磷酸羟基丙酮酸转化成O-磷酸丝氨酸的活性的蛋白质。SerC包括但不限于表现出SerC活性的序列，优选其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。然而，只要它表现出SerC活性，可使用任意氨基酸序列，但优选与SEQ ID NO:8具有90％或以上，更优选96％或以上，还更优选98％或以上，最优选99％或以上的同源性。此外，可向serC引入突变，以增加酶活性。在本发明的一个实施方案中,当进一步向具有受到破坏的serB和抗反馈抑制的SerA的谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌中导入抗反馈serC时，发现其与野生型相比生产更大量的OPS(见表9)。

进一步地，可降低本发明重组微生物进行O-磷酸丝氨酸细胞内摄取或降解的能力。具体地，可对重组微生物进行改性以降低PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC运载蛋白(PhnCDE操纵子，即磷酸酯转运蛋白(PhnC；EG 10713)的ATP结合组分-Pn运载蛋白(PhnD；EG 10714)的周质结合蛋白组分-烷基磷酸酯ABC运载蛋白(PhnE；EG11283)的整体膜组分)、碱性磷酸化酶(PhoA)或酸性磷酸化酶(AphA)的活性。

在本发明的一个实施方案中,观察到进一步缺失重组突变体的phnCDE操纵子导致OPS产量的增加(表10)。在PhoA或AphA活性被进一步受到破坏的重组微生物中，当培养基中磷酸浓度降低的时候，OPS的降解开始减少(表12)。然而，引入抗反馈的serA或serC增加了OPS的产量(表14～16)。

同样，本发明的重组微生物进一步的特征在于嘧啶核苷酸转氢酶(PntAB；EC 1.6.1.1)活性的增加。如之前(Sauer U P等人,J BiolChem.20；279(8):6613-9.Epub 2003)所公开的，PntAB参与NADPH代谢，以调控细胞内氧化还原平衡。在本发明的一个实施方案中，观察到通过在重组微生物中过表达pntAB进一步增加PntAB活性，增加了OPS产量(表17)。

此外，本发明重组微生物的特征在于O-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排透性酶(YfiK)、高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白质(RhtB；EG11469)或苏氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白质(RhtC；EG11468)的增加。已知YfiK作为外运蛋白用来向细胞外运输半胱氨酸和OAS(Franke I等人,J.Bacteriology,185:1161-1166,2003)，据报道RhtB作为高丝氨酸/高丝氨酸内酯、苏氨酸前体的胞间外运蛋白。此外，已知RhtC为苏氨酸和高丝氨酸的外运蛋白。YfiK、RhtC和RhtB活性的增加表明了OPS积累菌株生长和OPS产量的增加(表18)。

可使用各种公知的方法，包括但不限于增加编码目的酶的基因拷贝数、向基因调控区引入突变以增加酶活性、用突变基因取代染色体基因以增加酶活性，以及向染色体基因引入突变以增加酶活性，从而实现酶活性的增加。

此外，本发明的重组微生物进一步的特征在于，磷酸甘油酸变位酶活性的降低。磷酸甘油酸变位酶存在三种形式的同工酶：GpmI、GpmA和GpmB，其在糖酵解方法中用于将3-磷酸甘油酸转化成2-磷酸甘油酸。对于使用3-磷酸甘油酸作为底物，这三种酶与催化3-磷酸羟基丙酮酸合成的SerA竞争。因此，观察到各个酶活性的降低导致产生大量的OPS前体3-磷酸甘油酸，从而引起OPS生产水平的增加(表19)。

在本发明的重组微生物中，也可减少L-丝氨酸脱水酶I(SdaA；EC 4.3.1.17)或2-氨基-3-酮丁酸辅酶A连接酶(Kbl)。因此，该重组微生物的特征在于，即使当它培养于含低浓度甘氨酸或丝氨酸的培养基中，仍能维持或增加OPS的产量(表20)。

此外，本发明的重组微生物进一步的特征在于，IclR活性的降低。IclR为一种转录因子，其能够抑制旁路操纵子aceBAK的表达(L Gui等人,J.Bacteriol.,Vol 178,No.1,321-324,1996)。当它被缺失后，观察到OPS产量的增加(表21)。

同样，本发明的重组微生物进一步的特征在于，选自下组的酶的活性增加：i)乙酰基-CoA合成酶(Acs)、ii)乙酸激酶(AckA)-磷酸转乙酰酶(Pta)、iii)苹果酸合成酶G(GlcB)、iv)苹果酸脱氢酶(MaeB)、v)谷氨酸脱氢酶(GdhA)、vi)乙醛酸醛连接酶(Glc)、vii)羟基丙二酸半醛还原酶2(GlxR)、viii)甘油酸激酶II(GlxK)和其组合。

在本发明具体的实施方案中，当进一步增加i)Acs(ECNo.6.2.1.1；J Bacteriol.1995May；177(10):2878-86)或丙酮酸氧化酶单体(PoxB；EC 1.2.2.2)或ii)AckA和Pta(EC 2,3,1,8)，所有这些旨在伴随着生产的NADH的消耗而有效地再利用积累的醋酸盐，发现本发明的重组微生物中OPS产量的增加(表22)。iii)GlcB(EC No.2.3.3.9)和iv)MaeB(EC 1.1.137)的功能是催化由乙醛酸合成苹果酸和苹果酸向丙酮酸的转化，其可削弱TCA循环，因此可用于增加葡萄糖的消耗和O-磷酸丝氨酸的产量(表23)。根据本发明的一个实施方案，催化由2-氧化戊二酸和NADPH合成SerC的底物谷氨酸的v)GdhA(EC1.4.1.2)的增加，赋予了微生物更高的生产OPS的潜能(表17)。已知vi)Glc(EC 4.1.1.47)、vii)GlxR(EC 1.1.1.60)和viii)GlxK(EC 2.7.1.31)都将乙醛酸转化成3-磷酸甘油酸，即增加磷酸甘油酸脱氢酶的底物的水平(Kim HJ等人,J.Bacteriol.,186(11),3453-3460,2004；Eva Cusa等人,J.Bacteriol.,181(24),7479-7484,1999；Chnag YY等人,J.Biol.Chem.268(6):3911-3919,1993)。当进一步增加Glc、GlxR和GlxK的活性，改善了本发明的重组微生物的糖消耗和生产(表24)。

本发明的重组微生物涉及SerB活性降低从而以更高的水平生产OPS的任何微生物。如果条件满足，任何微生物，无论是原核的或真核的，都落在本发明的范围内。它们中的典型代表为肠道菌或棒状杆菌。用于本发明的微生物的实例包括埃希氏菌属(Escherichiasp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗维登斯菌属(Providencia sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和短杆菌属(Brevibacterium sp)。优选为埃希氏菌属和棒状杆菌属，更优选为埃希氏菌属，最优选为大肠杆菌。

在一个实施方案中，将能生产OPS的重组菌株命名为大肠杆菌CA07-0012，并于2011年10月12日保藏于位于韩国首尔市西大门区弘济1洞，361-221的韩国微生物保藏中心(Korean Culture Centerof Microorganisms)，保藏号为KCCM11212P。

此外，在一个实施方案中，将能生产OPS的重组菌株命名为大肠杆菌CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC，并于2010年9月28日保藏于位于韩国首尔西大门区弘济1洞，361-221的韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM11103P。本申请中，术语“CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC”可与CA07-0022serA*(G336V)/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC互换使用。

菌株在1L发酵罐中培养80小时后，以19.5g/L的浓度生产O-磷酸丝氨酸(实施例35)。

如本申请中所使用的，术语“培养”是指在人工控制的条件下生产微生物。可使用本领域公知的合适培养基和培养条件实施培养过程。本领域技术人员可易于控制与所使用的菌株相应的培养过程。例如，可以分批型、连续型、补料分批型实施，但不限于此。

此外，培养基含有碳源。碳源的实例包括糖类和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油类和脂肪如豆油、葵花油、蓖麻油和椰油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类如甘油和乙醇，以及有机酸如乙酸。这些碳源可单独存在或组合存在于培养基中。该培养基可含有作为氮源的有机物如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆和面粉蛋白，或无机氮化合物如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独使用或组合使用。培养基可含有磷酸二氢钾、磷酸钾或相应的钠盐作为磷源。培养基可含有金属盐如硫酸镁或硫酸铁。培养基还可含有氨基酸、微生物和适合的前体物。营养元素可以分批的方式或连续的方式添加到培养基中。

在培养过程中，可以适宜的方式向培养基加入化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸，以调节培养基的pH值。此外，在培养过程中，可用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯抑制泡沫的形成。此外，为维持培养基中的富氧环境，可将氧气或含氧的气体注入到培养基中。为维持厌氧或微氧环境，在不通气的条件下提供氮气、氢气或二氧化碳。通常，可将培养基维持在27℃～37℃，优选维持在30℃～35℃。可将培养期维持到获得所需量的目标产物，优选范围为10～100小时。

为了进一步在培养过程中从培养基中收集和回收OPS，可根据培养类型，即分批、连续或分批补料培养，选择本领域公知的适宜方法。

在本发明的方法中，步骤2)致力于在O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物存在下，使步骤1)的OPS和硫化物反应，以诱导将O-磷酸丝氨酸转化成半胱氨酸或其衍生物。

