ES2535816T3 - Enzima recombinante con sensibilidad alterada a la retroalimentación - Google Patents

Abstract

Método para la preparación de metionina, sus precursores o productos derivados de la misma, en un proceso fermentativo con un microorganismo en el que la L-homoserina es convertida en O-succinilhomoserina con una homoserina transuccinilasa, que comprende la etapa de cultivar dicho microorganismo en un medio adecuado y recuperar la metionina, sus precursores o productos derivados de la misma una vez producidos, en el que la homoserina transuccinilasa es una homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina, caracterizado por que la homoserina transuccinilasa mutada es una homoserina transuccinilasa que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o la secuencia homóloga que presenta una actividad de homoserina transuccinilasa y que comparte una homología de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que comprende una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-VD y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 que corresponde a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

Description

Enzima recombinante con sensibilidad alterada a la retroalimentación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de enzimas homoserina transuccinilasa recombinantes con sensibilidad alterada a la retroalimentación (MetA*) y finalmente, enzimas S-adenosil metionina sintetasa recombinantes con actividad reducida (MetK*), para la producción de metionina, sus precursores o derivados de la misma.

Antecedentes de la técnica

Compuestos que contienen azufre tales como cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosilmetionina son críticos para el metabolismo celular, y se producen industrialmente para su uso como aditivos alimentarios o aditivos para piensos y agentes farmacéuticos. En particular, la metionina, un aminoácido esencial, la cual no puede ser sintetizada por los animales, desempeña una función importante en muchas funciones del cuerpo. Además de su función en la biosíntesis de proteínas, la metionina está implicada en la transmetilación y en la biodisponibilidad de selenio y cinc. La metionina se usa también directamente como un tratamiento para trastornos tales como alergia y fiebre reumática. Sin embargo, la mayor parte de la metionina que se produce se añade al pienso.

Con el uso disminuido de proteínas derivadas de animales como resultado de BSE y la influenza aviar, la demanda de metionina pura se ha incrementado. Químicamente, la D,L-metionina se produce comúnmente a partir de acroleína, mercaptano de metilo y cianuro de hidrógeno. Sin embargo, la mezcla racémica no funciona tan bien como la L-metionina pura como, por ejemplo, en aditivos para piensos para pollos (Saunderson, C. L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633). La L-metionina pura puede producirse a partir de metionina racémica, por ejemplo, a través del tratamiento de N-acetil-D,L-metionina con acilasa, que incrementa dramáticamente los costes de producción. La demanda creciente de L-metionina pura, acoplada a asuntos ambientales, hace que la producción microbiana de metionina sea atractiva.

Los microorganismos han desarrollado mecanismos reguladores altamente complejos que sintonizan en forma precisa la biosíntesis de componentes de la célula, permitiendo de esta manera índices de crecimiento máximos. En consecuencia, sólo se sintetizan las cantidades requeridas de metabolitos, tales como aminoácidos, y usualmente no pueden detectarse en el sobrenadante de cultivo de cepas de tipo silvestre. Las bacterias controlan la biosíntesis de aminoácidos principalmente por inhibición de enzimas por retroalimentación, y represión o activación de la transcripción génica. Los efectores para estas vías reguladoras son en la mayoría de los casos los productos finales de las vías relevantes. En consecuencia, las estrategias para la sobreproducción de aminoácidos en microorganismos, requieren la desregulación de estos mecanismos de control.

La vía para la síntesis de L-metionina es bien conocida en muchos microorganismos (figuras 1A-1B). La metionina se obtiene del aminoácido aspartato, pero su síntesis requiere la convergencia de dos vías adicionales, biosíntesis de cisteína y metabolismo C1 (tetrahidrofolato de N-metilo). El aspartato es convertido en homoserina por una secuencia de tres reacciones. La homoserina puede entrar subsiguientemente a la vía de biosíntesis de treonina/isoleucina o metionina. En E. coli, la entrada en la vía de biosíntesis de metionina requiere la acilación de homoserina a succinil-homoserina. Esta etapa de activación permite la condensación subsiguiente con cisteína, que lleva a la cistationina que contiene tioéter, la cual es hidrolizada para dar homocisteína. La transferencia final de metilo que lleva a la metionina, es llevada a cabo por una metiltransferasa dependiente de B12 o independiente de B12.

La biosíntesis de metionina en E. coli es regulada por la represión y activación de genes de biosíntesis de metionina por medio de las proteínas MetJ y MetR, respectivamente (revisado en Neidhardt, F. C. (ed. en jefe), R. Curtiss III, J.

L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger (eds.) 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology; Weissbach et al., 1991 Mol. Microbiol., 5, 1593-1597). MetJ usa S-adenosilmetionina como un correpresor, que es producido a partir de metionina por la enzima S-adenosilmetionina sintetasa (EC 2.5.1.6) codificada por el gen esencial metK. metA, que codifica para homoserina transuccinilasa (EC 2.3.1.46), la primera enzima única para la síntesis de metionina, es otro punto de control principal para la producción de metionina. Además de la regulación de metA por MetJ y MetR a través de la transcripción, la enzima es también regulada por retroalimentación por los productos finales metionina y S-adenosilmetionina (Lee, L. W. et al. (1966) Multimetabolite control of a biosynthetic pathway by sequential metabolites, JBC 241 (22), 5479-5780). La inhibición por retroalimentación por estos dos productos es sinergística, lo cual significa que bajas concentraciones de cada metabolito sólo son apenas ligeramente inhibidoras, mientras que en combinación, se ejerce una fuerte inhibición.

Los análogos de aminoácidos inhiben el crecimiento bacteriano a través de la síntesis de polipéptidos anormales, e interfiriendo con la inhibición por retroalimentación, lo cual lleva a procesos perjudiciales dentro de la célula. Se han obtenido mutantes resistentes a análogos de aminoácidos que muestran enzimas alteradas y desreguladas que

conducen a un exceso de síntesis de los metabolitos correspondientes que pueden superar al análogo. Varios grupos han usado los análogos de metionina norleucina, etionina y α-metilmetionina para generar cepas microbianas que sobreproducen metionina. Se mostró que la α-metilmetionina es un inhibidor potente de la enzima homoserina transuccinilasa MetA (Rowbury RJ (1968) The inhibitory effect of α-methylmethionine on Escherichia coli, J. Gen. Microbiol., 52, 223-230). Se aislaron mutantes resistentes a la retroalimentación en Salmonella typhimurium que mapearon hacia el locus de metA (Lawrence D. A., (1972) Regulation of the methionine feedback-sensitive enzyme in mutants of Salmonella typhimurium; Lawrence, D. A., Smith, D. A., Rowbury, R. J. (1967) Regulation of methionine synthesis in Salmonella typhimurium: Mutants resistant to inhibition by analogues of methionine, Genetics 58, 473492). Se mostró que mutantes resistentes a norleucina mapean hacia el locus de metK (Chattopadhyay, M. K., Ghosh, A. K. y Sengupta, S. (1991). Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli K12: a closer study with analogue resistant mutants, Journal of General Microbiology, 137, 685-691). Los mismos autores han informado del aislamiento de mutantes de metA resistentes a la retroalimentación y mutantes resistentes a norleucina en E. coli, pero no se han descrito las mutaciones reales en metA y metK.

Se ha demostrado la función crítica de la homoserina transuccinilasa para la producción de metionina bacteriana por fermentación (Kumar, D. Garg, S. Bisaria V. S., Sreekrishnan, T. R. y Gomes, J. (2003) Production of methionine by a multi-analogue resistant mutant of Corynebacterium lilium, Process Biochemistry 38, 1165-1171). La solicitud de patente JP2000139471 describe un procedimiento para la producción de L-metionina usando mutantes en los genes metA y metK. En este caso, se ha determinado la ubicación precisa de las mutaciones. Las enzimas mutantes MetA han perdido parcialmente la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por metionina y S-adenosil-metionina. Sin embargo, sus actividades iniciales son disminuidas hasta aproximadamente 25% cuando se comparan con la enzima de tipo silvestre, y a concentraciones de metionina a 1 mM para algunos mutantes o SAM a 1 mM para otros, se pierde otro 25 a 90% de la actividad enzimática. Los mutantes de metK no fueron caracterizados enzimáticamente, pero se usaron en fermentaciones para incrementar la cantidad de metionina producida.

Breve descripción de la invención

Esta invención se refiere a un método para la preparación de metionina, sus precursores o productos derivados de la misma, en un proceso fermentativo con un microorganismo, en el que la L-homoserina es convertida en O-succinilhomoserina con una homoserina transuccinilasa, que comprende la etapa de cultivar dicho microorganismo en un medio adecuado, y recuperar la metionina, sus precursores o productos derivados de la misma una vez producidos, en donde la homoserina transuccinilasa es una homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida para los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina.

La invención se refiere también al mismo método con microorganismos, en el que la actividad de la enzima Sadenosilmetionina sintetasa, es reducida.

La presente invención se refiere también a las enzimas mutadas, secuencias de nucleótidos que codifican para dichas enzimas con sensibilidad o actividad reducida, y microorganismos que comprenden dichas secuencias de nucleótidos como se describió anteriormente y como se describe a continuación.

Las enzimas recombinantes pueden usarse en conjunto, y pueden combinarse también, con varios otros cambios en los microorganismos correspondientes, tales como sobreexpresión de genes o su deleción. Preferentemente, el gen que codifica para aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa (metLo thrA) es sobreexpresado, y el gen que codifica para el represor de metionina metJ es eliminado.

