BRPI0607939A2 - microorganismo, e, método para a preparação fermentativa de um aminoácido - Google Patents

Abstract

MICROORGANISMO, E, MéTODO PARA A PREPARAçãO FERMENTATIVA DE UM AMINOáCIDO A presente invenção refere-se um microorganismo em são expressadas enzimas que apresentam uma ou várias das seguintes atividades de cistationina-sintases e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilases e que apresentam, ao mesmo tempo, baixa atividade de eliminação. A presente invenção refere-se também a enzimasrecombinantes que apresentam uma ou várias das seguintes atividades de cistationina-y-sintase e/ou fosfo-homosserina e/ou acil homosserina sulfidrilase, apresentam, ao mesmo tempo, baixa atividade de y-eliminase e são usados para a produção fermentativa de aminoácidos, em particularmetionina.

Description

"MICROORGANISMO, Ε, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃOFERMENTATIVA DE UM AMINOÁCIDO"

Campo Da Invenção

A presente invenção refere-se a um microorganismo em queenzimas são expressadas que apresentam uma ou várias das seguintesatividades de cistationina-7-sintases e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ouacil homosserina sulfidrilases e que apresentam, ao mesmo tempo, baixaatividade de eliminação de 7. A presente invenção refere-se também aenzimas recombinantes que apresentam uma ou várias das seguintesatividades de cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina e/ou acilhomosserina sulfidrilase, apresentando, ao mesmo tempo, baixa atividade deγ-eliminase e são usadas para a produção fermentativa de aminoácidos, emparticular metionina.

Técnica anterior

Compostos contendo enxofre, como cisteína, homocisteína,metionina ou S-adenosilmetionina são críticos para o metabolismo celular esão produzidos industrialmente para serem usados como farmacêuticos eaditivos para alimentos e rações. Em particular a metionina, um aminoácidoessencial, que não pode ser sintetizado por animais, desempenha um papelimportante em muitas funções do corpo. Além de seu papel na biossíntese deproteína, a metionina está envolvida na transmetilação e na biodisponibilidadede selênio e zinco. Metionina também é usada diretamente como umtratamento para distúrbios clínicos, como alergia e febre reumática. Noentanto, a maior parte da metionina que é produzida é adicionada à raçãoanimal.

Quimicamente, a D,L-metionina é comumente produzida apartir de acroleína, metil mercaptano e cianeto de hidrogênio. No entanto, amistura racêmica não desempenha tão bem quanto L-metionina pura, p. ex.em aditivos para ração de frangos (Saunderson, C.L., (1985) British Journalof Nutrition 54, 621-633). L-Metionina pura pode ser produzida a partir demetionina racêmica, p. ex., por meio de tratamento [com] acilase de N-acetil-D,L-metionina que incrementa drasticamente custos de produção. A crescentedemanda de L-metionina pura associada a preocupações ambientais tornaatraente a produção microbiana de metionina.

Apenas microorganismos e plantas são capazes de biossíntesede metionina. A via para a síntese de L-metionina é bem conhecida em muitosmicroorganismos e plantas (Fig. 1). Metionina em Escherichia coli é derivadado aminoácido aspartato, porém sua síntese requer a convergência de duasvias adicionais, biossíntese de cisteína e metabolismo de Cl (N-metiltetraidrofolato).

Aspartato é convertido a homosserina por meio de umaseqüência de três reações. Homosserina pode entrar subseqüentemente a viade treonina/isoleucina ou metionina. Em E. coli a entrada na via de metioninarequer a acilação de homosserina a succinil-homosserina. Esta etapa deativação permite a condensação subseqüente com cisteína, levando àcistationina contendo tioéter, que é hidrolisada dando homocisteína. Atransferência final de metila que leva à metionina é realizada por umametiltransferase dependente de B12 ou independentemente de B12.

A biossíntese da metionina em E. coli é regulada por meio derepressão e ativação de genes biossintéticos de metionina via as proteínasMetJ e MetR. Adicionalmente a esta regulação transcricional, a entrada na viaespecífica da metionina é estritamente controlada por metA codificandohomosserina transsuccinilase (EC 2.3.1.46). Além do controle transcricionalde metA por MetJ e MetR a enzima também é regulada [por] retroalimentaçãopelos principais produtos finais da via metionina e S-adenosilmetionina (Lee,L.- W et al. (1966) Multimetabolite control of a biosynthetic pathway bysequential metabolites, JBC 241 (22), 5479-5780). A inibição deretroalimentação por estes dois produtos é sinérgica, significando que baixasconcentrações de cada metabólito sozinho são apenas ligeiramente inibitórias,enquanto que, em combinação, exerce-se uma forte inibição.

Enquanto que, em E. coli, a homosserina é ativada a succinil-homosserina que é transformada subseqüentemente a 7-cistationina por meiode cistationina-7-sintase, bactérias gram-positivas e espiroquetas ativamhomosserina a acetil-homosserina e são capazes de incorporar enxofre a partirde H2S, transformando acetil-homosserina diretamente em homocisteínausando acetil-homosserina sulfidrilase, denominada MetY em gram-positivase MetZ em espiroquetas.

Em contraste à biossíntese da metionina em eubactérias, emplantas o ponto de ramificação entre biossíntese de metionina etreonina/isoleucina situa-se no nível de fosfo-homosserina. Homosserina éfosforilada dando fosfo-homosserina, que pode reagir com treoninacatalisada pela enzima treonina sintase ou com 7-cistationina e/ouhomocisteína usando-se a enzima de planta METB apresentando atividadede cistationina-7- sintase e fosfo-homosserina sulfidrilase. Dados recentesindicam que uma via similar opera em archaea (White, 2003, Thebiosynthesis of cystein e homocystein in Methanococcus jannasehii,Biochim Biophys Acta. 1624 (l-3):46-53), porém as enzimascorrespondentes ainda não foram caracterizadas. Assim, em plantas e, maisprovavelmente, em algumas archaea a etapa comprometida para produçãode metionina consiste de síntese de 7-cistationina de fosfo-homosserina.Em plantas, a biossíntese de metionina é controlada por meio de atividadedas duas enzimas-chave cistationina-7-sintase (CGS) e treonina sintase(TS). CGS é regulada pós-transcricionalmente via uma região reguladoraN-terminal não encontrada na enzima bacteriana (Hacham et ai. 2002 PlantPhysiol. 128, 454-462). TS é ativada com retroalimentação por S-adenosilametionina, um derivado de metionina que sinaliza elevadas concentraçõesde metionina. Ambos estes mecanismos reguladores dirigem o fluxo decarbono para longa da metionina no sentido da treonina, porém não sãofuncionais em procariontes.

A expressão de diferentes cistationina-7-sintases foiensinada no pedido de patente WO 93/17112 (Genencor). O conhecimentopreciso sobre cistationina-7-sintases não existia naquele momento e não seconheciam seqüências de plantas. Pedido de patente JP2000-139471(Ajinomoto) descreve a superexpressão de cistationina-7-sintase de E. coli,porém o uso de cistationina-7-sintase de diferentes organismos não foiavaliado para a produção de metionina em qualquer organismo.

Enzimas MetB e suas contrapartes MetY/MetZ podemaceitar uma variedade de substratos diferentes, listados na Tabela 1. Estasenzimas podem catalisar quatro reações diferentes, sendo que todasrequerem homosserina ativada. Homosserina ativada pode ser fosfo-,acetila ou succinil-homosserina. (i) Em conjunto com cisteína acistationina-7-sintase produz cistationina, (ii) em conjunto com sulfeto dehidrogênio a sulfidrilase sintetiza homocisteína, (iii) em conjunto commetilmercaptano a metionina sintase produz metionina e (iiii) na ausênciade um segundo substrato 7-eliminase catalisa a dissociação do substrato ace-cetobutirato, amônia e o grupo ativador (acetato, succinato, fosfato).Várias enzimas podem catalisar mais do que uma reação, com eficiênciascatalíticas variáveis.

Por exemplo, E. coli MetB apresenta a mais elevadaeficiência catalítica com cisteína e succinil-homosserina como substratos euma atividade 7-eliminase relativamente alta na ausência de cisteína(Aitken et al. 2003, Biochemistry 42, 11297-11306). Enzimas de plantastambém são produtores de cistationina igualmente bons, mas apresentambaixa atividade de 7-eliminase. Efetivamente, o kcat de A. thaliana METBpara a atividade de 7-eliminase é de apenas 1/1500 da enzima de E. coli(Ravanel et al. 1998 Biochem. J. 331, 639-648). Algumas enzimas combaixa atividade de eliminação de 7 deveriam favorecer alta produção demetionina quando introduzidas em E. coli.<table>table see original document page 6</column></row><table>

Tabela 1. Substratos preferidos para enzimas com atividade decistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acilhomosserina sulfidrilase de diferentes organismos.

O tipo de homosserina ativada e de reação favorecida sãoindicados para enzimas de diferentes espécies ou grupos. Para detalhes, ver(Hacham et al 2003, Mol. Biol Evol. 20:1513-1520)

Sumário da invenção

A invenção baseia-se na verificação de que a produção demetionina produção é incrementada quando enzimas com atividade decistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acilhomosserina sulfidrilase são expressadas apresentando uma baixa atividade deeliminação de γ. Uso destas enzimas reduz a produção de α-cetobutirato quepode ser transformada a isoleucina, que se acumula no caldo de fermentação.

Assim, a invenção refere-se a fragmentos de DNA compreendendo genes quecodificam enzimas com atividade de cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilase que apresentamuma baixa atividade de 7-eliminase. A presente invenção refere-se também àexpressão, particularmente a superexpressão destas enzimas na produção demetionina. A invenção refere-se adicionalmente a microorganismos, depreferência enterobacteriaceae, bactérias coryneform ou levedura, em que asenzimas previamente indicadas são expressadas. Adicionalmente, a invençãodescreve um processo para a produção fermentativa de metionina, sendo queseus precursores ou derivados usam os microorganismos com as propriedadesdescritas.

Descrição detalhada da invenção

Metionina é usada em aplicações farmacêuticas e de nutriçãoanimal. Freqüentemente, o estereoisômero específico, neste caso a forma Lbiologicamente ativa, é a espécie preferida. Como a síntese química só podeproporcionar misturas racêmicas que são duras para dissolver, é de interessegeral produzir L-metionina por meio de fermentação. Um objeto destainvenção consiste, portanto, da otimização de uma cepa por meio demanipulação genética e do melhoramento de um processo fermentativo que dáL-metionina, seus precursores ou derivados em altas quantidades. Em plantase microorganismos, são necessárias diversas enzimas para a produçãofermentativa de metionina. Cistationina-γ-sintase em E. coli (SEQ ID NO 1) éuma das enzimas-chave envolvidas na biossíntese da metionina.