由于pH、压强和/或溶解度的差异，可以液态或气态以及本领域通常所用的固态形式提供硫化物。只要它能转化成硫醇基(SH)，任何硫化物如硫化物(S^2-)或硫代硫酸盐(S₂O₃ ^2-)可用于本发明中。优选地，可为OPS提供硫醇基的Na₂S、NaSH、H₂S、(NH₄)₂S、NaSH和Na₂S₂O₃都可使用。在该反应中，一个硫醇基提供给一个OPS分子，以生产一分子的半胱氨酸或其衍生物。在这个酶转化中，优选以所使用OPS摩尔浓度的0.1～3倍，更优选以1～2倍的摩尔浓度添加硫化物。鉴于经济性，提供硫醇基的硫化物和OPS最优选以摩尔比1:1使用。在本发明的一个实施方案中,使用Na₂S作为硫源。Na₂S以在该转化反应中使用的OPS摩尔浓度的1～3倍进行添加。优选地，以OPS两倍的摩尔浓度进行添加，从而有效地将OPS转化成半胱氨酸(表34)。

如本申请中所使用的，术语“O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)”是指催化硫醇基(SH)向OPS(O-磷酸丝氨酸)转移从而将OPS转化成半胱氨酸的酶。该酶首次发现于超嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)中(Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003；Burns KE等人,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005)。

如本申请中所使用的，术语“突变体”是指表现出可遗传或不可遗传的表型改变的培养物或个体。当和OPSS一起使用时，术语“突变体”倾向于指遗传上发生改变的OPSS酶，其与野生型相比有效地增加了活性。

在本发明中，可通过缺失、取代或添加一部分编码OPSS核苷酸序列构建OPSS突变。根据本发明的一个实施方案，优选通过缺失耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)OPSS酶C末端的五个氨基酸残基而制备活性提高的OPSS酶。

可在广泛用于酶表达的大肠杆菌中获得OPSS突变体，使用基于密码子优化的基因合成方法，从而高产率地获得目标酶。或者，可使用基于大量微生物遗传信息的生物信息学有用酶来源的筛选方法获得OPSS突变体。在本发明的一个实施方案中，通过在各种微生物中筛选氨基酸的同源序列，选择利用OPS为底物合成半胱氨酸的OPSS酶。在这点上，将使用通过本领域合适培养基和培养条件获得的细胞团进行裂解，接着纯化含有酶的上清生产OPSS酶(表26)。

此外，开发了经济地获得OPSS酶的高产率表达系统。使用T7启动子的pET载体是本领域公知的。然而，本发明的发明人开发了一种名为CJ1系统(韩国专利10-0620092B1)的酶表达系统，替代常规的系统。在本发明的一个实施方案中，在相同条件下将含有T7启动子的pET系统和含有CJ1启动子的CJ1系统的OPSS表达水平进行比较。结果，CJ1系统表现出比pET系统更高的OPSS表达水平。此外，在pET系统中OPSS的过表达需要低温(18℃)和长时间，但在pCL-pCJ1系统中需要高温(37℃)和短时间。优选地，使用pCL-pCJ1系统用于获得OPSS(实施例46)。

可使用各种本领域公知的方法实现酶活性的增加。例如，可通过增加编码OPSS基因的拷贝数、使用强启动子或引入基因突变来实现。

可使用各种本领域公知的方法实现OPSS酶转化的优化。例如，该优化可基于充分了解OPSS的特性，如最佳的温度和pH、对底物的抑制、底物浓度、热稳定性等。此外，可通过酶转化的最佳条件来确定优化，如最佳OPSS浓度、依据浓度使用的底物的最佳平衡、为酶转化提供SH的优选硫化物、优选的特定缓冲剂、产生的离子的影响和辅因子以及它们的最佳浓度。

在本发明的一个实施方案中，将使用上述方法获得的OPSS酶特征化，并且基于确定的特征，开发了经济上有益、具有将OPS向半胱氨酸转化的高转化率并保证酶稳定性的酶转化方法。在该酶转化方法中，反应温度可设置在37℃～80℃，具体地，古细菌(Archea)的Ape-OPSS(SEQ ID NO:12)在60℃的酶活性比37℃的高，并且该酶本身对热的稳定性高，最佳反应性在60℃。另一方面，Msm-T(SEQID NO:10)的最佳活性在37℃，并且在60℃热处理时，活性解除。观察到OPSS酶在6.0～10.0的pH范围内具有酶活性。Ape-OPSS在pH7.4时具有最佳活性。由于Msm-T在8.0～9.0的pH范围内具有最佳活性，因此其与Ape-OPSS相比在更宽的pH范围内表现出稳定性(表28和31，以及图2和3)。

作为辅助因子的0.001-2mM PLP(吡哆醛-5’-磷酸酯)或0.001-100mM DTT可用于酶转化中。在本发明的一个实施方案中，在25mM DTT或0.2mM PLP存在下，半胱氨酸转化率提高了2.3倍。同样地，用DTT或PLP处理提高了步骤2)的半胱氨酸转化率。考虑生产成本的增加和转化率的增加，将辅助因子的添加设置在合理的水平(表30)。

OPSS的反应条件可根据所使用的OPSS的种类和浓度而改变。在本发明的一个实施方案中，在各种条件下使用纯OPS(市售获得)、从步骤1)制备的培养物中纯化的OPS以及步骤1)的含有OPS的培养物，以提供最佳的转化率。结果，半胱氨酸转化率根据OPSS的种类和浓度、反应温度以及OPS的种类和浓度而变化(图5和6，表35)。

本发明的方法可进一步包括分离和纯化步骤2)生产的半胱氨酸。酶转化以后，可使用本领域公知的方法从培养基中分离和纯化半胱氨酸。

本领域技术人员可使用公知的方法通过半胱氨酸化学合成半胱氨酸衍生物。半胱氨酸可易与乙酰化试剂反应而生产NAC(N-乙酰基半胱氨酸)，以及在基本条件下与卤化醋酸反应而生产SCMC(S-羧甲基半胱氨酸)。这些半胱氨酸衍生物用作治疗咳嗽、支气管炎、支气管哮喘和咽喉痛药物中的原料。

在本发明中，通过微生物发酵获得的OPS液体培养基用作合成半胱氨酸的底物。通过微生物发酵获得的OPS液体培养基与常规市售获得的纯OPS相比，具有经济上的优势，因为OPS液体培养基不需要额外的纯化就可以使用，而且转化所需的辅助因子PLP可从发酵培养物中获得。

在本发明的一个实施方案中，开发了一种转化方法，当使用50μg/ml Msm-T，在50mM OPS液体培养基或60mM纯化的OPS培养基、100mM Na₂S或120mM Na₂S和0.2mM PLP的条件下，这种转化方法能确保高达80％的半胱氨酸转化率。本领域技术人员应当理解，可易于优化并按比例放大使用高活性酶的酶转化。

根据其另一个方面，本发明提供用于生产OPS的SerB活性降低的重组微生物。在一个实施方案中，重组微生物表现出抗丝氨酸反馈的serA或serC的增加或至少一个选自PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC转运蛋白(phnCDE操纵子)、碱性磷酸酶(phoA)和酸性磷酸酶(aphA)的缺失。优选地，生产OPS的重组微生物为保藏号为KCCM11103P或KCCM11212P的保藏微生物。更优选地，生产OPS的重组微生物为保藏号为KCCM11103P的微生物。

发明实施方式

通过下述实施例可更好地了解本发明，所述实施例用于说明而非旨在限制本发明。

<制备生产O-磷酸丝氨酸的棒状杆菌(Corynebacterium)和使用该棒状杆菌生产O-磷酸丝氨酸>

实施例1:制备磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)缺失的棒状杆菌菌株

通过使编码催化由O-磷酸丝氨酸合成L-丝氨酸的磷酸丝氨酸磷酸酶的serB基因(SEQ ID NO:13,EC 3.1.3.3)从谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)13032上发生缺失，从而对其进行修饰。将用于失活serB的片段构建到这个末端。为此，设计用于制备本发明的重组菌株13032-ΔserB的引物。首先，根据NIH GenBank的数据，获得谷氨酸棒状杆菌13032的serB序列，并且基于该serB序列合成SEQ ID NOS:22～27所示的引物。为了进行位点特异性基因中断(gene disruption)，使用不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDC载体。构建其中serB的开放阅读框被内部受到破坏的pDC-ΔserB质粒，用于在谷氨酸棒状杆菌的突变菌株中制备位点特异性serB基因缺失。通过使用SEQ ID NOS:22和23以及SEQ ID NOS:24和25的引物对，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，进行交叉PCR，并将PCR产物导入到pDC载体中，产生pDC-ΔserB的内部基因中断。通过电穿孔，将产生的重组质粒转化到野生型谷氨酸棒状杆菌中van der Rest等人，1999)。通过初级重组(交换)，再进行二级重组(交换)将质粒导入到染色体，以从染色体中切除原始serB。

完成二级重组后，用SEQ ID NOS:26和27所示的一对基因特异性引物进行诊断PCR，分析含有serB缺失突变的谷氨酸棒状杆菌转化子。将重组菌命名为CB01-0047。

