ES2711830T3 - Microorganismo que produce O-fosfoserina y método de producción de L-cisteína o derivados de la misma a partir de O-fosfoserina usando el mismo - Google Patents

Abstract

Un método para producir cisteína, que comprende: 1) cultivar un microorganismo recombinante en que la actividad de fosfoserina fosfatasa SerB endógena está reducida, para producir O-fosfoserina (OPS); y 2) hacer reaccionar la OPS de la etapa 1) con un sulfuro en presencia de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) o con un sulfuro en presencia de un microorganismo que expresa OPSS, para producir cisteína, en el que el nivel de actividad enzimática de SerB se reduce usando una técnica seleccionado entre el grupo que consiste en: eliminación del gen cromosómico que codifica la enzima SerB, la introducción de mutación en el gen cromosómico que codifica la enzima SerB para reducir la actividad génica endógena, la sustitución del gen cromosómico que codifica la enzima SerB con un gen mutado para reducir la actividad enzimática endógena, la introducción de mutación en una región reguladora para el gen que codifica la enzima SerB para reducir la actividad génica endógena, y la introducción de un oligonucleótido de antisentido complementario a un transcrito del gen que codifica la enzima SerB para inhibir la traducción del ARNm.

Description

DESCRIPCION

Microorganismo que produce O-fosfoserina y metodo de produccion de L-cistefna o derivados de la misma a partir de O-fosfoserina usando el mismo

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de cistefna o sus derivados N-acetilcistefna o S-carboximetilcistefna usando O-fosfoserina como intermedio y a microorganismo recombinante para su uso en la produccion de O-fosfoserina.

Antecedentes de la tecnica

La L-cistefna es un aminoacido que desempena una funcion importante en el metabolismo del azufre en todos los organismos vivos. Se usa en la biosfntesis de protefnas, tales como queratina del pelo, glutation, biotina, metionina y otros metabolitos que contienen azufre, y tambien sirve como precursor de coenzima A. Ademas, se sabe que la biosfntesis de cistefna esta muy asociada con la biosfntesis de otros aminoacidos incluyendo L-serina, L-glicina y L-metionina. Industrialmente, la L-cistefna y sus derivados encuentran aplicaciones en una diversidad de campos incluyendo la industria farmaceutica (para el tratamiento de enfermedades bronquiales), la industria cosmetica (en champus para el cabello, composiciones para rizos permanentes) y para la industria alimentaria (antioxidantes, potenciadores del aroma, auxiliares de masa, etc.).

La L-cistefna se obtuvo una vez de forma industrial por hidrolisis acida de pelos humanos o plumas de animal (Biotechnology of the Amino Acids Production editado por Ko Aida, pag. 217-223, 1986). Sin embargo, no solamente la produccion de cistefna a partir de pelos o plumas asegura un rendimiento tan bajo como de un 7~8 %, sino que tambien el uso de acido clorhfdrico o acido sulfurico produce un monton de residuos que provocan contaminacion ambiental. Ademas, la extraccion de pelos o plumas puede inducir al usuario a tener una fuerte aversion a ello. Estos problemas han causado un empuje del desarrollo de procesos de produccion respetuosos con el medio ambiente de L-cistefna. La ruta actual principal implica la fermentacion utilizando microorganismos.

Es representativo entre la produccion microbiana de L-cistefna 1) la conversion biologica de D, L-ATC usando un microorganismo (Ryu OH, Ju JY y Shin CS, Process Biochem., 32:201-209, 1997). Este proceso de conversion, sin embargo, es diffcil de aplicar industrialmente debido a la baja solubilidad del precursor D, L-ATC. 2) Otro metodo de produccion de L-cistefna es la fermentacion directa usando E. coli (patente n.° EP0885962B; Wada M y Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). La acumulacion excesiva de L-cistefna en los microorganismos conlleva toxicidad intracelular, lo que muestra una limitacion en la produccion de L-cistefna a una alta concentracion. Para superar este inconveniente, se emplean protefnas de exportacion de L-cistefna, pero no ha habido mejoras significativas en la productividad.

Con referencia a la ruta de biosfntesis de L-cistefna en microorganismos y plantas, la O-acetil-serina (OAS) actua como precursor intermedio que proporciona la cadena principal de carbono de L-cistefna (Kredich NM y Tomkins ^{GM, J. Biol. Chem., 241: 4955-4965, 1966). La enzima O-acetilserina sulfhidrilasa} (OaSs), ^{usando sulfuro de} hidrogeno como donador de azufre, cataliza la conversion de O-acetilserina en cistefna. Como alternativa, puede reducirse SO⁴ en tiosulfato para su uso como donador de azufre en la produccion de cistefna (Nakamura T, Kon Y, Iwahashi H y Eguchi Y, J. Bacteriol., 156: 656-662, 1983). Por lo tanto, puede producirse cistefna usando microorganismos que acumulan OAS y OASS usando diversos donadores de azufre (documento US6579705). La ruta de biosfntesis de cistefna mediante OAS usa las dos enzimas de serina acetiltransferasa (CysE), que cataliza la ^{conversion de OAS a partir de serina, y cistefna sintasa (CysK), que cataliza la conversion de} oAs ^{en cistefna. Entre} ellas, la serina acetiltransferasa (CysE) es muy sensible a la inhibicion por retroalimentacion por el producto final cistefna (Wada M y Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006).

Divulgacion

[Problema tecnico]

Dando lugar a la presente invencion, los autores de la presente invencion descubrieron la existencia de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) en Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, y Trichomonas vaginalis que toma una ruta especffica de O-fosfo-L-serina (OPS), en lugar de la ruta especffica de OAS, para sintetizar L-cistefna mediante investigacion intensiva (Mino K y Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW y Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC y Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006) y que la OPSS de M. tuberculosis, puede usar Na²S como donador de azufre en la conversion de OPS en cistefna incluso en ausencia de enzimas adicionales cuando se retiran cinco restos de aminoacido del extremo C de la misma (Argen D, Schnell R y Schneider G, FEBS Letters, 583: 330-336, 2009). En la presente invencion, se muta un microorganismo para que acumule OPS en el mismo, despues de la incubacion para convertir OPS en cistefna en presencia de la enzima OPSS. No se ha descrito anteriormente nada de este metodo.

[Solucion tecnica]

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo para producir cistefna o un derivado de la misma, es decir, N-acetilcistefna o S-carboximetilcistefna.

Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un microorganismo recombinante para la produccion de O-fosfoserina.

[Efectos ventajosos]

El metodo de la presente invencion en que se produce O-fosfoserina a alto rendimiento mediante un microorganismo recombinante y se usa para la conversion en cistefna, tal como esta, es mas respetuoso con el medio ambiente y asegura mayor eficacia en la produccion de cistefna que los metodos de sfntesis qufmica. La cistefna y sus derivados producidos por la fermentacion y bioconversion de la presente invencion pueden usarse ampliamente en la produccion de alimentos y aditivos alimenticios para animales y seres humanos.

Descripcion de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama esquematico que muestra la acumulacion de O-fosfoserina por fermentacion microbiana y la conversion enzimatica de la O-fosfoserina acumulada en L-cistefna.

La FIG. 2 es un grafico que muestra la actividad de OPS sulfhidrilasa de acuerdo con las temperaturas.

La FIG. 3 es un conjunto de graficos que muestra la sensibilidad al pH de la OPS sulfhidrilasa.

La FIG. 4 es una fotograffa que muestra el nivel de expresion de Msm-T en un sistema pET y un sistema pCL-Pcjl analizado por SDS PAGE.

La FIG. 5 es un grafico que muestra la actividad enzimatica de OPS sulfhidrilasa para convertir el caldo de fermentacion de OPS purificado en cistefna.

La FIG. 6 es un grafico que muestras la actividad enzimatica de OPS sulfhidrilasa para convertir el caldo de fermentacion de OPS en cistefna.

Mejor modo

Como se usa en este documento, la expresion "conversion de cistefna" pretende referirse a la reaccion catalftica de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) que provoca la conversion del sustrato O-fosfoserina (OPS) en el producto cistefna, es decir, se refiere a la reaccion catalftica de conversion de OPS en cistefna.

Como se usa en este documento, la expresion "tasa de conversion de cistefna" se refiere al porcentaje de la cantidad del producto cistefna respecto a la cantidad de material de partida OPS. En condiciones de reaccion optimas, se convierte 1 mol de OPS en 1 mol de cistefna. Por ejemplo, si se convierten 100 moles de OPS en 100 moles de cistefna, la tasa de conversion de cistefna es del 100 %.

De acuerdo con un aspecto de la misma, la presente invencion proporciona un metodo para producir cistefna, que comprende:

1) cultivar un microorganismo recombinante que esta modificado para tener una actividad fosfoserina fosfatasa (SerB) endogena para producir O-fosfoserina (OPS); y 2) hacer reaccionar la OPS de la etapa 1) con un sulfuro en presencia de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) o con un sulfuro en presencia de un microorganismo que expresa OPSS, para producir cistefna,

en el que el nivel de actividad enzimatica SerB se reduce usando una tecnica seleccionada del grupo que consiste en eliminacion del gen cromosomico que codifica la enzima SerB, la introduccion de mutacion en el gen cromosomico que codifica la enzima SerB para reducir la actividad genica endogena, la sustitucion del gen cromosomico que codifica la enzima SerB con un gen mutado para reducir la actividad enzimatica endogena, la introduccion de mutacion en una region reguladora para el gen que codifica la enzima SerB para reducir la actividad genica endogena y la introduccion de un oligonucleotido de antisentido complementario a un transcrito del gen que codifica la enzima SerB para inhibir la traduccion del ARNm.

Ademas, en otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para producir un derivado de cistefna N-acetilcistefna o S-carboximetilcistefna, que comprende:

1) cultivar un microorganismo recombinante en que se reduce la actividad de fosfoserina fosfatasa (SerB) endogena, para producir O-fosfoserina (OPS);

2) hacer reaccionar la OPS de la etapa 1) con un sulfuro en presencia de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) o con un sulfuro en presencia de un microorganismo que expresa OPSS, para producir cistefna, y

3) sintetizar el derivado de cistefna N-acetilcistefna o S-carboximetilcistefna. a partir de la cistefna producida en la etapa 2), en el que el nivel de actividad enzimatica SerB se reduce usando una tecnica seleccionada del grupo que consiste en eliminacion del gen cromosomico que codifica la enzima SerB, la introduccion de mutacion en el gen cromosomico que codifica la enzima SerB para reducir la actividad genica endogena, la sustitucion del gen cromosomico que codifica la enzima SerB con un gen mutado para reducir la actividad enzimatica endogena, la introduccion de mutacion en una region reguladora para el gen que codifica la enzima SerB para reducir la actividad genica endogena y la introduccion de un oligonucleotido de antisentido complementario a un transcrito del gen que codifica la enzima SerB para inhibir la traduccion del ARNm.

En el metodo, la etapa 1) se refiere a cultivar un microorganismo recombinante que tiene la actividad de fosfoserina fosfatasa (SerB) endogena reducida.

La SerB es una protefna que tiene la actividad de hidrolizar OPS en L-serina. Por tanto, un microorganismo que tenga actividad SerB endogena reducida se caracteriza por la acumulacion de OPS en el mismo. La SerB no se limita a ello, puede comprender cualquier secuencia de aminoacidos, que muestre actividad SerB, y puede tener preferiblemente la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 2. Sin embargo, siempre que muestre actividad SerB, se usa cualquier secuencia de aminoacidos, que tiene preferiblemente una homologfa de un 90 % o mayor, mas preferiblemente un 96 % o mayor, mucho mas preferiblemente un 98 % o mayor y lo mas preferiblemente un 99 % o mayor con la de la SEQ ID NO: 1 o 2. La actividad SerB reducida significa una disminucion en la actividad SerB, en comparacion con la de una cepa modificada previamente y abarca la alteracion de SerB. Se conocen bien en la tecnica diversas tecnicas para la reduccion de la actividad SerB. Ejemplos ilustrativos incluyen la eliminacion de una serB cromosomica, la introduccion de mutacion en serB cromosomico para reducir la actividad SerB endogena, la introduccion de mutacion en una region reguladora para serB para reducir la actividad SerB endogena, la sustitucion del serB cromosomico con un gen mutado para reducir la actividad SerB endogena y la introduccion de un oligonucleotido de antisentido complementario a un transcrito del serB para inhibir la traduccion del ARNm, pero los metodos para reducir la actividad SerB no se limitan a estos. Estas tecnicas pueden aplicarse a la reduccion de la actividad de otras enzimas en la presente invencion.

La alteracion de SerB endogena provoca la introduccion de auxotrofia de serina en el microorganismo recombinante de modo que el medio debe complementarse con glicina o serina. La glicina puede proporcionarse en forma de glicina purificada, un extracto de levadura que contiene glicina o triptona. La glicina esta contenida a una concentracion de 0,1 a 10 g/l, y preferiblemente a una concentracion de 0,5 a 3 g/l. En cuanto a la serina, puede proporcionarse en forma de serina purificada, un extracto de levadura que contiene serina o triptona. Su concentracion en el medio de cultivo varfa de 0,1 a 5 g/l, y preferiblemente de 0,1 a 1 g/l.

Como se divulga en este documento, cuando se cultiva en un medio que contiene glicina o serina, Corynebacterium glutamicum mutante o E. coli en que se ha alterado la actividad de SerB endogena se encontraba que producfa una mayor cantidad de OPS, en comparacion con el tipo silvestre (veanse la tablas 2, 3, 6 y 7).