>E. coli |EG10582|MetB: 386 aa - Cistationina gama-sintaseMTRKQATIAV RSGLNDDEQY GCWPPIHLS STYNFTGFNE PRAHDYSRRGNPTRDWQRA LAELEGGAGA VLTNTGMSAI HLVTTVFLKP GDLLVAPHDCYGGSYRLFDS LAKRGCYRVL FVDQGDEQAL RAALAEKPKL VLVESPSNPLLRWDIAKIC HLAREVGAVS WDNT FLS PA LQNPLALGAD LVLHS CTKYLNGHSDWAGV VIAKDPDWT ELAWWANNIG VTGGAFDSYL LLRGLRTLVPRMELAQRNAQ AIVKYLQTQP LVKKLYHPSL PENQGHEIAA RQQKGFGAMLSFELDGDEQT LRRFLGGLSL FTLAESLGGV ESLISHAATM THAGMAPEARAAAGISETLL RISTGIEDGE DLIADLENGF RAANKG

Adicionalmente a sua principal atividade, a cistationina y-sintase apresenta uma atividade secundária indesejada, succinil-homosserina7-eliminase, que transforma succinil-homosserina em ce-cetobutirato,succinato e amônia. Esta atividade é particularmente pertinente se estiverempresentes apenas baixas quantidades de cisteína. Em E. coli isto leva a umaperda na produção de metionina, um problema que pode ser evitado por meiodo uso de cistationina-7-sintase que apresenta uma atividade reduzida de 7-eliminase quando comparada com a enzima de E. coli.

O objeto da invenção é, portanto, um microorganismo para aprodução fermentativa de aminoácidos em que se expressa uma ou váriasenzimas com cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ouacil homosserina sulfidrilase apresentando uma baixa atividade de 7-eliminase.

Baixa atividade de 7-eliminase significa, de acordo com ainvenção, de preferência, uma atividade de 7-eliminase inferior à atividadeobservada com a enzima de E. coli nativa. Adicionalmente, deseja-se que asenzimas com atividade reduzida de 7-eliminase apresentem atividadesespecíficas de cistationma-7-sintase e/ou acil homosserina sulfidrilase e/oufosfo-homosserina sulfidrilase. Referida atividade pode ser eventualmentequando as atividades das enzimas de E. coli nativas.

As referidas enzimas expressadas com cistationina-7-sintasee/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilase queapresentam uma baixa atividade de 7-eliminase são, de preferência, diferentesdas enzimas nativas presentes no mesmo organismo. Elas podem ser genesmutados da mesma espécie ou genes nativos ou mutados de outras espécies.

De acordo com uma concretização preferida da presenteinvenção, o microorganismo é transformado para introduzir um gene quecodifica uma enzima com referida baixa atividade de 7-eliminase. Referidogene pode ser introduzido por diferentes meios disponíveis para a pessoaversada na técnica:

- modificação do gene nativo por meio de recombinaçãohomóloga para introduzir mutações na enzima codificada pelo referido genepara reduzir a atividade de 7-eliminase e manter a atividade de enzima;

- integrar no genoma do microorganismo um gene estranhoque codifica para a enzima selecionada conhecida por apresentar baixaatividade de 7-eliminase; sendo que referido gene estranho encontra-se sob ocontrole de elementos reguladores funcionais no microorganismo hospedeiro;

- introduzir um plasmídio compreendendo um gene estranhoque codifica para a enzima selecionada conhecida por apresentar baixaatividade de 7-eliminase sob o controle de elementos reguladores funcionaisno microorganismo hospedeiro.

Quando o gene é integrado no genoma do microorganismo, elepode ser introduzido vantajosamente em um lócus selecionado para substituiro gene nativo.

Métodos usados para transformar microorganismos são bemconhecidos η técnica, incluindo recombinação homóloga.

É de conhecimento geral que cistationina-7-sintases de plantaapresentam menores atividades de 7-eliminase do que a enzima de E. coli(Ravanel et al, 1998, Biochem. J. 331, 639-648). No entanto, nunca semostrou que o uso de enzimas de plantas na produção fermentativa demetionina apresenta uma vantagem, em comparação com o uso da enzima deE. coli nativa. Assim, esta invenção refere-se a o uso de cistationina-7-sintasede planta para incrementar a produção fermentativa de metionina.

Enzimas de planta usam fosfo-homosserina como umsubstrato, enquanto que a enzima de E. coli aceita succinil-homosserina e, atécerto ponto, acetil-homosserina. Mostrou-se recentemente que a biossíntesede metionina em archaea prossegue provavelmente via fosfo-homosserina.Até aqui as enzimas não foram caracterizadas. Assim, a invenção refere-setambém ao uso de enzimas archaea com atividade de cistationina-7-sintasee/ou fosfo-homosserina sulfidrilase na produção fermentativa de metionina.

O homólogo mais próximo das cistationina-7-sintases deplanta em bactérias é encontrado na bactéria fotossintética Chloroflexus.Alinhamentos desta enzima com enzimas de planta demonstram que osaminoácidos requeridos para a ligação do grupo fosfo, que foramdeterminados a partir de comparações estruturais entre as enzimas de E. coli ede planta (Steegborn et al. 2001 J. Mol. Biol. 311, 789-801) são conservadosna enzima Chloroflexus (Fig. 2).

Assim, um microorganismo expressando um homólogo dogene de Chloroflexus, p. ex. o gene >gi|53798754|ref]ZP_00020132.2|COGOÓ26 de Chloroflexus aurantiacus, também é objeto desta invenção.

Objetos adicionais da invenção são enzimas com atividade decistationina-7-sintase/ fosfo-homosserina sulfidrilase que conservaram osaminoácidos nas posições 107E, 11IY3 165K, 403S (ver alinhamento Fig.2)permitindo o uso de fosfo-homosserina como um substrato e, assim,apresentando uma reduzida atividade de eliminação de γ. Posições deaminoácidos são dadas com referência à seqüência de Nicotiana tabacum. Amesma posição de aminoácido pode ser identificada sem experimentaçãodesnecessária por meio de simples alinhamento de seqüências (ver Fig. 2).

Como parte da via biossintética da treonina, fosfo-homosserinaé produzida em E. coli e, portanto, poderia ser transformada diretamente emγ-cistationina e/ou homocisteína. Em contraste com plantas eenterobacteriaceae, várias bactérias gram-positivas usam um mecanismo paraativar homosserina que se baseia na transferência de um grupo acetila parahomosserina dando acetil-homosserina. Subseqüentemente, acetil-homosserina é transformada em homocisteína por meio de sulfidrilaçãousando-se uma acetil-homosserina sulfidrilase MetY ou em γ-cistationinausando-se cistationina-7-sintase. Esta reação foi usada para produzirmetionina por meio de fermentação em bactérias coryneform como descritonos pedidos de patentes W02004024933 e EP 1313871. No entanto, os genescorrespondentes nunca foram testados em E. coli e sua atividade de γ-eliminase não foi determinada.

Assim, a presente invenção refere-se também ao uso deenzimas MetY em E. coli com baixa atividade de γ-eliminase, mas comatividade de sulfidrilase comparável ou incrementada com relação à enzimade E. coli.

De acordo com outra concretização da presente invenção,também é possível obter diminuição da atividade de γ-eliminase da enzimanativa ou introduzida, por meio de otimização da enzima, p. ex. por meio deevolução direta ou mutagênese direcionada-para-sítio como descrito emSambrook et ai. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2a ed. ColdSpring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.). A enzima tambémpode se otimizada por meio de mutagênese randômica usando-se mutágenos,como NTG ou EMS ou por meio de evolução in vivo como descrito empedidos de patentes PCT/FR04/00354. Enzimas otimizadas também podemser genes sintéticos que se baseiam em genes naturais e apresentando uso decódon otimizado e teor de GC para o organismo hospedeiro. Portanto,constitui objeto da invenção o uso de enzimas otimizadas com reduzidaatividade de 7-eliminase ou incrementada atividade de cistationina-7-sintasee/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilase.

Um exemplo particular de uma enzima otimizada é umaenzima otimizada de cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilasee/ou acil homosserina sulfidrilase enzima, em particular a enzima MetB de E.coli, em que a alanina na posição 337 foi substituída por uma prolina que éaltamente expressa em enzimas de diferentes gêneros bacterianos e/oucompreendendo uma alanina na posição 335. Exceto se indicado de outraforma, posições são dadas com referência à enzima de E. coli nativa.

A presente invenção refere-se adicionalmente a seqüências denucleotídeos, seqüências de DNA ou RNA, que codificar cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilasede acordo com a invenção como definido acima.

As cistationina-7-sintases e fosfo-homosserina sulfidrilasese/ou acil homosserina sulfidrilases são selecionadas vantajosamente entre asenzimas correspondentes às referências de PFAM PFO1053 e à referência deCOG COGOÓ26 e COG2873.

As PFAM (protein families daíabase of alignments and hiddenMarkov models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) banco de dados defamílias de proteínas de alinhamentos e modelos de Marcov ocultos] formamuma grande coleção de alinhamentos de seqüências de proteínas. Cada PFAMtorna possível visualizar alinhamentos múltiplos, ver domínios de proteínas,avaliar distribuição entre organismos, obter acesso a outros bancos de dados,e visualizar estruturas de proteínas conhecidas.

Os COGs (clusters of orthologous groups of proteins\http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) [aglomerados de grupos ortólogos deproteínas] são obtidos comparando-se as seqüências de proteínas de 43genomas totalmente seqüenciados representando 30 linhas filogenéticasprincipais. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhas, o que,portanto, torna possível identificar domínios conservados antigos.