实施例2:磷酸丝氨酸磷酸酶缺失型棒状杆菌菌株的O-磷酸丝氨酸生产率试验

将谷氨酸棒状杆菌13032发生serB缺失而产生的预期积累O-磷酸丝氨酸的突变菌株CB01-0047涂布于BHIS平板，并在30℃培养箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在BHIS平板上的菌落接种到如表1所示25mL的滴度培养基(titer medium)中，然后于30℃、200rpm振荡培养48小时。结果概述与下表2中。

表1

表2

观察到CB01-0047菌株在滴度培养基中生长非常缓慢。即使补充添加L-甘氨酸，这种生长的阻滞也没有得到改善。然而，在L-丝氨酸存在下增加了生长，但观察到与野生型相比，O-磷酸丝氨酸的产量只有少量的增加。结果概述于下表3中。

表3

实施例3:构建源自棒状杆菌的磷酸甘油酸脱氢酶(SerA*)的突变基因

构建源自谷氨酸棒状杆菌的基因serA*(E235K)(SEQ ID NO:14和serA*(197△)(SEQ ID NO:15)，其编码各自的催化由3-磷酸甘油酸合成3-磷酸羟基丙酮酸的3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变体。据报道，该突变体对丝氨酸有反馈抗性(FBR)(Peters-Wendisch P等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,60:437-441,2002；EP0943687B)。以SEQ ID NOS:28～31为引物，通过缝合PCR(sewing PCR)扩增ATCC13032的基因组DNA而获得serA*(E235K)，并用SEQ ID NOS:28～32的引物对进行PCR扩增构建serA*(197△)。将所得的PCR产物插入到各自的T载体中以构建名为Tblunt-serA*(E235K)和Tblunt-serA*(197△)的重组载体。接下来，用限制性内切酶EcoRV和XbaI处理这两个载体，得到两个DNA片段serA*(E235K)和serA*(197△)。将这些片段插入到各自的已被相同限制性内切酶消化的pECCG117-Pcj7-GFP-终止子载体中。结果，获得两个重组载体pECCG117-Pcj7-serA*(E235K)和pECCG117-Pcj7-serA*(197△)。

实施例4:制备过表达serA*的棒状杆菌和O-磷酸丝氨酸的生产率试验

将实施例3构建的两个源自棒状杆菌的FBR-serA*质粒导入到谷氨酸棒状杆菌CB01-0047中。为了评价O-磷酸丝氨酸的生产率，将转化子涂布于BHIS平板，并在30℃培养箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在BHIS平板上的菌落接种到25mL的额外加入2g/L L-丝氨酸的表1所示滴度培养基中，然后于30℃、200rpm振荡培养48小时。结果概述与下表4中。

表4

如表4所示，在转化了源自棒状杆菌的FBR-serA*的谷氨酸棒状杆菌的菌株中，观察到O-磷酸丝氨酸的积累量为0.1～0.3g/L。

<生产O-磷酸丝氨酸的大肠杆菌的制备并用该大肠杆菌生产O-磷酸丝氨酸>

实施例5：制备磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性降低的大肠杆菌菌株

通过使编码催化由O-磷酸丝氨酸合成L-丝氨酸的磷酸丝氨酸磷酸酶的serB基因(SEQ ID NO:16)在大肠杆菌上发生缺失而对其进行修饰。用一步失活法制备大肠杆菌缺失突变体K12(Datsenko KA和Wanner BL,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:6640-6645,2000)，以去除耐抗生素选择标记基因。为制备serB缺失突变菌株，首先，用SEQ IDNOS:33和34的引物对对pKD3质粒(Datsenko KA和Wanner BL,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:6640-6645,2000；GenBank No.AY048742)进行PCR扩增。通过电穿孔法，将PCR产物导入到含有pKD46的大肠杆菌K12的感受态细胞中(Datsenko KA和Wanner BL,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:6640-6645,2000；GenBank No.AY048746)。此后，将氯霉素抗性菌株进行PCR以确定serB的缺失，然后，用pCP20(Datsenko KA和Wanner BL,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:6640-6645,2000)进行转化，去除耐抗生素选择标记。将所得的突变菌株命名为CA07-0012。

此外，按如下方式修饰serB的起始密码子，以降低磷酸丝氨酸磷酸酶活性。以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，PCR扩增获得以ATG为起始密码子的野生型serB基因。通过缝合PCR构建以CTG为起始密码子的突变的serB。SEQ ID NOS:35的36的引物对用于PCR扩增野生型serB，而SEQ ID NOS:37～38的引物对用于PCR扩增突变的serB。PCR产物分别用HindIII处理，并克隆到pccBAC1(Epicentre)的HindIII限制性酶切位点，从而分别构建pccBAC1-Pself-ATG-serB和pccBAC1-Pself-CTG-serB。将野生型和突变型serB载体导入到CA07-0012中，用于比较磷酸丝氨酸磷酸酶的活性。

实施例6:：SerB活性降低的菌株的O-磷酸丝氨酸生产率试验

将预期用于积累O-磷酸丝氨酸的磷酸丝氨酸磷酸酶缺陷型突变菌株CA07-0012涂布于LB平板上，并在33℃的恒温箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在LB平板上的菌落接种到25mL的如表5所示的滴度培养基中，然后于33℃、200rpm振荡培养48小时。结果概述与下表6中。

表5

组成	量(每升)
		葡萄糖	40g
KH₂PO₄	2g
		(NH₄)₂SO₄	17g
MgSO₄.7H₂O	1g
		FeSO₄.7H₂O	10mg
MnSO₄.4H₂O	10mg
		ZnSO₄.7H₂O	10mg
酵母提取物	2g
		碳酸钙	30g
pH	6.8

表6

为增加其生长和O-磷酸丝氨酸的生产率，将CA07-0012培养于额外添加1g/L的L-甘氨酸的表5中滴度培养基中48小时。结果概述于下表7中。

表7

菌株	OD 562nm	消耗的糖(g/L)	O-磷酸丝氨酸(g/L)
				E.coli W3110	16	40	0.03
CA07-0012	18	40	1.5

如表7中所示，向培养基添加L-甘氨酸增加了菌株的生长率和O-磷酸丝氨酸生产率。

实施例7:构建携带源自大肠杆菌的突变磷酸甘油酸脱氢酶(SerA*)基因的载体

构建编码催化由3-磷酸甘油酸合成3-磷酸羟基丙酮酸的3-磷酸甘油酸脱氢酶的各个突变体的源自大肠杆菌基因的serA*(G336V)(SEQ ID NO:18)、serA*(G336V,G337V)(SEQ ID NO:19)、和serA*(G336V,R338G)(SEQ ID NO:20)。报道这些突变体抗丝氨酸的反馈抑制(FBR)(Grant GA,Xu XL和Hu Z,Biochem.,39:7316-7319,2000；Grant GA,Hu Z和Xu XL,J.Biol.Chem.,276:17844-17850,2001)。使用缝合PCR法将突变基因导入到大肠杆菌的染色体中。用下述引物制备含有突变的DNA片段。

引物SEQ ID NOS:39和41普遍用于SerA*基因。为了将突变引入到serA基因中，用引物对SEQ ID NOS:42和43PCR扩增serA*(G336V)，用引物对SEQ ID NOS:44和45PCR扩增serA*(G336V,G337V)，用引物对SEQ ID NOS:46和47PCR扩增serA*(G336V,R338G)。基于注册于NIH GenBank的K12W3110基因(GenBank登录号：AP 003471)和它的相邻核苷酸序列的信息合成引物。

实施例8:克隆源自大肠杆菌的serA基因、serA*基因、和3-磷酸丝氨酸氨基转移酶(serC)基因

按如下方法克隆serA(SEQ ID NO:17,EC 1.1.1.95)、serC(SEQID NO:21,EC 2.6.1.52)、serA*(G336V)、serA*(G336V,G337V)和serA*(G336V,R338G)。通过PCR扩增大肠杆菌W3110的基因组DNA获得serA和serC，以实施例7的DNA片段作为模板通过PCR扩增构建serA*(G336V)、serA*(G336V,G337V)和serA*(G336V,R338G)。扩增serA的PCR引物为SEQ ID NOS:48和49，扩增serC的PCR引物为SEQ ID NOS:50和51。用EcoRV和HindII处理后，将PCR产物克隆到通过将大肠杆菌rmf启动子插入到pCL1920载体(GenBank No.AB236930)而构建的重组载体pCL-Prmf中，分别制备各自名为pCL-Prmf-serA、pCL-Prmf-serC、pCL-Prmf-serA*(G336V)、pCL-Prmf-serA*(G336V,G337V)和pCL-Prmf-serA*(G336V,R338V)的重组载体。

此外，构建其中由serA、三个serA突变体中的一个和/或serC组成操纵子的质粒，即pCL-Prmf-serA-(RBS)serC、pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC、pCL-Prmf-serA*(G336V,G337V)-(RBS)serC和pCL-Prmf-serA*(G336V,R338V)-(RBS)serC。为此，用引物SEQ ID NOS:51和52获得(RBS)serC片段，并克隆到pCL-Prmf-serA、pCL-Prmf-serA*(G336V)、pCL-Prmf-serA*(G336V,G337V)和pCL-Prmf-serA*(G336V,R338V)的HindIII位点。