Ademas, el microorganismo recombinante de la presente invencion puede tener actividad fosfoglicerato deshidrogenasa (SerA) o fosfoserina aminotransferasa (SerC) potenciada. La SerA es una protefna que tiene la actividad de convertir 3-fosfoglicerato en 3-fosfohidroxipiruvato. La SerA puede tener aminoacidos de tipo silvestre o una secuencia de aminoacidos mutante que muestra resistencia a inhibicion por retroalimentacion por serina, pero no se limita a estas. Preferiblemente, la SerA puede tener una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 3 a 7. Siempre que muestre actividad SerA de tipo silvestre o la actividad SerA mutante resistente a inhibicion por retroalimentacion de serina, puede usarse cualquier secuencias de aminoacidos, aunque comparte preferiblemente una homologfa de un 90 % o mayor, mas preferiblemente un 96 % o mayor, mucho mas preferiblemente un 98 % o mayor y lo mas preferiblemente un 99 % o mayor con la de una de las SEQ ID NO: 3 a 7. Una "SerA mutante resistente a inhibicion por retroalimentacion" significa el mutante que muestra una actividad SerA mantenida o potenciada independientemente de la inhibicion por retroalimentacion por serina o glicina. Los mutantes resistentes a retroalimentacion son bien conocidos en la tecnica (Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276: 17844-17850, 2001; Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 437-441, 2002; documento EP0943687B). En una realizacion de la presente invencion, cuando se introducfa un serA resistente a retroalimentacion en la misma, se encontro que Corynebacterium glutamicum o E. coli que tienen una serB alterada producfa una cantidad mayor de OPS, en comparacion con el tipo silvestre (veanse las tablas 4 y 9).

La SerC es una protefna que tiene la actividad de convertir 3-fosfohidroxipiruvato en O-fosfoserina. La SerC no se limita a ello, puede comprender las secuencias que muestran actividad SerC y puede tener preferiblemente la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8. Sin embargo, siempre que muestre actividad SerC, puede emplearse cualquier secuencia de aminoacidos, pero debe compartir preferiblemente una homologfa de un 90 % o mayor, mas preferiblemente un 96 % o mayor, mucho mas preferiblemente un 98 % o mayor y lo mas preferentemente un 99 % o mayor con la de la SEQ ID NO: 8. Ademas, puede introducirse una mutacion en el serC de modo que la actividad enzimatica pueda aumentarse. En una realizacion de la presente invencion, cuando un serC se introducfa adicionalmente en la misma, se encontro que Corynebacterium glutamicum o E. coli que tienen un serB y un serA resistente a retroalimentacion producfa una cantidad mayor de OPS, en comparacion con el tipo silvestre (vease la tabla 9).

Ademas, la capacidad del microorganismo recombinante de la presente invencion de realizar la captacion intracelular o la degradacion de O-fosfoserina puede disminuirse. En detalle, el microorganismo recombinante puede modificarse para reducir la actividad del transportador ABC de alquilfosfonato PhnC/PhnD/PhnE (operon PhnCDE, es decir, componente de union a ATP del transporte de fosfonato (PhnC; EG 10713)-componente de protema de union periplasmica del transportador Pn (PhnD; EG 10714)-componente de membrana integral del transportador ABC de alquilfosfonato (PhnE; EG 11283)), fosfatasa alcalina (PhoA) o fosfatasa acida (AphA).

En una realizacion de la presente invencion, se observo que la eliminacion adicional del operon phnCDE del mutante recombinante daba lugar a un aumento en la produccion de OPS (tabla 10). En el microorganismo recombinante que tema alterado ademas la actividad PhoA o AphA, la degradacion de OPS comenzaba a disminuir en el tiempo cuando se disminrna la concentracion de acido fosforico en el medio de cultivo (tabla 12). Ademas, la introduccion de serA o serC resistentes a retroalimentacion aumentaba la produccion de OPS (tablas 14 a 16).

Ademas, el microorganismo recombinante de la presente invencion puede caracterizarse ademas por la potenciacion de la actividad transhidrogenasa de nucleotido de pirimidina (PntAB; EC 1.6.1.1). Como se describe previamente (Sauer U P et al., J Biol Chem. 20; 279(8):6613-9. Epub 2003), PntAB participa en el metabolismo de NADPH para regular el equilibrio de oxidorreduccion intracelular. En una realizacion de la presente invencion, el microorganismo recombinante en que la actividad PntAB se potencio adicionalmente por sobreexpresion de pntAB, se encontro que aumentaba la produccion de OPS (tabla 17).

Ademas, el microorganismo recombinante de la presente invencion puede caracterizarse por la potenciacion de la permeasa del flujo de O-acetilserina/cistema (YfiK), protema de flujo de homoserina/homoserina lactona (RhtB; EG 11469) o protema de flujo de treonina/homoserina lactona (RhtC; EG11468). La YfiK se conoce como un exportador para exportar cistema y OAS de forma extracelular (Franke I et al., J. Bacteriology, 185: 1161-1166, 2003) y se informa de que RhtB actua como exportador extracelular de homoserina/homoserina lactona, un precursor de treonina. Ademas, la RhtC se conoce como un exportador de treonina y homoserina. La potenciacion de la actividad de YfiK, RhtC y RhtB mostro un aumento en el crecimiento y produccion de OPS de la cepa de acumulacion de OPS (tabla 18).

La potenciacion de la actividad enzimatica puede conseguirse usando diversos metodos bien conocidos incluyendo, aunque sin limitacion, aumento del numero de copias de un gen que codifica una enzima de interes, introduccion de una mutacion en una region reguladora para el gen para potenciar la actividad enzimatica, sustitucion del gen cromosomico con un gen mutado para potenciar la actividad enzimatica e introduccion de una mutacion en el gen cromosomico para potenciar la actividad enzimatica.

Ademas, el microorganismo recombinante de la presente invencion se caracteriza ademas por la actividad reducida de fosfoglicerato mutasa. La fosfoglicerato mutasa existe como tres isoenzimas: Gpml, GpmA y GpmB y es responsable de la conversion de 3-fosfoglicerato en 2-fosfoglicerato en el proceso de glucolisis. Para el uso de 3-fosfoglicerato como sustrato, estas enzimas compiten con SerA, que cataliza la smtesis de 3-fosfohidroxipiruvato. Por lo tanto, se observo que la disminucion de la actividad de cada una de las enzimas causaba una abundancia de 3-fosfoglicerato, un precursor de OPS, que provoca la produccion de un nivel aumentado de OPS (tabla 19).

En el microorganismo recombinante de la presente invencion, tambien puede reducirse la L-serina deshidratasa I (SdaA; EC 4.3.1.17) o 2-amino-3-cetobutirato coenzima A ligasa (Kbl). Por tanto, el microorganismo recombinante se caracteriza por la produccion de OPS mantenida o aumentada incluso cuando se cultiva en un medio que contiene una baja concentracion de glicina o serina (tabla 20).

Ademas, el microorganismo recombinante de la presente invencion puede caracterizarse ademas por la actividad reducida de IclR. IclR es un factor de transcripcion que funciona reprimiendo la expresion de aceBAK, un operon de derivacion de glioxilato (L Gui et al., J. Bacteriol., vol. 178, N.° 1, 321-324, 1996). Cuando se eliminaba, se observaba que la produccion de OPS aumentaba (tabla 21).

Ademas, el microorganismo recombinante de la presente invencion puede caracterizarse ademas por la potenciacion de una actividad enzimatica seleccionada del grupo que consiste en i) acetil-CoA sintetasa (Acs), ii) acido acetico cinasa (AckA)-fosfotransacetilasa (Pta), iii) malato sintasa G (GlcB), iv) malato deshidrogenasa (MaeB), v) glutamato deshidrogenasa (GdhA), vi) glioxilato carboligasa (Glc), vii) tartronato semialdehndo reductasa 2 (GlxR), viii) glicerato cinasa II (GlxK) y una combinacion de las mismas.

En una realizacion concreta de la presente invencion, cuando i) Acs (EC N.° 6.2.1.1; J Bacteriol. mayo de 1995; 177(10):2878-86) o monomero de piruvato oxidasa (PoxB; EC 1.2.2.2) o ii) AckA y Pta (EC 2,3,1,8), todas con el objetivo de reutilizar de forma eficaz el acetato acumulado con el consumo concomitante de NADH producido, se potenciaban adicionalmente, se encontro que el microorganismo recombinante de la presente invencion aumentaba la produccion de OPS (tabla 22). Al funcionar catalizando la smtesis de malato a partir de glioxalato y la conversion de malato en piruvato, iii) GlcB (EC N.° 2.3.3.9) y iv) MaeB (EC 1.1.137) pueden debilitar el ciclo de t Ca y, por tanto, usarse para aumentar el consumo de glucosa y la produccion de O-fosfoserina (tabla 23). De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, la potenciacion de v) GdhA; (EC 1.4.1.2), que cataliza la smtesis de glutamato, un sustrato de SerC, a partir de 2-oxoglutarato y NADPH, otorga un potencial mucho mayor para la produccion de OPS en el microorganismo (tabla 17). Todos de vi) Glc(EC 4.1.1.47), vii) GlxR(EC 1.1.1.60) y viii) GlxK(EC 2.7.1.31) se conocen por convertir glucoxilato en 3-fosfoglicerato, es decir, aumentar el nivel del sustrato de fosfoglicerato deshidrogenasa (Kim HJ et al., J. Bacteriol., 186(11), 3453-3460, 2004; Eva Cusa et al., J. Bacteriol., 181(24), 7479­ 7484, 1999; Chnag YY et al., J. Biol. Chem. 268(6): 3911-3919, 1993). El microorganismo recombinante de la presente invencion, cuando se potenciaba adicionalmente en la actividad de Glc, GlxR y GlxK, estaba mejorado en el consumo de azucar y el crecimiento (tabla 24).

El microorganismo recombinante de la presente invencion se refiere a cualquier microorganismo en que haya la reduccion de actividad SerB, produciendo de este modo OPS a un nivel elevado. Si se satisface esta condicion, cualquier microorganismo, sea procariota o eucariota, esta dentro del alcance de la presente invencion. Son representativos entre ellos las enterobacterias o bacterias corineformes. Ejemplos de los microorganismos utiles en la presente invencion incluyen Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. y Brevibacterium sp. Son preferibles Escherichia sp. y Corynebacterium sp, con mas preferencia dada para Escherichia sp. y con la maxima preferencia dada para E. coli.

En una realizacion, la cepa recombinante que puede producir OPS se llamo E. coli CA07-0012, y se deposito en el Korean Culture Center of Microorganisms, ubicado en 361-221, Hongje 1, Seodaemun, Seul, Corea, el 12 de octubre de 2011 con el numero de acceso KCCM11212P.

Ademas, en una realizacion, la cepa recombinante que puede producir OPS se llamo E. coli CA07-0022/pCL-prmfserA*(G336V)-serC, y se deposito en el Korean Culture Center of Microorganisms, ubicado en 361-221, Hongje 1, Seodaemun, Seul, Corea, el 28 de septiembre de 2010 con el numero de acceso KCCM11103P. En este documento, el termino "CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC" se usa indistintamente con CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC.

Despues de cultivar la cepa durante 80 horas en un fermentador de 1 l, se produjo O-fosfoserina a una concentracion de 19,5 g/l (ejemplo 35).

Como se usa en este documento, el termino "cultivar" pretende indicar el cultivo de microorganismos en condiciones controladas de forma artificial. Un procedimiento de cultivo puede realizarse usando un medio adecuado y condiciones de cultivo bien conocidas en la tecnica. Los expertos en la materia pueden controlar facilmente el procedimiento de cultivo para que corresponda a las cepas empleadas. Por ejemplo, puede realizarse en un tipo discontinuo, en un tipo continuo o en un tipo semicontinuo, pero no se limita a ellos.

Ademas, el medio de cultivo contiene una fuente de carbono. Ejemplos de la fuente de carbono incluyen sacaridos y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidon y celulosa, aceites y grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco, acidos grasos tales como acido palmftico, acido estearico y acido linoleico, alcoholes tales como glicerol y etanol, y acidos organicos tales como acido acetico. Estas fuentes de carbono pueden estar presentes en solitario o en combinacion en el medio de cultivo. Como fuente de nitrogeno, un material organico tal como peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, destilado del macerado del mafz, soja y protefna de trigo, o un compuesto de nitrogeno inorganico tal como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio puede estar contenido en el medio de cultivo. Estas fuentes de nitrogeno pueden usarse en solitario o en combinacion. El medio puede contener dihidrogenofosfato de potasio, fosfato de potasio o sales de sodio correspondientes como fuentes de fosforo. El medio puede contener sales metalicas tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. El medio de cultivo tambien puede contener aminoacidos, vitaminas y precursores adecuados. Los nutrientes pueden anadirse de una manera discontinua o de una manera continua al medio.

Un compuesto tal como hidroxido de amonio, hidroxido de potasio, amoniaco, acido fosforico y acido sulfurico puede anadirse de una manera adecuada al medio de cultivo durante el cultivo para ajustar el pH del cultivo. Ademas, durante el cultivo, se usa un agente desespumante tal como ester de poliglicol de acido graso para suprimir la formacion de espuma. Ademas, para mantener el medio de cultivo en una condicion aerobica, puede inyectarse oxfgeno o gas que contiene oxfgeno al menos de cultivo. Para una condicion anaerobica o microaerobica, se proporciona nitrogeno, hidrogeno o dioxido de carbono sin aireacion. El medio de cultivo puede mantenerse tfpicamente a una temperatura de 27 °C a 37 °C y preferiblemente de una temperatura de 30 °C a 35 °C. En cuanto al periodo de cultivo, puede mantenerse hasta que el producto de interes se obtiene en una cantidad deseada, y preferiblemente varfa de 10 a 100 horas.

Para la recogida y recuperacion adicional de la OPS producida durante la etapa de cultivo del medio de cultivo, puede seleccionarse un metodo adecuado bien conocido en la tecnica dependiendo del tipo de cultivo, que es cultivo discontinuo, continuo o semicontinuo.