En la descripción de la presente invención, se identifican genes y proteínas usando las denominaciones de los genes correspondientes en E. coli. Sin embargo, y a menos que se especifique de otra manera, el uso de estas denominaciones tiene un significado más general de acuerdo con la invención, y comprende todos los genes y proteínas correspondientes en otros organismos, más particularmente microorganismos.

La PFAM (base de datos de alineaciones de familias de proteínas y modelos de Markov ocultos; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), representa una gran colección de alineaciones de secuencias de proteínas. Cada PFAM hace posible visualizar alineaciones múltiples, ver dominios de proteínas, evaluar distribución entre organismos, lograr acceso a otras bases de datos, y visualizar estructuras de proteína conocidas.

La COG (multitud de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG) se obtiene comparando secuencias de proteína de 43 genomas completamente secuenciados que representan 30 líneas filogenéticas principales. Cada COG se define de por lo menos tres líneas, que permiten la identificación de los dominios conservados anteriores.

Los medios para identificar secuencias homólogas y su porcentaje de homologías, son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen en particular los programas BLAST, que pueden usarse a partir del sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros predeterminados indicados en ese sitio web. Las secuencias obtenidas pueden aprovecharse entonces (por ejemplo, pueden alinearse) usando, por ejemplo, los programas CLUSTALW (http://www.cbi.ac.uk/clustalw/) o MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl),

con los parámetros predeterminados indicados en esos sitios web.

Mediante el uso de las referencias proporcionadas en el GenBank para genes conocidos, los expertos en la materia son capaces de determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este trabajo de rutina se hace en forma ventajosa usando secuencias consenso que pueden determinarse llevando a cabo alineaciones de secuencias con genes derivados de otros microorganismos, y diseñando sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo. Estos métodos de rutina de biología molecular son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2a. ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York).

Descripción detallada de la invención

Las homoserina succiniltransferasas modificadas que muestran una sensibilidad disminuida a la retroalimentación hacia metionina y S-adenosilmetionina en comparación con la enzima de tipo silvestre, de acuerdo con la presente invención, comprenden por lo menos una mutación de aminoácido cuando se comparan con la secuencia de tipo silvestre. La mutación se selecciona preferentemente en las regiones conservadas que codifican para los aminoácidos 24 a 30, o en la región que codifica para los aminoácidos 58 a 65, o en la región que codifica para los aminoácidos 292 a 298, con el primer aminoácido prolina después de la formilmetionina contando como número 1.

Todas las referencias a las posiciones de aminoácido se obtienen con base en la homoserina succiniltransferasa codificada por el gen metA de E. coli representada en la figura 2. Las posiciones relativas de las regiones conservadas correspondientes en otras homoserina succiniltransferasas de diferentes organismos, pueden ser encontradas por el experto en la técnica por medio de la alineación de secuencias simple, como se representa en la figura 3 con las enzimas enlistadas a continuación:

-gi|20138683|sp|Q97I29|META homoserina O-succiniltransferasa de Clostridium acetobutylicum -gi|12230304|sp|Q9PLV2|META homoserina O-succiniltransferasa de Campylobacter jejuni -gi|12230277|sp|Q9KAK7|META homoserina O-succiniltransferasa de Bacillus halodurans -gi|20138686|sp|Q97PM9|META homoserina O-succiniltransferasa de Streptococcus pneumoniae -gi|20138715|sp|Q9CEC5|META homoserina O-succiniltransferasa de Lactococcus lactis -gi|20138656|sp|Q92L99|META homoserina O-succiniltransferasa de Sinorhizobium meliloti -gi|20138618|sp|Q8YBV5|META homoserina O-succiniltransferasa de Brucella melitensis -gi|20141549|sp|P37413|META homoserina O-succiniltransferasa de Salmonella typhimurium -gi|20138601|sp|Q8X610|META homoserina O-succiniltransferasa de O157:H7 de Escherichia coli -gi|12231004|sp|P07623|META homoserina O-succiniltransferasa de Escherichia coli -gi|12230285|sp|Q9KRM5|META homoserina O-succiniltransferasa de Vibrio cholerae -gi|38258142|sp|Q8FWG9|META homoserina O-succiniltransferasa de Brucella melitensis biovar suis -gi|20138631|sp|Q8ZAR4|META homoserina O-succiniltransferasa de Yersinia pestis -gi|12231010|sp|P54167|META homoserina O-succiniltransferasa de Bacillus subtilis -gi|12230320|sp|Q9WZY3|META homoserina O-succiniltransferasa de Thermotoga maritima -gi|20138625|sp|Q8Z1W1|META homoserina O-succiniltransferasa de Salmonella typhi ->gi|31340217|sp|Q8D937|META homoserina O-succiniltransferasa de Vibrio vulnificus -gi|31340213|sp|Q87NW7|META homoserina O-succiniltransferasa de Vibrio parahaemolyticus

Las homoserina succiniltransferasas modificadas exhiben preferentemente una actividad específica que es por lo menos diez veces la de la enzima de tipo silvestre en presencia de metionina a 10 mM y S-adenosilmetionina a 1 mM, y por lo menos 80 veces la de la enzima de tipo silvestre en presencia de metionina a 10 mM y Sadenosilmetionina a 0.1 mM. Las enzimas preferidas retienen una actividad de por lo menos dos por ciento de su actividad inicial en presencia de metionina a 100 mM y S-adenosilmetionina a 1 mM.

Particularmente, la homoserina transuccinilasa es seleccionada de entre una homoserina transuccinilasa Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholera y Yersinia pestis, con una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 correspondiente a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

Preferentemente, la homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida por los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina presenta la secuencia tal como se representa en SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido Q en la posición 63 con el aminoácido E.

En otra forma de realización preferida, la homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida por los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina presenta la secuencia tal como se ha representado en SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido L en la posición 62 con el aminoácido F.

La presente invención se refiere además a las secuencias de nucleótidos, secuencias de ADN o ARN, que codifican la homoserina succiniltransferasa mutada según la invención tal como se ha definido anteriormente.

Estas secuencias de ADN pueden prepararse, por ejemplo, mediante procedimientos de mutagénesis dirigida a partir de cepas que alojan la secuencia de ADN que codifica la homoserina succiniltransferasa de tipo natural.

Las mutaciones no específicas en el interior de la región de ADN pueden ser producidas, por ejemplo, mediante 5 agentes químicos (por ejemplo, nitrosoguanidina, ácido etilmetansulfónico y similares) y/o procedimientos físicos y/o reacciones de PCR, que se realizan bajo condiciones particulares.

Los procedimientos para introducir mutaciones en posiciones específicas en el interior de un fragmento de ADN son conocidos y se describen en Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989, 2ª ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold 10 Spring Harbor, New York.

Utilizando los procedimientos mencionados anteriormente, una o más mutaciones que provocan que la homoserina succiniltransferasa modificada presente una secuencia de aminoácidos que conduce a la insensibilidad a la metionina y S-adenosilmetioniona pueden ser introducidas en dicha región de ADN de cualquier gen metA.

15 Preferentemente, uno o más nucleótidos en la secuencia de ADN que codifica la homoserina succiniltransferasa son modificados de manera que la secuencia de aminoácidos que es codificada por el gen presente por lo menos una mutación.

Otro procedimiento para producir unos alelos metA resistentes a la retroalimentación consiste en combinar las 20 diferentes mutaciones puntuales que conducen a una resistencia a la retroalimentación, provocando así a múltiples mutantes que presentan nuevas propiedades.

Otras mutaciones pueden encontrarse presentes en las regiones conservadas 1 y 3 como se define a continuación.

25 Por lo menos una mutación puede estar presente en la región conservada 1, que comprende la secuencia de aminoácidos definida a continuación, en la parte N-terminal de las homoserina transuccinilasas de tipo natural, que corresponde a los aminoácidos 24 a 30 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli mostrada en SEC ID nº

1. Esta región conservada 1 no mutada tiene la siguiente secuencia:

30 X1-X2-X3-A-X4-X5-Q

en donde:

X1 representa E, D, T, S, L, preferentemente T

35 X2 representa D, S, K, Q, E, A, R, preferentemente S X3 representa R, E, D, preferentemente R X4 representa Y, I, F, A, K, S, V, preferentemente S X5 representa H, S, N, G, T, R, preferentemente G.

40 En una forma de realización preferida, la región conservada 1 de homoserina succiniltransferasa no modificada, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: T-S-R-A-S-G-Q.

En una forma de realización preferida, la alanina conservada en la región conservada 1 se sustituye con otro aminoácido, más preferentemente con una valina. La región conservada modificada presenta todavía más 45 preferentemente la secuencia de aminoácidos siguiente: T-S-R-V-S-G-Q.

Por lo menos una mutación puede estar presente en una región conservada en su parte C-terminal, que corresponde a los aminoácidos 292 a 298 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli mostrada en SEC ID nº 1. La región conservada 3 no mutada tiene la siguiente fórmula:

50 X1-Y-Q-X2-T-P-X3

en donde:

55 X1 representa V, I, M, preferentemente V X2 representa E, K, G, I, Q, T, S, preferentemente I X3 representa F, Y, preferentemente Y.

En una forma de realización preferida, la región conservada 3 de homoserina succiniltransferasa no modificada, 60 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: V-Y-Q-I-T-P-Y.