实施例9:制备源自大肠杆菌的serA、serA*和serC增强的菌株和O-磷酸丝氨酸生产率试验

将实施例8构建的8个质粒转化到CA07-0012，产生的的重组菌株进行O-磷酸丝氨酸生产率的试验。将每个菌株涂布于LB平板，并在33℃培养箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在LB平板上的菌落接种到25mL的如表8所示的滴度培养基中，然后于33℃、200rpm振荡培养48小时。结果概述与下表9中。

表8

组成	量(每升)
		葡萄糖	40g
KH₂PO₄	4g
		(NH₄)₂SO₄	17g
MgSO₄.7H₂O	1g
		FeSO₄.7H₂O	10mg
MnSO₄.4H₂O	10mg
		ZnSO₄.7H₂O	10mg
L-甘氨酸	2.5g
		胰蛋白胨	2g
酵母提取物	2g
		碳酸钙	30g
pH	6.8

表9

如表9的数据所示，当用serA进行转化时，大肠杆菌CA07-0012菌株增加了O-磷酸丝氨酸的生产率，而当导入三个serA*突变体中的一个时，O-磷酸丝氨酸的生产率的增加程度更大。其中serA或三个serA*突变体中的一个和serC同时被激活的菌株的O-磷酸丝氨酸的生产率高于单独serA或serA*被激活的菌株。检测到的O-磷酸丝氨酸的生产率最高的菌株中，serA*和serC同时被激活。

实施例10:制备PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC转运蛋白(phnCDE操纵子)缺陷型大肠杆菌菌株

据报道，在大肠杆菌中，PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC转运蛋白将O-磷酸丝氨酸易位到细胞质中(Wanner BL和Metcalf WW.FEMS Microbiol.Lett.,15:133-139,1992)。使编码PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC转运蛋白的phnCDE操纵子从serB缺陷型菌株发生缺失而制备CA07-0016菌株。为了缺失phnCDE，使用引物对SEQID NOS:53和54。以与实施例5相同的方法进行缺失。

此外，将实施例8构建的pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC导入到CA07-0016中。

实施例11:phnCDE操纵子缺陷型大肠杆菌菌株的O-磷酸丝氨酸生产率试验

将实施例10制备的菌株CA07-0016和CA07-0016/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC进行O-磷酸丝氨酸生产率的评价。每个菌株涂布于LB平板或LB(壮观霉素)平板上，并在33℃的恒温箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在LB平板或LB(壮观霉素)上的菌落接种到25mL的如表8所示的滴度培养基中，然后于33℃、200rpm振荡培养48小时。结果概述与下表10中。

表10

从表10中可以看出，phnCDE操纵子缺陷型菌株的O-磷酸丝氨酸生产率只有少量的增加。

实施例12:制备碱性磷酸酶(phoA)、酸性磷酸酶(aphA)缺陷型大肠杆菌菌株

将磷酸丝氨酸磷酸酶缺陷型大肠杆菌菌株额外地缺失编码碱性磷酸酶基因phoA和碱性磷酸酶基因。用引物对SEQ ID NOS:55和56对pkD3质粒进行扩增，获得用于缺失phoA的DNA片段。另一方面，以相同方法用引物对SEQ ID NOS:57和58进行扩增，获得用于缺失aphA的DNA片段。以与实施例5相同的方式制备各缺陷型菌株。通过将用于aphA缺失的DNA片段电穿孔到已被pKD46再次转化的phoA缺陷型菌株的感受态细胞中，制备phoA和aphA缺失的菌株。此后，将耐氯霉素的转化子进行PCR以确认aphA的缺失，并用pCP20进行转化以去除耐抗生素选择标记。产生的突变菌株和它们的基因型概述于下表11中。

表11

菌株	基因型
		CA07-0013	W3110 △serB △phoA
CA07-0015	W3110 △serB △aphA
		CA07-0018	W3110 △serB △phoA △aphA

以与实施例10相同的方法，将实施例8构建的pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC导入到每个缺陷型菌株中。

实施例13：碱性磷酸酶(phoA)、酸性磷酸酶(aphA)缺陷型大肠杆菌菌株的降解O-磷酸丝氨酸能力的试验

将实施例12制备的菌株进行OPS的生产率和OPS降解的无能度(Incapability)试验。将每个菌株涂布于LB平板或LB(壮观霉素)平板上，并在33℃的恒温箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在LB平板或LB(壮观霉素)平板上的菌落接种到25mL的如表8所示的滴度培养基中，然后于33℃、200rpm振荡培养72小时。结果概述与下表12中。用通过磷酸根分析确定磷酸根离子水平的改变以评价OPS降解的无能度(Incapability)。

表12

如表12所示，aphA缺陷型菌株出现不正常的生长现象，而缺失phoA或缺失phoA和aphA的菌株O-磷酸丝氨酸的生产率有些增加且降低了降解O-磷酸丝氨酸的能力。另一方面，phoA和aphA都没有缺失的菌株用72小时降解了积累的O-磷酸丝氨酸，并伴随PO₄水平的增加。

实施例14:phnCDE操纵子、phoA和aphA缺陷型菌株的制备

将serB缺陷型菌株(CA07-0012)进行修饰，进一步缺失编码phnC/phnD/phnE烷基磷酸酯ABC转运蛋白的phnCDE、编码碱性磷酸酶的phoA和编码酸性磷酸酶的aphA。由此制备的菌株如下表13所示。用实施例5中所述的一步失活法制备缺失突变体。

表13

菌株	基因型
		CA07-0020	W3110 △serB △phoA △phnCDE
CA07-0022	W3110 △serB △phoA △aphA △phnCDE

用与实施例10相同的方法将实施例8构建的pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC导入到每个缺陷型菌株。

实施例15:phnCDE操纵子、phoA和aphA缺陷型大肠杆菌菌株的O-磷酸丝氨酸生产率试验

测试实施例14制备的菌株的OPS生产率。每个菌株涂布于LB平板或LB(壮观霉素)平板上，并在33℃的恒温箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在LB平板或LB(壮观霉素)平板上的菌落接种到25mL的如表8所示的滴度培养基中，然后于33℃、200rpm振荡培养72小时。结果概述与下表14中。

表14

发现与CA07-0012相比，CA07-0020和CA07-0022增加了OPS的生产率并降低了降解O-磷酸丝氨酸的能力。这种特性也在进一步转化pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC的菌株中检测到。

实施例16:phnCDE操纵子、phoA和aphA基因缺失和具有磷酸甘油酸脱氢酶(serA*)取代的大肠杆菌突变体的制备

在CA07-0022中，按如下方法在染色体上用所有被报道具有抗丝氨酸反馈抑制的serA*(G336V)、serA*(G336V,G337V)或serA*(G336V,R338G)替换编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA。

为了将突变引入到染色体的serA基因上，按如下方式构建载体。用引物对SEQ ID NOS:40和41对实施例7制备的serA*(G336V)、serA*(G336V,G337V)和serA*(G336V,R338G)进行PCR扩增。用SacI和BamHI处理后，将获得的PCR产物克隆到pSG76C的SacI和BamHI位点。将产生的重组载体转化到大肠杆菌BW中，然后在涂布到LB平板上。将平板上出现的菌落进行碱基测序，筛选导入了突变的转化子。然后，通过它们用常规的miniprep方法制备质粒。根据引入的突变，将质粒命名为pSG76C-serA*(G336V)、pSG76C-serA*(G336V,G337V)和pSG76C-serA*(G336V,R338G)。

如前所述(Posfai G,Kolisnychenko V,Bereczki Z和Blattner FR,Nucleic Acids Res.27:4409-4415,1999)制备每个大肠杆菌突变体，并去除它们中的耐抗生素选择标记基因。为制备serA*(G336V)突变体，通过电穿孔将pSG76C-serA*(G336V)导入到CA07-0022的感受态细胞中。将耐氯霉素的菌株进行PCR以确认serA*(G336V)的导入。用pST76-ASceP(Posfai G,Kolisnychenko V,Bereczki Z和Blattner FR,Nucleic Acids Res.27:4409-4415,1999)转化该菌株，去除耐抗生素选择标记基因。将产生的菌株命名为CA07-0022serA*(G336V)。用相似的方法将pSG76C-serA*(G336V,G337V)和pSG76C-serA*(G336V,R338G)转化CA07-0022serA*(G336V)菌株，获得serA*(G336V,G337V)和serA*(G336V,R338G)突变体，分别命名为CA07-0022serA*(G336V,G337V)和CA07-0022serA*(G336V,R338G)。

实施例17:phnCDE操纵子、aphA和aphA基因缺失以及具有磷酸甘油酸脱氢酶(serA*)取代的大肠杆菌突变体的O-磷酸丝氨酸生产率试验

将实施例16制备的菌株进行O-磷酸丝氨酸生产率试验。每个菌株涂布于LB平板或LB(壮观霉素)平板上，并在33℃的恒温箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在LB平板或LB(壮观霉素)平板上的菌落接种到25mL的如表8所示的滴度培养基中，然后于33℃、200rpm振荡培养48小时。结果概述与下表15中。