En el metodo de la presente invencion, la etapa 2) aborda la reaccion de la OPS de la etapa 1) con un sulfuro en presencia de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) o un microorganismo que expresa OPSS, para inducir la conversion de O-fosfoserina en cistefna o sus derivados.

El sulfuro puede proporcionarse en una forma lfquida o gaseosa, asf como en una forma solida tfpicamente usada en la tecnica, a causa de la diferencia en el pH, presion y/o solubilidad. Siempre que puede convertirse en un grupo tiol (SH), puede usarse cualquier compuesto de azufre tal como sulfuro (S^2-) o tiosulfato (S²O^32-) en la presente invencion. Preferiblemente, puede usarse Na²S, NaSH, H²S, (NH⁴)²S, NaSH y Na²S²O³ , todos los cuales pueden proporcionar un grupo tiol para OPS. En la reaccion, se suministra un grupo tiol a una molecula de OPS para producir una molecula de cistefna o un derivado de la misma. En esta conversion enzimatica, puede anadirse preferiblemente un sulfuro a una concentracion molar de 0,1 a 3 veces y mas preferiblemente de 1 a 2 veces tan alta como la de OPS usada. A la luz de la economfa, se usa mucho mas preferiblemente un sulfuro que proporciona grupo tiol y OPS a una relacion molar de 1:1. En una realizacion de la presente invencion, se uso Na²S como fuente de azufre. Se anadio Na²S a una concentracion molar de 1 a 3 veces tan alta como la de OPS usada en la reaccion de conversion. Preferiblemente, se suministro una concentracion molar dos veces tan alta como la de OPS para convertir de forma eficaz OPS en cistefna (tabla 34).

Como se usa en este documento, la expresion "O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS)" se refiere a una enzima que cataliza la transferencia de un grupo tiol (SH) a OPS (O-fosfoserina) para convertir OPS en cistefna. La enzima se encontro por primera vez en Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, y Trichomonas vaginalis (Mino K y Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE et al., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005).

Como se usa en este documento, el termino "mutante" se refiere a un cultivo o un individuo que muestra una alteracion hereditaria o no hereditaria en el fenotipo. Cuando se usa junto con OPSS, el termino "mutante" pretende indicar una enzima OPSS que esta geneticamente alterada de modo que su actividad puede potenciarse de forma eficaz, en comparacion con el tipo silvestre.

En la presente invencion, la OPSS mutante puede construirse eliminando, sustituyendo o anadiendo una parte de una secuencia nucleotfdica que codifica OPSS. De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, una enzima OPSS con actividad potenciada se preparo eliminando cinco restos de aminoacido del extremo C de la enzima OPSS de Mycobacterium smegmatis.

La OPSS mutante puede obtenerse en E. coli, usada ampliamente para la expresion de enzimas, usando tecnicas de sfntesis genica basadas en optimizacion de codones por la que pueden obtenerse enzimas de interes a alto rendimiento. Como alternativa, pueden usarse metodos de cribado de fuentes de enzimas utiles basados en bioinformatica de cantidades masivas de informacion genetica sobre microorganismos para obtener la OPSS mutante. En una realizacion de la presente invencion, se seleccionaron enzimas OPSS que utilizan OPS como sustrato para sintetizar cistefna de diversos microbios cribando la homologfa de secuencias de aminoacidos. A este respecto, se lisaron sedimentos celulares obtenidos usando un medio y condiciones de cultivo que eran adecuados en la tecnica, seguido de la purificacion del sobrenadante que contenfa la enzima para producir la enzima OPSS (tabla 26).

Ademas, se desarrollo un sistema de expresion de alto rendimiento para obtener la enzima OPSS economicamente. Se conoce bien en la tecnica un vector pET que emplea un promotor T7. Sin embargo, los autores de la presente invencion desarrollaron un sistema de expresion de enzimas, llamado el sistema CJ1 (patente coreana 10-0620092 B1), en lugar de emplear el sistema tfpico. En una realizacion de la presente invencion, los niveles de expresion de OPSS entre un sistema pET que comprende un promotor T7 y el sistema CJ1 que comprende un promotor CJ1 se compararon dadas las mismas condiciones. Como resultado, el sistema CJ1 mostro un nivel de expresion mayor de OPSS que el sistema pET. Ademas, la sobreexpresion de OPSS requerfa una baja temperatura (18 °C) y un largo periodo de tiempo en el sistema pET, pero una alta temperatura (37 °C) y un corto periodo de tiempo en el sistema pCL-pCJ1. Preferiblemente, el sistema pCL-pCJ1 se usa para obtener OPSS (ejemplo 46).

La potenciacion de la actividad enzimatica puede conseguirse usando diversos metodos bien conocidos. Por ejemplo, puede realizarse aumentando el numero de copias de un gen que codifica OPSS, usando un promotor fuerte o introduciendo una mutacion genetica.

La optimizacion de la conversion enzimatica de OPSS puede conseguirse usando diversos metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la optimizacion puede basarse en una comprension completa de las caracterfsticas de OPSS, tales como la temperatura y pH optimos, la inhibicion contra sustratos, concentracion de sustrato, estabilidad termica, etc. Ademas, la optimizacion puede determinarse mediante condiciones optimas para la conversion enzimatica, tal como la concentracion optima de OPSS, los equilibrios optimos de los sustratos usados en terminos de concentraciones, una preferencia por compuestos de azufre que proporcionan SH para la conversion enzimatica, una preferencia por determinados tampones, la influencia de iones generados y cofactores y sus concentraciones optimas.

En una realizacion de la presente invencion, la enzima OPSS obtenida usando el metodo mencionado anteriormente se caracterizo y basandose en las caracterfsticas determinadas, se desarrollo un proceso de conversion enzimatica economicamente beneficioso que tenia una alta tasa de conversion de cistefna a partir de OPS, con la garantfa de estabilidad enzimatica. En el proceso de conversion enzimatica, la temperatura de la reaccion puede establecerse de 37 °C a 80 °C. En detalle, Ape-OPSS (SEQ ID NO: 12), que pertenece a arqueobaterias, muestra actividad enzimatica aumentada a 60 °C en comparacion con 37 °C, y la propia enzima es muy estable al calor, con reactividad optima a 60 °C. Por otro lado, Msm-T (SEQ ID NO: 10) muestra actividad optima a 37 °C y esta exenta de la actividad para tratamiento termico a 60 °C. Se observo que la enzima OPSS tiene actividad enzimatica sobre un intervalo de pH de 6,0 a 10,0. Ape-OPSS mostro actividad optima a pH 7,4. Con la aparicion de actividad optima a un pH de 8,0 a 9,0, Msm-T mostro estabilidad sobre un intervalo de pH mas amplio, en comparacion con Ape-OPSS (tablas 28 y 31, y FIGS. 2 y 3).

Como cofactor, puede usarse PLP (piridoxal-5'-fosfato) 0,001 - 2 mM o DTT 0,001 - 100 mM en la conversion enzimatica. En una realizacion de la presente invencion, la tasa conversion de cistefna se aumentaba 2,3 veces en presencia de DTT 25 mM o PLP 0,2 mM. Por tanto, el tratamiento con DTT o PLP consigue una mejora en la tasa de conversion de cistefna de la etapa 2). La adicion del cofactor se establecio a un nivel razonable considerando el coste de produccion aumentado y la tasa de conversion aumentada (tabla 30).

Las condiciones de reaccion para OPSS pueden variar dependiendo de los tipos y concentracion de la OPS usada. En una realizacion de la presente invencion, se uso OPS pura (disponible en el mercado), OPS purificada del cultivo preparado en la etapa 1) y el cultivo que contiene OPS de la etapa 1) en diversas condiciones para proporcionar las tasas de conversion optimas. Como resultado, la tasa de conversion de cistefna vario dependiendo del tipo y concentracion de OPSS y la temperatura de reaccion y el tipo y concentracion de OPS (FIG. 5 y 6, y tabla 35).

El metodo de la presente invencion puede comprender ademas el aislamiento y purificacion de la cistefna producida en la etapa 2). Despues de la conversion enzimatica, la cistefna puede aislarse y purificarse del medio de cultivo usando un metodo bien conocido en la tecnica.

Los expertos en la materia pueden sintetizar qufmicamente derivados de cistefna a partir de cistefna usando un metodo bien conocido. La cistefna puede hacerse reaccionar facilmente con un agente de acetilacion para dar NAC (N-acetilcistefna) y con acido aloacetico en condiciones basicas para dar SCMC (S-carboximetilcistefna). Estos derivados de cistefna se usan como materiales en medicinas que tratan catarros, bronquitis, asma bronquial y garganta irritada.

En la presente invencion, el caldo de OPS obtenido mediante fermentacion microbiana se usa como sustrato para sintetizar cistefna. El caldo de OPS obtenido por fermentacion microbiana tiene ventajas economicas sobre OPS pura disponible en el mercado porque el caldo de OPS puede usarse sin tener que purificarse adicionalmente y el cofactor PLP necesario para la conversion puede obtenerse del cultivo fermentado.

En una realizacion de la presente invencion, se desarrollo un proceso de conversion que asegura una tasa de conversion de cistefna tan elevada como de un 80 % cuando se usaba 50 pg/ml de Msm-T en condiciones de ^{reaccion de un caldo de OPS 50 mM o un caldo de OPS purificada 60 mM, Na}2^{S 100 mM o Na}2^{S 120 mM, y PLP} 0,2 mM. Debe apreciarse por los expertos en la materia que la conversion enzimatica usando enzimas muy activas puede optimizarse facilmente y aumentarse de escala.

De acuerdo con otro aspecto de la misma, la presente invencion proporciona un microorganismo recombinante que tiene actividad reducida de SerB para la produccion de OPS. En una realizacion, el microorganismo recombinante muestra una potenciacion de serA o serC resistente a retroalimentacion por serina o eliminacion de al menos una seleccionada entre transportador ABC de alquilfosfonato PhnC/PhnD/PhnE (operon phnCDE), fosfatasa alcalina (phoA) y fosfatasa acida (aphA). Preferiblemente, los microrganismos recombinantes para la produccion de OPS son el microorganismo depositado con el n.° de acceso KCCM11103P o KCCM11212P. Mas preferiblemente, el microorganismo recombinante para la produccion de OPS es el microorganismo depositado con el n.° de acceso KCCM11103P.

Modo para la invencion

Puede obtenerse una mejor comprension de la presente invencion mediante los siguientes ejemplos que se exponen para ilustrar, pero no se deben interpretar como limitantes de la presente invencion.

<Preparación de Corynebacterium productora de O-fosfoserina y produccion de O-fosfoserina usando la misma>

EJEMPLO 1: Preparación de cepa de Corynebacterium deficiente para fosfoserina fosfatasa (serB)

Se modifico Corynebacterium glutamicum 13032 eliminando el gen de serB (SEQ ID NO: 13, EC 3.1.3.3) que codifica fosfoserina fosfatasa, que cataliza la sfntesis de L-serina a partir de O-fosfoserina, mediante la misma. Para este fin, se construyo un fragmento para la inactivacion de serB. A este respecto, se disenaron cebadores para la preparacion de la cepa recombinante 13032-AserB de la presente invencion. En primer lugar, se obtuvo la secuencia de serB de Corynebacterium glutamicum 13032 con referencia a los datos del NIH GenBank, y se sintetizaron los cebadores de las SEQ ID NO: 22 a 27 basandose en la secuencia de serB. Para la alteracion genica especffica de sitio, se empleo un vector pDC que no puede replicarse en Corynebacterium glutamicum. Se construyo un plasmido pDC-AserB en que la pauta abierta de lectura de serB estaba alterada internamente y se adopto para la preparacion de una eliminacion genica de serB especffica de sitio en la cepa mutante de Corynebacterium glutamicum. La alteracion genica interna del pDC-AserB se genera por PCR cruzada usando los pares de cebadores de las SEQ ID NO: 22 y 23 y de las SEQ ID NO: 24 y 25, con el ADN genomico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 que sirve como molde, e introduccion del producto de PCR en un vector pDC. El plasmido recombinante resultante se transformo en Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre por electroporacion (van der Rest et al. 1999). El plasmido se introdujo en el cromosoma por recombinacion primaria (cruce), seguida de recombinacion secundaria (cruce) para escindir la serB original del cromosoma.

Despues de completarse la recombinacion secundaria, los transformantes de Corynebacterium glutamicum que contenfan la mutacion de eliminacion de serB se analizaron por PCR diagnostica usando un par de cebadores especfficos de gen de las SEQ ID NO: 26 y 27. La cepa recombinante se llamo CB01-0047.

EJEMPLO 2: Ensayo para la productividad de O-fosfoserina en la cepa de Corynebacterium deficiente para fosfoserina fosfatasa

La cepa mutante CB01-0047, resultante de la eliminacion de serB de Corynebacterium glutamicum 13032, que se habfa previsto que acumularfa O-fosfoserina, se propago sobre placas BHIS y se incubo durante la noche en una incubadora a 30 °C. Despues de ello, las colonias que aparecieron en las placas BHIS se inocularon en 25 ml de un medio de valoracion mostrado en la tabla 1 usando un inoculo de platino y despues se incubaron a 30 °C durante 48 horas con agitacion a 200 rpm. Los resultados se resumen en la tabla 2, a continuacion.

T l 11

T l 21

Se observo que la cepa CB01-0047 crecfa muy lentamente en el medio de valoracion. Este retardo del crecimiento no se mejoro incluso tras la adicion de un complemento de L-glicina. Sin embargo, el crecimiento se aumento en presencia de L-serina, pero se observo un ligero aumento en la produccion de O-fosfoserina en comparacion con el tipo silvestre. Los resultados se resumen en la tabla 3, a continuacion.