As enzimas preferidas são a cistationina-7-sintase deArabidopsis thaliana (número de acesso gi: 1389725), a cistationina-7-sintaseputativa e/ou sulfidrilase de Methanosarcia barkeri (número de acessogi:48839517), a acetil-homosserina sulfidrilase de Saccharomyces cerevisiae(número de acesso YLR303W), a cistationina-7-sintase putativa e/ousulfidrilase de Chloroflexus aurantiaeus (gi:53798753) e a acetil-homosserinasulfidrilase de Corynebaeterium glutamieum (gi:41324877) como genesintético adaptado a E. eoli. Estas seqüências são alinhadas com as seguintesseqüências representativas:

>gi|8439541 |gb|AAF74981.1 |AF082891_1 cistationina gama-sintase,isoforma 1 [Solanum tuberosum]

>gi|4959932|gb|AAD34548,l|AF141602_l cistationina-gama-sintase,precursor [Glyeine max]

>gi|2198853|gb|AAB61348,1 |cistationina gama-sintase [.Zea mays]>gi|4322948|gb|AAD16143,l|cistationina gama-sintase, precursor [.Nicotianatabacum]

>gi|11602834|gb|AAG38873,l|AF076495_l cistationina gama-sintase [Oryzasativa]

>gi|305042|gb|AAB03071.1 |cistationina gama-sintase [.Escherichia eoli]

As seqüências homólogas destas seqüências que apresentamuma atividade de cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilasee/ou acil homosserina sulfidrilase, e apresentam pelo menos 80 % dehomologia, e, de preferência, 90 % de homologia, e mais preferivelmente, 95% de homologia com as seqüências de aminoácidos descritas acima tambémsão objeto desta invenção.

Os meios de identificar seqüências homólogas e seu percentualde homologia são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, e incluem,em particular, o programa BLAST, e, em particular, o programa BLASTP,que podem ser usados a partir do website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros padrão indicados naquele sítio.

Para determinar quais enzimas podem ser benéficas para aprodução de metionina quando introduzidas na cepa correspondentes, épossível avaliar enzimaticamente as atividades de γ-eliminase. Por exemplo,cistationina-7-sintase, atividade de γ-eliminase e sulfidrilase atividades podemser determinadas em testes enzimáticos com homosserina ativada e (i) semoutro substrato, ou (ii) cisteína, ou (iii) H2S como substrato. A reação éiniciada por meio de adição do extrato de proteína contendo a correspondenteatividade enzimática, e a formação de homocisteína e/ou γ-cistationina émonitorada por meio de GC-MS após precipitação de proteína e derivatizaçãocom um reagente de sililação.

O(s) gene(s) que codifica(m) cistationina-y-sintase e/ou fosfo-homosserina e/ou acil homosserina sulfidrilase podem ser codificadoscromossomicamente ou extra-cromossomicamente, Cromossomicamentepode haver uma ou várias cópias no genoma que podem ser introduzidas pormeio de métodos de recombinação conhecidos pela pessoa versada no campo.Extra-cromossomicamente, genes podem ser realizados por meio dediferentes tipos de plasmídeos que diferem com relação a sua origem dereplicação e, portanto, seu número de cópias na célula. Podem estar presentesde 1 a 5 cópias, sendo que cerca de 20 ou até 500 cópias correspondem aplasmídios com baixo número de cópias com replicação estreita (pSClOl,RK2), plasmídios com baixo número de cópias (pACYC, pRSFlOlO) ouplasmídios com alto número de cópias (pSK bluescript II).

Os genes metB podem ser expressados usando-se promotorescom intensidade diferente que precisam ou que não precisam ser induzidospor moléculas indutoras. São exemplos os promotores Ptrc, Ptac, Plac, opromotor lambda cl ou outros promotores conhecidos pela pessoa versada nocampo.

Expressão dos genes-alvo podem ser reforçados ou reduzidospor elementos que estabilizam ou desestabilizam o RNA mensageirocorrespondente (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou aproteína (p. ex. marcadores GST, Amersham Biosciences).

A presente invenção refere-se também a microorganismos quecontêm um ou vários alelos que codificam uma cistationina-7-sintase e/ou acilhomosserina e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase de acordo com a invenção.

Referidas cepas são caracterizadas pelo fato de que apresentamum metabolismo de metionina que permite um fluxo incrementado no sentidoda metionina, ou por meio do uso exclusivo de enzimas aceitadoras de fosfo-homosserina e, assim, reduzindo a quantidade de α-cetobutirato produzido, oudo uso de enzimas aceitadoras de fosfo-homosserina adicionalmente aenzimas aceitadoras de acil homosserina, incrementando com isso o fluxo nosentido da metionina.

Em particular, a invenção refere-se à preparação de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos, por meiodo cultivo de microorganismos inéditos e isolamento dos compostos contendoenxofre que foram produzidos. E possível obter um incremento da produçãode L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos,reduzindo-se os níveis de expressão ou deletando-se um dos genes a seguir.

Gene entrada no Genbank atividadeackA 1788633 acetato quinasepta 1788635 fosfotransacetilaseacs 1790505 acetato sintaseace E 1786304 piruvato desidrogenase Elace F 1786305 piruvato desidrogenase E2Ipd 1786307 piruvato desidrogenase E3sucC 1786948 succinil-CoA sintetase, subunidade betasucO 1786949 succinil-CoA sintetase, subunidade alfapck 1789807 fosfoenolpiruvato carboxiquinasepykA 1788160 piruvato quinase IIpykF 1787965 piruvato quinase Ipox B 1787096 piruvato oxidaseí/vB 1790104 ácido acetóxi-hidróxi sintase I, subunidade grandeilvN 1790103 ácido acetóxi-hidróxi sintase I, subunidade pequenailvG 1790202 ácido acetóxi-hidróxi sintase II, subunidade grande 1790203 ilvM 1790204 ácido acetóxi-hidróxi sintase Π, subunidade pequenailvl 1786265 ácido acetóxi-hidróxi sintase ΙΠ, subunidade grandeilvH 1786266 ácido acetóxi-hidróxi sintase III, subunidade pequenaaroF 1788953 DAHP sintetasearoG 1786969 DAHP sintetasearoH 1787996 DAHP sintetase

Um aumento adicional da produção de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos, pode ser obtidosuperexpressando um ou vários dos genes a seguir: a piruvato carboxilase deRhizobium etli (pyc, U51439), ou um de seus homólogos, as enzimassintetizadoras de homosserina codificadas pelos genes thrA (homosserinadesidrogenase/aspartoquinase, 1786183), de preferência com reduzidasensibilidade de retroalimentação, met L (homosserinadesidrogenase/aspartoquinase, gl790376) ou IysC (aspartoquinase, 1790455)e asd (aspartato semialdeído desidrogenase, 1789841) ou uma combinaçãodos mesmos.

Um incremento adicional da produção de L-metionina, seusprecursores ou compostos derivados da mesma, é possível por meio desuperexpressão de genes envolvidos na assimilação de sulfato e produção decisteína. Uma quantidade incrementada de compostos contendo enxofretambém reduzirão a atividade de γ-eliminase. Isto pode ser obtido por meio desuperexpressão dos seguintes genes (ver abaixo) ou por meio de desregulaçãoda via por meio da introdução de um alelo cysB constitutivo como descritopor Coyler e Kredich (1994 Mol Microbiol 13, 797-805) e por meio deintrodução de um alelo cysE codificando uma serina acetil transferase comsensibilidade diminuída por seu inibidor L-cisteína (pedido de patente dosE.U.A. US 6,218,168, Denk & Bock 1987 J Gen Microbiol 133 515-25). Os

genes a seguir precisam ser superexpressados. CysA 1788761 sulfato permeaseCysU 1788764 sistema de transporte de cisteínaCysW 1788762 sistema de transporte de sulfato ligado a membranasCysZ 1788753 ORF a montante de cysKcys*N 1789108 ATP sulfiirilasecysO 1789109 sulfato adenililtransferasecysC 1789107 adenililsulfato quinasecysR 1789121 adenililsulfato redutasecysl 1789122 sulfito redutase, subunidade alfacysJ 1789123 sulfíto redutase, subunidade betaçysE 1790035 serina acetiltransferasecysK 1788754 cisteína sintasecysM 2367138 O-acetil-sulfidrolasecysW 1788762 transporte de sulfatocysT transporte de sulfatocysZ 1788753 transporte de sulfatosbp 1790351 proteína de ligação de sulfato periplásmico Adicionalmente, é possível incrementar genes envolvidos na produção de grupos Cl (metila) por meio de superexpressando dos seguintes genes: serA 1789279 fosfoglicerato desidrogenase, de preferência resistente a retroalimentaçãoserB 1790849 fosfoserina fosfataseserC 1787136 fosfoserina aminotransferaseglyA 1788902 serina hidroximetiltransferasemetF 1790377 5,10-metilenotetraidrofolato redutase Adicionalmente, é possível superexpressar genes envolvidosdiretamente na produção de metionina: metB 1790375 cistationina-7-sintasemetC 1789383 cistationina-/3-liasemetH 1790450 homocisteína-N5-metiltetraidrofolato transmetilase dependente de B12metE 2367304 tetraidropteroiltriglutamato metiltransferase

metF 1790377 5,10-metilenotetraidrofolato redutase

metR 1790262 gene regulador positivo para metE e metH e

regulação autógena

Adicionalmente, a expressão de genes em vias de degradaçãode metionina ou o desvio da via de produção de metionina pode ser reduzidoou os genes podem ser deletados.

speD 1786311 S-adenosilmetionina descarboxilase

spe C 1789337 ornitina descarboxilase

astA 1788043 arginina succiniltransferase

dapA 1788823 diidrodipicolinato sintase

Reações anapleróticas podem ser reforçadas por meio deexpressão de

ppc 1790393 fosfoenolpiruvato carboxilase

pps 1787994 fosfoenolpiruvato sintase

Um aumento adicional da produção de L-metionina, seusprecursores ou compostos derivados da mesma, é obtido por meio de deleçãodo gene para a proteína repressora MetJ, responsável pela regulação parabaixo do régulon de metionina como foi sugerido na JP 2000157267-A/3 (vertambém GenBank 1790373).

A produção de metionina pode ser incrementadaadicionalmente por meio do uso de um alelo de metB alterado que usapreferivelmente ou exclusivamente H2S e, assim, produz homocisteína a partirde O-succinil-homosserina como foi descrito no pedido de patente PCT N0PCT/FR04/00354, cujo teor é incorporado aqui por referência.

Em um pedido preferido, o organismo é E. coli ou C.glutamicum ou Saccharomyces eerevisiae.

A invenção também se refere ao processo para a produção deL-metionina, seus precursores ou compostos derivados da mesma, que é/sãousualmente preparados por meio de fermentação da cepa bacteriana projetada.