表15

其中serA被改造成抗丝氨酸反馈抑制基因的菌株生长率有些降低，但增加了O-磷酸丝氨酸的生产率。

实施例18:phnCDE操纵子、aphA、和aphA基因缺失和具有磷酸甘油酸脱氢酶(serA*)取代以及3-磷酸丝氨酸氨基转移酶增强的大肠杆菌突变体的制备和O-磷酸丝氨酸生产率试验

将实施例8制备的质粒，即pCL-Prmf-serC导入到实施例16制备的菌株即CA07-0022serA*(G336V)、CA07-0022serA*(G336V,G337V)和CA07-0022serA*(G336V,R338G)中。以实施例9相同的方法评价产生的突变体的O-磷酸丝氨酸的生产率。结果概述于下表16中。

表16

如表16中所示，发现serC激活的菌株提高了O-磷酸丝氨酸的生产率。这种现象在serA被修饰成抗丝氨酸反馈抑制基因的菌株中更加明显。

实施例19:嘧啶核苷酸转氢酶(PntAB)增强的菌株和含谷氨酸脱氢酶(GdhA)的载体的构建

为制备其中编码嘧啶核苷酸转氢酶的pntAB上调表达的菌株，使用突变loxP系统(Arakawa H等人,BMC Biotechnol.1:7,2001)用trc启动子替换pntAB启动子。为此，用引物对SEQ ID NOS:59和60PCR扩增pmlox-trc(ref)质粒，并通过电穿孔将获得的PCR产物导入到锚定pKD46的CA07-0022serA*(G336V)的感受态细胞中。将耐氯霉素的转化子进行PCR以确认启动子的替换，接着用pJW168(LeBorgne S等人,Methods Mol Biol.267:135-43,2004)进行转化，以去除耐抗生素选择标记基因。产生的菌株命名为CA07-0022serA*(G336V)P(trc)-pntAB。基于注册于NHI GenBank的K12W3110基因(GenBank登录号：AP002223、AP002224)和它的相邻核苷酸序列的信息，设计用于PCR的引物。用PCR引物对SEQ ID NOS:61和62扩增编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因，以获得单个的多核苷酸。引物SEQ ID NOS:61和62均具有限制性酶切位点HindIII。基于注册于NHI GenBank的K12W3110基因(GenBank登录号：AP002380)和它的相邻核苷酸序列的信息，设计用于PCR的引物。

PCR起始于94℃变性3min，然后将94℃变性30sec、56℃退火30sec以及72℃延伸2min进行25个循环，接着72℃延伸7min。结果，获得长1714bp的多核苷酸。用HindIII处理后，将PCR产物克隆到pCC1BAC的HindIII位点，再导入到大肠杆菌DH5α中，然后涂布LB平板。通过碱基测序筛选所培育菌株中它们的gdhA基因中没有发生突变的菌株。用常规的miniprep法分离质粒，并命名为pCC1BAC-P(native)-gdhA。

实施例20:OPS生产菌株的pntAB和gdhA的导入以及OPS生产率试验

为制备其中pntAB和gdhA上调表达的OPS生产菌株，如下表所示，用pCL-P(trc)-serA*(G336V)-serC和pCC1BAC-P(native)-gdhA单独或共同转化CA07-0022serA*(G336V)菌株或CA07-0022serA*(G336V)P(trc)-pntAB菌株。每个转化子在LB平板中33℃培养过夜。此后，用铂环将菌落接种到25mL的如表8所示的滴度培养基中，然后于33℃、200rpm振荡培养48小时。

表17

如表17所示，当其中pntAB上调表达时，该菌株提高了O-磷酸丝氨酸的生产率。与对照相比，pntAB和gdhA都上调带来O-磷酸丝氨酸生产率的增加更大。因此，了解到pntAB和gdhA在OPS生产中起着重要作用。

实施例21:携带编码大肠杆菌O-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排蛋白(ydeD)、O-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排透性酶(yfiK)、高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白(rhtB)、苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白(rhtC)、亚砷酸/亚锑酸转运蛋白(asrB)和亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸转运亚单位(livHM)基因的载体的构建

生产的O-磷酸丝氨酸释放到细胞外需要适合的输出因子，然而，之前对其没有任何的报道。在本申请中，从之前报道的各种转运蛋白基因中筛选出6个基因，即编码O-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排蛋白的ydeD、编码O-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排透性酶的yfiK(Franke I,Resch A,Dassler T,Maier T和Bock A,J.Bacteriology,185:1161-166,2003)、编码高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白的rhtB、编码苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白的RhtC、编码亚砷酸/亚锑酸转运蛋白的asrB，以及编码亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸转运亚单位的livHM，并进行克隆和评价。

对大肠杆菌W3110的基因组DNA进行PCR扩增获得每个基因，用引物对SEQ ID NOS:63和64扩增ydeD，用引物对SEQ IDNOS:65和66扩增yfiK，用引物对SEQ ID NOS:67和68扩增rhtB，用引物对SEQ ID NOS:69和70扩增rhtC，用引物对SEQ ID NOS:71和72扩增asrB，以及用引物对SEQ ID NOS:73和74扩增livHM。用EcoRV和HindIII处理后，将各个获得的PCR产物导入到pCL-Prmf-GFP的EcoRV和HindIII位点进行克隆，获得重组载体，命名为pCL-Prmf-ydeD、pCL-Prmf-yfiK、pCL-Prmf-rhtB、pCL-Prmf-rhtC、pCL-Prmf-arsB和pCL-Prmf-livHM。

实施例22:将携带编码大肠杆菌YdeD、YfiK、RhtB、RhtC、AsrB、livHM的基因的载体导入O-磷酸丝氨酸生产菌株以及O-磷酸丝氨酸生产率的试验

用实施例12构建的6个质粒转化CA07-0022serA*(G336V)菌株，并以如实施例9的相同方法评价O-磷酸丝氨酸的生产率。结果示于下表18中。

表18

如表18所示，转化ydeD、mdtG或livHM的菌株降低了生长率并降低了OPS生产率，而转化yfiK、rhtB或rhtC的菌株增加了生长率和OPS生产率(表18)。

实施例23：磷酸甘油酸变位酶(gpmI、gpmA和gpmB)缺陷型菌株的制备

将每个都编码磷酸甘油酸变位酶的gpmI、gpmA和gpmB单独或共同从CA07-0022serA*(G336V)中缺失，产生分别名为CA07-0022serA*(G336V)ΔgpmI、CA07-0022serA*(G336V)ΔgpmA、CA07-0022serA*(G336V)ΔgpmB、CA07-0022serA*(G336V)ΔgpmIΔgpmA、CA07-0022serA*(G336V)ΔgpmAΔgpmB和CA07-0022serA*(G336V)ΔgpmIΔgpmAΔgpmB的突变菌株。以与实施例5相同的方法制备gpmA和gpmB缺陷型菌株，用引物对SEQ ID NOS:75and 76扩增gpmA，用引物对SEQ ID NOS:81and 82扩增gpmB。gpmI缺陷型菌株的构建如实施例16所述，用pSG76C导入含有终止密码子的gpmI突变。通过缝合PCR，以K12W3110的基因组DNA为模板，用引物SEQ ID NOS:77～81扩增含有终止密码子的gpmI突变，并导入到pSG76的SacI/BamHI位点进行克隆。

实施例24:gpmI、gpmA和gpmB缺陷型菌株的OPS生产率试验

以与实施例9相同的方法，将实施例23制备的菌株进行OPS生产率的评价。结果概述与下表19中。

表19

从表19中可以看出，当各自缺失gpmI、gpmA和gpmB而不缺失其它，与母株相比，突变菌株的糖消耗降低，但它们的OPS生产率增加。特别地，与gpmA或gpmB缺失的菌株相比，gpmA和gpmB都缺失的菌株具有相似的糖消耗，但增加了OPS的生产率。因此，了解到gpmI、gpmA和gpmB的缺失增加了OPS的前体3-磷酸甘油酸的生产量，因而导致OPS生产量的增加。

实施例25:2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(kbl)、L-丝氨酸脱氨酶I(sdaA)缺陷型菌株的制备

将CA07-0022serA*(G336V)中的编码2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶的基因kbl和编码L-丝氨酸脱氨酶I的基因sdaA进行缺失，分别获得CA07-0022serA*(G336V)Δkbl和CA07-0022serA*(G336V)ΔsdaA。以与实施例5相同的方法制备kbl和sdaA缺陷型菌株，用引物对SEQ ID NOS:83和84扩增kbl，用引物对SEQ ID NOS:85的86扩增sdaA。

实施例26:根据甘氨酸浓度试验kbl/sdaA缺陷型菌株的OD和糖消耗

当菌株培养于如实施例9的表8中所述的相同培养基条件下，除甘氨酸的使用量为0～2.5g/L外，对实施例25中制备的菌株进行OD、糖消耗和O-磷酸丝氨酸生产率的评价。

表20

从表20中可以看出，当培养基中甘氨酸水平增加，所有三个菌株中OD和糖消耗率均增加。特别地，sdaA缺陷型菌株在甘氨酸浓度为1g/L时，显著增加了OD和糖消耗率。kbl缺陷型菌株的OPS生产率在存在2.5g/L甘氨酸时大大提高。