T l

EJEMPLO 3: Construccion de gen de fosfoglicerato deshidrogenasa (SerA*) mutado derivado de Corynebacterium

Los genes derivados de Corynebacterium glutamicum serA*(E235K) (SEQ ID NO: 14) y serA*(197A) (SEQ ID NO: 15) se construyeron, que codifican mutantes respectivos de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, una enzima que cataliza la sfntesis de 3-fosfohidroxipiruvato a partir de 3-fosfoglicerato. Los mutantes se presentaron como resistentes a retroalimentacion (FBR) de serina (Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 437-441, 2002; documento EP0943687B). serA*(E235K) se obtuvo por PCR de union sobre el ADN genomico de ATCC13032 usando los cebadores de las SEQ ID NO: 28 a 31 mientras que serA*(197A) se construyo por PCR usando pares de cebadores de las SEQ ID NO: 28 a 32. Los productos de PCR asf obtenidos se insertaron en vectores T respectivos para construir vectores recombinantes llamados Tblunt-serA*(E235K) y Tblunt-serA*(197A). Posteriormente, los dos vectores se trataron con las enzimas de restriccion EcoRV y Xbal para dar dos fragmentos de ADN serA*(E235K) y serA*(197A). Estos fragmentos se insertaron en los vectores respectivos pECCG117-Pcj7-GFP-terminador que se han digerido con las mismas enzimas de restriccion. Como resultado, se obtuvieron dos vectores recombinantes pECCG117-Pcj7-serA*(E235K) y pECCG117-Pcj7-serA*(197A).

EJEMPLO 4: Preparación de cepa de Corynebacterium que sobreexpresa serA* y ensayo para la productividad de O-fosfoserina

Los dos plasmidos FBR-serA* derivados de Corynebacterium construidos en el ejemplo 3 se introdujeron en Corynebacterium glutamicum CB01-0047. Para evaluar la productividad de O-fosfoserina, los transformantes se propagaron sobre placas BHIS y se incubaron durante una noche a 30 °C. Despues de ello, las colonias que aparecieron en las placas BHIS se inocularon en 25 ml de un medio de valoracion mostrado en la tabla 1 que contenfa adicionalmente 2 g/l de L-serina usando un inoculo de platino y despues se incubaron a 30 °C durante 48 horas con agitacion a 200 rpm. Los resultados se resumen en la tabla 4, a continuacion.

T l 4

En las cepas de Corynebacterium glutamicum transformadas con el FBR-serA* derivado de Corynebacterium, como se muestra en la tabla 4, se observaron acumulaciones de O-fosfoserina a una concentracion de 0,1 a 0,3 g/l.

<Preparación de E. co lique produce O-fosfoserina y produccion de O-fosfoserina usando la misma>

EJEMPLO 5: Preparación de cepa de E. coli que tiene la actividad reducida de fosfoserina fosfatasa (SerB)

Se modifico E. coli eliminando el gen de serB (SEQ ID NO: 16) que codifica fosfoserina fosfatasa, que cataliza la sfntesis de L-serina a partir de O-fosfoserina, mediante la misma. El mutante de eliminacion E. coli K12 se preparo usando el metodo de inactivacion de una etapa (Datsenko KA y Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 6640-6645, 2000) para eliminar un gen marcador resistente a antibiotico. Para preparar la cepa de eliminacion de serB, en primer lugar, se realizo PCR en un plasmido pKD3 (Datsenko KA y Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 6640­ 6645, 2000; GenBank n.° AY048742) usando un par de cebadores de las SEQ ID NO: 33 y 34. El producto de PCR se introdujo en celulas competentes de E. coli K12 que contenfan pKD46 (Datsenko KA y Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 6640-6645, 2000; GenBank n.° AY048746) por electroporacion. Despues de ello, las cepas que mostraron resistencia a cloranfenicol se sometieron a PCR para confirmar la eliminacion de serB, y despues se transformaron con pCP20 (Datsenko KA y Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 6640-6645, 2000) para eliminar el marcador resistente a antibiotico. La cepa mutante resultante se llamo CA07-0012.

Ademas, el codon de inicio de serB se modified para reducir la actividad fosfoserina fosfatasa de la siguiente manera. El gen de serB de tipo silvestre con ATG como codon de inicio se obtuvo por PCR con el ADN genomico de E. coli W3110 que sirvio como molde. Se construyo una serB mutante con CTG como codon de inicio por PCR de union. Se uso un par de cebadores de las SEQ iD NO: 35 y 36 en la PCR para amplificar la serB de tipo silvestre mientras que se emplearon los pares de cebadores de las SEQ ID NO: 37 a 38 para amplificacion por PCR de la serB mutante. Los productos de PCR se trataron con Hindi!! y se clonaron en pccBACI (epicentro) en el sitio de restriccion de Hindi!! para construir pccBAC1-Pself-ATG-serB y pccBAC1-Pself-CTG-serB, respectivamente. El vector de serB de tipo silvestre y el mutante se introdujeron en CA07-0012 para comparar la actividad fosfoserina fosfatasa.

EJEMPLO 6: Ensayo de cepa que tiene la actividad reducida de SerB para la productividad de O-fosfoserina

La cepa mutante deficiente de fosfoserina fosfatasa CA07-0012 que se habfa previsto que acumularfa O-fosfoserina, se propago sobre placas BHIS y se incubo durante la noche en una incubadora a 33 °C. Despues de ello, las colonias que aparecieron en las placas BHIS se inocularon en 25 ml de un medio de valoracion mostrado en la tabla 5 usando un inoculo de platino y despues se incubaron a 33 °C durante 48 horas con agitacion a 200 rpm. Los resultados se resumen en la tabla 6, a continuacion.

T l 1

T l

Para potenciar el crecimiento y productividad de O-fosfoserina del mismo, se cultivo CA07-0012 durante 48 horas en el medio de valoracion de la tabla 5 que contenfa adicionalmente 1 g/l L-glicina. Los resultados se resumen en la tabla 7, a continuacion.

T l 71

Como se muestra en la tabla 7, la adicion de L-glicina al medio de cultivo permitio que la cepa aumentara la tasa de crecimiento y la productividad de O-fosfoserina.

EJEMPLO 7: Construccion del vector que alberga el gen de fosfoglicerato deshidrogenasa (SerA*) mutado derivado de E. coli

Se construyeron los genes derivados de E. coli serA* (G336V) (SEQ ID NO: 18), serA* (G336V, G337V) (SEQ ID NO: 19) y serA* (G336V, R338G) (SEQ ID NO: 20) que codifican mutantes respectivos de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, una enzima que cataliza la sfntesis de 3-fosfohidroxipiruvato a partir de 3-fosfoglicerato. Los mutantes se presentaron como resistentes a retroalimentacion (FBR) de serina (Grant GA, Xu XL y Hu Z, Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA, Hu Z y Xu XL, J. Biol. Chem., 276: 17844-17850, 2001). La introduccion de los genes mutantes en el cromosoma de E. coli se realizo usando el metodo de PCR de union. Los fragmentos de ADN que contenfan mutaciones se prepararon usando los siguientes cebadores.

Los cebadores de las SEQ ID NO: 39 y 41 se usaron habitualmente en el gen SerA*. Para introducir mutaciones en el gen de serA, se realizo PCR con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 42 y 43 para serA* (G336V), con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 44 y 45 para serA*(G336V, G337V), y con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 46 y 47 para serA* (G336V, R338G). Los cebadores se sintetizaron basandose en la informacion acerca del gen K12 W3110 (numero de acceso a GenBank AP 003471) y sus secuencias nucleotfdicas adyacentes, registradas en el NIH GenBank.

EJEMPLO 8: Clonacion de gen serA derivado de E. coli, gen serA* Gene y gen de 3-fosfoserina aminotransferasa (serC)

Se clonaron serA(SEQ ID NO: 17, EC 1.1.1.95), serC(SEQ ID NO: 21, EC 2.6.1.52), serA*(G336V), serA*(G336V, G337V) y serA*(G336V, R338G) de la siguiente manera. Se obtuvieron serA y serC realizando PCR sobre el ADN genomico de E. coli W3110 mientras que serA*(G336V), serA*(G336V, G337V), y serA*(G336V, R338G) se construyeron por PCR con los fragmentos de ADN del ejemplo 7 que sirven como moldes. Los cebadores de PCR fueron las SEQ ID NO: 48 y 49 para serA y las SEQ ID NO: 50 y 51 para serC. Despues del tratamiento con EcoRV y HindII, los productos de la PCR se clonaron en el vector recombinante pCL-Prmf, construido por insercion del promotor rmf de E. coli en el vector pCL1920 (GenBank n.° AB236930) para producir vectores recombinantes respectivos llamados pCL-Prmf-serA, pCL-Prmf-serC, pCL-Prmf-serA*(G336V), pCL-Prmf-serA*(G336V, G337V) y pCL-Prmf-serA*(G336V, R338V), respectivamente.

Ademas, se construyeron los plasmidos en que serA, uno de los tres mutantes de serA, y/o serC forman un operon, es decir, pCL-Prmf-serA-(RBS)serC, pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC, pCL-Prmf-serA*(G336V, G337V)-(RBS)serC y pCL-Prmf-serA*(G336V, R338V)-(RBS)serC. A este respecto, se obtuvo un fragmento (RBS)serC usando los cebadores de las SEQ ID NO: 51 y 52 y se clono en un sitio HindIII en pCL-Prmf-serA, pCL-PrmfserA*(G336V), pCL-Prmf-serA*(G336V, G337V) y pCL-Prmf-serA*(G336V, R338V).

EJEMPLO 9: Preparación de cepas de serA, serA* y serC potenciadas derivadas de E. coli y ensayo para la productividad de O-fosfoserina

Los ocho plasmidos construidos en el ejemplo 8 se transformaron en CA07-0012 y las cepas recombinantes resultantes se ensayaron para la productividad de O-fosfoserina. Cada cepa se propago sobre placas LB y se incubo durante la noche a 33 °C. Despues de ello, las colonias que aparecieron en las placas LB se inocularon en 25 ml de medio de valoracion de la tabla 8 y se cultivaron a 33 °C durante 48 horas con agitacion a 200 rpm. Los resultados se resumen en la tabla 9, a continuacion.

T l 1

T l 1

Como es evidente a partir de los datos de la tabla 9, la cepa de E. coli CA07-0012 aumento en la productividad de O-fosfoserina cuando se transformaba con serA, y la productividad de O-fosfoserina se aumentaba a un grado mayor tras la introduccion de uno de los tres mutantes serA*. Las cepas en que serA, o uno de los tres mutantes serA* y serC se activaron simultaneamente, mostraban mayor productividad de O-fosfoserina de lo que lo hacfan cuando habfa una unica actividad de serA o serA*. La maxima productividad de O-fosfoserina se detecto en una cepa en que se activo simultaneamente el mutante serA* y serC.

EJEMPLO 10: Preparación de cepa de E. coli deficiente del transportador ABC de alquilfosfonato PhnC/PhnD/PhnE (operon phnCDE)

En E. coli, se informo de que el transportador ABC de alquilfosfonato PhnC/PhnD/PhnE trasladaba la O-fosfoserina al citoplasma (Wanner BL y Metcalf WW. FEMS Microbiol. Lett., 15:133-139, 1992). El operon phnCDE que codifica una protefna transportadora ABC de alquilfosfonato PhnC/PhnD/PhnE se elimino de una cepa de eliminacion de serB para preparar la cepa CA07-0016. Para la eliminacion de phnCDE, se empleo un par de cebadores de las SEQ ID NO: 53 y 54. La eliminacion se realizo de una manera similar a la del ejemplo 5.

Ademas, se introdujo pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC, construido en el ejemplo 8, en CA07-0016.

EJEMPLO 11: Ensayo de cepa de E. coli deficiente de operon phnCDE para la productividad de O-fosfoserina Las cepas CA07-0016 y CA07-0016/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC, preparado en el ejemplo 10, se evaluaron para la productividad de O-fosfoserina. Cada cepa se propago sobre placas LB o placas de LB (espectinomicina) y se incubo durante la noche a 33 °C. Despues de ello, las colonias que aparecieron en las placas LB o las placas l B (espectinomicina) se inocularon en 25 ml de medio de valoracion de la tabla 8 usando un inoculo de platino y se cultivaron a 33 °C durante 48 horas con agitacion a 200 rpm. Los resultados se resumen en la tabla 10, a continuacion.

T l 11

Como se observa en la tabla 10, la cepa de eliminacion del operon phnCDE mostro unicamente un ligero aumento en la productividad de O-fosfoserina.

EJEMPLO 12: Preparación de cepa de E. coli deficiente de fosfatasa alcalina (phoA), fosfatasa acida (aphA) La cepa de E. coli de eliminacion de fosfoserina fosfatasa se elimino adicionalmente del gen phoA que codifica fosfatasa alcalina y el gen aphA que codifica fosfatasa acida. Se obtuvo un fragmento de ADN para su uso en la eliminacion de phoA realizando PCR en un plasmido pkD3 con un par de cebadores de las SEQ iD NO: 55 y 56. Por otro lado, se obtuvo un fragmento de ADN para uso en la eliminacion de aphA usando un par de cebadores de las SEQ ID NO: 57 y 58 de la misma manera. Cada cepa de eliminacion se preparo de la misma manera que en el ejemplo 5. La cepa que elimino tanto phoA como aphA se preparo por electroporacion del fragmento de ADN para la eliminacion de aphA en una celula competente de la cepa de eliminacion de phoA que se habfa transformado de nuevo con pKD46. Despues de ello, los transformantes que eran resistente a cloranfenicol se sometieron a PCR para confirmar la eliminacion de aphA, y despues se transformaron con pCP20 para eliminar el marcador resistente a antibiotico. Las cepas mutantes resultantes y sus genotipos se resumen en la tabla 11, a continuacion.