De acordo com a invenção, os termos 'cultura' e 'fermentação'são usados indiferentemente para indicar o crescimento de ummicroorganismo em um meio de cultura apropriado contendo uma fonte decarbono simples.De acordo com a invenção uma fonte de carbono simples éuma fonte de carbono que pode ser usada por aqueles com prática na técnicapara obter crescimento normal de um microorganismo, em particular de umabactéria. Em particular, pode ser um açúcar assimilável, como glicose,galactose, sacarose, lactose ou melaço, ou subprodutos destes açúcares. Umafonte de carbono simples particularmente preferida é glicose. Outra fonte decarbono simples preferida é sacarose.

Aqueles com prática na técnica são capazes de definir ascondições de cultura para os microorganismos de acordo com a invenção. Emparticular, as bactérias são fermentadas a uma temperatura entre 20°C e 55°C,

De preferência entre 25°C e 40°C, e mais especificamente de cerca de 30°Cpara C. glutamicum e de cerca de 37°C para E. coli.

A fermentação é realizada geralmente em fermentadores comum meio de cultura inorgânico de composição definida conhecida adaptada àsbactérias usadas, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples, e, senecessário, um co-substrato necessário para a produção do metabólito.

Em particular, o meio de cultura para E. coli pode apresentarcomposição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl.Acad. Sd. USA 32:120-128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course inBacterial Geneties: A Laboratory Manual and Handbook for Eseheriehia colie Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York) ou um meio, como definido por Schaefer et al. (1999,Anal. Biochem. 270: 88-96).

Analogamente, o meio de cultura inorgânico para C.glutamicum pode apresentar composição idêntica ou similar ao meio BMCG(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol 32: 205-210) ou a um meio,como aquele descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol Microbiol Biotechnol.3: 573-583). O meio pode ser suplementado para compensar auxotrofiasintroduzidas por mutações.Após a fermentação, L-metionina, seus precursores oucompostos derivados da mesma, é/são recuperados e purificados senecessária. Os métodos para a recuperação e purificação do produtoproduzido, como metionina, no meio de cultura são bem conhecidos poraqueles versados na técnica.

A fonte de carbono usada para a produção fermentativa de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados da mesma, pode serqualquer um dos seguintes: sulfato, tiossulfato, sulfeto de hidrogênio,metilmercaptano.

Legendas das Figuras:

Fig. 1. Vias metabólicas que convertem oxaloacetato emtreonina, isoleucina e metionina. Homólogos de MetB podem catalisar pelomenos três reações: síntese de γ- cistationina, sulfidrilação ou eliminação de γde homosserina ativada. Homólogos de MetB que aceitam preferencialmentefosfo-homosserina são mostrados em vermelho, enzimas aceitadoras desuccinil homosserina são representadas em azul e enzimas transformadoras deacetil-homosserina (MetBImetZ) são indicadas em verde.

Fig. 2. Alinhamento de enzimas com atividade de cistationina-γ-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acetil-homosserinasulfidrilase de plantas e espécies bacterianas. Os radicais mostrados em caixascinzas tornam a enzima específica para a ligação de fosfo-homosserina.Aminoácidos altamente conservados são mostrados em vermelho, radicaisconservados em azul.

Exemplo 1: Construção de uma cepa usando exclusivamente METBaceitadora de fosfo-homosserina de planta com baixa atividade de γ-eliminasepara produção de metionina

Para verificar que CGS de planta apresentam uma menoratividade de 7-eliminase do que a enzima de E. coli, determinou-se as relaçõesentre atividade de γ-eliminase e atividade de CGS da enzima METB deArabidopsis e a enzima de E. coli em extratos brutos. Para este fim, construiu-se cepas de E. coli em que a cópia cromossômica do gene metB foi deletada ese CGS de E. coli ou Arabidopsis foi expressada a partir do plasmídio.Concomitantemente, com a deleção de metB o gene metJ também foieliminado (ver abaixo).

Cepas de E. coli AmetJB portando cistationina-7-sintase e/ousulfidrilases aceitadoras de acil homosserina ou fosfo-homosserina de tiposelvagem ou heterólogas foram cultivadas em meio mínimo com 5 g/l deglicose e colhidas numa fase Iog tardia. Células foram ressuspensas emtamponador de fosfato de potássio frio e sonificadas sobre gelo (sonificadorBranson, 70W). Após centrifugação, proteínas contidas nos sobrenadantesforam quantificadas (Bradford, 1976).

Dez μ\ dos extratos foram incubados durante 10 minutos a30°C com 5 mM de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina e com1,5 mM de sulfeto de sódio ou cisteína. Proteínas foram precipitadas comacetona e homocisteína ou γ-cistationina produzida durante a reaçãoenzimática foi quantificada com GC-MS, após derivatização com t-butildimetilsililtrifluoroacetamida (TBDMSTFA). L-Serina [1-13C] foiincluída como um padrão interno. Alternativamente, mediu-se odesaparecimento de cisteína usando-se o mesmo protocolo.

Para inativar o gene metB e metJ usou-se a estratégia derecombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). Estaestratégia permitiu a inserção de uma cassete de resistência ao cloranfenicol,ao mesmo tempo que deletou a maior parte dos genes relacionados. Para esteobjetivo usou-se os seguintes oligonucleotídeos:

DmetJR (SEQ ID NO 2): tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatcaggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttg ctttagtatt cccacgtctc TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

com- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência(4125596-4125675) do gene metJ (seqüência de referência no website[endereço da rede mundial de computadores]http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

uma região (letras maiúsculas) para a amplificação da cassetede resistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K.A. &Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), DmetJBF (SEQ ID NO 3):tatgcagctg acgacctttc gcccctgcct gcgcaatcac actcattttt accccttgtt tgcagcccggaagccatttt CAGGCACCAG AGTAAACATT

com

- uma região (letras minúsculas) homólogas à seqüência(4127460-4127381) do gene metB e uma região (4126116-4126197)homóloga ao promotor de meiL

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação da cassetede resistência ao cloranfenicol.

Os oligonucleotídeos DmetJBR e DmetJBF foram usados paraamplificar a cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeopKD3. O produto de PCR obtido foi então introduzido por meio deeletroporação na cepa MG1655 (pKD46) em que a enzima recombinase Redfoi expressada permitindo a recombinação homóloga. Selecionou-setransformantes resistentes ao cloranfenicol e verificou-se a inserção da cassetede resistência por meio de análise de PCR com os oligonucleotídeos MetJR eMetJF definidos abaixo. A cepa conservada foi denominada MGl 655(AmetjB::Cm).

MetJR (SEQ ID NO 4): ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc(homóloga à seqüência de 4125431 a 4125460).

MetLR (SEQ ID NO 5): aaataacact tcacatcagc cagactactgccaccaaattt (homóloga à seqüência de 4127500 a 4157460).

A cassete de resistência ao cloranfenicol foi então eliminada.O plasmídeo pCP20 portando recombinase FLP atuando nos sítios FRT dacassete de resistência ao cloranfenicol foi introduzido nas cepasrecombinantes por meio de eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C,verificou-se a perda da cassete de resistência ao cloranfenicol por meio deanálise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos que aqueles usadospreviamente.

Para a produção de metionina usando METB aceitadora defosfo-homosserina a partir de Arabidopsis thaliana construiu-se a cepa deEscherichia coli a seguir. O repressor de metionina metJ em conjunto commetB de E. coli foram deletados como descrito acima.

Subseqüentemente deletou-se o gene metA que codificasuccinil-homosserina transferase e/ou o gene thrC que codifica treoninasintase. A estratégia de deleção foi exemplificada para a deleção de metJB. Adeleção de todos os outros genes baseou-se na mesma estratégia usando-se osoligonucleotídeos indicados. Os oligonucleotídeos para as deleções dos genesmetA e thrC são indicados abaixo. Os números em parênteses indicam asregiões que são homólogas ao cromossomo de E. coli. Oligonucleotídeoscomeçando com D foram usados para a deleção efetiva, outrosoligonucleotídeos para a verificação das construções ou para fins específicos,conforme indicado.

Para a deleção do gene metA usou-se os oligonucleotídeos aseguir: OmetAF (4211866-4211945; SEQ ID NO 6): ttcgtgtgcc ggacgagctacccgccgtca atttcttgcg tgaagaaaac gtctttgtga tgacaacttc tcgtgcgtctTGTAGGCTGG AGCTGCTTCG OmetAR (4212785-4212706; SEQ ID NO7): atccagcgtt ggattcatgt gccgtagatc gtatggcgtg atctggtaga cgtaatagttgagccagttg gtaaacagta CATATGAATA TCCTCCTTAG

MetAF (4211759-4211788; SEQ ID NO 8): tcaccttcaacatgcaggct cgacattggc MetAR (4212857-4212828; SEQ ID NO 9): ataaaaaaggcacccgaagg tgcctgaggtPara a deleção do gene thrC usou-se os seguintesoligonucleotídeos: DthrCF (3740-3821; SEQ ID NO 10): ctctacaatctgaaagatca caacgagcag gtcagctttg cgcaagccgt aacccagggg ttgggcaaaaatcaggggcT GTAGGCTGGAG CTGCTTCG DthrCR (5012-4932; SEQ IDNO 11): gattcatcat caatttacgca acgcagcaaa atcggcgggc agattatgtg aaagcaagggtaaatcagca cgttctgcCA TATGAATATC CTCCTTAG thrCF (3490-3511; SEQID NO 12): cgctgaaccc taccgtgaac gg thrCR (5284-5260; SEQ ID NO 13):gcgaccagaa ccagggaaag tgcg

Para incrementar adicionalmente a produção de homosserina aaspartoquinase/homosserina expressou-se um alelo thrA* com resistência deretroalimentação reduzida à treonina a partir do plasmídeo pCL1920 (Lerner& Inouye, 1990, NAR 18, 15 ρ 4631) usando-se o promotor Ptrc. Para aconstrução do plasmídeo pME101-í/zrA*l thrA foi amplificado com PCR apartir de DNA genômico usando-se os oligonucleotídeos a seguir:BspmthrA (SEQ ID NO 14):ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc

.SmalthrA (SEQ ID NO 15):ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc

O fragmento amplificado com PCR foi cortado com enzimasde restrição BspEl e Smal e clonado nos sítios NcoVSmal do vetor pTRC99A(Stratagene). Para a expressão de um vetor com baixo número de cópias,construiu-se o plasmídeo pMElOl como a seguir. O plasmídeo pCL1920 foiamplificado com PCR usando-se os oligonucleotídeos PMElOlF e PME10IRe o fragmento BstZ17I-XmnI do vetor pTRC99A abrigando o gene Iacl e opromotor Ptrc foi inserido no vetor amplificado. O vetor resultante e o vetorabrigando o gene thrA foram restrito com Apal e Smal e o fragmentocontendo thrA foi clonado no vetor pMElOl. Para liberar ThrA da inibição deretroalimentação introduziu-se a mutação F318S por meio de mutagênesedirecionada-para-sítio (Stratagene) usando-se os oligonucleotídeos Thr^4FF318S e ThraR F318S, resultando no pME101-thrA*l, denominado pSBl.