实施例27:iclR缺陷型菌株的制备

将CA07-0022serA*(G336V)中的转录因子iclR进行缺失获得CA07-0022serA*(G336V)ΔiclR。用实施例5中的一步法制备缺失突变菌株并去除耐抗生素选择标记基因。为了制备iclR缺陷型菌株，用引物对SEQ ID NOS:87和88进行PCR扩增。

实施例28:iclR缺陷型菌株的OPS生产率试验

以如实施例9中的相同方法，将实施例27制备的菌株进行OPS生产率的评价。

表21

如表21的数据所示，发现iclR缺陷型菌株的OPS的生产率增加了。

实施例29：携带大肠杆菌乙酰基CoA合成酶(acs)、丙酮酸氧化酶单体(poxB)、醋酸酯激酶(ackA)和磷酸酯乙酰基转移酶(pta)的载体的构建

为了增加O-磷酸丝氨酸生产菌株中的醋酸酯的产量和再利用，分别构建携带编码乙酰基CoA合成酶的acs、编码丙酮酸氧化酶单体的poxB、编码醋酸酯激酶的ackA和编码磷酸酯乙酰基转移酶的pts的表达质粒。

通过pfu PCR扩增大肠杆菌W3110的基因组DNA获得各个基因，用引物对SEQ ID NOS:89和90扩增acs、用引物对SEQ ID NOS:91和92扩增poxB、以及用引物对SEQ ID NOS:93和94扩增ackA和pta。用HindIII处理后，每个获得的PCR产物导入到通过将大肠杆菌rmf启动子插入到pCL1920而构建的pCL-Prmf-GFP载体的EcoRV和HindIII位点进行克隆，从而获得pCL-Prmf-acs、pCL-Prmf-poxB和pCL-Prmf-ackA-pta。接下来，用EcoRI处理这些质粒获得DNA插入片段，即Prmf-acs、Prmf-poxB、和Prmf-ackA-pta，然后再将它们导入到pCC1BAC(EcoRI)(CopyControl^TM pcc1BAC^TM载体,Epicentre.Cat.Nos.CBAC311)中，分别构建成pCC1BAC-Prmf-acs、pCC1BAC-Prmf-poxB和pCC1BAC-Prmf-ackA-pta。

实施例30：大肠杆菌acs、poxB、ackA、pta增强的OPS生产菌株的制备和OPS生产率的试验

用实施例29制备的三个载体转化CA07-0022serA*(G336V)菌株，并以如实施例9中的相同方法试验OPS的生产率。

表22

从表22中可以看出，转化poxB的菌株的生长率降低，而导入acs或ackA-pta的菌株增加了生长率和OPS的生产率。

实施例31：携带大肠杆菌苹果酸合成酶A(aceB)、异柠檬酸裂解酶单体(aceA)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)、苹果酸合成酶G(glcB)和苹果酸脱氢酶(maeB)的载体的构建

构建分别在大肠杆菌中共同表达编码苹果酸合成酶A的aceB和编码异柠檬酸裂解酶单体的aceA、编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA、编码苹果酸合成酶G的glcB以及苹果酸脱氢酶的maeB的质粒。

通过pfu PCR扩增大肠杆菌W3110的基因组DNA制备这些基因，用引物对SEQ ID NOS:95和96扩增aceBA，用引物对SEQ IDNOS:97和98扩增pckA，用引物对SEQ ID NOS:99和100扩增glcB，以及用引物对SEQ ID NOS:101和102扩增maeB。用HindIII处理后，将各个获得的PCR产物导入通过将大肠杆菌rmf启动子插入到pCL1920而构建的pCL-Prmf-GFP载体的EcoRV和HindIII位点进行克隆，从而获得pCL-Prmf-aceBA、pCL-Prmf-pckA、pCL-Prmf-glcB以及pCL-Prmf-maeB。

实施例32：大肠杆菌aceB、aceA、pckA、glcB和maeB增强的OPS生产菌株的制备和O-磷酸丝氨酸生产率的试验

用实施例31制备的四个载体转化CA07-0022serA*(G336V)菌株，并以如实施例9中的相同方法试验O-磷酸丝氨酸的生产率。

表23

从表23中可以看出，当用aceBA转化时该菌株的糖消耗率和生产率有一些降低，而当用pckA转化时该菌株的生长率显著降低，而glcB或maeB的导入增加了OPS的生产率。

实施例33：携带乙醛酸醛连接酶(glc)、羟丙二酸半醛还原酶2(glxR)和甘油酸激酶II(glxK)的载体的构建

按如下方法克隆都参与乙醛酸向3-磷酸甘油酸转化的编码乙醛酸醛连接酶的gcl、编码羟丙二酸半醛还原酶2的glxR以及编码甘油酸激酶II的glxK。通过大肠杆菌W3110的基因组DNA的PCR扩增获得各个基因，用引物对SEQ ID NOS:103和104扩增gcl，用引物对SEQ ID NOS:105～108扩增glxR～glxK。用EcoRV和HindIII处理后，将每个获得的PCR产物导入到通过将大肠杆菌rmf启动子插入到pCL1920而构建的pCL-Prmf-GFP载体的EcoRV和HindIII位点进行克隆，获得重组载体，分别命名为pCL-Prmf-gcl、pCL-Prmf-glxR-glxK以及pCL-Prmf-glxR-glxK-Prmf-gcl。

实施例34：将携带glc、glxR、glxK的载体导入到O-磷酸丝氨酸生产菌株以及O-磷酸丝氨酸生产率的试验

将实施例33中构建的三个质粒导入到CA07-0022serA*(G336V)，然后以如实施例9中的相同方法评价O-磷酸丝氨酸的生产率。结果概述于下表24中。

表24

从表24中可以看出，与CA07-0022serA*(G336V)菌株本身相比，分别转化gcl、glxR-glxK和glxR-glxK-gcl的菌株的最终O-磷酸丝氨酸的生产率降低，但生长率和糖消耗率增加。特别地，发现导入glxR-glxK最大地增加了生长率和糖消耗率。

实施例35:在发酵罐中评价O-磷酸丝氨酸生产菌株

在含有50μg/mL壮观霉素的MMYE琼脂平板(2g/L葡萄糖、2mM硫酸镁、0.1mM氯化钙、6g/L焦磷酸钠、0.5g/L氯化钠、3g/L磷酸二氢钾、10g/L酵母提取物、18g/L琼脂)上，将CA07-0022serA*(G336V)/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC菌株于33℃培养24小时。从每个琼脂平板的1/10面积处刮取产生的菌落，并在挡板烧瓶中培养于含有50μg/mL壮观霉素的种子培养基(10g/L葡萄糖、0.5g/L硫酸镁、3g/L磷酸二氢钾、10g/L酵母提取物、0.5g/L氯化钠、1.5g/L氯化铵、12.8g/L焦磷酸钠、1g/L甘氨酸)，并于30℃、200rpm振荡培养6个小时。向1L发酵罐内300mL主要培养基中以主要培养基体积的16％的量添加生成的种子培养基，接下来在33℃、pH7.0下进行培养。主要培养基的组成如下表25所示。

表25

培养过程中，用氨水将培养基的pH值调至7.0。去掉培养基中的葡萄糖，通过加入520g/L葡萄糖溶液进行补料-分批型发酵。在发酵80小时以后，通过HPLC测定生产的O-磷酸丝氨酸的浓度为19.5g/L。

<O-磷酸丝氨酸(OPS)巯解酶(OPSS)的开发和表征>

实施例36:OPS巯解酶(OPSS)的开发

据报道，超嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)具有O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)，一种在大肠杆菌中以O-磷酸-L-丝氨酸(OPS)而非O-乙酰基丝氨酸(OAS)为底物合成半胱氨酸的酶(Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003；Burns KE,Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H,McLafferty FW和Begley TP,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005；Westrop GD,Goodall G,Mottram JC和Coombs GH,J.Biol.Chem.,281:25062-25075,2006)。根据报道，本发明的发明人从超嗜热古菌和结核分枝杆菌H37Rv中发现两种将OPS转化成半胱氨酸的OPS巯解酶。它们中，源自结核分枝杆菌H37Rv的OPSS酶用于筛选同源氨基酸。结果，从耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)str.MC2155、红球菌(Rhodococcusjostii)RHA1和皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)IFM 10152中筛选到三种OPSS。

为了从各个菌株中获得OPSS，构建通常用于酶表达的pET28a载体系统(Novagen)。用于克隆5个不同的OPS巯解酶基因的每个模板和引物以及产生的重组质粒概述于下表26中。表26中所示的适合的模板和引物的组合用于PCR扩增各自的OPSS基因。PCR产物和pET28a载体用NdeI和HindIII(37℃，3小时)进行消化。各自的基因片段连接到消化后的pET28a载体(Novagen)上。基于测序确认携带各自OPSS基因的表达载体的构建。将酶表达载体导入到大肠杆菌(DE3)，以生产能表达5个OPSS酶的载体。酶的名称示于下表26中。