En una forma de realización particular, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada en el microorganismo utilizada en el método de acuerdo con la invención tiene actividad disminuida en comparación con la enzima de tipo silvestre, y tiene por lo menos una mutación en su secuencia de proteína cuando se compara con la secuencia de tipo

65 silvestre.

La mutación es preferentemente en una de las regiones conservadas definidas a continuación. Todas las referencias a las posiciones de aminoácido se hacen sobre la base de la S-adenosilmetionina sintetasa codificada por el gen metK de E. coli. Las posiciones relativas de regiones conservadas correspondientes en otras S-adenosilmetionina sintetasas de diferentes organismos, pueden ser descubiertas por el experto en la materia por medio de la alineación de secuencias simple representada en la figura 4 con las enzimas presentadas a

continuación: >gi|39574954|emb|CAE78795.1| metionina adenosiltransferasa de HD100 de Bdellovibrio bacteriovorus >gi|45657232|ref|YP_001318.1| proteína S-adenosilmetionina sintetasa de Leptospira interrogans serovar

Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 >gi|28378057|ref|NP_784949.1| metionina adenosiltransferasa de WCFS de Lactobacillus plantarum >gi|26453553|dbj|BAC43885.1| S-adenosilmetionina sintetasa de Mycoplasma penetrans >gi|24212014|sp|Q9K5E4| S-adenosilmetionina sintetasa de Corynebacterium glutamicum >gi|18145842|dbj|BAB81883.1| S-adenosilmetionina sintetasa de Clostridium perfringens cepa 13 >gi|13363290|dbj|BAB37241.1| metionina adenosiltransferasa 1 de 0157:H7 de Escherichia coli >gi|45443250|ref|NP_994789.1| S-adenosilmetionina sintetasa de Yersinia pestis biovar Mediaevails cepa 91001 >gi|44888151|sp|Q7WQX8|METK S-adenosilmetionina sintetasa de Borrelia burgdorferi >gi|44888141|sp|Q7U4S6| S-adenosilmetionina sintetasa de WH8102 de Synechococcus sp. >gi|44888135|sp|Q7MHK6| S-adenosilmetionina sintetasa de YJ016 de Vibrio vulnificus >gi|23466330|ref|NP_696933.1| S-adenosilmetionina sintetasa de NCC2705 de Bifidobacterium longum >gi|21219978|ref|NP_625757.1| S-adenosilmetionina sintetasa de A3(2) de Streptomyces coelicolor >gi|39937076|ref|NP_949352.1| metionina S-adenosiltransferasa de CGA009 de Rhodopseudomonas palustris >gi|16766391|ref|NP_462006.1| metionina adenosiltransferasa 1 de LT2 de Salmonella typhimurium >gi|33594910|ref|NP_882553.1| S-adenosilmetionina sintetasa de 12822 de Bordetella parapertussis >gi|44888148|sp|Q7VRG5| S-adenosilmetionina sintetasa de Candidatus Blochmannia floridanus >gi|44888147|sp|Q7VNG7|METK_HAEDU S-adenosilmetionina sintetasa de Haemophilus ducreyi >gi|44888146|sp|Q7VFY5| S-adenosilmetionina sintetasa de Helicobacter hepaticus >gi|44888145|sp|Q7VDM7| S-adenosilmetionina sintetasa de Prochlorococcus marinus >gi|44888142|sp|Q7URU7| S-adenosilmetionina sintetasa de Pirellula spec >gi|44888138|sp|Q7NHG0| S-adenosilmetionina sintetasa de Gloeobacter violaceus >gi|44888137|sp|Q7N119| S-adenosilmetionina sintetasa de Photorhabdus luminescens subsp. laumondii >gi|44888136|sp|Q7MTQ0| S-adenosilmetionina sintetasa de Porphyromonas gingivalis >gi|39650934|emb|CAE29457.1| metionina S-adenosiltransferasa de CGA009 de Rhodopseudomonas palustris >gi|15792421|ref|NP_282244.1| S-adenosilmetionina sintetasa de NCTC 11168 de Campylobacter jejuni subsp.

jejuni >gi|39574954|emb|CAE78795.1| metionina adenosiltransferasa de HD100 de Bdellovibrio bacteriovorus >gi|45657232|ref|YP_001318.1| proteína s-adenosilmetionina sintetasa de Leptospira interrogans serovar

Copenhageni cepa Fiocruz L1-130

>gi|28378057|ref|NP_784949.1| metionina adenosiltransferasa de WCFS1 de Lactobacillus plantarum

>gi|45600470|gb|AAS69955.1| proteína s-adenosilmetionina sintetasa de Leptospira interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 >gi|26453553|dbj|BAC43885.1| S-adenosilmetionina sintetasa de Mycoplasma penetrans >gi|18145842|dbj|BAB81883.1| S-adenosilmetionina sintetasa de Clostridium perfringens cepa 13 >gi|13363290|dbj|BAB37241.1| metionina adenosiltransferasa 1 de O157:H7 de Escherichia coli >gi|45443250|ref|NP_994789.1| S-adenosilmetionina sintetasa de Yersinia pestis biovar Mediaevails cepa 91001 >gi|44888153|sp|Q8CXS7| S-adenosilmetionina sintetasa de Leptospira interrogans >gi|44888151|sp|Q7WQX8| S-adenosilmetionina sintetasa de Bordetella bronchiseptica >gi|44888150|sp|Q7W200| S-adenosilmetionina sintetasa de Bordetella parapertussis >gi|44888149|sp|Q7VUL5| S-adenosilmetionina sintetasa de Bordetella pertussis.

La S-adenosilmetionina sintetasa modificada exhibe preferentemente una actividad específica que es por lo menos

cinco veces menor que la de la enzima de tipo silvestre. Preferentemente, la secuencia de proteína de una S-adenosilmetionina sintetasa modificada contiene la mutación de aminoácido de por lo menos una de las secuencias especificadas a continuación.

En una forma de realización de la invención, los cambios de aminoácido se refieren a la cisteína en la posición 89 o la cisteína en la posición 239 que reduce la actividad de MetK (Reczkowski y Markham, 1995, JBC 270, 31, 1848418490).

En una forma de realización preferida, por lo menos una mutación está presente en la región conservada 1, que corresponde a los aminoácidos 54 a 59 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, comprendiendo la región conservada 1 no mutada la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

G-E-X1-X2-X3-X4 en donde: X1 representa I, V, L, T, preferentemente I X2 representa T, K, S, R, preferentemente T X3 representa T, S, G, preferentemente T X4 representa S, N, T, K, E, R, P, N, A, preferentemente S.

Preferentemente, la región conservada 1 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: G-E-I-T-T-S. En otra forma de realización preferida, por lo menos una mutación está presente en la región conservada 2, que

corresponde a los aminoácidos 98 a 107 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, comprendiendo la región conservada 2 no mutada la secuencia de aminoácidos definida a continuación: Q-S-X1-D-1-X2-X3-G-V-X4

en donde: X1 representa P, Q, A, S, preferentemente P X2 representa A, N, Q, S, F, preferentemente N X3 representa V, Q, Y, R, M, N, preferentemente Q X4 representa K, D, N, T, S, A, E, preferentemente D.

Preferentemente, la región conservada 2 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada tiene la siguiente

secuencia de aminoácidos: Q-S-P-D-I-N-Q-G-V-D. En otra forma de realización preferida, por lo menos una mutación está presente en la región conservada 3, que corresponde a los aminoácidos 114 a 121 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID

nº 2, comprendiendo la región conservada 3 no mutada la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

X1-G-A-G-D-Q-G-X2

en donde:

X1 representa Q, A, I, V, E, T, preferentemente Q

X2 representa L, I, S, V, M, preferentemente L.

Preferentemente, la región conservada 3 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Q-G-A-G-D-Q-G-L.

En otra forma de realización preferida, por lo menos una mutación está presente en la región conservada 4, que corresponde a los aminoácidos 137 a 144 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, comprendiendo la región conservada 4 no mutada la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

X1-I-X2-X3-X4-H-X5-X6

en donde:

X1 representa S, P, T, A, preferentemente P

X2 representa A, T, W, Y, F, S, N, preferentemente T

X3 representa M, Y, L, V, preferentemente Y

X4 representa S, A, preferentemente A

X5 representa K, R, E, D, preferentemente R

X6 representa L, I, preferentemente L.

Preferentemente, la región conservada 4 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: P-I-T-Y-A-H-R-L.

En otra forma de realización preferida, por lo menos una mutación está presente en la región conservada 5, que corresponde a los aminoácidos 159 a 163 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, comprendiendo la región conservada 5 no mutada la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

X1-L-X2-X3-D

en donde:

X1 representa W, F, Y, V, E, preferentemente W

X2 representa R, G, L, K, preferentemente R

X3 representa P, L, H, V, preferentemente P.

Preferentemente, la región conservada 5 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: W-L-R-P-D.

Preferentemente, por lo menos una mutación está presente en la región conservada 6, que corresponde a los aminoácidos 183 a 189 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, comprendiendo la región conservada 6 no mutada la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

X1-X2-X3-S-X4-Q-H

en donde:

X1 representa V, I, preferentemente V

X2 representa V, L, I, preferentemente V

X3 representa V, L, I, M, preferentemente L

X4 representa T, V, A, S, H, preferentemente T.

En una forma de realización preferida, la región conservada 6 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: V-V-L-S-T-Q-H.

Preferentemente, las mutaciones se introducen en la región conservada 7, que corresponde a los aminoácidos 224 a 230 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, comprendiendo la región conservada 7 no mutada la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

X1-N-P-X2-G-X3-F

en donde:

X1 representa I, V, preferentemente I

X2 representa T, G, S, preferentemente T

X3 representa R, T, Q, K, S, preferentemente R.