PMElOlF (SEQ ID NO 16): CcgacagtaagacgggtaagcctgPMElOIR (SEQ ID NO 17): AgcttagtaaagccctcgctagThraF F318S (Smal) (SEQ ID NO 18):CcaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggcccgggThrAR F318S (Smal) (SEQ IDNO 19):Cccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattgg

Para transformar parte da homosserina produzida na fosfo-homosserina o gene thrB foi clonado no vetor pSBl, thrB foi amplificadocom PCR usando-se os oligonucleotídeos thrA'BF e thrA1BRthrABF (SEQ ID NO 20): tacgatgtac atggccttaa tctggaaaac tggcthrA'BR (SEQ ID NO 21): tcccccgggT TAGTTTTCCA GTACTCGTGC GCCC

O fragmento de PCR foi digerido com BsrG 1 e SmaI e clonadono vetor pSB 1 cortado por meio das mesmas enzimas de restrição, resultandono plasmídeo pSB2.

Subseqüentemente a enzima METB de Arabidopsis thalianafoi amplificada com PCR a partir de um clone de cDNA que écomercialmente obtenível (TAIR, http://arabidopsis.org/contact/) usando-seos oligonucleotídeos gapA-cgsAF e cgsAR. Os oligonucleotídeos gapA-cgsAF consistiram de nucleotídeos de 1 a 38 de METB (negrito) enucleotídeos de 1860761 a 1960799 (sublinhado) de E. coli pertencentes àregião promotora de GapA.

gapA-cgsAF (SEQ ID NO 22): ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgttgagctccgatg ggagcctcac tgttcatgcc ggcgsAR (SEQ ID NO 23): AATCGCGGAT CCGAATCCGG TCAGATGGCTTCGAGAGCTT GAAGAATGTC AGC

Ao mesmo tempo, a região promotora de GapA do gene de E.coli GapA foi amplificada usando-se os oligonucleotídeos gapA-cgsAR e GapAF. O oligonucleotídeo gapA-cgsAR abriga bases de 1 a 39 do gene MetB ebases de 1860799 a 1860761 do cromossomo de E. coli correspondente àregião promotora de GapA. O oligonucleotídeo GapAF corresponde às basesde 1860639 a 1860661 do genoma de E. coli.

gapΑ-cgsAR (SEQ ID NO 24): ccggcatgaa cagtgaggct cccatcggag ctcaacatatattccaccag ctatttgtta gtgaataaaag g

GapAF (SEQ ID NO 25): acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc

Ambos os fragmentos foram fundidos subseqüentementeusando-se os oligonucleotídeos cgsAR e GapAF (Horton et ai. 1989 Gene77:61-68), cortados com as enzimas de restrição BamHl e Smal e clonadosnos sítios de restrição correspondentes dos vetores pSBl e pSB2 dando vetorpSB3 (pMElOlíArA* -metBAt) e pSB4 (pMElOlí/zrA* -thrB-metBAt),respectivamente.

Os vetores pSB3 e pSB4 foram introduzidossubseqüentemente na cepa AmetBJ AmeiA AthrC.

Exemplo 2: Construção de uma cepa usando exclusivamente METB de plantacom baixa atividade de γ-eliminase para produção de metionina via O-succinil-homosserina.

Para o uso de METB de planta para a produção de metioninavia succinil-homosserina construiu-se a cepa AmetBJ metA*. A construção éiniciada com as cepas descritas no exemplo 1 em que uma homosserinaresistente a retroalimentação transsuccinilase metA* 11 (descrita no pedido depatente PCT IB2004/001901) é introduzida no genoma. Para este fim, o alelode metA* 11 foi amplificado a partir do cromossomo de E. coli usando-se osoligonucleotídeos a seguir.

MetArcF (4211786-4211883; SEQ ID NO 26): ggcaaatttt ctggttatct tcagctatctggatgtctaa acgtataagc gtatgtagtg aggtaatcag gttatgccga ttcgtgtgcc ggacgagcMetArcR (4212862-4212764; SEQ ID NO 27): cggaaataaa aaaggcacccgaaggtgcct gaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg actatcacag aagattaatc cagcgttggattcatgtgcO plasmídeo pKD46 foi introduzido nas cepas MG1655AmetA AthrC e MG165 5 AmetA e transformado com o fragmento de DNAabrigando o alelo de metA* II. Clones foram selecionados quanto àprototrofia da metionina em placas M9 modificadas. Subseqüentemente amutação AmetBJ foi adicionada como descrito acima. O plasmídeo pSB3 epSB4 foram introduzidos nas duas cepas.

Exemplo 3: Construção de uma cepa usando METB aceitadora de fosfo-homosserina de planta com baixa atividade de γ-eliminase e uso simultâneode MetB de E. coli.

Para reforçar adicionalmente a síntese de metionina construiu-se uma cepa que produz simultaneamente via O-succinil homosserina e fosfo-homosserina. A construção foi iniciada com as cepas AmetA e AmetA AthrCdescritas no exemplo 1 em que o gene meti foi deletado usando-se osoligonucleotídeos a seguir:

DmetJF com 100 bases (SEQ ID NO 28): caggcaccag agtaaacatt gtgttaatggacgtcaatac atctggacat ctaaacttct ttgcgtatag attgagcaaa CATATGAATATCCTCCTTAG

DmetJR with 100 bases (SEQ ID NO 29): tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatcaggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttg ctttagtatt cccacgtctc TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

MetJR (SEQ ID NO 30): ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc (homóloga com aseqüência de 4125431 a 4125460).

MetBR (SEQ ID NO 31): ttcgtcgtca tttaacccgc tacgcactgc (homóloga com aseqüência de 4126305 a 4126276).

Subseqüentemente introduziu-se no genoma uma homosserinatranssuccinilase resistente a retroalimentação metA* 11 (descrita no pedido depatente PCT IB2004/001901). Para este fim o alelo metA* 11 foi amplificadodo cromossomo de E. coli usando-se os oligonucleotídeos a seguir.MetArcF (4211786-4211883; SEQ ID NO 32): ggcaaatttt ctggttatct tcagctatctggatgtctaa acgtataagc gtatgtagtg aggtaatcag gttatgccga ttcgtgtgcc ggacgagcMetArcR (4212862-4212764; SEQ ID NO 33): cggaaataaa aaaggcacccgaaggtgcct gaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg actatcacag aagattaatc cagcgttggattcatgtgc

0 plasmídeo pKD46 foi introduzido nas cepas MG1655 AmetJAmetA AthrC e MGl 655 Ametl AmetA que foram transformadas com ofragmento de DNA abrigando o alelo de me/A* 11. Clones foram selecionadospara prototrofia de metionina em placas M9 modificadas (suplementadas comtreonina, se necessário).

De maneira análoga à construção de pSB3 e pSB4 usando-semetBylt no exemplo 1, o gene metB de E. coli com seu próprio promotor foiclonado nos vetores pSB 1 e pSB2 por meio de amplificação dos mesmos comos oligonucleotídeos MetBF e MetBR e clonagem do amplificado com PCRnos sítios de restrição Pstl e Hindlll.

MetBF (4125957-4125982) (SEQ ID NO 34): ttagacagaa çtgçagcgccgctccattca gccatgagat ac

MetBR (4127500-4127469) (SEQ ID NO 35): cgtaacgccc aagcttaaataacacttcac atcagccaga ctactgcc

Os vetores resultantes são denominados pSB5 (pMElOlthrA*-metBEc) e pSB6 (pME 101 thrA* -thrB-metBEc).

Subseqüentemente, o plasmídeos pSB3, pSB4, pSB5 e pSB6foram introduzidos nas cepas de MG165 5 AmetJ me/A* 11 AthrC e MG165 5Ametl metA* 11.

Exemplo 4: Produção de metionina via fosfo-homosserina e/ou O-succinil-homosserina usando-se sulfato ou sulfeto de hidrogênio como fonte deenxofre

A produção de aminoácidos das cepas construídas no exemplode 1 a 3 é analisado em culturas em frasco de Small Erlenmeyer usando-semeio M9 modificado (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 32:120-128) que é suplementado com 5 g/l de MOPS, 5 g/l de glicose e,possivelmente, 2 mM de treonina. Caso se use sulfeto de hidrogênio comofonte de enxofre, todos os sais contendo sulfato são substituídos porquantidades molares iguais de sais contendo cloreto. Sulfeto é fornecido comosulfeto de amônio (10 mM). Espectinomicina é adicionada, se necessário, auma concentração de 100 mg/l. Usou-se uma cultura realizada de um dia parao outro para inocular uma cultura de 30 ml a uma ODóOO de 0,2. Após acultura ter atingido uma ODóOO de 4,5 a 5, adicionou-se 1,25 ml de umasolução a 50 % de glicose e 0,75 ml de 2M de MOPS (pH 6,9) e a cultura éagitada durante 1 hora. Subseqüentemente adiciona-se IPTG, se necessário.

Metabólitos extracelulares são analisados durante a fase debatelada. Aminoácidos são quantificados por meio de HPLC apósderivatização de OPA/Fmoc e outros metabólitos relevantes são analisadosusando-se GC-MS após sililação.

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Tabela 2. Produção de metionina específica de cepasabrigando E. coli (pSB5) e Arabidopsis (pSB3) MetB e suas atividadescorrespondentes de Cistationina-7-sintase (CGS) e eliminação de 7.

Produção de metionina usando METB de A. thalianaapresentando baixa atividade de γ-eliminase reduz significantemente aprodução de isoleucina por meio de reação de γ-eliminase, enquanto que aprodução de metionina não é afetada intensamente. Isto contrasta comexperimentos em que exclusivamente a via de E. coli é usada, e quantidadessignificativas do subproduto isoleucina são produzidas via eliminação de γ.

Exemplo 5: Construção e avaliação de uma cepa produtora de metioninausando-se a enzima de levedura MetB que aceita acetil-homosserina e H2Scomo substratos.