表26

根据pET系统生产商(Novagen)的说明书进行酶表达。将各自LB平板中的单克隆菌株接种到5mL LB培养液中，于37℃、200rpm振荡培养16小时。将培养物转接到25mL新鲜LB培养液中(于250mL烧瓶中)，在相同条件下培养至OD₆₀₀为0.5～0.6(2～3小时)，之后，迅速向培养基中加入1mM IPTG，于18℃、120rpm振荡培养18小时以诱导酶的表达。借助His SpinTrap(GE Healthcare)，用Ni-NTA柱纯化带有His-标签的酶。分离的5个酶中，通过14％SDS-PAGE电泳分析，发现4个是可溶形式的，1个(Rjo-OPSS)是包涵体。

实施例37:OPS巯解酶(OPSS)的半胱氨酸合成活性试验

试验从4个微生物菌株中获得的OPS巯解酶的催化O-磷酸丝氨酸(OPS)转化成半胱氨酸的能力。关于试验条件和方法(cysM酶试验)，参考以前的报道(Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003；Burns KE,Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H,McLafferty FW和Begley TP,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005；Westrop GD,Goodall G,Mottram JC和Coombs GH,J.Biol.Chem.,281:25062-25075,2006)。所使用的底物的量以mL为单位/表示。酶活性试验条件概述与下表27中。

表27

母液(Stock soln)	终浓度	空白	OPS巯解酶
				6x his-酶		-	40(50mg)
1 M HEPES(pH7.4)	100 mM HEPES	100	100
				0.5 M Na₂S	10 mM Na₂S	20	20
10 mM PLP	0.2 mM PLP	20	20
				100mM OPS	5mM OPS	0	50
DW		790	750
				总计		1000	1000

除酶外的反应溶液在37℃下培养5min，此后，向反应液加入50mg纯化的OPS巯解酶。在37℃的培养过程中的设定时间，取100mL酶反应液，与100 mL 33.2％TCA混合终止酶反应。根据Gaitonde法测定OD₅₆₀的吸光度定量分析酶反应的半胱氨酸的浓度。4个不同OPS巯解酶的半胱氨酸合成活性概述于下表28中。OPSS酶的半胱氨酸合成滴度表示成根据反应时间的半胱氨酸转化率。

表28

以前有报道的源自超嗜热古菌和结核分枝杆菌H37Rv的OPS巯解酶(Mino K和Ishikawa K,FEBS letters,551:133-138,2003；WestropGD,Goodall G,Mottram JC和Coombs GH,J.Biol.Chem.,281:25062-25075,2006)，被确认具有利用底物OPS合成半胱氨酸活性。通过筛选与Mtb-OPSS酶的氨基酸同源性获得的源自新型耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)str.MC2155的OPS巯解酶的半胱氨酸合成活性是首次发现的。从下表28中可以看出，Ape-OPSS的将OPS转化成半胱氨酸的转化率在1小时内达到将近100％。基于以前报道过的源自结核分枝杆菌H37Rv的OPSS而新筛选到的Msm-OPSS酶的最终转化率为43.7％，而这是Mtb-OPSS的4.3倍。另一方面，通过同源筛选获得的新的皮疽诺卡菌(Nocardiafarcinica)IFM 10152的OPS巯解酶将O-磷酸丝氨酸转化成半胱氨酸的活性不足。

实施例38:编码C末端5个氨基酸残基被截短的Mtb-OPSS和Msm-OPSS的Mtb-T和Msm-T的制备

源自结核分枝杆菌H37Rv的OPSS(Mtb-OPSS)，其在另外的mec+和cysO酶的帮助下催化OPS向半胱氨酸的转化，被报道当C末端的5个氨基酸残基被去除后，在OPS向半胱氨酸的转化中，即使不存在另外的酶，也可利用含S^2-的硫源(Agren D,Schnell R andSchneider G,FEBS letters,583:330-336,2009)。基于这一报道，获得在硫源S^2-的存在下，可迅速转化OPS的Mtb-T(SEQ ID NO:11)。还可从与Mtb-OPSS具有氨基酸同源性的Msm-OPSS(SEQ ID NO:9)中获得Msm-T。构建携带这两个酶突变体的表达载体。为此，在引物对SEQ ID NOS:119、120、121和122存在下，对结核分枝杆菌H37Rv或耻垢分枝杆菌的基因组DNA进行pfu PCR扩增。用NdeI和HindIII对获得的OPSS基因片段进行处理，并克隆到相同内切酶消化的pET28a载体中分别构建名为pET28a-Mtb-T和pET28a-Msm-T的重组载体。将重组表达载体导入到大肠杆菌(DE3)中。通过14％SDS PAGE确认两个突变酶的表达。以如实施例36中相同的条件纯化和表达两个突变OPSS酶。结果，获得Mtb-T(SEQ ID NO:11)和Msm-T(SEQ ID NO:10)。

实施例39:Mtb-T和Msm-T的半胱氨酸转化活性试验

基于缺失C末端的5个氨基酸残基的源自结核分枝杆菌H37Rv的OPSS，即使没有辅助酶，也增加了对含S^2-基的硫源的亲和性的报道(Agren D,Schnell R和Schneider G,FEBS letters,583:330-336,2009)，获得Mtb-T和Msm-T。通过测定最终的半胱氨酸转化率评价它们的酶活性。以如实施例37相同的条件和方法进行酶活性试验。用Gaitonde法对生产的半胱氨酸的进行定量分析。

表29

从表29中可以看出，缺失了结核分枝杆菌str.MC2155的OPSSC末端5个氨基酸残基的Msm-T使底物转化成半胱氨酸的转化率1小时内为100％。

当它的氨基酸序列被修饰，O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)可更加有效地催化L-半胱氨酸的生物合成。

实施例40:OPS巯解酶活性对辅助因子的需求

为了测试辅助因子对OPSS的半胱氨酸转化的作用，在无或有PLP(吡哆醛-5’-磷酸酯)和DTT(二硫苏糖醇)的条件下，测试Msm-T的半胱氨酸转化率。为此，在有25mM DTT或0.2mM PLP的条件下，底物50mM OPS培养液和100mM Na₂S在37℃反应30min。用Gaitonde法定量分析所产生的半胱氨酸。从表30中可以看出，有PLP和DTT时的半胱氨酸转化率为无PLP和DTT的2.3倍。因而，观察到PLP和DTT都对转化具有积极的作用。

表30

Msm-T	半胱氨酸转化率(％)
		(-)PLP,(-)DTT	23.62
(+)PLP,(-)DTT	33.21
		(-)PLP,(+)DTT	40.08
(+)PLP,(+)DTT	54.65

实施例41:温度对OPS巯解酶活性的影响

测试Ape-OPSS和Msm-T根据温度的半胱氨酸转化率。在37℃和60℃下测定反应2、5、10、30和60min后的酶活性。在100mMHEPES(pH 7.4)、5mM OPS、10mM Na₂S、0.2mM PLP和CysM50μg/mL的条件下进行反应。用Gaitonde法测定生产的半胱氨酸的量。如图2所示，在缓冲剂条件下，Ape-OPSS相比Msm-T在37℃有更快的起始反应率以及在60℃有更高的反应活性。

实施例42:OPS巯解酶的热稳定性

对Ape-OPSS和Msm-T进行热稳定性分析。将各个酶在OPS培养液中稀释成2mg/mL的浓度，并37℃和60℃热处理10、30、60、120和240min，接着在5mM OPS、10mM Na₂S、0.2mM PLP和100mM HEPES(pH 7.4)的条件下，于37℃反应30min。对于这一反应，使用10μg/mL Ape-OPSS和50μg/mL Msm-T。用Gaitonde法测定生产的半胱氨酸的量。观察到尽管于60℃处理Ape-OPSS 4小时，仍能维持它完整的活性，而Msm-T在37℃能维持活性，但在60℃下处理30min时活性下降50％。结果示于下表31中。

表31

当Msm-T的施用量为在OPS培养液中实际使用浓度50μg/mL时，在37℃下进行酶活性的保留测试。在无Na₂S的条件下，将50mM OPS培养液与0.2mM PLP和50μg/mL Msm-T一起在37℃下处理0.5、1、2、4、和6小时，之后，加入Na₂S诱导酶反应。反应30min后，测定Msm-T的活性。用Gaitonde法测定生产的半胱氨酸的量。结果，在OPS培养液中于37℃下反应2小时后，Msm-T的活性降至低于50％(表32)。

表32

实施例43:pH对OPS巯解酶的影响

测定Ape-OPSS和Msm-T根据pH值的半胱氨酸转化率。在100mM缓冲液中，将每个浓度为50μg/mL的Ape-OPSS和Msm-T在37℃下反应10min。为此，使用pH值为6.4/7.0/7.4/8.0的K-磷酸缓冲液、pH值为7.0/7.4/8.0/8.5/8.8的Tris-HCl缓冲液和pH值为8.0/8.5/9.0/10.0碳酸钠缓冲液。用Gaitonde法定量分析生产的半胱氨酸的量。如从图3中可以看出，Msm-T在8.0～9.0的pH值条件下活性最高，与缓冲液无关。在K-磷酸缓冲液(pH 7.4)中检测到Ape-OPSS的最高活性，而且不同缓冲液的最佳pH值彼此不同。