En una forma de realización preferida, la región conservada 7 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: I-N-P-T-G-R-F.

Preferentemente, las mutaciones se introducen en la región conservada 8, que corresponde a los aminoácidos 231 a 237 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, comprendiendo la región conservada 8 no mutada la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

X1-X2-G-X3-P-X4-X5

en donde:

X1 representa T, V, I, Y, E, preferentemente V

X2 representa V, I, L, N, preferentemente I

X3 representa G, S, preferentemente G

X4 representa M, I, Q, A, H, D, preferentemente M

X5 representa G, S, A, H, preferentemente G.

En una forma de realización preferida, la región conservada 8 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: V-I-G-G-P-M-G.

Preferentemente, las mutaciones se introducen en la región conservada 9, que corresponde a los aminoácidos 246 a 253 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, la región conservada 9 no mutada comprendiendo la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

X1-X2-D-T-Y-G-G

en donde:

X1 representa M, I, preferentemente I

X2 representa V, I, preferentemente I.

En una forma de realización preferida, la región conservada 9 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: I-V-D-T-Y-G-G.

Preferentemente, las mutaciones se introducen en la región conservada 10, que corresponde a los aminoácidos 269 a 275 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2, la región conservada 10 no mutada comprendiendo la secuencia de aminoácidos definida a continuación:

K-V-D-R-S-X1-X2

en donde:

X1 representa A, G, preferentemente A

X2 representa A, S, L, preferentemente A.

En una forma de realización preferida, la región conservada 10 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: K-V-D-R-S-A-A.

En otra aplicación preferida de la invención, por lo menos una mutación está presente en la región conservada 11. La S-adenosilmetionina sintetasa no modificada aloja la región conservada en su parte C-terminal, con la siguiente secuencia de aminoácidos:

X1-X2-Q-X3-X4-Y-A-I-G-X5-X6

en donde:

X1 representa L, E, I, Q, T, preferentemente E

X2 representa V, I, L, preferentemente I

X3 representa V, L, I, preferentemente V

X4 representa A, S, preferentemente S

X5 representa V, I, R, K, A, preferentemente V

X6 representa A, V, T, S, preferentemente A.

Esta región corresponde a los aminoácidos 295 a 305 en la secuencia de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada en SEC ID nº 2.

En una forma de realización preferida, la región conservada 11 de S-adenosilmetionina sintetasa no modificada, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: E-I-Q-V-S-Y-A-I-G-V-A.

En otra aplicación preferida de la invención, las mutaciones se introducen en el extremo N-terminal de la proteína, que lleva a un cambio de estructura y cambios en por lo menos 6 aminoácidos.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente la serina en la región conservada 1 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la serina es reemplazada con una asparagina.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada: G-E-I-T-T-N.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente la glicina conservada en la región conservada 2 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la glicina conservada es reemplazada con una serina.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada 2: Q-S-P-D-I-N-Q-S-V-D.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la glicina conservada en la región conservada 3 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la glicina conservada es reemplazada con una serina.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada 3: Q-S-A-G-D-Q-G-L.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la histidina conservada y/o la prolina semiconservada en la región conservada 4, son reemplazadas con otros aminoácidos. En una aplicación preferida de la invención, la histidina conservada es reemplazada con una tirosina, y/o la prolina semiconservada es reemplazada con una leucina.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos en la región conservada 4:

P-I-T-Y-A-Y-R-L,

L-I-T-Y-A-H-R-L,

L-I-T-Y-A-Y-R-L.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la arginina semiconservada en la región conservada 5 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la arginina es reemplazada con una cisteína.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada 5: W-L-C-P-D.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la histidina conservada o valina semiconservada en la región conservada 6, es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la histidina conservada es reemplazada con una tirosina, y/o la valina con aspartato.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene una de las tres secuencias de aminoácidos en la región conservada 6:

V-V-L-S-T-Q-Y

V-D-L-S-T-Q-H

V-D-L-S-T-Q-Y.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la treonina semiconservada en la región conservada 7 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la treonina es

reemplazada con una isoleucina.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada 7: I-N-P-I-G-R-F.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la prolina conservada en la región conservada 8 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la prolina es reemplazada con una serina.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada 8: V-I-G-G-S-M-G.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la segunda glicina conservada en la región conservada 9 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la glicina es reemplazada con un aspartato.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada 9: I-V-D-T-Y-G-D.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la serina conservada en la región conservada 10 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la serina es reemplazada con una fenilalanina.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada tiene la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada 10: K-V-D-R-F-A-A.

En la S-adenosilmetionina sintetasa con actividad disminuida, preferentemente, la isoleucina conservada en la región conservada 11 es reemplazada con otro aminoácido. En una aplicación preferida de la invención, la isoleucina es reemplazada por leucina.

En una forma de realización preferida, la S-adenosilmetionina sintetasa modificada presenta la siguiente secuencia de aminoácidos en la región conservada 11: E-I-Q-V-S-Y-A-L-G-V-A.

La presente invención se refiere además a secuencias de nucleótidos, secuencias de ADN o ARN, que codifican una S-adenosilmetionina sintetasa mutada de acuerdo con la invención, como se definió anteriormente. En una forma de realización preferida, estas secuencias de ADN se caracterizan por el hecho de que comprenden por lo menos una mutación en las regiones de secuencia de ADN codificantes para las regiones conservadas 1 a 11 del gen metK de tipo natural, representado como tipo natural en SEC ID nº 2, dicha mutación no siendo una mutación silenciosa.

En una aplicación preferida, el gen metK es la S-adenosilmetionina sintetasa de K12 de E. coli representada por SEC ID nº 2 y secuencias homólogas a esa secuencia que tienen actividad de S-adenosilmetionina sintetasa, y que comparten por lo menos 80% de homología, preferentemente 90% de homología, con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2.

Los genes de S-adenosilmetionina sintetasa mutada descritos anteriormente, pueden obtenerse por medio de técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia descritas anteriormente y a continuación, incluyendo mutagénesis aleatoria o dirigida, o construcción de ADN sintético.

El gen metA que codifica homoserina succiniltransferasa modificada, y/o el gen metK que codifica Sadenosilmetionina sintetasa modificada, pueden ser codificados cromosómicamente o extracromosómicamente. Cromosómicamente, pueden existir una o varias copias en el genoma que pueden introducirse por medio de métodos de recombinación conocidos por los expertos en la materia. Extracromosómicamente, ambos genes pueden ser llevados por diferentes tipos de plásmidos que difieren con respecto a su origen de replicación, y de esta manera su número de copias en la célula. Pueden estar presentes como 1 a 5 copias, aproximadamente 20 o hasta 500 copias, que corresponden a plásmidos de bajo número de copias con replicación estrecha (pSC101, RK2), plásmidos de bajo número de copias (pACYC, pRSF1010) o plásmidos de alto número de copias (pSK bluescript II).

Los genes metA y/o metK pueden expresarse usando promotores con diferente potencia que necesitan ser inducidos o no por moléculas inductoras. Ejemplos son el promotor Ptrc, Ptac, Plac, el promotor lambda cl, u otros promotores conocidos por los expertos en la materia.

La expresión de MetA y/o MetK puede ser incrementada o reducida por elementos que estabilizan o desestabilizan el ARN mensajero (Carrier y Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) o la proteína correspondiente (por ejemplo, marcadores de GST, Amersham Biosciences).

La presente invención se refiere también a microorganismos que contienen un alelo de metA resistente a la

retroalimentación de acuerdo con la invención, y finalmente un alelo de metK con actividad reducida de acuerdo con la invención.

Dichas cepas se caracterizan por el hecho de que poseen un metabolismo de metionina que es desregulado mediante por lo menos un alelo de metA resistente a la retroalimentación, y/o por una producción reducida de SAM causada por una enzima MetK con actividad reducida.

Pueden prepararse cepas nuevas a partir de cualquier microorganismo en el cual el metabolismo de metionina proceda por la misma vía metabólica.

Las bacterias Gram-negativas, en particular E. coli, son especialmente adecuadas.

Para el propósito de expresión de la enzima homoserina succiniltransferasa modificada y la enzima Sadenosilmetionina sintetasa, los alelos de metA resistentes a la retroalimentación y los alelos de metK con actividad reducida, son transformados en una cepa hospedadora usando los métodos acostumbrados. La selección de cepas que posean propiedades de homoserina succiniltransferasa y S-adenosilmetionina sintetasa modificadas se realiza, por ejemplo, usando pruebas enzimáticas.

Por ejemplo, la actividad de homoserina succiniltransferasa puede determinarse en una prueba enzimática con homoserina y succinil-CoA como sustratos. La reacción se inicia añadiendo el extracto de proteínas que contiene a la enzima homoserina succiniltransferasa, y la formación de O-succinilhomoserina se monitorea por medio de GC-MS después de precipitación de la proteína y derivación con un reactivo de sililación. Se pone a prueba la inhibición por retroalimentación en presencia de metionina y S-adenosilmetionina en la mezcla de reacción.

La actividad de S-adenosilmetionina sintetasa puede determinarse en una prueba enzimática con metionina y ATP como sustratos. La reacción se inicia añadiendo el extracto de proteínas que contiene a la enzima Sadenosilmetionina sintetasa, y la formación de S-adenosilmetionina se monitorea por medio de FLA-MS/MS.