Para testar a atividade de γ-eliminase de levedura in vivo epara avaliar seu potencial para a produção de metionina construiu-se a cepa aseguir. A homosserina acetil transferase que codifica o gene MET2 deSaccharomyces cerevisiae foi amplificada por meio de PCR a partir de DNAgenômico usando-se os oligonucleotídeos a seguir:

Ptac-meíAlevF (SEQ ID NO 36): tgctacagct ggagctgttg acaattaatc atcggctcgtataatgtgtg gaaggaggac agaccatgtc gcatacttta aaatcgaaaa cgctccaaga gcPtac-meíAlevR (SEQ ID NO 37): CGTACTGACG ACCGGGTCCTACCAGTTGGT AACTTCTTCG GCCTCACC

Subseqüentemente, o fragmento de PCR foi clonado nos sítiosde restrição PvuII e DrdI do vetor pACYC184, resultando em vetor pSB7. Ooligonucleotídeo Ptac-metAlevF abriga o promotor pTAC que impele aexpressão do gene de levedura MET2 do vetor pACYC 184.

A acetil-homosserina sulfidrilase (METI7) de levedura foiamplificada usando-se os oligonucleotídeos metBlev e gapA-metBlevF.

Simultaneamente o promotor gapA de E. coli foi amplificado usando-se osoligonucleotídeos gapA-metBlevR e GapAF. Subseqüentemente, o geneMETI7 foi fundido ao promotor gapA por meio de PCR de fusão usando-seapenas oligonucleotídeos metBlev e GapAF (ver acima para detalhes).

gapA-metBlevR (38-75: 1860797-1860761; SEQ ID NO 38):GGCCGGCGTG TAGTTGAACA GTATCGAAAT GAGATGGCATATATTCCACC AGCTATTTGT TAGTGAATAA AAGGgapA-metBlevF (1-38: 1860761-1860797; (SEQ ID NO 39): ccttttattcactaacaaat agctggtgga atatatgcca tctcatttcg atactgttca actacacgcc ggccmetBlev (SEQ ID NO 40): TAATCGCGGAT CCGCGTCATGGTTTTTGGCC AGCG

GapAF (1860639-1860661; SEQ ID NO 41): acgtcccggg caagcccaaaggaagagtga ggcO fragmento de fusão foi clonado no sítio Smal e BamHl dovetor pSBl descrito no exemplo 1, resultando no vetor pSB8.

Ambos os vetores pSB7 e pSB8 foram transformados na cepaAmetJ AmetB AmetA. resultando em DmetBJ DmetC DmetA pSB7 pSB8. Estacepa desenvolveu-se após um período de retardo com uma taxa decrescimento de 0,21 h-1. Verificou-se plasmídeos e mutações e quantiflcou-sea quantidade de metionina.

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Tabela 3. Produção de metionina específica a partir de cepasabrigando MetB de E. coli (pSB5) e levedura (pSB8) e suas correspondentesatividades de O-succinil homosserina sulfidrilase (OSHS), O-acetilhomosserina sulfidrilase (OAHS) e de eliminação de γ. ivalores foram obtidosna cepa AmetBJ metA* 11 pSB5.

A Tabela 3 mostra que a quantidade de metionina produzida éincrementada significativamente na presença do gene de levedura MET2 eMETI7. Ao mesmo tempo reduziu-se a quantidade de isoleucina produzida.

Isto foi explicado pela baixa atividade de γ-eliminase da enzima MET17 (Aatividade de γ-eliminase da levedura acetil-homosserina sulfidrilase foideterminada in vitro como descrito no exemplo 1).

Exemplo 6: Construção e avaliação de uma cepa produtora de metioninaexpressando metB archaeaX a partir de Methanosarcina barkeri (cepa Fusaro).

Como em plantas, em archaea, supõe-se que a biossíntese demetionina prossegue via fosfo-homosserina. Portanto, foi presumido que, deforma similar à enzima de planta, MetB de Methanosarcina também podeapresentar uma baixa atividade de γ-eliminase. Portanto, Methanosarcina metB éamplificado com PCR usando-se os oligonucleotídeos metBmetano e gapA-metBmetanoR. Como descrito previamente, o promotor gap A de E. coli éfundido subseqüentemente ao gene metB usando-se os oligonucleotídeos gapA-metBmetanoF e GapAF para a amplificação do promotor e metBmetano e GapAFpara a fusão efetiva. O fragmento resultante é clonado no sítio de restrição Smaldo vetor pJB 137, resultando no plasmídeo pSB9.

MetBmetano (SEQ ID NO 42): GTCCCCCGGG AATCTAGTCTAGATTAAATT ACTTCAAGG GCCTGTTTGA GG

gapA-metBmetanoR (32-69: 1860797-1860761) (SEQ ID NO 43): cacattttgttgcaaacttc acttctcttt ccatatattc caccagctat ttgttagtga ataaaagggapA-metBmetanoF (1-38: 1860761-1860797) (SEQ ID NO 44): ccttttattcactaacaaat agctggtgga atatatggaaa gagaagtgaa gtttgcaaca aaatgtgGapAF (1860639-1860661) (SEQ ID NO 45): acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtgaggc

Plasmídeo pSB9 é introduzido nas cepas AmetJ rae/A* 11, AmetJAmetA AmetB e AmetJ AmetA AmetB AthrC e as cepas resultantes sãofermentadas como descrito no exemplo 2. A produção de metionina éincrementada a produção de isoleucina é diminuída em comparação com a cepaAmetJ metA* 11 abrigando o plasmídeo pSB5 com o gene de E. coli metB. Istodeve-se, o mais provavelmente, à baixa atividade de γ-eliminase da enzima metBde archaea.

Exemplo 7: Construção e avaliação de uma cepa expressando o gene metB deChloroflexus aurantiacus

O alinhamento na figura 2 mostra que e enzima MetB deChloroflexus aurantiacus abriga vários aminoácidos nas posições requeridas parao reconhecimento de fosfo-homosserina como um substrato. Portanto, foipresumido que esta enzima, como METB de planta, pode apresentar uma menoratividade de γ-eliminase em comparação com a enzima de E. coli. Para determinarse o uso da enzima metB confere uma vantagem na produção de metionina, metBde Chloroflexus é amplificado com PCR usando-se os oligonucleotídeosmetBcloro e gapA-metBcloroR. Como descrito previamente, o promotor gapA deE. coli é fundido subseqüentemente ao gene metB usando-se os oligonucleotídeosgapA-metBcloroF e GapAF para a amplificação do promotor e metBcloro eGapAF para a fusão efetiva. O fragmento resultante é clonado nos sítios derestrição BamHl e Smal do vetor pACYC177 (Biolabs), resultando em vetorpSBlO.

metBcloro (SEQID NO 46): ACGTGGATCC GAATTCCTTA TTCGTCGGCAAGAGCCTGTT GC

gapA-metBcloroR (33-70: 1860797-1860761) (SEQ ID NO 47): ggccgtacgggtccggtaaa ctgatcgata gccatatatt ccaccagcta tttgttagtg aataaaagg

gapA-metBcloroF (1-38: 1860761-1860797) (SEQ ID NO 48): ccttttattcactaacaaat agctggtgga atatatggct atcgatcagt ttaccggacc cgtacggccGapAF (1860639-1860661) (SEQ ID NO 49): acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtgaggc

Para avaliar a enzima na biossíntese da metionina, o plasmídeopSBlO é introduzido nas cepas AmetJ AmetA* 11, AmetJ AmetA AmetB e AmetlAmetA AmetB AthrC e as cepas resultantes são fermentadas como descrito noexemplo 2. A produção de metionina é incrementada significativamente secomparada com a cepa Ametl metA* 11 abrigando o plasmídeo pSB6 com o genede E. coli metB.

Exemplo 8: Construção de uma cepa expressando homosserina acetiltransferasede levedura e acetil-homosserina sulfidrilase meiY a partir de Corynebacteriumglutamicum

Para testar a atividade de γ-eliminase de C. glutamicum in vivo epara avaliar seu potencial para a produção de metionina constrói-se a cepa aseguir.

O uso de códon do gene de C. glutamicum acetil-homosserinasulfidrilase, metY, é adaptado a E. coli e é sintetizado in vitro. Simultaneamente,adiciona-se o promotor gapA de E. coli.O fragmento de fusão é clonado subseqüentemente no sítio Smal eBamHl do vetor pSBl descrito no exemplo 1, resultando no vetor pSBl 1.

Tanto o vetor pSB7 portando a homosserina acetiltransferase delevedura, como o pSBl 1, são transformados nas cepas MGl655 AmetJ metA 11 eAmetJ AmetB AmetA e determina-se a quantidade de metionina produzida. Pode-se mostrar que a quantidade de metionina produzida é significativamenteincrementada na presença da homosserina acetiltransferase de levedura e o códonadaptado acetil-homosserina sulfidrilase de Corynebacteria, metY, quandodesenvolvido com sulfeto de hidrogênio ou sulfato como fonte de enxofre. Aomesmo tempo, a quantidade de isoleucina produzida é significativamentereduzida. Alternativamente, é possível usar um códon adaptado homosserinatransacetilase de Corynebacterium em lugar de da enzima de levedura.

Exemplo 9: Construção de uma cepa expressando uma homosserinasucciniltransferase de E. coli com reduzida atividade de eliminação de γ

Para assegurar que a isoleucina não é produzida por sua via debiossíntese clássica, deletou-se o gene ilvA e o óperon fc/cABCDEFG abrigandouma segunda treonina desaminase.

O gene ilvA foi deletado usando-se a estratégia de deleção descritaacima e os oligonucleotídeos a seguir:

DzVvAF (SEQID NO 50)

GgctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgccgaatatttaagagcagtgctgcgcgcgccggtttacgaggTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG

com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (3952954-3953033) do gene ilvA (seqüência de referência no website [endereço da redemundial de computadores] http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação da cassete deresistência ao cloranfenicol (seqüência de referência em Datsenko, K.A. &Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),DilvAR (SEQ ID NO 51)

cctgaacgccgggttattggtttcgtcgtggcaatcgtagcccagctcattcagccgggtttcgaaatccggttcatggCATAT GAATATCCTCCTTAG com

- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência 3954478-3954400) do gene ilvA

- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação da cassete deresistência ao cloranfenicol.