T l 111

A cada cepa de eliminacion, el pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC, construido en el ejemplo 8, se introdujo de la misma manera que en el ejemplo 10.

EJEMPLO 13: Ensayo de cepa de E. coli deficiente de fosfatasa alcalina (phoA), fosfatasa acida (aphA) para la capacidad de degradar O-fosfoserina

Las cepas preparadas en el ejemplo 12 se ensayaron para la productividad de OPS y la incapacidad de degradar OPS. Cada cepa se propago sobre placas LB o placas LB (espectinomicina) y se incubo durante la noche a 33 °C. ^{Despues de ello, las colonias que aparecieron en las placas LB o las placas} Lb ^{(espectinomicina) se inocularon en} 25 ml de medio de valoracion de la tabla 8 usando un inoculo de platino y se cultivaron a 33 °C durante 72 horas con agitacion a 200 rpm. Los resultados se resumen en la tabla 12, a continuacion. Se evaluo la incapacidad de degradar OPS mediante un cambio en el nivel de iones fosfato determinado por el analisis de iones fosfato.

T l 121

Como se observa en la tabla 12, la cepa de eliminacion de aphA mostro un fenomeno de crecimiento anomalo mientras que las cepas que carecfan de phoA o tanto de phoA como de aphA aumentaban algo su productividad de O-fosfoserina y disminufan su capacidad de degradar O-fosfoserina. Por otro lado, la cepa en que no se elimino ni phoA no aphA degradaba la O-fosfoserina acumulada durante 72 horas, con el aumento concomitante del nivel de PO4.

EJEMPLO 14: Preparación de cepas deficientes de operon phnCDE, phoA y aphA

La cepa deficiente de serB (CA07-0012) se modifico para eliminar adicionalmente phnCDE que codifica el transportador ABC de alquilfosfonato phnC/phnD/phnE, phoA que codifica fosfatasa alcalina y aphA que codifica fosfatasa acida. Las cepas asf preparadas se proporcionan en la tabla 13, a continuacion. Se empleo el metodo de inactivacion de una etapa descrito en el ejemplo 5 para preparar los mutantes de eliminacion.

T l 11

^{En cada una de las cepas de eliminacion, el pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC, construido en el ejemplo} 8^{, se introdujo de la misma manera que en el ejemplo} 10^.

EJEMPLO 15: Ensayo de cepas de E. coli deficientes de operon phnCDE, phoA y aphA para productividad de O-fosfoserina

Las cepas preparadas en el ejemplo 14 se ensayaron para la productividad de OPS. Cada cepa se propago sobre placas LB o placas LB (espectinomicina) y se incubo durante la noche a 33 °C. Despues de ello, las colonias que ^{aparecieron en las placas} Lb ^{o las placas LB (espectinomicina) se inocularon en 25 ml de medio de valoracion de la tabla} 8 ^{usando un inoculo de platino y se cultivaron a 33 °C durante 72 horas con agitacion a 200 rpm. Los} resultados se resumen en la tabla 14, a continuacion.

T l 141

Se descubrio que CA07-0020 y CA07-0022 tenfan productividad de OPS aumentada y capacidad disminuida de degradar O-fosfoserina, en comparacion con CA07-0012. Esta propiedad tambien se detecto en las cepas transformadas adicionalmente con pCL-Prmf-serA* (G336V)-(RBS)serC.

EJEMPLO 16: Preparación de mutantes de E. coli deficientes de operon phnCDE, genes phoa y aphA y que tienen sustitucion de fosfoglicerato deshidrogenasa (serA*)

En CA07-0022, se sustituyo serA que codifica 3-fosfoglicerato deshidrogenasa con serA*(G336V), serA*(G336V, G337V) o serA*(G336V, R338G), que todas se presentan con resistencia por retroalimentacion de serina, en el cromosoma, del siguiente modo. Para introducir mutaciones en el gen de serA en el cromosoma, se construyeron vectores de la siguiente manera. Se realizo PCR con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 40 y 41 en serA* (G336V), serA*(G336V, G337V) y serA*(G336V, R338G), preparados en el ejemplo 7. Despues del tratamiento tanto con SacI como con BamHI, los productos de PCR asf obtenidos se clonaron en pSG76C en el sitio SacI y BamHI. El vector recombinante resultante se transformo en E. coli BW que entonces se propago sobre placas LB. Las colonias que aparecieron en las placas se sometieron a secuenciacion de bases, y se seleccionaron los transformantes en que se introdujeron mutaciones. De ellos, se prepararon plasmidos usando un metodo de minipreparacion tfpico. De acuerdo con las mutaciones introducidas, los plasmidos se llamaron pSG76C-serA*(G336V), pSG76C-serA*(G336V, G337V) y pSG76C-serA*(G336V, R338G).

Cada uno de los mutantes de E. coli se preparo como se describe previamente (Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z y Blattner FR, Nucleic Acids Res. 27: 4409-4415, 1999) y se elimino el gen marcador resistente a antibiotico de los mismos. Para preparar el mutante serA*(G336V), se introdujo pSG76C-serA*(G336V) en una celula competente de CA07-0022 por electroporacion. Las cepas resistentes a cloranfenicol se sometieron a PCR para confirmar la introduccion de serA* (G336V). La cepa se transformo con pST76-ASceP (Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z y Blattner FR, Nucleic Acids Res. 27: 4409-4415, 1999) para eliminar el gen marcador resistente a antibiotico. La cepa resultante se llamo CA07-0022 serA*(G336V). La cepa CA07-0022 serA*(G336V) se transformo con pSG76C-serA*(G336V, G337V) y pSG76C-serA*(G336V, R338G) de una manera similar para proporcionar los mutantes serA*(G336V, G337V) y serA*(G336V, R338G), llamados CA07-0022 serA*(G336V, G337V) y serA* (G336V, R338G), respectivamente.

EJEMPLO 17: Ensayo de mutantes de E. coli deficientes de operon phnCDE, genes aphA y aphA y que tiene sustitucion de fosfoglicerato deshidrogenasa (serA*) para la productividad de O-fosfoserina

Las cepas preparadas en el ejemplo 16 se ensayaron para la productividad de O-fosfoserina. Cada cepa se propago ^{sobre placas} Lb ^{o placas LB (espectinomicina) y se incubo durante la noche a 33 °C. Despues de ello, las colonias que aparecieron en las placas} lB ^{o las placas} Lb ^{(espectinomicina) se inocularon en 25 ml de medio de valoracion de la tabla} 8 ^{usando un inoculo de platino y se cultivaron a 33 °C durante 48 horas con agitacion a 200 rpm. Los} resultados se resumen en la tabla 15, a continuacion.

T l 11

Las cepas en que se habfa alterado serA para genes resistentes a retroalimentacion de serina mostraron tasas de crecimiento algo disminuidas, pero un aumento en la productividad de O-fosfoserina.

EJEMPLO 18: Preparación de cepas de E. coli mutantes deficientes de operon phnCDE, phoA y aphA y que tienen fosfoglicerato deshidrogenasa (serA*) sustituida y 3-fosfoserina aminotransferasa potenciada y ensayo para la productividad de O-fosfoserina

En las cepas preparadas en el ejemplo 16, es decir, CA07-0022 serA*(G336V), CA07-0022 serA* (G336V, G337V) y CA07-0022 serA* (G336V, R338G), se introdujeron en el plasmido preparado en el ejemplo 8, es decir, pCL-PrmfserC. Los mutantes resultantes se evaluaron para la productividad de O-fosfoserina de la misma manera que en el ejemplo 9. Los resultados se resumen en la tabla 16, a continuacion.

T l 11

Como se observa en la tabla 16, se descubrio que las cepas de serC activadas estaban mejoradas en la productividad de O-fosfoserina. Este fenomeno fue mas evidente en la cepa en que se modifico serA en un gen resistente a retroalimentacion de serina.

EJEMPLO 19: Cepa de nucleotido de pirimidina transhidrogenasa (pntAB) potenciada y construccion de vector que contiene glutamato deshidrogenasa (gdhA)

Para preparar una cepa en que pntAB que codifica la transhidrogenasa de nucleotidos de pirimidina este regulado por aumento, se cargo el promotor pntAB con un promotor trc usando un sistema loxP mutante (Arakawa H et al., BMC Biotechnol. 1: 7, 2001). A este respecto, se realizo PCR en el plasmido pmlox-trc (ref) usando un par de cebadores de las SEQ ID NO: 59 y 60 y el producto de PCR asf obtenido se introdujo en una celulas competente de CA07-0022 serA*(G336V) de anclaje a pKD46 por electroporacion. Los transformantes que mostraron resistencia a cloranfenicol se sometieron a PCR para confirmar el remplazo del promotor, seguido de transformacion con pJW168 (Le Borgne S et al., Methods Mol Biol. 267: 135-43, 2004) para eliminar el gen marcador resistente a antibiotico. La cepa resultante se llamo CA07-0022 serA*(G336V) P(trc)-pntAB. Los cebadores usados para la PCR se disenaron basandose en la informacion acerca del gen K12 W3110 (numero de acceso a GenBank AP002223, AP002224) y sus secuencias nucleotfdicas adyacentes, registradas en el NHI GenBank.

El gen de gdhA que codifica glutamato deshidrogenasa se amplifico usando PCR con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 61 y 62 para dar un unico polinucleotido. Los dos cebadores de las SEQ ID NO: 61 y 62 tienen el sitio para la enzima de restriccion Hindlll. Los cebadores se disenaron basandose en la informacion acerca del gen K12 W3110 (numero de acceso a GenBank AP 002380) y sus secuencias nucleotfdicas adyacentes, registradas en el NHI GenBank.

La PCR empezo con la desnaturalizacion a 94 °C durante 3 min y continuo con 25 ciclos de desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 56 °C durante 30 s y prolongacion a 72 °C durante 2 min, seguido de prolongacion a 72 °C durante 7 min. Como resultado, se obtuvo un polinucleotido de 1714 pb de longitud. Despues del tratamiento con Hindlll, el producto de PCR se clono en pCC1BAC y el sitio Hindlll y se introdujo en E. coli DH5a que despues se propago sobre placas LB. La secuenciacion de bases permitio la seleccion de las colonias desarrolladas que no tenfan mutaciones en su gen gdhA. El plasmido se aislo usando un metodo de minipreparacion tfpico y se llamo pCC1 BAC-P(nativo)-gdhA.

EJEMPLO 20: Introduccion de pntAB y gdhA en cepa productora de OPS y ensayo para la productividad de OPS

Para preparar una cepa productora de OPS en que estuvieran regulados por aumento pntAB y gdhA, la cepa CA07-0022 serA*(G336V) o la cepa CA07-0022 serA*(G336V) P(trc)-pntAB se transformo con pCL-P(trc)-serA*(G336V)-serC y pCC1BAC-P(nativo)-gdhA individualmente o en combinacion, como se muestra en la siguiente tabla. Cada transformante se incubo durante la noche a 33 °C en placas LB. Las colonias se inocularon en 25 ml de medio de valoracion de la tabla 8 usando un inoculo de platino y se cultivaron a 33 °C durante 48 horas con agitacion a 200 r.p.m.

T l 171

Como se observa en la tabla 17, la cepa se mejoro en la productividad de O-fosfoserina cuando pntAB estaba regulado por aumento en la misma. La regulacion por aumento tanto de pntAB como de gdhA consiguio un aumento mayor en la productividad de O-fosfoserina, en comparacion con el control. Por tanto, se entiende que pntAB y gdhA desempenan una funcion importante en la produccion de OPS.

EJEMPLO 21: Construccion de vectores que portan genes que codifican O-acetilserina/protefna de flujo de cistefna (ydeD) de E. coli, permeasa de flujo de O-acetilserina/cistefna (yfiK), protefna de flujo de homoserina/homoserina lactona (rhtB), protefna de flujo de treonina/homoserina (rhtC), transportador de arsenito/antimonito (asrB) y subunidad de transporte de leucina/isoleucina/valina (livHM)

La liberacion de la O-fosfoserina producida de la celula requiere un factor de exportacion adecuado, ninguno de los cuales, sin embargo, se ha presentado previamente. En este contexto, seis genes, es decir, ydeD que codifica protefna de flujo de O-acetilserina/cistefna, yfiK que codifica permeasa de flujo de O-acetilserina/cistefna (Franke I, Resch A, Dassler T, Maier T y Bock A, J. Bacteriology, 185: 1161-166, 2003), rhtB que codifica protefna de flujo de homoserina/homoserina lactona, RhtC que codifica protefna de flujo de treonina/homoserina, asrB que codifica transportador de arsenito/antimonito y livHM que codifica subunidad transportadora de leucina/isoleucina/valina se seleccionaron entre la diversidad previamente presentada de genes transportadores, y se clonaron y evaluaron.

Cada gen se obtuvo realizando PCR en el ADN genomico de E. coli W3110, con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 63 y 64 para ydeD, con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 65 y 66 para yfiK, con un par de cebadores de las SEQ ID No: ^{67 y 68 para rhtB, con un par de cebadores de las} SeQ ^{ID NO: 69 y 70 para rhtC, con un par de} cebadores de las SEQ ID NO: 71 y 72 para asrB y con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 73 y 74 para livHM. Despues del tratamiento con EcoRv y HindIII, cada uno de los productos de PCR asf obtenidos se clono en el sitio EcoRV y HindIII en el pCL-Prmf-GFP, para dar vectores recombinantes, llamados pCL-Prmf-ydeD, pCL-Prmf-yfiK, pCL-Prmf-rhtB, pCL-Prmf-rhtC, pCL-Prmf-arsB y pCL-Prmf-livHM.