实施例44:离子对OPS巯解酶活性的影响

按如下方法测试离子对OPS巯解酶活性的影响。在含有5mMOPS、10mM Na₂S、0.2mM PLP和100mM HEPES(pH 7.4)的反应混合物中，在(NH₄)₂SO₄(1、3、5、10、20g/L)、KH₂PO₄(0.5、1、2、4、8g/L)或NH₄Cl(0.2、0.5、1、2g/L)存在下，该酶在37℃下反应30min。Ape-OPSS和Msm-T使用的浓度分别为10μg/mL和50μg/mL。用Gaitonde法测定生产的半胱氨酸的量。

从表33中可以看出，当加入(NH₄)₂SO₄或KH₂PO₄到反应混合物中，没有检测到半胱氨酸转化率的改变。另一方面，从表33中可以看出，半胱氨酸转化率随着NH₄Cl浓度的增加而降低。特别地，当加入2g/L NH₄Cl时，酶的最大活性降低超过了70％。因此，观察到NH₄Cl对OPS巯解酶的转化活性具有负面的作用。

表33

实施例45：硫源对OPS巯解酶的半胱氨酸合成活性的影响

开展试验测试了硫源对各个酶的半胱氨酸合成活性的影响。在含有5mM OPS、0.2mM PLP和100mM HEPES的反应混合物中，在10mM Na₂S、NaSH或Na₂S₂O₃的存在下，每个酶在37℃下反应1小时。用Gaitonde法测定生产的半胱氨酸的量。观察到Ape-OPSS偏好Na₂S₂O₃作为硫源，而Msm-T偏好Na₂S。结果概述于下表34中。

表34

实施例46：携带OPS巯解酶的表达载体(pCL-Pcj1系统)的构建和在大肠杆菌中表达

以pET28a-Msm-T载体为模板，用引物SEQ ID NOS:123和124进行PCR反应。用EcoRV和HindIII处理所获得的PCR产物，并克隆到pCL-P(CJ1)中构建成名为pCL-P(CJ1)-Msm-T的重组载体。为了测试pET系统和pCL-Pcj1系统的Msm-T表达水平的差异，制备用于表达酶的菌株。将pET系统导入到Rosetta(DE3)中，而pCL-Pcj1系统使用K12G菌株。将LB平板中获取的单克隆接种到5mL LB培养液中，37℃、200rpm振荡培养16小时。将这些培养物转接到25ml的含有卡那霉素或壮观霉素以及0.2％葡萄糖的新鲜LB培养液中(于250mL烧瓶中)，培养至OD₆₀₀为0.5～0.6，之后，迅速向培养基中加入1mM IPTG诱导酶的表达。在37℃、200rpm的振荡培养过程中，在不同培养时间(8、16、24小时)测定酶的表达水平。在14％的SDS-PAGE上分析两个系统的酶表达水平(图4)。

实施例47:用纯化的OPS发酵培养液通过OPS巯解酶合成半胱氨酸

测定Msm-T和Ape-OPSS的将OPS转化成半胱氨酸的转化率。在存在75μg/mL的每个酶和0.2mM PLP的条件下，将60mM从OPS发酵培养液中纯化的OPS与120mM Na₂S在37℃或70℃下反应30、60、90和120min。Msm-T仅在37℃下进行反应，但Ape-OPSS在37℃和70℃都进行反应。用Gaitonde法测定生产的半胱氨酸的量。从图5中可以看出，纯化的OPS发酵培养液能很好地作为底物用于酶转化成半胱氨酸。特别地，即使使用纯化的OPS发酵培养液，Ape-OPSS的转化率在70℃也增加。

实施例48:用OPS发酵培养液通过OPS巯解酶合成半胱氨酸

当OPS发酵培养液用作底物，根据酶的浓度测定Msm-T和Ape-OPSS的半胱氨酸转化率。在存在100mM Na₂S和0.2mM PLP的条件下，将50mM OPS发酵培养液与5μg/mL或50μg/mL各自的Msm-T和Ape-OPSS在37℃下反应。用Gaitonde法测定生产的半胱氨酸的量。从图6中可以看出，在50μg/mL Msm-T中检测到最高的转化率。此外，对于使用OPS发酵培养液作为底物，Msm-T的活性高于Ape-OPSS。

实施例49:根据OPS浓度的半胱氨酸转化率

为了测试OPS浓度对Msm-T转化率的影响，将设定量的纯化的OPS加入到发酵培养液中诱导转化反应。酶的使用量为50μg。用Gaitonde法测定反应液中半胱氨酸的量。当OPS的浓度约为30g/L时，Msm-T的转化率高达100％。

当OPS的浓度超过50g/L时，发现转化率和转化百分比降低。从这些结果中可知，当OPS发酵培养液用作底物时，OPS和酶之间有最佳的浓度比。

表35 半胱氨酸转化率(Msm-T 50ug)

时间	0min	10min	30min	60min	120min	180min
							测定的OPS 10.65g/l	0	23.03	65.38	65.70	61.95	55.35
测定的OPS 36.09g/l	0	1.15	10.23	28.07	97.84	100.34
							测定的OPS 55.6g/l	0	0	2.36	7.41	42.69	66.67

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Claims

1.生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括：

1)培养其中内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)活性降低的重组微生物，以生产O-磷酸丝氨酸(OPS)；以及

2)在O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物存在下，使步骤1)的OPS和硫化物进行反应，以生产半胱氨酸或其衍生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述磷酸丝氨酸磷酸酶具有SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中通过选自下组的方法降低酶活性：缺失编码该酶的染色体基因、向染色体基因中引入突变以降低内源基因活性、用突变基因取代染色体基因以降低内源酶活性、向基因的调控区引入突变以降低内源基因活性，以及引入与基因转录本互补的反义寡核苷酸以抑制mRNA的翻译。

4.根据权利要求3所述的方法，其中内源SerB活性被降低的重组微生物培养于含有甘氨酸或丝氨酸的培养基中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中培养基所含的甘氨酸的量为0.1～10g/L。

6.根据权利要求4所述的方法，其中培养基中所含的丝氨酸的量为0.1～5g/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)的活性。

8.根据权利要求7所述的方法，其中SerA为野生型或抗丝氨酸反馈抑制的突变体。

9.根据权利要求7所述的方法，其中：

i)SerA具有选自SEQ ID NOS:3～7的一种氨基酸序列；以及

ii)SerC具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低PhnCDE(phnC(磷酸酯转运蛋白EG 10713的ATP结合组分)-phnD(Pn转运蛋白EG 10714的周质结合组分)-phnE(烷基磷酸酯ABC转运蛋白EG 11283的整体膜组分))。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低碱性磷酸酶(PhoA)或酸性磷酸酶(AphA)的活性。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加核苷酸转氢酶(PntAB)的活性。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加失少一种选自下组酶的活性：O-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排透性酶(YfiK)、高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白(RhtB)，以及苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白(RhtC)。

14.根据权利要求7、12或13所述的方法，其中通过选自下述的方法增加酶活性水平：增加编码酶的基因的拷贝数、向基因调控区引入突变以增加酶活性、用突变基因取代染色体基因以增加酶活性，以及向染色体基因引入突变以增加酶活性。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低至少一种选自下组的酶的活性：磷酸甘油酸变位酶同工酶(GpmA、GpmI或GpmB)。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低L-丝氨酸脱水酶I(SdaA)的活性。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低2-氨基-3-酮丁酸辅酶A连接酶(Kbl)或转录因子(IclR)的活性。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加至少一种选自下组的酶的活性：乙酰基-CoA合成酶(Acs)、乙酸激酶(AckA)-磷酸转乙酰基酶(Pta)、苹果酸合成酶G(GlcB)、苹果酸脱氢酶(MaeB)、谷氨酸脱氢酶(GdhA)、乙醛酸醛连接酶(Glc)、羟丙二酸半醛还原酶2(GlxR)和甘油酸激酶II(GlxK)。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述重组微生物通过增加至少一种选自下组的酶的活性而在糖消耗和生长方面得到改善：Glc、GlxR以及GlxK。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物为埃希氏菌属(Escherichia sp.)或棒状杆菌(Coryneform bacteria)。

21.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)的硫化物选自下组：Na₂S、NaSH、(NH₄)₂S、H₂S、Na₂S₂O₃和其组合。

22.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中使用的硫化物的摩尔浓度为酶转化中所用OPS的0.1～3倍。

23.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)的OPSS源自至少一种选自下述的菌种：超嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)。

24.根据权利要求23所述的方法，其中OPSS被进一步改性，以增加步骤2)的转化率。

25.根据权利要求1所述的方法，其中在选自0.001～2mM PLP(吡哆醛-5-磷酸酯)、0.001～100mM DTT(二硫苏糖醇)和其组合的辅助因子的存在下，进行步骤2)的转化。

26.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括纯化分离和纯化半胱氨酸或其衍生物。

27.重组微生物，其内源SerB的活性被降低。

28.根据权利要求27所述的重组微生物，其被进一步改性，以增加SerA或SerC的活性，其中所述SerA抗丝氨酸的反馈抑制。

29.根据权利要求27所述的重组微生物，其被进一步改性，以降低PhnCDE、PhoA和AphA中至少一种的活性。

30.根据权利要求27所述的重组微生物，其保藏号为KCCM11103P。