Os oligonucleotídeos DilvAR e DilvAF foram usados paraamplificar a cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. Oproduto de PCR obtido foi então introduzido por meio de eletroporação nas cepasMG1655 AmetBl metAll (pKD46) e AmetJ me/Al 1 (pKD46) em que a enzimaRed recombinase expressa permitiu a recombinação homóloga. Os transformantesresistentes ao cloranfenicol foram então selecionados, e verificou-se a inserção dacassete de resistência por meio de uma análise de PCR com os oligonucleotídeosilvAR e ilvAF definidos abaixo. As cepas resultantes foram AmetBJ met A* 11ΔίΙνΑ.

ilvAR (3954693-3954670) (SEQID NO 52): gccccgaaccggtgcgtaaccgcgilvAF (3952775-3952795) (SEQ IDNO 53): ggtaagcgatgccgaactggc

Adicionalmente ao IlvA5 sabe-se que a treonina desidratase(TdcB) catalisa a desaminação da treonina ao αι-cetobutirato em condiçõesanaeróbias ou microaeróbicas. Para eliminar a possível contribuição desta enzimaà produção de ce-cetobutirato o gene foi deletado do genoma da cepa AmetBJmet A* Il AilvA. TdcB é parte do óperon frfcABCDEFG que foi deletado de umamaneira similar àquela descrita para mutantes prévios usando-se os quatrooligonucleotídeos descritos abaixo. DtdcGR e DtdcAF foram usados paraamplificar a cassette e tdcGR e tdcGF para a verificação

DtdcGR (3255915-3255993) (SEQ ID NO 54)gctgacagcaatgtcagccgcagaccactttaatggccagtcctccgcgtgatgtttcgcggtatttatcgttcatatcCATATGAATATCCTCCTTAG

DtdcAP (3264726-3264648) (SEQID NO 55)

GgtaattaacgtaggtcgttatgagcactattcttcttccgaaaacgcagcacctggtagtctttcaggaagtcattagTGT AGGCTGG

AGCTGCTTCG

tdeGR (3255616-3255640) (SEQID NO 56) gcgtctgeaatgacgcctttattegtdeAF (3264922-3264899) (SEQ ID NO 57)Cgccataaaatatggttatccccg

A cepa resultante foi denominada AmetBJ metA* 11 AilvA Δ/ífcABCDEFG.

Para diminuir a atividade de γ-eliminase de E. coli cistationina-γ-sintase/ sulfidrilase (MetB)5 mutações foram introduzidas em regiões que estãoenvolvidas na ligação do substrato cisteína. Para este fim Escherichia coli meiBfoi amplificado com PCR a partir de DNA genômico usando-se osoligonucleotídeos MetBF e MetBR (números em parênteses correspondem àsposições no genoma de E. coli). O fragmento de PCR foi digerido com enzimas derestrição Pstl e Hindlll e clonado em pUCl 8 nos mesmos sítios de restrição.

MetBF (4125957-4125982) (SEQ ID NO 58): ttagacagaa çtgçagcgcc gctccattcagccatgagat ac

MetBR (4127500-4127469) (SEQ ID NO 59): cgtaacgccca agcttaaata acacttcacatcagccagac tactgcc

Subseqüentemente, introduziu-se mutações na cistaüonina-γ-sintase/ sulfidrilase de Escherichia coli que resultam nas alterações deaminoácidos T335A/A337P, R49L e D45V.

Os pares de oligonucleotídeos a seguir foram usados para aintrodução de cada mutação usando mutagênese direcionada-para-sítio de acordocom o kit de mutagênese direcionada-para-sítio Quick change™ da Stratagene.Sítios de restrição (negrito) foram introduzidos para verificação.metBT335A/A337PF (SEQ ID NO 60): cgcgcttctg gtgccatgcc çggatgtgccatggttgcgg eg

metBT335A/A337PR (SEQ ID NO 61): cgccgcaacc atggcacatc cgggcatggcaccagaagcg eg

metBR49LF (SEQ ID NO 62): gaacctcgagcgcatgattactcgcgtctgggcaacccaacgcgcgmetBR49LR (SEQ ID NO 63): cgcgcgttgggttgcccagacgcgagtaatcatgcgctcgaggttcmetBD45VF (SEQ ID NO 64):

gaacctcgagcgcatgtgtactcgcgtcgcggcaacccaacgcgcgatmetBD45VR (SEQ ED NO 65):

atcgcgcgttgggttgccgcgacgcgagtacacatgcgctcgaggttc

As seqüências de metB modificadas resultantes foram verificadaspor meio de sequenciamento, restringidas com Pstl e Hindlll e clonadas nosmesmos sítios do vetor pSBl. Os plasmídios resultantes foram transformados nacepa AmeiBJ metA*l 1 AilvA Δ/í/cABCDEFG. Cepas foram avaliadas em culturascontidas em frascos de Erlenmeyer pequenos como descrito acima. A quantidadede isoleucina produzida por meio de eliminação de γ foi significativamentereduzida, enquanto que a síntese de metionina só foi ligeiramente afetada. Isto secorrelaciona com a baixa atividade de eliminação de γ e a retenção de umasignificativa atividade de cistationina-7-sintase.

<table>table see original document page 36</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> METABOLIC EXPLORER

<120> MICROORGANISMOS COMPREENDENDO ENZIMAS EXPRESSADAS COM BAIXA

ATIVIDADE DE ELIMINAÇÃO DE GAMA<130> 349288 D23125<140> PCT/EP/2006/050726<141> 07.02.2006<150> US 60/650,124<151> 07.02.2005<160> 65

<170> PatentIn versão 3.3<210> 1<211> 386<212> PRT

<213> Escherichia coli<4 00> 1

Met Thr Arg Lys Gln Ala Thr Ile Ala Val Arg Ser Gly Leu Asn Asp15 10 15

Asp Glu Gln Tyr Gly Cys Val Val Pro Pro Ile His Leu Ser Ser Thr20 25 30

Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Glu Pro Arg Ala His Asp Tyr Ser Arg35 40 45

Arg Gly Asn Pro Thr Arg Asp Val Val Gln Arg Ala Leu Ala Glu Leu50 55 60

Glu Gly Gly Ala Gly Ala Val Leu Thr Asn Thr Gly Met Ser Ala Ile65 70 75 80

His Leu Val Thr Thr Val Phe Leu Lys Pro Gly Asp Leu Leu Val Ala85 90 95

Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Ser Leu Ala100 105 110

Lys Arg Gly Cys Tyr Arg Val Leu Phe Val Asp Gln Gly Asp Glu Gln115 120 125

Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu130 135 140

Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys145 150 155 160

His Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Val Ser Val Val Asp Asn Thr Phe165 170 175

Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val180 185 190Leu His Ser Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Ser Asp Val Val Ala195 200 205

Gly Val Val Ile Ala Lys Asp Pro Asp Val Val Thr Glu Leu Ala Trp210 215 220

Trp Ala Asn Asn Ile Gly Val Thr Gly Gly Ala Phe Asp Ser Tyr Leu225 230 235 240

Leu Leu Arg Gly Leu Arg Thr Leu Val Pro Arg Met Glu Leu Ala Gln245 250 255

Arg Asn Ala Gln Ala Ile Val Lys Tyr Leu Gln Thr Gln Pro Leu Val260 265 270

Lys Lys Leu Tyr His Pro Ser Leu Pro Glu Asn Gln Gly His Glu Ile275 280 285

Ala Ala Arg Gln Gln Lys Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Leu290 295 300

Asp Gly Asp Glu Gln Thr Leu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Leu Ser Leu305 310 315 320

Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Ser His325 330 335

Ala Ala Thr Met Thr His Ala Gly Met Ala Pro Glu Ala Arg Ala Ala340 345 350

Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Leu Arg Ile Ser Thr Gly Ile Glu Asp355 360 365

Gly Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Glu Asn Gly Phe Arg Ala Ala Asn370 375 380

Lys Gly385<210> 2<211> 100<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo DmetJR para a deleção dos genes metJ e MetB<400> 2

tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatca ggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttg 60

ctttagtatt cccacgtctc tgtaggctgg agctgcttcg 100

<210> 3<211> 100<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo DmetJBF para a deleção dos genes metJ e metB<400> 3

tatgcagctg acgacctttc gcccctgcct gcgcaatcac actcattttt accccttgtt 60

tgcagcccgg aagccatttt caggcaccag agtaaacatt 100

<210> 4<211> 30<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciador de PCR<400> 4

ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc 30

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de PCR<400> 5

aaataacact tcacatcagc cagactactg ccaccaaatt t 41

<210> 6<211> 100<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo DmetAF para a deleção do gene metA<400> 6

ttcgtgtgcc ggacgagcta cccgccgtca atttcttgcg tgaagaaaac gtctttgtga 60

tgacaacttc tcgtgcgtct tgtaggctgg agctgcttcg 100

<210> 7<211> 100<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo DmetAR para a deleção do gene metA<400> 7

atccagcgtt ggattcatgt gccgtagatc gtatggcgtg atctggtaga cgtaatagtt 60

gagccagttg gtaaacagta catatgaata tcctccttag 100

<210> 8<211> 30<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 8

tcaccttcaa catgcaggct cgacattggc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 9

ataaaaaagg cacccgaagg tgcctgaggt 30

<210> 10<211> 99<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo DthrCF para a deleção do gene thrC<4 00> 10

ctctacaatc tgaaagatca caacgagcag gtcagctttg cgcaagccgt aacccagggg 60

ttgggcaaaa atcaggggct gtaggctgga gctgcttcg 99

<210> 11

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo DthrCR para a deleção do gene thrC<400> 11

gattcatcat caatttacgc aacgcagcaa aatcggcggg cagattatgt gaaagcaagg 60

gtaaatcagc acgttctgcc atatgaatat cctccttag 99

<210> 12<211> 22<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<4 00> 12

cgctgaaccc taccgtgaac gg 22

<210> 13<211> 24<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 13

gcgaccagaa ccagggaaag tgcg 24

<210> 14<211> 40<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 14

ttatcatgag agtgttgaag ttcggcggta catcagtggc 4 0

<210> 15<211> 39<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 15

ttacccgggc cgccgccccg agcacatcaa acccgacgc 39

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 16

ccgacagtaa gacgggtaag cctg 24

<210> 17<211> 22<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 17

agcttagtaa agccctcgct ag 22

<210> 18<211> 43<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 18

ccaatctgaa taacatggca atgtccagcg tttctggccc ggg 43

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 19

cccgggccag aaacgctgga cattgccatg ttattcagat tgg 43

<210> 20<211> 34<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 20

tacgatgtac atggccttaa tctggaaaac tggc 34

<210> 21<211> 34<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 21

tcccccgggt tagttttcca gtactcgtgc gccc 34

<210> 22<211> 72<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 22

ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgttg agctccgatg ggagcctcac 60