EJEMPLO 22: Introduccion de vectores que portan genes que codifican ydeD, yfiK, rhtB, rhtC, asrB, livHM de E. coli en cepas productora de O-fosfoserina y ensayo para la productividad de O-fosfoserina

La cepa CA07-0022 serA*(G336V) se transformo con los seis plasmidos construidos en el ejemplo 21 y se evaluo para la productividad de O-fosfoserina de la misma manera que en el ejemplo 9. Los resultados se dan en la Tabla 18, a continuacion.

T l 11

Como se muestra en la tabla 18, las cepas transformadas con ydeD, mdtG o livHM mostraban tasa de crecimiento disminuida y productividad de OPS disminuida mientras que la transformacion con yfiK, rhtB o rhtC aumentaba la tasa de crecimiento y la productividad de OPS (tabla 18).

EJEMPLO 23: Preparación de cepa deficiente de fosfoglicerato mutasa (gpml, gpmA y gpmB)

gpml, gpmA y gpmB, que codifican cada uno fosfoglicerato mutasa, se eliminaron unicamente o en combinacion de CA07-0022 serA*(G336V) para producir las cepas mutantes llamadas CA07-0022 serA*(G336V)AgpmI, CA07-0022 serA*(G336V)AgpmA, CA07-0022 serA*(G336V)AgpmB, CA07-0022 serA*(G336V)AgpmIAgpmA, CA07-0022 serA*(G336v)AgpmAAgpmB, y CA07-0022 serA*(G336V)AgpmIAgpmAAgpmB, respectivamente. Las cepas de eliminacion gpmA- y gpmB- se prepararon de una manera similar a la del ejemplo 5, usando un par de cebadores de las SEQ ID NO: 75 y 76 para gpmA y un par de cebadores de las SEQ ID NO: 81 y 82 para gpmB. Para la construccion de una cepa de eliminacion de gpml, como se describe en el ejemplo 16, se introdujo una mutacion de gpml que contenfa un codon de parada usando pSG76C. Un mutante de gpml que contenfa un codon de parada se amplifico por PCR de union usando los cebadores de las SEQ ID NO: 77 a 81, con el ADN genomico de K12 W3110 que sirve como molde, y se clono en pSG76 en el sitio SacI/BamHI.

EJEMPLO 24: Ensayo de cepas deficientes de gpmI, gpmA y gpmB para la productividad de OPS

Las cepas preparadas en el ejemplo 23 se evaluaron para la productividad de OPS de la misma manera que en el ejemplo 9. Los resultados se resumen en la tabla 19, a continuacion.

T l 1

Como puede observarse en la tabla 19, cuando cada uno de gpml, gpmA y gpmB se eliminaba y los otros no se eliminaban, el consumo de azucar de las cepas mutantes disminufa, pero su productividad de OPS aumentaba, en comparacion con la cepa madre. Particularmente, la cepa desprovista tanto de gpmA como de gpmB tenia un consumo de azucar similar, pero productividad de OPS aumentada, en comparacion con las cepas desprovistas de gpmA o gpmB. Por lo tanto, se entiende que la eliminacion de gpml, gpmA y gpmB produce una cantidad aumentada de 3-fosfoglicerato, un precursor de OPS, dando lugar por tanto a produccion de o Ps aumentada.

EJEMPLO 25: Preparación de cepas deficientes de 2-amino-3-cetobutirato CoA ligasa (kbl), L-serina desaminasa I (sdaA)

El gen kbl que codifica 2-amino-3-cetobutirato CoA ligasa y el gen sdaA que codifica L-serina desaminasa I se eliminaron de CA07-0022 serA*(G336V) para producir CA07-0022 serA*(G336V) Akbl y CA07-0022 serA*(G336V) AsdaA, respectivamente. Las cepas de eliminacion kbl- y sdaA- se prepararon de una manera similar a la del ejemplo 5, usando un par de cebadores de las SEQ ID NO: 83 y 84 para kbl y un par de cebadores de las SEQ ID NO: 85 y 86 para sdaA.

EJEMPLO 26: Ensayo para la DO y consumo de azucar de cepas deficientes de kbl/sdaA de acuerdo con la concentracion de glicina

Las cepas preparadas en el ejemplo 25 se evaluaron para la DO, el consumo de azucar y la productividad de O-fosfoserina cuando se incubaban en las mismas condiciones de medio como se describe en la tabla 8 del ejemplo 9, con la excepcion de que se uso glicina en una cantidad de 0 a 2,5 g/l.

T l 21

Como puede observarse en la tabla 20, la DO y la tasa de consumo de azucar en las tres cepas aumentaba cuando el nivel de glicina en el medio se aumentaba. Particularmente, la cepa de eliminacion sdaA- mostraba un aumento significativo en la DO y en la tasa de consumo de azucar a una concentracion de glicina de 1 g/l. La productividad de OPS de la cepa de eliminacion de kbl mejoro enormemente en presencia de 2,5 g/l de glicina.

EJEMPLO 27: Preparación de cepa deficiente de icIR

El factor de transcripcion iclR se elimino de CA07-0022 serA*(G336V) para producir CA07-0022 serA*(G336V) AicIR. La cepa mutante de eliminacion se preparo usando el metodo de inactivacion de una etapa como en el ejemplo 5 y se elimino el gen marcador resistente a antibiotico. Para la preparacion de la cepa de eliminacion de iclR, se realizo PCR con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 87 y 88.

EJEMPLO 28: Ensayo de la cepa deficiente de iclR para la productividad de OPS

La cepa preparada en el ejemplo 27 se evaluo para la productividad de OPS de la misma manera que en el ejemplo 9.

T l 211

Como es evidente a partir de los datos de la tabla 21, se descubrio que la productividad de OPS de la cepa de eliminacion de iclR aumentaba.

EJEMPLO 29: Construccion de vectores que portan acetil CoA sintasa (acs), monomero de piruvato oxidasa (poxB), acetato cinasa (ackA) y fosfato acetiltransferasa (pta) de E. coli

Para potenciar la produccion y reutilizacion de acetato en la cepa productora de O-fosfoserina, se construyeron plasmidos de expresion que portaban acs que codifica acetil CoA sintasa, poxB que codifica monomero de piruvato oxidasa, ackA que codifica acetato cinasa y pts que codifica fosfato acetiltransferasa, respectivamente.

Cada gen se obtuvo realizando PCR con pfu en el ADN genomico de E. coli W3110 con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 89 y 90 para acs, con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 91 y 92 para poxB y con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 93 y 94 para ackA y pta. Despues del tratamiento con Hindi!!, cada uno de los productos de PCR asf obtenido se clono en el sitio EcoRV y HindIII en el vector pCL-Prmf-GFP construido por insercion de un promotor rmf de E. coli en pCL1920, para dar pCL-Prmf-acs, pCL-Prmf-poxB y pCL-Prmf-ackA-pta. Posteriormente, estos plasmidos se trataron con EcoRI para obtener insertos de ADN, es decir, Prmf-acs, Prmf-poxB y Prmf-ackA-pta, que despues se introdujeron en pCCIBAC (EcoRI) (CopyControl™ pccIBAC™ Vector, Epicentre. ^{Cat. n.°} C^bA^c311) ^{para construir pCC1BAC-Prmf-acs, pCC1BAC-Prmf-poxB y pCC1BAC-Prmf-ackA-pta,} respectivamente.

EJEMPLO 30: Preparación de cepa productora de OPS de acs, poxB, ackA, pta potencia de E. coli y ensayo para la productividad de OPS

La cepa CA07-0022 serA*(G336V) se transformo con los tres vectores preparados en el ejemplo 29 y se ensayo para la productividad de OPS de la misma manera que en el ejemplo 9.

T l 221

Como puede observarse en la tabla 22, la tasa de crecimiento de la cepa transformada con poxB disminufa mientras que la introduccion de acs o ackA-pta aumentaba la tasa de crecimiento y la produccion de OPS.

EJEMPLO 31: Construccion de vectores que portan malato sintasa A (aceB), monomero de isocitrato liasa (aceA), fosfoenolpiruvato carboxicinasa (pckA), malato sintasa G (glcB) y malato deshidrogenasa (maeB) de E. coli

Se construyeron plasmidos que permitfan la expresion tanto de aceB que codifica malato sintasa A como aceA que codifica monomero de isocitrato liasa, pckA que codifica fosfoenolpiruvato carboxicinasa, glcB que codifica malato sintasa G y maeB que codifica malato deshidrogenasa en E. coli, respectivamente.

Los genes se prepararon realizando PCR con pfu en el ADN genomico de E. coli W3110 con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 95 y 96 para aceBA, con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 97 y 98 para pckA, con un par de ^{cebadores de las SEQ ID NO: 99 y 100 para glcB y con un par de cebadores de las} SeQ ^ID No: ^{101 y 102 para} maeB. Despues del tratamiento con Hindlll, cada uno de los productos de PCR asf obtenido se clono en el sitio EcoRV y HindIII en el vector pCL-Prmf-GFP construido por insercion de un promotor rmf de E. coli en pCL1920, para dar pCL-Prmf-aceBA, pCL-Prmf-pckA, pCL-Prmf-glcB y pCL-Prmf-maeB.

EJEMPLO 32: Preparación de cepa productora de OPS con aceB, aceA, pckA, glcB y maeB potenciada de E. coli y ensayo para la productividad de O-fosfoserina

La cepa CA07-0022 serA*(G336V) se transformo con los cuatro vectores preparados en el ejemplo 31 y se ensayo para la productividad de O-fosfoserina de la misma manera que en el ejemplo 9.

T l 21

Como puede observarse en la tabla 23, la tasa de consumo de azucar y la productividad de OPS de la cepa disminuyo algo cuando se transformaba con aceBA y la tasa de crecimiento disminufa significativamente cuando se transformaba con pckA, mientras que la introduccion de glcB o maeB aumentaba la productividad de OPS.

EJEMPLO 33: Construccion de vectores que portan glioxilato carboligasa (glc), tartronato semialdehfdo reductasa 2 (glxR) y glicerato cinasa II (glxK)

Se clono gcl que codifica glioxilato carboligasa, glxR que codifica tartronato semialdehfdo reductasa 2 y glxK que codifica glicerato cinasa II, todos los cuales estan implicados en la conversion de glioxilato en 3-fosfoglicerato, de la siguiente manera. Los genes se obtuvieron realizando PCR con en el ADN genomico de E. coli W3110 con un par de cebadores de las SEQ ID NO: 103 y 104 para gcl y con pares de cebadores de las SEQ ID NO: 105 a 108 para glxR-glxK. Despues de la digestion con EcoRV y HindIII, cada uno de los productos de PCR se clono en los sitios EcoRV y HindIII en el vector pCL-Prmf-GFP construido por insercion de un promotor rmf de E. coli en pCL1920 para producir plasmidos recombinados, llamados pCL-Prmf-gcl, pCL-Prmf-glxR-glxK y pCL-Prmf-glxR-glxK-Prmf-gcl, respectivamente.

EJEMPLO 34: Introduccion de vectores que portan glc, glxR, glxK en cepa productora de O-fosfoserina y ensayo para la productividad de O-fosfoserina

Los tres plasmidos construidos en el ejemplo 33 se introdujeron en CA07-0022 serA*(G336V), que despues se evaluaron para la productividad de O-fosfoserina de la misma manera que en el ejemplo 9. Los resultados se resumen en la tabla 24, a continuacion.

[T l 24

Como puede observarse en la tabla 24, la productividad de O-fosfoserina final de las cepas transformas respectivamente con gcl, glxR-glxK y glxR-glxK-gcl estaba disminuida, pero la tasa de crecimiento y la tasa de consumo de azucar estaban aumentadas, en comparacion con la propia cepa CA07-0022 serA*(G336V). Particularmente, se descubrio que la introduccion de glxR-glxK tenia el maximo aumento en la tasa de crecimiento y la tasa de consumo de azucar.

EJEMPLO 35: Evaluacion de cepa productora de O-fosfoserina en un fermentador

Se incubaron cepas CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC a 33 °C durante 24 horas en placas de agar MMYE (2 g/l de glucosa, sulfato de magnesio 2 mM, cloruro de calcio 0,1 mM, 6 g/l de pirofosfato de sodio, 0,5 g/l de cloruro de sodio, 3 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 10 g/l de extracto de levadura, 18 g/l de agar) que contenian 50 pg/ml de espectinomicina. Las colonias resultantes se rasparon de 1/10 del area de cada placa de agar, se inocularon en un medio de siembra que contenia 50 pg/ml de espectinomicina, 10 g/l de glucosa, 0,5 g/l de sulfato de magnesio, 3 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 10 g/l de extracto de levadura, 0,5 g/l de cloruro de sodio, 1,5 g/l de cloruro de amonio, 12,8 g/l de pirofosfato de sodio, 1 g/l de glicina) en un matraz con deflector, y se incubaron a 30 °C durante seis horas mientras se agitaba a 200 r.p.m. A 300 ml de un medio principal en un fermentador de 1 l, se anadio el cultivo de siembra resultante en una cantidad tan grande como de un 16 % del volumen del medio principal, seguido de incubacion a 33 °C y pH 7,0. El medio principal tenia la composicion dada en la tabla 25, a continuacion.

T l 21

Durante la incubacion, el pH del medio de cultivo se ajusto a 7,0 con agua amoniacal. Tras la reduccion de glucosa del medio de cultivo, se realizo fermentacion de tipo semicontinua anadiendo una solucion de glucosa de 520 g/l. Despues de la fermentacion durante 80 horas, se produjo O-fosfoserina a una concentracion de 19,5 g/l medida por HPLC.