Preferentemente, se hace uso de cepas de E. coli en las cuales los genes metA y metK endógenos son inactivados y complementados por genes recombinantes nuevos.

Los alelos de metA resistentes a la retroalimentación y los alelos de metK con actividad reducida, hacen posible suprimir el control en puntos de control biosintéticos importantes, amplificando de esta manera la producción de un gran número de compuestos que están situados corriente abajo del aspartato. Estos incluyen, en particular, homoserina, O-succinilhomoserina, cistationina, homocisteína, metionina y S-adenosilmetionina.

En particular, la invención se refiere a la preparación de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de la misma, por medio del cultivo de microorganismos nuevos. Los productos descritos anteriormente se clasifican a continuación como compuesto (I).

Un incremento en la producción del compuesto (I) puede lograrse cambiando los niveles de expresión, o eliminando los siguientes genes implicados en la producción de aspartato, un precursor del compuesto (I):

Gen

Entrada del GenBank Nombre

ackA

g1788633 acetato cinasa

pta

g1788635 fosfotransacetilasa

acs

g1790505 acetato sintasa

aceA

g1790445 isocitrato liasa

aceB

g1790444 malato sintasa

aceE

g1786304 piruvato deshidrogenasa E1

aceF

g1786305 piruvato deshidrogenasa E2

lpd

g1786307 piruvato deshidrogenasa E3

aceK

g1790446 isocitrato deshidrogenasa cinasa/fosfatasa

sucC

g1786948 succinil-CoA sintetasa, subunidad beta

sucD

g1786949 succinil-CoA sintetasa, subunidad alfa

ppc

g1790393 fosfoenolpiruvato carboxilasa

pck

g1789807 fosfoenolpiruvato carboxicinasa

pykA

g1788160 piruvato cinasa II

pykF

g1787965 piruvato cinasa I

poxB

g1787096 piruvato oxidasa

pps

g1787994 fosfoenolpiruvato sintasa

ilvB

g1790104 acetohidroxiácido sintasa I, subunidad grande

ilvN

g1790103 acetohidroxiácido sintasa I, subunidad pequeña

ilvG

g1790202 acetohidroxiácido sintasa II, subunidad grande

g1790203

ilvM

g1790204 acetohidroxiácido sintasa II, subunidad pequeña

ilvI

g1786265 acetohidroxiácido sintasa III, subunidad grande

ilvH

g1786266 acetohidroxiácido sintasa III, subunidad pequeña

aroF

g1788953 DAHP sintetasa

aroG

g1786969 DAHP sintetasa

aroH

g1787996 DAHP sintetasa

aspC

g1787159 aspartato aminotransferasa

Además, puede introducirse piruvato carboxilasa de Rhizobium etli (número de acceso U51439) por ingeniería genética en E. coli, y puede sobreexpresarse.

Puede lograrse un incremento adicional en la producción del compuesto (I) sobreexpresando genes de la vía de la lisina/metionina, tales como las enzimas que sintetizan homoserina codificadas por los genes thrA (homoserina deshidrogenasa/aspartoquinasa, g1786183) o metL (homoserina deshidrogenasa/aspartoquinasa, g1790376) o lysC (apartocinasa, g1790455) o asd (aspartato semialdehído deshidrogenasa, g 1789841), o una combinación de las mismas.

Un incremento adicional en la producción del compuesto (I) es posible, sobreexpresando genes implicados en la asimilación de sulfato y producción de cisteína. Esto puede lograrse sobreexpresando los siguientes genes (véase a continuación), o desregulando la vía a través de la introducción de un alelo de cysB constitutivo como es descrito por Colyer y Kredich (1994 Mol Microbiol 13 797-805), e introduciendo un alelo de cysE que codifique puna serina acetiltransferasa con sensibilidad disminuida por su inhibidor L-cisteína (solicitud de patente nº US 6.218.168, Denk y Bock 1987 J Gen Microbiol 133 515-25). Los siguientes genes necesitan ser sobreexpresados:

CysA g1788761 sulfato permeasa CysU g1788764 sistema de transporte de cisteína CysW g1788762 sistema de transporte de sulfato unido a membrana CysZ g1788753 marco de lectura abierto corriente arriba de cysK cysN g1789108 ATP sulfurilasa cysD g1789109 sulfato adenililtransferasa cysC g1789107 adenililsulfato cinasa cysH g1789121 adenililsulfato reductasa cysI g1789122 sulfito reductasa, subunidad alfa cysJ g1789123 sulfito reductasa, subunidad beta cysE g1790035 serina acetiltransferasa cysK g1788754 cisteína sintasa cysM g2367138 O-acetil-sulfhidrolasa

Además, los genes implicados en la producción de grupos C1 (metilo) pueden mejorarse sobreexpresando los siguientes genes:

serA g1789279 fosfoglicerato deshidrogenasa serB g1790849 fosfoserina fosfatasa serC g1787136 fosfoserina aminotransferasa glyA g1788902 serina hidroximetiltransferasa metF g1790377 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa

Además, pueden sobreexpresarse los siguientes genes implicados directamente en la producción de metionina:

metB g1790375 cistationina gamma-sintasa metC g1789383 cistationina beta-liasa metH g1790450 homocisteína-N5-metiltetrahidrofolato transmetilasa dependiente de B12 metE g2367304 Tetrahidropteroiltriglutamato metiltransferasa metF g1790377 5,10-Metilentetrahidrofolato reductasa metR g1790262 gen regulador positivo para metE y metH y regulación autógena

Además, la expresión de genes en vías que degradan metionina, o que se desvían de la vía de producción de metionina, puede ser reducida, o los genes pueden ser eliminados.

speD g1786311 S-adenosilmetionina descarboxilasa speC g1789337 ornitina descarboxilasa thrB g1786184 homoserina cinasa astA g1788043 arginina succiniltransferasa dapA g1788823 dihidrodipicolinato sintasa

Un incremento adicional en la producción del compuesto (I) es posible eliminando el gen para la proteína represora MetJ, responsable de la subregulación del regulón de metionina, como se sugirió en el documento JP 2000157267

A/3 (véase también g1790373 del GenBank).

La producción de (I) puede incrementarse además usando un alelo de metB alterado que usa preferentemente o exclusivamente H2S, y produce de esta manera homocisteína a partir de O-succinilhomoserina, como se ha descrito en la solicitud de patente del PCT nº PCT/FR04/00354, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.

En otra forma de realización preferida, el gen que codifica aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa es sobreexpresado, y/o el gen que codifica el represor de metionina metJ es eliminado en el microorganismo de la presente invención y en el microorganismo usado en el método de acuerdo con la invención.

Preferentemente, la aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa es codificada por un alelo de ThrA desregulado por retroalimentación. Dicha desregulación por retroalimentación puede obtenerse introduciendo la mutación Phe318Scr en la enzima de ThrA. La posición de la enzima es proporcionada en la presente memoria haciendo referencia a la secuencia de ThrA descrita en el número de acceso V00361.1 del GeneBank (g1786183).

Los alelos de metA y metK descritos anteriormente, pueden usarse en eucariontes o procariontes. Preferentemente, el organismo usado es un procarionte. En una aplicación preferida, el organismo es E. coli o C. glutamicum.

La invención se refiere también al procedimiento para la producción del compuesto (I). El compuesto (I) se prepara usualmente por fermentación de la cepa bacteriana designada.

De acuerdo con la invención, los términos “cultivo” y “fermentación” se usan indistintamente para referirse al crecimiento de un microorganismo en un medio de cultivo adecuado que contiene una fuente de carbono simple.

De acuerdo con la invención, una fuente de carbono simple es una fuente de carbono que puede ser usada por los expertos en la materia para lograr el crecimiento normal de un microorganismo, en particular de una bacteria. En particular, puede ser un azúcar asimilable tal como glucosa, galactosa, sacarosa, lactosa o miel, o subproductos de estos azúcares. Una fuente de carbono simple especialmente preferida, es la glucosa. Otra fuente de carbono simple preferida, es la sacarosa.

Los expertos en la materia son capaces de definir las condiciones de cultivo para los microorganismos de acuerdo con la invención. En particular, las bacterias son fermentadas a una temperatura entre 20°C y 55°C, pre ferentemente entre 25°C y 40°C, y más específicamente aproximada mente 30°C para C. glutamicum y aproximadamente 37°C para E. coli.

La fermentación se lleva a cabo en general en fermentadores con un medio de cultivo inorgánico de composición definida conocida adaptado para las bacterias usadas, conteniendo por lo menos una fuente de carbono simple y, si es necesario, un cosustrato necesario para la producción del metabolito.

En particular, el medio de cultivo inorgánico para E. coli puede ser de composición idéntica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32: 120-128), un medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), o un medio tal como el definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).

De manera análoga, el medio de cultivo inorgánico para C. glutamicum puede ser de composición idéntica o similar al medio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210), o a un medio tal como el descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583). El medio puede ser complementado para compensar auxotrofias inducidas por mutaciones.

Después de la fermentación, el compuesto (I) es recuperado y purificado si es necesario. Los métodos para la recuperación y purificación del compuesto (I), tal como metionina en el medio de cultivo, son bien conocidos por los expertos en la materia.

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Figuras 1A-1B: Metabolismo de metionina en Escherichia coli.

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Figura 2: Alineación de genes metA recombinantes y de tipo natural obtenidos tras selección en α-metilmetionina. Los residuos conservados son representados por cuadros grises claros, y los residuos mutados son indicados por cuadros blancos.