tgttcatgcc gg 72

<210> 23<211> 53<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 23

aatcgcggat ccgaatccgg tcagatggct tcgagagctt gaagaatgtc age 53

<210> 24<211> 72<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 24

ccggcatgaa cagtgaggct cccatcggag ctcaacatat attccaccag ctatttgtta 60

gtgaataaaa gg 72

<210> 25<211> 33<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 25

acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33

<210> 26

<211> 98

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 26

ggcaaatttt ctggttatct tcagctatct ggatgtctaa acgtataagc gtatgtagtg 60

aggtaatcag gttatgccga ttcgtgtgcc ggacgagc 98

<210> 27<211> 99<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 27

cggaaataaa aaaggcaccc gaaggtgcct gaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg 60

actatcacag aagattaatc cagcgttgga ttcatgtgc 99

<210> 28<211> 100<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo DmetJF para a deleção do gene metJ<400> 28

caggcaccag agtaaacatt gtgttaatgg acgtcaatac atctggacat ctaaacttct 60

ttgcgtatag attgagcaaa catatgaata tcctccttag 100

<210> 29

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo DmetJR para a deleção do gene metJ<400> 29

tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatca ggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttg 60

ctttagtatt cccacgtctc tgtaggctgg agctgcttcg 100

<210> 30<211> 30<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 30

ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 31

ttcgtcgtca tttaacccgc tacgcactgc 30<210> 32<211> 98<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 32

ggcaaatttt ctggttatct tcagctatct ggatgtctaa acgtataagc gtatgtagtg 60

aggtaatcag gttatgccga ttcgtgtgcc ggacgagc 98

<210> 33

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 33

cggaaataaa aaaggcaccc gaaggtgcct gaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg 60

actatcacag aagattaatc cagcgttgga ttcatgtgc 99

<210> 34<211> 42<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 34

ttagacagaa ctgcagcgcc gctccattca gccatgagat ac 42

<210> 35<211> 48<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 35

cgtaacgccc aagcttaaat aacacttcac atcagccaga ctactgcc 48

<210> 36<211> 102<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 36

tgctacagct ggagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaaggaggac 60

agaccatgtc gcatacttta aaatcgaaaa cgctccaaga gc 102

<210> 37<211> 48<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 37

cgtactgacg accgggtcct accagttggt aacttcttcg gcctcacc 48

<210> 38

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 38

ggccggcgtg tagttgaaca gtatcgaaat gagatggcat atattccacc agctatttgt 60tagtgaataa aagg 74

<210> 39

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 39

ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgcca tctcatttcg atactgttca 60

actacacgcc ggcc 7 4

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 40

taatcgcgga tccgcgtcat ggtttttggc cagcg 35

<210> 41<211> 33<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 41

acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33

<210> 42

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial

<220> ■

<223> iniciadores de PCR<400> 42

gtcccccggg aatctagtct agattaaatt acttcaaggg cctgtttgag g 51

<210> 43

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 43

cacattttgt tgcaaacttc acttctcttt ccatatattc caccagctat ttgttagtga 60

ataaaagg 68

<210> 44

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 44

ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatggaa agagaagtga agtttgcaac 60

aaaatgtg 68

<210> 45<211> 33<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 45

acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33<210> 46<211> 42<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 46

acgtggatcc gaattcctta ttcgtcggca agagcctgttgc 42

<210> 47

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 47

ggccgtacgg gtccggtaaa ctgatcgata gccatatatt ccaccagcta tttgttagtg 60

aataaaagg 69

<210> 48

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 48

ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatggct atcgatcagt ttaccggacc 60

cgtacggcc 69

<210> 49

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 49

acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33

<210> 50

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo DilvAF para a deleção do gene ilvA<400> 50

ggctgactcg caacccctgt ccggtgctcc ggaaggtgcc gaatatttaa gagcagtgct 60

gcgcgcgccg gtttacgagg tgtaggctgg agctgcttcg 100

<210> 51

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo DilvAR para a deleção do gene ilvA<400> 51

cctgaacgcc gggttattgg tttcgtcgtg gcaatcgtag cccagctcat tcagccgggt 60

ttcgaaatcc ggttcatggc atatgaatat cctccttag 99

<210> 52<211> 24<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 52gccccgaacc ggtgcgtaac cgcg 24

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 53

ggtaagcgat gccgaactgg c 21

<210> 54<211> 99<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo DtdcGR para a deleção do gene tdcB<400> 54

gctgacagca atgtcagccg cagaccactt taatggccag tcctccgcgt gatgtttcgc 60

ggtatttatc gttcatatcc atatgaatat cctccttag 99

<210> 55<211> 99<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo DtdcAF para a deleção do gene tdcB<400> 55

ggtaattaac gtaggtcgtt atgagcacta ttcttcttcc gaaaacgcag cacctggtag 60

tctttcagga agtcattagt gtaggctgga gctgcttcg 99

<210> 56<211> 25<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 56

gcgtctgcaa tgacgccttt attcg 25

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 57

cgccataaaa tatggttatc cccg 24

<210> 58<211> 42<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 58

ttagacagaa ctgcagcgcc gctccattca gccatgagat ac 42

<210> 59

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 59

cgtaacgccc aagcttaaat aacacttcac atcagccaga ctactgcc 48

<210> 60<211> 42<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 60

cgcgcttctg gtgccatgcc cggatgtgcc atggttgcgg cg

<210> 61

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 61

cgccgcaacc atggcacatc cgggcatggc accagaagcg cg

<210> 62

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 62

gaacctcgag cgcatgatta ctcgcgtctg ggcaacccaa cgcgcg

<210> 63

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 63

cgcgcgttgg gttgcccaga cgcgagtaat catgcgctcg aggttc<210> 64<211> 48<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 64

gaacctcgag cgcatgtgta ctcgcgtcgc ggcaacccaa cgcgcgat<210> 65<211> 48<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciadores de PCR<400> 65

atcgcgcgtt gggttgccgc gacgcgagta cacatgcgct cgaggttc

Claims (26)

1. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que as enzimasque são expressadas no mesmo apresentam uma ou várias das seguintesatividades de cistationina-7-sintases e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ouacil homosserina sulfidrilases e que apresentam, ao mesmo tempo, baixaatividade de eliminação de 7.

2. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de que cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserinasulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilase apresentam uma atividade deeliminação de 7 que é pelo menos duas vezes inferior, de preferência pelomenos 10 vezes inferior, quando comparado com a cistationina-7-sintase de E.coli.

3. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 1ou 2 caracterizado pelo fato de que expressa cistationina-7-sintase/fosfo-homosserina sulfidrilase aceitadora de fosfo-homosserina.

4. Microorganismo de acordo com a reivindicação 3caracterizado pelo fato de que a cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserinasulfidrilase é o gene METB de plantas, de preferência de Arabidopsisthaliana.

5. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 1ou 2 caracterizado pelo fato de que a cistationina-7-sintase e/ou O-acetilahomosserina sulfidrilase é o gene METB de Saccharomyces eerevisiae.

6. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 1ou 2 caracterizado pelo fato de que a cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase é derivada de arehaea, de preferência deMethanosareina barkeri.

7. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 1ou 2 caracterizado pelo fato de que a cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase é derivada de Chloroflexaeeae, de preferência, deChloroflexus aurantiacus.

8. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 1ou 2 caracterizado pelo fato de que a enzima apresenta pelo menos dois dosaminoácidos a seguir, nas posições 107E, 111 Υ, 165K, 403S.

9. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 1ou 2 caracterizado pelo fato de que a cistationina-7-sintase e/ou acilhomosserina sulfidrilase é o gene metY e/ou o gene metB de bactérias gram-positivas.

10. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações de- 1 a 9 caracterizado pelo fato de que a enzima cistationina-7-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilase nativa ouheterológa é otimizada e, como uma conseqüência, apresenta uma menoratividade de γ-eliminase e, assim, permite maior seletividade de metionina emdetrimento da isoleucina.

11. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de que uma enzima cistationina-y-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilase otimizada éexpressada apresentando uma prolina na posição 337.

12. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de que uma enzima cistationina-y-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilase otimizada éexpressada apresentando uma alanina na posição 335.

13. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de que uma enzima cistationina-γ- sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserina sulfidrilase otimizada éexpressada apresentando uma alanina na posição 335 e uma prolina naposição 337.

14. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações de-1 a 13 caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo, que codifica para acistationina-Y-sintase e/ou fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acilhomosserina sulfidrilase é superexpressado.

15. Microorganismo de acordo com a reivindicação de 1 a 13caracterizado pelo fato de que as propriedades catalíticas da cistationina-γ-sintase e/ou da fosfo-homosserina sulfidrilase e/ou acil homosserinasulfidrilase são aperfeiçoadas.

16. Microorganismos de acordo com uma das reivindicaçõesde 1 a 15 caracterizados pelo fato de que homosserina aciltransferasesheterológas são introduzidas permitindo o uso de uma correspondentecistationina-Y-sintase e/ou acil homosserina sulfidrilases aceitadora de acilhomosserina.

17. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações de-1 a 16 caracterizado pelo fato de que diversas vias híbridas diferentesproduzem ativamente homocisteína e/ou cistationina a partir de homosserina.

18. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações de-1 a 17 caracterizado pelo fato de que genes adicionais da via de biossíntese doaminoácido desejado a ser produzido são incrementados adicionalmente.

19. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações de-1 a 17 caracterizado pelo fato de que as vias metabólicas que reduzem aprodução dos aminoácidos desejados são pelo menos parcialmente reduzidas.

20. Método para a preparação fermentativa de um aminoácido,em particular metionina, seus precursores ou derivados, usando ummicroorganismo como definido em uma das reivindicações de 1 a 19,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) fermentação do microorganismo que produz o aminoácidodesejadob) concentração do produto desejado nas células das bactériasou no meio, ec) isolamento dos desejados aminoácidos / constituintes docaldo de fermentação e/ou da biomassa opcionalmente remanescente emporções ou na quantidade total (0-100 %) no produto final.

21. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizadopelo fato de que a molécula de enxofre/composto é transferida para qualquerhomosserina ativada a partir de cisteína.

22. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizadopelo fato de que a molécula de enxofre/composto é transferida diretamente deH2S para qualquer homosserina ativada.

23. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizadopelo fato de que a fonte de enxofre no meio é sulfato ou um derivado.

24. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizadopelo fato de que a fonte de enxofre no meio é tiossulfato.

25. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizadopelo fato de que a fonte de enxofre no meio é H2S.

26. Método de acordo com a reivindicação 20 caracterizadopelo fato de que a fonte de enxofre no meio é metilmercaptano.