<Desarrollo y caracterizacion de O-fosfoserina (OPS) sulfhidrilasa (OPSS)>

EJEMPLO 36: Desarrollo de OPS sulfhidrilasa (OPSS)

Se informa que Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis y Trichomonas vaginalis tienen O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS), una enzima que emplea O-fosfo-L-serina (OPS), en lugar de O-acetil serina (OAS) en E. coli, como sustrato para la sfntesis de cistefna (Mino K y Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW y Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC y Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). Basandose en el informe, los autores de la presente invencion descubrieron dos tipos de OPS sulfhidrilasa, que convierte OPS en cistefna, de Aeropyrum pernix y Mycobacterium tuberculosis H37Rv. De ellas, la enzima OPS derivada de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se uso para el cribado de homologfa de aminoacidos. Como resultado, se fijaron tres tipos de OPSS de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155, Rhodococcus jostii RHA1 y Nocardia farcinica IFM 10152.

Para obtener OPSS de cada cepa, se construyo un sistema de vector pET28a (Novagen), que se usa tfpicamente para la expresion de enzimas. Cada uno de los moldes y cebadores para su uso en la clonacion de los cinco diferentes genes de OPS sulfhidrilasa y los plasmidos recombinantes resultantes se resumen en la tabla 26, a continuacion. Se usaron combinaciones adecuadas de los moldes y los cebadores, que se dan en la tabla 26, para PCR para la amplificacion de los genes de OPSS respectivos. Los productos de PCR y el vector pET28a se digirieron con Ndel y Hindlll (37 °C durante 3 horas). Cada uno de los fragmentos genicos se ligo al vector pET28a digerido (Novagen). La secuenciacion de bases confirmo la construccion de los vectores de expresion que portan cada uno de los genes OPSS. Los vectores de expresion de enzima se introdujeron en E. coli (DE3) para producir cepas que pueden expresar cinco enzimas OPSS. Los nombres de las enzimas se dan en la tabla 26, a continuacion.

T l 2

La expresion de las enzimas se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante del sistema pET (Novagen). Se inocularon colonias individuales de cada cepa de las placas LB en 5 ml de caldo LB y se incubaron a 37 °C durante 16 horas mientras se agitaban a 200 rpm. Los cultivos se transfirieron a 25 ml de caldo LB reciente (en ^{matraces de 250 ml) y se incubaron a una DO}600 ^{de 0,5 - 0,6 (durante 2 - 3 horas) en las mismas condiciones,} inmediatamente despues de lo cual se anadio IPTG 1 mM al medio para inducir la expresion de las enzimas durante la incubacion a 18 °C durante 18 horas mientras se agitaban a 120 rpm. Las enzimas se purificaron usando columnas de Ni-NTA para marca de His, con la ayuda de His SpinTrap (GE Healthcare). De las cinco enzimas OPSS asf aisladas, se descubrio que cuatro eran formas insolubles, siendo una (Rjo-OPSS) un cuerpo de inclusion, analizado por electroforesis en SDS-PAGE al 14 %.

EJEMPLO 37: Ensayo de OPS sulfhidrilasa (OPSS) para la actividad de sfntesis de cistefna

Las enzimas OPS sulfhidrilasa obtenidas de las cuatro cepas de microorganismos se ensayaron para la capacidad de catalizar la conversion de O-fosfoserina (OPS) en cistefna. Con respecto a las condiciones de ensayo y los metodos (ensayo de enzima cysM), se hizo referencia a los informes previos (Mino K y Ishikawa K, FEBS letters, ^{551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty} Fw ^{y Begley TP, J. Am. Chem. Soc.,} 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC y Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). La cantidad del sustrato usado se representa por una unidad de ml. Las condiciones de ensayo para la actividad enzimatica se resumen en la tabla 27, a continuacion.

T l 271

Las soluciones de reaccion exceptuando las enzimas se incubaron a 37 °C durante 5 min, despues de lo cual se anadieron 50 mg de OPS sulfhidrilasa purificada a la solucion de reaccion. En momentos predeterminados durante la incubacion a 37 °C, se recogieron 100 ml de las reacciones enzimaticas y se mezclaron con 100 ml de TCA al 33,2 % para detener la reaccion enzimatica. Las concentraciones de cistefna de las reacciones enzimaticas se ^{analizaron cuantitativamente midiendo la absorbancia a DO}560 ^{de acuerdo con el metodo de Gaitonde. Las} actividades de sfntesis de cistefna de las cuatro enzimas OPS sulfhidrilasa diferentes se resumen en la tabla 28, a continuacion. Los tftulos de sfntesis de cistefna de las enzimas OPSS se expresan como tasas de conversion de cistefna con el tiempo de reaccion.

T l 21

Las enzimas OPS sulfhidrilasa derivadas de Aeropyrum pernix y Mycobacterium tuberculosis H37Rv, que se ^{presentaron previamente (Mino K y Ishikawa K,} FEbS ^{letters, 551: 133-138, 2003; Westrop GD, Goodall G, Mottram} JC y Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006), se confirmo que tenfan la actividad de uso de OPS como sustrato para sintetizar cistefna. La actividad de sfntesis de cistefna de la OPS sulfhidrilasa novedosa derivada de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155, que se obtuvo por cribado de homologfa de aminoacidos con la enzima Mtb-OPSS, se descubre por primera vez. Como se observa en los datos de la tabla 28, la tasa de conversion de OPS en cistefna de Ape-OPSS alcanzo casi un 100 % en una hora. La tasa de conversion final de la enzima Msm-OPSS, que se selecciono recientemente a traves de cribado enzimatico basandose en la OPSS derivada de Mycobacterium tuberculosis H37Rv presentada previamente, fue de un 43,7 %, que fue 4,3 veces tan alta como la de Mtb-OPSS. Por otro lado, la OPS sulfhidrilasa novedosa derivada de Nocardia farcinica IFM 10152, obtenida por el cribado de homologfa, mostro actividad insuficiente de conversion de O-fosfoserina en cistefna.

EJEMPLO 38: Preparación de Mtb-T y Msm-T que codifican Mtb-OPSS y Msm-OPSS truncados en los 5 restos de aminoacido del extremo C

OPSS derivada de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mtb-OPSS), que cataliza la conversion de OPS en cistefna con la ayuda de las enzimas adicionales mec+ y cysO, se informa de que puede usar una fuente de azufre que contiene S2- en la conversion de OPS en cistefna incluso en ausencia de las enzimas adicionales cuando se retiran cinco restos de aminoacido del extremo C de la misma (Agren D, Schnell R y Schneider G, FEBS Letters, 583: 330­ 336, 2009). Basandose en este informe, se obtuvo Mtb-T (SEQ ID NO: 11), que puede convertir rapidamente OPS en presencia de S2- como fuente de azufre. Tambien se obtuvo Msm-T de Msm-OPSS (SEQ ID NO: 9) que comparte una homologfa de aminoacidos con Mtb-OPSS. Se construyeron vectores de expresion que portan los dos mutantes enzimaticos. A este respecto, se realizo PCR con pfu en el ADN genomico de Mycobacterium tuberculosis H37Rv o Mycobacterium smegmatis en presencia de un par de cebadores de las SEQ ID NO: 119, 120, 121 y 122. Los fragmentos genicos de OPSS asf obtenidos se trataron con NdeI y HindIII y se clonaron en el vector pET28a digerido con las mismas enzimas de restriccion para construir los vectores de expresion recombinantes llamados pET28a-Mtb-T y pET28a-Msm-T, respectivamente. Los vectores de expresion recombinantes se introdujeron en E. coli (DE3). La expresion de las dos enzimas OPSS mutantes se confirmo por SDS PAGE al 14 %. Las dos enzimas OPSS mutantes se purificaron y expresaron en las mismas condiciones que en el ejemplo 36. Como resultado, se obtuvieron Mtb-T (SEQ ID NO: 11) y Msm-T (SEQ ID NO: 10).

EJEMPLO 39: Ensayo de Mtb-T y Msm-T para la actividad de conversion de cistefna

Basandose en el informe de que mutantes de OPSS derivados de Mycobacterium tuberculosis H37Rv desprovistos de cinco restos de aminoacidos del extremo C muestran afinidad aumentada por una fuente de azufre que contiene el grupo S2" incluso en ausencia de enzimas subsidiarias (Agren D, Schnell R y Schneider G, FEBS Letters, 583: 330-336, 2009), se obtuvieron Mtb-T y Msm-T. Se evaluaron para la actividad enzimatica midiendo las tasas finales de conversion de cistefna. La actividad enzimatica se ensayo en las mismas condiciones y de la misma manera que en el ejemplo 37. La cistefna producida se analizo cuantitativamente usando el metodo de Gaitonde.

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Como se observa en la tabla 29, Msm-T, que esta desprovista de los cinco restos de aminoacidos del extremo C de OPSS derivada de Mycobacterium smegmatis cepa MC2 155 permitio la conversion de cistefna a partir del sustrato a una tasa de un 100 % en una hora.

Cuando se modifico su secuencia de aminoacidos, la O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) puede catalizar de forma mas eficaz la biosfntesis de L-cistefna.

EJEMPLO 40: Requisito de cofactor para la actividad de OPS sulfhidrilasa

Para examinar el efecto de cofactores sobre la conversion de cistefna de OPSS, se midio la tasa de conversion de cistefna de Msm-T en ausencia o presencia de PLP (piridoxal-5'-fosfato) y DTT (ditiotreitol). A este respecto, los ^{sustratos de caldo de OPS 50 mM y Na}2^{S 100 mM se hicieron reaccionar a 37 °C durante 30 min en presencia de} DTT 25 mM o PLP 0,2 mM. La cistefna asf producida se analizo cuantitativamente usando el metodo de Gaitonde. Como se observa en la tabla 30, la tasa de conversion de cistefna en presencia tanto de PLP como de DTT fue 2,3 veces tan grande como en ausencia tanto de PLP como de DTT. Por tanto, se observo que tanto PLP como DTT tienen una influencia positiva sobre la conversion.

T l 1

EJEMPLO 41: La influencia de la temperatura sobre la actividad de la OPS sulfhidrilasa

Se examinaron las tasas de conversion de cistefna de Ape-OPSS y Msm-T de acuerdo con las temperaturas. La actividad enzimatica a 37 °C y 60 °C se midio 2, 5, 10, 30 y 60 min despues de la reaccion. La reaccion se realizo en ^{condiciones de HEPES 100 mM (pH 7,4), OPS 5 mM, Na}2^{S 10 mM, PLP 0,2 mM y 50 pg/ml de CysM. La cantidad} de cistefna producida se determino usando el metodo de Gaitonde. En las condiciones de un tampon, como se muestra en la FIG. 2, Ape-OPSS mostro una tasa de reaccion inicial mas rapida a 37 °C, asf como mayor reactividad a 60 °C de lo que lo hizo Msm-T.

EJEMPLO 42: Estabilidad termica de OPS sulfhidrilasa

Se analizaron Ape-OPSS y Msm-T para la estabilidad termica. Cada una de las enzimas se diluyo hasta una concentracion de 2 mg/ml en un caldo de OPS y se trato termicamente a 37 °C y 60 °C durante 10, 30, 60, 120 y 240 ^{min, seguido de reaccion a 37 °C durante 30 min en las condiciones de OPS 5 mM, Na}2^{S 10 mM, PLP 0,2 mM y} HEPES 100 mM (pH 7,4). Para esta reaccion, se emplearon 10 pg/ml de Ape-OPSS y 50 pg/ml de Msm-T. Las cantidades de la cistefna producida se midieron usando el metodo de Gaitonde. Se observo que Ape-OPSS retenfa su actividad intacta a pesar del tratamiento termico a 60 °C durante 4 horas mientras que la actividad de Msm-T se mantenfa a 37 °C, pero disminufa en un 50 % tras el tratamiento termico a 60 °C durante 30 min. Los resultados se dan en la tabla 31, a continuacion.

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Se hizo un examen de la retencion de actividad enzimatica a 37 °C cuando se usaba Msm-T en una cantidad de ^{50 pg/ml, que es una concentracion practica en caldo de OPS. En ausencia de Na}2^{S, se trataron 50 pg/ml de Msm-}T, junto con caldo de OPS 50 mM y PLP 0,2 mM, a 37 °C durante 0,5, 1, 2, 4 y 6 horas, despues de lo cual se ^{anadio Na}2^{S para inducir la reaccion enzimatica. Despues de la reaccion durante 30 min, se midio la actividad de} Msm-T. Las cantidades de la cistefna producida se determinaron usando el metodo de Gaitonde. Como resultado, se disminuyo la actividad de Msm-T por debajo de un 50 % 2 horas despues de la reaccion a 37 °C en caldo de OPS (tabla 32).

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_______________________

EJEMPLO 43: La influencia del pH sobre la OPS sulfhidrilasa

Se examinaron las tasas de conversion de cistefna de Ape-OPSS y Msm-T de acuerdo con los pH. En tampon 100 mM, Ape-OPSS y Msm-T, que tienen, cada una, una concentracion de 50 pg/ml, se sometieron a reaccion a 37 °C durante 10 min. A este respecto, se uso tampon fosfato de K con un pH de 6,4 / 7,0 / 7,4 / 8,0, tampon Tris-HCl con un pH de 7,0 / 7,4 / 8,0 / 8,5 / 8,8 y tampon carbonato de Na con un pH de 8,0 / 8,5 / 9,0 / 10,0. El analisis cuantitativo de la cistefna producida se realizo usando el metodo de Gaitonde. Como se observa en la FIG. 3, Msm-T mostro la maxima actividad a un pH de 8,0 a 9,0 independientemente del tampon. En cuanto a Ape-OPSS, su maxima actividad se detecto en fosfato de K (pH 7,4), con un pH optimo que difiere de un tampon a otro.