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Figura 3: Alineación de secuencias de MetA de diferentes microorganismos.

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Figura 4: Alineación de secuencias de MetK de diferentes microorganismos.

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Figura 5: Reemplazos de aminoácidos en la proteína MetK de E. coli. Los aminoácidos sobre las líneas

coherentes indican la posición y el aminoácido de reemplazo.

Ejemplos

Ejemplo 1

Aislamiento de mutantes de E. coli que contienen enzimas homoserina transuccinilasa que muestran sensibilidad disminuida a la retroalimentación hacia metionina y S-adenosilmetionina

Aislamiento de cepas de E. coli que crecen en α-metilmetionina

La α-metilmetionina es un análogo de metionina inhibidor del crecimiento que produce un efecto inmediato sobre el índice de crecimiento de E. coli a concentraciones muy bajas (concentración inhibidora mínima de 1 µg/ml, y concentración mínima para una inhibición máxima de 5 µg/ml, Rowbury et al., 1968). Los análogos pueden imitar a la metionina en la inhibición por retroalimentación de la homoserina transuccinilasa, e interferir con la síntesis de proteínas sin que sea metabolizada. Sólo las cepas mutantes son capaces de crecer en un medio que contiene al análogo.

Se desarrolló habitualmente E. coli aeróbicamente a 37°C en medio de LB complementado, según fuese necesario, con el antibiótico adecuado. El medio usado para el análogo de α-metil-metionina resistente, fue un medio mínimo que contenía (por litro): K2HPO4 8 g, Na2HPO4 2 g, (NH4)2SO4 0.75 g, (NH4)2HPO4 8 g, NH4Cl 0.13 g, ácido cítrico

6.55 g, MgSO4 2.05 g, CaCl2 40 mg, FeSO4, 40 mg, MnSO4 20 mg, CoCl2 8 mg, ZnSO4 4 mg, (NH4)2Mo2O7 2.8 mg, CuCl2 2 mg, H3BO3 1 mg. El pH se ajustó a 6.7, y el medio se esterilizó. Antes de su uso, se añadieron glucosa 10 g/l y tiamina 10 mg/l.

La α-metilmetionina en polvo comercializada por Sigma, contiene trazas de metionina. Un cultivo líquido de la noche anterior de una cepa de E. coli (MG1655 ΔmetE) incapaz de crecer sin la adición de metionina, se llevó a cabo para eliminar la metionina (proveniente de α-metilmetionina) del medio mínimo. El cultivo se centrifugó 10 minutos a 7000 rpm, y el sobrenadante se filtró (Sartorius 0.2 µm). Se añadió agar 15g/l a este medio mínimo.

Se extendieron sobre placas 1x108 células/ml de un cultivo de la noche anterior, en medio mínimo de la cepa de tipo silvestre (MG1655) con medio mínimo y α-metilmetionina después de 4 etapas de lavado en agua estéril. Las placas se incubaron a 37°C hasta que aparecieran colonias.

Evidencia de mutaciones en la secuencia codificante del gen metA que codifica la enzima homoserina transuccinilasa

Se preparó ADN genómico a partir de 4 clones que crecían en α-metil-metionina a 4 mg/ml después de cultivo en medio de LB. El sedimento celular se lavó una vez con agua estéril, y se resuspendió en 30 µl de agua estéril. Las células se rompieron por calentamiento por 5 minutos a 95°C, y los restos se transformaron a pellas. El gen metA fue amplificado por PCR usando Taq polimerasa y los siguientes iniciadores:

MetAF (SEC ID nº 3): tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc (4211759-4211788)

MetAR (SEC ID nº 4): ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt (4212857-4212828).

En tres clones se detectaron mutaciones puntuales que llevaron a sustituciones de aminoácidos. En el clon de metA11, CAG fue intercambiado por un GAG que lleva al reemplazo de Q por E. En metA*13, TTG fue intercambiado por un TTT que lleva al reemplazo de L por F. En metA*14, GCG fue intercambiado por GTG que lleva al reemplazo de A por V (véase figura 2).

Como puede apreciarse a partir de la alineación mostrada en la figura 3, los tres aminoácidos que son reemplazados están altamente conservados en las proteínas MetA de varias especies.

Las enzimas homoserina transuccinilasa mutadas muestran sensibilidad disminuida a la retroalimentación hacia metionina y S-adenosilmetionina

Se determinó la actividad de homoserina transuccinilasa in vitro. Se cultivaron cepas de E. coli que poseen enzimas mutantes o de tipo natural en medio rico con 2.5 g/l de glucosa, y se cosecharon a la fase logarítmica tardía. Las células se resuspendieron en regulador de pH de fosfato de potasio frío, y se sonicaron sobre hielo (sonificador Branson, 70W). Después de la centrifugación, las proteínas contenidas en los sobrenadantes se cuantificaron (Bradford, 1976).

Se incubaron 10 µl de los extractos por 30 minutos a 25°C con homose rina a 30 mM y succinil-CoA a 4 mM. Se añadieron metionina y/o S-adenosilmetionina, según se indica. La succinil homoserina producida por las enzimas homoserina transuccinilasa se cuantificó por GC-MS después de derivación con ter-butildimetilsililtrifluoroacetamida

(TBDMSTFA). Se incluyó L-serina [1-13C] como un estándar interno. Los resultados de las actividades de homoserina transuccinilasa se presentan en la tabla 1 siguiente: Tabla 1 Actividades específicas de enzimas homoserina transuccinilasa mutante y de tipo silvestre tras la adición de los

inhibidores L-metionina y S-adenosil metionina

Cepa

Metionina mM S-adenosilmetionina mM Actividad específica mUI/mg de proteínas

metA

0 0 0 0 0.1 1 36,7 (100%) 27,9 (76%) 4,7 (12,8%)

10 10 10

0 0.1 1 0,4 (1,1%) 0,2 (0,5%) 0,1 (0,3%)

metA*11

0 0 19,2 (100%)

0 0 10 10

0.1 1 0 0.1 21,7 (113%) 18,5 (96%) 18,7 (97%) 16,9 (88%)

10

1 2,7 (14,1%)

metA*13

0 0 0 1 10,9 (100%) 12,7 (117%)

10 10

0 1 13,7 (126%) 1,0 (9,2%)

metA*14

0 0 0 1 18,0 (100%) 15,1 (83,9%)

10 10

0 1 20,8 (116%) 2,0 (11,1%)

10 Las enzimas homoserina transuccinilasa mutadas muestran de esta manera, sensibilidad disminuida a la retroalimentación hacia metionina y S-adenosilmetionina.

Ejemplo 2

Aislamiento de mutantes de E. coli que contienen enzimas S-adenosilmetionina sintetasa con actividad reducida

Aislamiento de cepas de E. coli que crecen en norleucina

20 La norleucina es un análogo de metionina inhibidor del crecimiento. A mayores concentraciones (50 mg/l), sólo las cepas mutantes son capaces de crecer en medio que contiene al análogo. La mayoría de estas mutaciones mapean hacia los loci de metKy metJ.

25 Se desarrolló habitualmente E. coli aeróbicamente a 37°C en medio de LB complementado, según fuese necesario con el antibiótico adecuado. El medio usado para el análogo de norleucina resistente, era un medio mínimo que contenía (por litro): K2HPO4 8 g, Na2HPO4 2 g, (NH4)2SO4 0.75 g, (NH4)2HPO4 8 g, NH4Cl 0.13 g, ácido cítrico 6.55 g, MgSO4 2.05 g, CaCl2 40 mg, FeSO4 40 mg, MnSO4 20 mg, CoCl2 8 mg, ZnSO4 4 mg, (NH4)2Mo2O7 2.8 mg, CuCl2 2 mg, H3BO3 1 mg. El pH se ajustó a 6.7, y el medio se esterilizó. Antes de su uso, se añadieron glucosa 10 g/l y

30 tiamina 10 mg/l.

Se extendieron sobre placas 1x108 células/ml de un cultivo de la noche anterior en medio mínimo de la cepa de tipo silvestre (MG1655), con medio mínimo y norleucina (50 a 200 g/l) después de 4 etapas de lavado en agua estéril. Las placas se incubaron a 37°C hasta que apareciero n colonias.

35 Evidencia de mutaciones en la secuencia codificante del gen metK que codifica la enzima S-adenosilmetionina sintetasa

Se preparó ADN genómico a partir de cultivos desarrollados en medio de LB líquido. El sedimento celular de células 40 se lavó una vez con agua estéril, y se resuspendió en 30 µl de agua estéril. Las células se rompieron por calentamiento por 5 minutos a 95°C, y los restos se extrajeron.

Se amplificó por PCR ADN con Taq polimerasa, usando los siguientes cebadores:

MetKpF: cccggctggaagtggcaacacg (3084372-3084393) (SEC ID nº 05)

MetKR: gccggatgcggcgtgaacgcctatcc (3085956-3085931) (SEC ID nº 06).

Se secuenció el gen metK. En 10 clones, se detectaron mutaciones puntuales que llevaron a sustituciones de

5 aminoácidos. En el clon de metK*59/105, AGC fue intercambiado por AAC que lleva al reemplazo de S por N (posición 59), y GGC fue intercambiado por AGC que lleva al reemplazo de G por S (posición 105). En el clon metK*105, GGC fue intercambiado por AGC que lleva al reemplazo de G por S. En metK*115, GGC fue intercambiado por AGC que lleva al reemplazo de G por S. En metK*137, CCT fue reemplazado por CTT que lleva al reemplazo de P por L. En metK*142, CAC fue reemplazado por TAC que lleva al reemplazo de H por Y. En

10 metK*161/235, CGC fue reemplazado por TGC que lleva al reemplazo de R por C, y CCA fue reemplazado por TCA que lleva al reemplazo de P por S. En metK*189, CAC fue reemplazado por TAC que lleva al reemplazo de H por Y. En metK*227, ACC fue reemplazado por ATC que lleva al reemplazo de T por I. En metK*253, GGC fue reemplazado por GAC que lleva al reemplazo de G por D. En metK*273, TCC fue reemplazado por TTC que lleva al reemplazo de S por F (véase figura 5).

15 Como puede apreciarse a partir de la alineación representada en la figura 4, todos los aminoácidos que son reemplazados están conservados en las proteínas MetK de varias especies.

Enzimas S-adenosilmetionina sintetasa recombinantes con actividad disminuida

20 Se determinó la actividad de S-adenosilmetionina sintetasa in vitro. Se cultivaron cepas de E. coli que poseen enzimas mutantes o de tipo natural en medio mínimo con 5 g/l de glucosa, y se cosecharon a la fase logarítmica tardía. Las células se resuspendieron en regulador de pH de fosfato de potasio frío, y se sonicaron sobre hielo (sonificador Branson, 70W). Después de la centrifugación, las proteínas contenidas en los sobrenadantes se

25 cuantificaron (Bradford, 1976).

Cien µL de los extractos se incubaron por 30 minutos a 37°C con metionina a 10 mM y ATP a 10 mM. Se incluyó cloruro de potasio para activar a las enzimas. La adenosilmetionina producida por enzimas metionina adenosiltransferasas se cuantificó por FIA-MS/MS.

30 Los resultados de las actividades de S-adenosilmetionina sintetasa se presentan en la tabla 2 siguiente:

Tabla 2

35 Actividades de S-adenosilmetionina sintetasa (MAT) de mutantes de tipo silvestre y MetK*

Cepa

Mutaciones MAT mUI/mg de proteínas

Tipo silvestre

- 7.5

MetK*

H189Y 0.6

MetK*

S273F 2.2

MetK*

T227I 4.9

MetK*

G115S 0.4

MetK*

G105S 2.8

MetK*

H142Y 2.5

MetK*

R161C + P235S 0.7

MetK*

S59N + G105S 2.9

MetK*

P137L 1.2

MetK*

G253D 0.2

Ejemplo 3

40 Construcción de cepas de E. coli para la producción de O-succinilhomoserina o metionina, sobreexpresando homoserina transuccinilasa alterada y otras enzimas de la vía de biosíntesis de metionina

Para la construcción de cepas de E. coli que permiten la producción de O-succinilhomoserina, se introdujo un

plásmido que sobreexpresa al gen metL, que codifica para homoserina deshidrogenasa y aspartoquinasa en cepas 45 que alojan diferentes alelos de metA. El plásmido que sobreexpresa a metL se construyó de la manera siguiente:

Se usaron los dos oligonucleótidos siguientes:

-

MetLF con 32 bases (SEC ID nº 7): TATTCatgagtgtgattgcgcaggcaggggcg 50 con

-

una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4127415 a 4127441) del gen metL (secuencia 4127415 a 4129847, secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

-

una región (mayúsculas) que en conjunto con la secuencia que pertenece a metL, forma un sitio de restricción para la enzima BspHI (subrayada),

-

MetBLAR con 38 bases (SEC ID nº 8): TATAAGCTTccataaacccgaaaacatgagtaccgggc

con

-

una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4129894 a 4129866) del gen metL

-

una región (mayúsculas) que aloja el sitio de restricción HindIII.

El gen metL se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos MetLF y MetBLAR, y los sitios de restricción BspHI y HindIII se introdujeron en los extremos N-terminal y C-terminal del gen metL, respectivamente. El fragmento de PCR resultante fue restringido por BspHI y HindIII, y clonado en el vector pTrc99A (Stratagene) cortado previamente por NcoIy HindIII. Se examinaron preparaciones de plásmidos para la presencia de inserciones del tamaño correcto. Se verificó a la secuencia de ADN de metL, y se transformó el plásmido resultante pTRCmetL en las cepas que alojan los alelos metA*11 y metA*13.

Se determinó la actividad de homoserina deshidrogenasa II (HDH) in vitro. Se cultivaron cepas de E. coli en medio mínimo con 10 g/l-1 de glucosa, y se cosecharon a la fase logarítmica tardía. Las células se resuspendieron en regulador de pH de fosfato de potasio frío, y se sonicaron sobre hielo (sonificador Branson, 70W). Después de la centrifugación, las proteínas contenidas en los sobrenadantes se cuantificaron (Bradford, 1976).

Se incubaron 30 µL de los extractos a 30°C en un espectrofotómetro, con homoserina a 25 mM y NADP+ a 1 mM. Se incluyó cloruro de potasio para activar a la enzima. Puesto que E. coli aloja un segundo gen que codifica para la actividad de homoserina deshidrogenasa (thrA), se añadió treonina que inhibe esta actividad. La aparición de NADPH se monitoreó durante 30 minutos a 340 nm.

La expresión de metL a partir del promotor Ptrc, incrementa drásticamente la actividad de HDH cuando se compara con una cepa similar con el plásmido.

Tabla 3

Actividades de homoserina deshidrogenasa de la proteína MetL en la cepa MG1655 de E. coli que aloja la mutación metA*11 con o sin sobreexpresión de metL a partir del promotor Ptrc

Cepa

HDH en mUl/mg de proteína

metA*11 de MG1655

11

metA*11 pTRCmetL de MG1655

117

En otra aplicación, el gen regulador de metionina metJ fue eliminado en las cepas que alojan los alelos metA*11, metA*13 y metA*14. Para inactivar el gen metJ, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol, mientras que deleta la mayor parte del gen involucrado. Para este propósito, se usaron dos oligonucleótidos:

DmetJF con 100 bases (SEC ID nº 9): Caggcaccagagtaaacattgtgttaatggacgtcaatacatctggacatctaaacttctttgcgtatagattg agcaaaCATATGAATATCCTCCTTAG

con

-

una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4126216 a 4126137) del gen metJ (secuencia 4125658 a 4125975, secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

-

una región (mayúscula) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. y Wanner, B. L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

-

DmetJR con 100 bases (SEC ID nº 10): tgacgtaggcctgataagcgtagcgcatcaggcgattccactccgcgccgctcttttttgctttagt attcccacgtctcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

con

-

una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4125596 a 4125675) del gen metJ

-

una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol.

Se usaron los oligonucleótidos DmetJR y DmetJF para amplificar el casete de resistencia a cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto de PCR obtenido se introdujo entonces por electroporación en la cepa MG1655

5 (pKD46), en la cual la enzima Red recombinasa expresada permitió la recombinación homóloga. Los transformantes resistentes a cloranfenicol se seleccionaron entonces, y se verificó la inserción del cassette de resistencia por medio de un análisis por PCR con los oligonucleótidos MetJR y MetJF definidos más adelante. La cepa retenida es designada como MG1655 (ΔmetJ::Cm)metA*.

10 MetJR (SEC ID nº 11): ggtacagaaaccagcaggctgaggatcagc (homólogo a la secuencia de 4125431 a 4125460). MetBR (SEC ID nº 12): ttcgtcgtcatttaacccgctacgcactgc (homólogo a la secuencia de 4126305 a 4126276).

Se eliminó entonces el casete de resistencia a cloranfenicol. El plásmido pCP20 que posee FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT del cassette de resistencia a cloranfenicol, se introdujo en la cepa recombinante por

15 electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, se verificó la pérdida del casete de resiste ncia a cloranfenicol por medio de un análisis por PCR con los mismos oligonucleótidos que se usaron previamente. Las cepas retenidas fueron designadas como MG1655 (ΔmetJ)metA*.

Subsiguientemente, el plásmido pTRCmetL que aloja el gen metL se introdujo en estas cepas, dando lugar a ΔmetJ 20 metA*11 pTRC:metL, ΔmetJ metA*13 pTRCmetLy ΔmetJ metA*14 pTRCmetL.

Ejemplo 4

Construcción de alelos de homoserina succiniltransferasa que expresan enzimas con más sensibilidad 25 reducida a la retroalimentación

Para reducir más la sensibilidad de la homoserina transuccinilasa a sus inhibidores de retroalimentación metionina y SAM, se construyeron otros mutantes de metA por mutagénesis dirigida al sitio.

30 Inicialmente, los alelos metAy metA*11 fueron clonados en el vector pTRC99A (Stratagene). Se usaron los dos oligonucleótidos siguientes:

-MetA-NcoI con 49 bases (SEC ID nº 13): TATTAAATTACCatggcaccgattcgtgtgccggacgagctacccgccg

35 con

-

una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4211862 a 4211892) del gen metA (secuencia 4211859 a 4212788, secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

40 -una región (mayúsculas) que en conjunto con la secuencia que pertenece a metA, forma un sitio de restricción para la enzima NcoI (subrayada),

-MetA-EcoRI con 47 bases (SEC ID nº 14): TATTAAATTAGaattccgactatcacagaagattaatccagcgttgg

45 con

-

una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4212804 a 42127774) del gen metA

-

una región (mayúsculas) que aloja el sitio de restricción EcoRI.