EJEMPLO 44: Efecto de iones sobre la actividad de OPS sulfhidrilasa

Se examinaron los efectos de iones sobre la actividad de las enzimas OPSS de la siguiente manera. En una mezcla de reaccion que contenfa OPS 5 mM, Na²S 10 mM, PLP 0,2 mM y HEPES 100 mM (pH 7,4), las enzimas se sometieron a reaccion a 37 °C durante 30 min en presencia de (NH⁴)²SO⁴ (1, 3, 5, 10, 20 g/l), KH²PO⁴ (0,5, 1, 2, 4, 8 g/l) o NH⁴Cl (0,2, 0,5, 1, 2 g/l). Se usaron Ape-OPSS y Msm-T a una concentracion de 10 pg/ml y 50 pg/ml, respectivamente. Las cantidades de la cistefna producida se determinaron usando el metodo de Gaitonde.

No se detectaron cambios en la tasa de conversion de cistefna cuando se anadfa (NH⁴)²SO⁴ o KH²PO⁴ a la mezcla de reaccion. Por otro lado, como se observa en la tabla 33, la tasa de conversion de cistefna se disminuyo con un aumento en la concentracion de NH⁴CL Particularmente, la actividad enzimatica maxima se disminuyo en mas de un 70 % cuando se anadfan 2 g/l de NH⁴CL Por lo tanto, se observo que NH⁴Cl tenia un efecto negativo sobre la actividad de conversion de OPS sulfhidrilasa.

T l 1

EJEMPLO 45: Efecto de fuente de azufre sobre la actividad de sfntesis de cistefna de OPS sulfhidrilasa

Se realizo un experimento para examinar el efecto de las fuentes de azufre sobre la actividad de sfntesis de cistefna de cada enzima. En una mezcla de reaccion que contenfa OPS 5 mM, PLP 0,2 mM y HEPES 100 mM, cada enzima ^{(50 pg/ml de Ape-OPSS, 50 pg/ml de Msm-T) se sometio a reaccion a 37 °C durante 1 hora en presencia de Na}2^{S, NaSH o Na}2^S2^O3^{10 mM. Las cantidades de la cistefna producida se midieron usando el metodo de Gaitonde. Se observo que Ape-OPSS preferfa Na}2^S2^O3 ^{como fuente de azufre, mientras que Msm-T prefiere Na}2^{S. Los resultados} se resumen en la tabla 34, a continuacion.

T l 41

EJEMPLO 46: Construccion del vector de expresion que porta OPS sulfhidrilasa (sistema pCL-Pcj1) y expresion en E. coli

Se realizo PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO: 123 y 124, con el vector pET28a-Msm-T que sirve como molde. El producto de PCR asf obtenido se trato con EcoRV y Hindlll y se clono en pCL-P(CJ1) para construir un vector recombinante llamado pCL-P(CJ1)-Msm-T. Para examinar una diferencia en el nivel de expresion de Msm-T entre el sistema pET y el sistema pCL-Pcj1, se prepararon cepas para expresar la enzima. El sistema pET se introdujo en Rosetta (DE3) mientras que el sistema pCL-Pcjl uso la cepa K12G. Se inocularon colonias individuales recogidas de placas LB en 5 ml de caldo LB y se cultivaron a 37 °C durante 16 horas mientras se agitaba a 200 rpm. Estos cultivos se transfirieron a 25 ml de caldo LB fresco que contenfa canamicina o espectinomicina y glucosa al ^{0,2 % (en matraces de 250 ml) y se incubaron a una DO}600 ^{de 0,5 - 0,6, inmediatamente despues de lo cual se} anadio IPTG 1 mM al medio para inducir las enzimas a expresar. Durante la incubacion a 37 °C mientras se agitaba a 200 rpm, se midieron los niveles de expresion de la enzima a diversos tiempos de cultivo (8, 16, 24 horas). Los niveles de expresion enzimatica de los dos sistemas se analizaron en SDS PAGE al 14 % SDS PAGE (FIG. 4).

EJEMPLO 47: Sfntesis de cistefna por OPS sulfhidrilasa con el caldo de fermentacion de OPS purificada

Se determinaron las tasas de conversion de OPS purificada en cistefna de Msm-T y Ape-OPSS. En presencia de 75 pg/ml de cada una de las enzimas y PLP 0,2 mM, OPS 60 mM purificada del caldo de fermentacion de OPS se ^{hizo reaccionar con Na}2^{S 120 mM a 37 °C o 70 °C durante 30, 60, 90 y 120 min. La reaccion ser realizo unicamente} a 37 °C para Msm-T, pero tanto a 37 °C como a 70 °C para Ape-OPSS. Las cantidades de la cistefna producida se midieron usando el metodo de Gaitonde. Como se observa en la FIG. 5, un caldo de fermentacion de OPS purificada sirvio bien como sustrato para la conversion enzimatica en cistefna. Particularmente, la tasa de conversion de Ape-OPSS se aumento a 70 °C incluso tras el uso del caldo de fermentacion de OPS purificada.

EJEMPLO 48: Sfntesis de cistefna por OPS sulfhidrilasa con el caldo de fermentacion de OPS

Cuando se usaba un caldo de fermentacion de OPS como sustrato, las tasas de conversion de cistefna de Msm-T y ^{Ape-OPSS se midieron de acuerdo con las concentraciones de las enzimas. En presencia de Na}2^{S 100 mM y PLP} 0,2 mM, se hicieron reaccionar 50 mM de caldo de fermentacion de OPS con 5 pg/ml o 50 pg/ml de cada una de Msm-T y Ape-OPSS a 37 °C. Se midieron las cantidades de la cistefna producida usando el metodo de Gaitonde. Como se observa en la FIG. 6, la maxima tasa de conversion se detecto en 50 pg/ml de Msm-T. Ademas, tras el uso del caldo de fermentacion de OPS como sustrato, la actividad de Msm-T fue mayor que la de Ape-OPSS.

EJEMPLO 49: Tasa de conversion de cistefna de acuerdo con la concentracion de OPS

Para examinar el efecto de la concentracion de OPS sobre la tasa de conversion de Msm-T, se anadieron cantidades predeterminadas de OPS purificada al caldo de fermentacion de OPS para inducir la reaccion de conversion. La enzima se uso en una cantidad de 50 pg. Las cantidades de cistefna en la solucion de reaccion se midieron usando el metodo de Gaitonde. Msm-T mostro una tasa de conversion tan alta como de un 100 % cuando la concentracion de OPS era de aproximadamente 30 g/l.

Cuando la concentracion de OPS excedfa de 50 g/l, se descubrio que tanto la tasa de conversion como el porcentaje de conversion disminufan. A partir de estos resultados, se entiende que cuando se usa caldo de fermentacion de OPS como sustrato, hay una relacion de concentracion optima entre o Ps y la enzima.

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para producir cistefna, que comprende:

1) cultivar un microorganismo recombinante en que la actividad de fosfoserina fosfatasa SerB endogena esta reducida, para producir O-fosfoserina (OPS); y

2) hacer reaccionar la OPS de la etapa 1) con un sulfuro en presencia de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) o con un sulfuro en presencia de un microorganismo que expresa OPSS, para producir cistefna, en el que el nivel de actividad enzimatica de SerB se reduce usando una tecnica seleccionado entre el grupo que consiste en: eliminacion del gen cromosomico que codifica la enzima SerB,

la introduccion de mutacion en el gen cromosomico que codifica la enzima SerB para reducir la actividad genica endogena,

la sustitucion del gen cromosomico que codifica la enzima SerB con un gen mutado para reducir la actividad enzimatica endogena,

la introduccion de mutacion en una region reguladora para el gen que codifica la enzima SerB para reducir la actividad genica endogena, y

la introduccion de un oligonucleotido de antisentido complementario a un transcrito del gen que codifica la enzima SerB para inhibir la traduccion del ARNm.

2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la fosfoserina fosfatasa tiene una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 2.

3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante en que se altera la actividad de SerB endogena se cultiva en un medio que contiene glicina o serina.

4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que el medio contiene glicina en una cantidad de 0,1 a 10 g/l.

5. El metodo de la reivindicacion 3, en el que el medio contiene serina en una cantidad de 0,1 a 5 g/l.

6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microrganismo recombinante se modifica ademas para potenciar la actividad de fosfoglicerato deshidrogenasa SerA o fosfoserina aminotransferasa SerC.

7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que la SerA es un tipo silvestre o un mutante resultante a inhibicion por retroalimentacion de serina.

8. El metodo de la reivindicacion 6, en el que:

i) la SerA tiene una seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 3 a 7; y

ii) la SerC tiene una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8.

9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante se modifica ademas para reducir la actividad de un operon PhnCDE de phnC (componente de union a ATP del transporte de fosfonato, EG 10713)-phnD (componente de protefna de union periplasmica del transportador Pn, EG 10714)-phnE (componente de membrana integrado del transportador ABC de alquilfosfonato, EG 11283).

10. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante se modifica ademas para reducir la actividad de fosfatasa alcalina (PhoA) o fosfatasa acida AphA.

11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante se modifica ademas para potenciar la actividad de la nucleotido transhidrogenasa PntAB.

12. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante se modifica ademas para potenciar la actividad de al menos una enzima seleccionada entre el grupo que consiste en permeasa del flujo de oacetilserina/cistefna YfiK, protefna de flujo de homoserina/homoserina lactona RhtB y protefna de flujo de treonina/homoserina RhtC.

13. El metodo de la reivindicacion 6, 11 o 12, en el que el nivel de actividad enzimatica se potencia usando una tecnica seleccionado entre el grupo que consiste en aumentar un numero de copias de un gen que codifica la enzima, introduccion de una mutacion en una region reguladora para el gen para potenciar la actividad enzimatica, sustitucion del gen cromosomico con un gen mutado para potenciar la actividad enzimatica e introduccion de una mutacion en el gen cromosomico para potenciar la actividad enzimatica.

14. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante se modifica ademas para reducir la actividad de al menos una seleccionada del grupo que consiste en las isoenzimas de fosfoglicerato mutasa GpmA, GpmI o GpmB.

15. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante se modifica ademas para reducir la actividad de La L-serina deshidratasa I SdaA.

16. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante se modifica ademas para reducir la actividad de 2-amino-3-cetobutirato coenzima A ligasa Kbl o un factor de transcripcion IclR.

17. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante se modifica ademas para potenciar la actividad de al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en acetil-CoA sintetasa Acs, acido acetico cinasa AckA-fosfotransacetilasa Pta, malato sintasa G GlcB, malato deshidrogenasa MaeB, glutamato deshidrogenasa GdhA, glioxilato carboligasa Glc, tartronato semialdehfdo reductasa 2 GlxR y glicerato cinasa II GlxK.

18. El metodo de la reivindicacion 17, en el que el microorganismo recombinante se mejora en el consumo de azucar y el crecimiento por potenciacion de la actividad de al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en Glc, GlxR y GlxK.

19. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el microorganismo recombinante es Escherichia sp. o bacterias corineformes.

20. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el sulfuro de la etapa 2) se selecciona del grupo que consiste en ^Na2^{S, NaSH, (NH}4⁾2^{S, H}2^{S, Na}2^S2^O3 ^{y una combinacion de los mismos.}

21. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el sulfuro de la etapa 2) se usa a una concentracion molar de 0,1 a 3 veces tan alta como la de OPS usada en la reaccion de la etapa 2).

22. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la OPSS de la etapa 2) es de al menos una especie seleccionada del grupo que consiste en Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis y Trichomonas vaginalis.

23. El metodo de la reivindicacion 22, en el que la OPSS se modifica ademas para aumentar una tasa de conversion de la etapa 2).

24. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la reaccion de la etapa 2) se realiza en presencia de un cofactor seleccionado de PLP (piridoxal-5-fosfato) 0,001 ~ 2 mM, DTT (ditiotreitol) 0,001 ~ 100 mM y una combinacion de los mismos.

25. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas aislar y purificar la cistefna producida en la reaccion de la etapa 2).

26. Un microorganismo recombinante en que la actividad de fosfoserina fosfatasa SerB endogena esta reducida y que se modifica ademas para potenciar la actividad de fosfoglicerato deshidrogenasa SerA o fosfoserina aminotransferasa SerC, en el que la SerA es resistente a inhibicion por retroalimentacion de serina.

27. El microorganismo recombinante de la reivindicacion 26, que se modifica ademas para reducir la actividad de al menos una seleccionada entre PhnCDE, PhoA y AphA.

28. El microorganismo recombinante de la reivindicacion 26, que esta depositado con el n.° de acceso KCCM11103P.

29. Un metodo para producir N-acetilcistefna o S-carboximetilcistefna, que comprende:

1) cultivar un microorganismo recombinante en que la actividad de fosfoserina fosfatasa SerB endogena esta reducida, para producir O-fosfoserina (OPS);

2) hacer reaccionar la OPS de la etapa 1) con un sulfuro en presencia de O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) o con un sulfuro en presencia de un microorganismo que expresa OPSS, para producir cistefna, y

3) sintetizar N-acetilcistefna o S-carboximetilcistefna. a partir de la cistefna producida en la etapa 2), en el que el nivel de actividad enzimatica SerB se reduce usando una tecnica seleccionada del grupo que consiste en: eliminacion del gen cromosomico que codifica la enzima SerB,

la introduccion de mutacion en el gen cromosomico que codifica la enzima SerB para reducir la actividad genica endogena,

la sustitucion del gen cromosomico que codifica la enzima SerB con un gen mutado para reducir la actividad enzimatica endogena,

la introduccion de mutacion en una region reguladora para el gen que codifica la enzima SerB para reducir la actividad genica endogena, y

la introduccion de un oligonucleotido de antisentido complementario a un transcrito del gen que codifica la enzima SerB para inhibir la traduccion del ARNm.

30. El metodo de la reivindicacion 29, que comprende ademas aislar y purificar dicha N-acetilcistefna o S-carboximetilcistefna producida en la reaccion de la etapa 3).