50 Los alelos metA y metA*11 se amplificaron por PCR usando los oligonucleótidos MetAF y MetAR, y se introdujeron los sitios de restricción NcoIy EcoRI en los extremos N-terminal y C-terminal del gen metA, respectivamente. Los fragmentos de PCR resultantes fueron restringidos por NcoIy EcoRI, y clonados en el vector pTRC99A (Stratagene) cortado previamente por NcoIy EcoRI.

55 Se examinaron preparaciones de plásmidos para la presencia de inserciones del tamaño correcto, y las secuencias de ADN de metA y metA*11 se verificaron por secuenciación.

El análisis enzimático de los clones que expresan metAy metA*11, proporcionó una actividad de MetA muy

60 reducida. Los presentes inventores asumieron que la introducción de una alanina entre el aminoácido 1M y 2P, que se requirió para la clonación de metA en el vector pTRC99A, causó esta pérdida de actividad. Por lo tanto, mediante el uso de mutagénesis dirigida a sitio (Stratagene), se eliminó la alanina usando los oligonucleótidos:

metA-alaF (AfIIII) (SEC ID nº 15): cacacaggaaacagaccatgccgatacgtgtgccggacgagctaccc 65 metA-alaR (AfIIII) (SEC ID nº 16): gggtagctcgtccggcacacgtatcggcatggtctgtttcctgtgtg

Después, se construyeron los mutantes metA*15 (A27V + Q64E), metA*16 (Q64D) y metA*17 (A27V + Q64D) por mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene), usando la secuencia de metA corregida como matriz. Para la construcción de pTRCmetA*15 (A27V + Q64E), se usaron los siguientes oligonucleótidos:

MetAA28VF (XbaI) (SEC ID nº 17): Gtgatgacaacttctagagtgtctggtcaggaaattcgtcc MetAA28VR (XbaI) (SEC ID nº 18): Ggacgaatttcctgaccagacactctagaagttgtcatcac y pTRC metA*11 como matriz.

Para la construcción de pTRCmetA*16 (Q64D), se usaron los siguientes oligonucleótidos: MetAQ64DF (EcoRV) (SEC ID nº 19): Gctttcaaactcacctttggatgtcgatatccagctgttgc MetAQ64DR (EcoRV) (SEC ID nº 20): gcaacagctggatatcgacatccaaaggtgagtttgaaagc y pTRCmetA como matriz.

Para la construcción de pTRCmetA*17 (A27V + Q64D), se usaron los siguientes oligonucleótidos: MetAA28VF (XbaI) (SEC ID nº 17) y MetAA28VR (XbaI) (SEC ID nº 18); y pTRCmetA*16 como matriz.

Los plásmidos se verificaron por secuenciación. Para transferir los alelos metA*15, metA*16 y metA*17 en el locus de metA en el cromosoma, se construyó una deleción de metA en la base de ΔmetJ aplicando la misma estrategia usada para la deleción de metJ. Se usaron los siguientes oligonucleótidos para la deleción de metA:

DmetAF (4211866-4211945) (SEC ID nº 21): ttcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatg

acaacttctcgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG DmetAR (4212785-4212706) (SEC ID nº 22): Atccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagacgtaatagttgagc cagttggtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAG

La región indicada en minúsculas corresponde a la secuencia entre metA e yjaB. La región en mayúsculas se usa para amplificar el casete de resistencia a kanamicina (Datsenko y Wanner, 2000). (Los números entre paréntesis corresponden a la secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/).

La deleción resultante se verificó usando los siguientes oligonucleótidos (los números entre paréntesis corresponden a la secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/).

MetAF (SEC ID nº 3) y MetAR (SEC ID nº 4). La cepa resultante DmetJDmetA se usó para introducir los alelos metA*15, metA*16 y metA*17 en el cromosoma. Para este propósito, se introdujo el plásmido pKD46 en la cepa DmetJDmetA (Datsenko y Wanner, 2000). Los alelos se amplificaron a partir de los vectores pTRCmetA*15, pTRCmetA*16 y pTRCmetA*17 usando los siguientes oligonucleótidos:

MetArcF (4211786-4211884 (SEC ID nº 23) Ggcaaattttctggttatcttcagctatctggatgtctaaacgtataagcgtatgtagtgaggtaatcaggttatgccgattcgtgtgccggacgagc MetArcR (4212862-412764) (SEC ID nº 24) Cggaaataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggtaaggtgctgaatcgcttaacgatcgactatcacagaagattaatccagcgttggattcatgtgc La secuencia en negritas es homóloga a la secuencia del gen metA; el resto de la secuencia es adyacente a metA. Para verificación por PCR, se usaron los siguientes oligonucleótidos: MetAF (SEC ID nº 3) y MetAR (SEC ID nº 4). Como se describió anteriormente, las cepas resultantes se cultivaron en medio mínimo, se prepararon extractos

crudos, y se determinó la actividad de MetA. Como puede apreciarse a partir de la tabla 4, los alelos recién construidos son menos sensibles a la inhibición por metionina y SAM, que los alelos descritos anteriormente. Especialmente interesante es el alelo metA*15 con alta actividad intrínseca que no puede ser inhibido por SAM y metionina.

Tabla 4 Actividades de homoserina transuccinilasa de mutantes de MetA en ausencia y presencia de metionina a 100 mM y SAM a 1 mM. Los valores en porcentaje entre paréntesis, indican la cantidad de actividad restante tras la inhibición

Cepa

Metionina mM S-adenosilmetionina mM Actividad específica mUI/mg de proteínas

metA*11 ΔmetJ

0 0 492 (100%)

100

1 14 (2,8%)

metA*11rc ΔmetJ

0 0 531 (100%)

100

1 18 (3,4%)

metA*15rc ΔmetJ

0 0 610 (100%)

100

1 733 (100%)

metA*16rc ΔmetJ

0 0 294 (100%)

100

1 143 (48,6%)

metA*17rc ΔmetJ

0 0 436 (100%)

100

1 305 (70%)

Ejemplo 5

Construcción de cepas de E. coli para la producción de O-succinil homoserina o metionina combinando 5 alelos de MetA resistentes a la retroalimentación con alelos de MetK con actividad disminuida

Para transferir los alelos de metK recombinantes en cepas que albergan alelos de metA resistentes a la retroalimentación, se introdujo un casete de resistencia a kanamicina entre el gen metK y ga/P.

10 Para introducir el casete, se usa la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a kanamicina, mientras que elimina la mayor parte del gen involucrado. Para este propósito, se usaron dos oligonucleótidos:

-

DMetKFscr con 100 bases (SEC ID nº 25): ccgcccgcacaataacatcattcttcctgatcacgtttcaccgcagattat 15 catcacaactgaaaccgattacaccaaccTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

con

-

una región (minúsculas) homóloga a la secuencia de la región entre metK y galP (secuencia 3085964 a 20 3086043, secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),

-

una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. y Wanner, B. L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

25 -DmetKRscr con 100 bases (SEC ID nº 26): gagttatatcatcatagattaaacgctgttatctgcaattaagactttactgaaaag aaatgtaacaactgtgaaaaccgCATATGAATATCCTCCTTAG

con

30 -una región (minúsculas) homóloga a la región entre el gen metK y galP (3086162 a 3086083)

-

una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina.

Se usan los oligonucleótidos DMetKFscr y DmetKRscr para amplificar el casete de resistencia a kanamicina a partir

35 del plásmido pKD4. El producto de PCR obtenido se introduce entonces por electroporación en la cepa MG1655 (pKD46) en la cual la enzima Red recombinasa expresada permite la recombinación homóloga. Los transformantes resistentes a kanamicina se seleccionan entonces, y se verifica la inserción del casete de resistencia por medio de un análisis por PCR con los oligonucleótidos MetKFscr y MetKRscr definidos a continuación. La cepa retenida es designada como MG1655 (metK, Km).

40 MetKFscr (SEC ID nº 27): gcgcccatacggtctgattcagatgctgg (homólogo a la secuencia de 3085732 a 3085760). MetKRscr (SEC ID nº 28): gcgccagcaattacaccgatatccaggcc (homólogo a la secuencia de 3086418 a 3086390).

Para transferir los alelos de metK, se usa el método de transducción del fago P1. El protocolo seguido es 45 implementado en dos etapas con la preparación del lisado del fago de la cepa MG1655 (metK, Km), y a continuación la transducción en la cepa MG1655 ΔmetK metA*11 pTRCmetL.

La construcción de la cepa (metK, Km) se describió anteriormente.

50 Preparación del lisado del fago P1

-

Inoculación con 100 µl de un cultivo de la noche anterior de la cepa MG1655 (metK, Km) de 10 ml de medio de LB +Km 50 µg/ml + glucosa 0.2% + CaCl2 5 mM

55 -Incubación durante 30 minutos a 37°C con agitació n

-

Adición de 100 µl del lisado del fago P1 preparado en la cepa MG1655 de tipo silvestre (aproximadamente 1x109 fagos/ml) -Agitación a 37°C durante3 horas hasta que todas la s células sean lisadas -Adición de 200 µl de cloroformo y tratamiento por acción de remolino -Centrifugación durante 10 minutos a 4500 g para eliminar restos de células -Transferencia del sobrenadante a un tubo estéril, y adición de 200 µl de cloroformo -Almacenamiento del lisado a 4°C. Transducción -Centrifugación durante 10 minutos a 1500 g de 5 ml de un cultivo de la noche anterior de la cepa MG1655 ΔmetJ metA*11 pTRCmetL en medio de LB -Suspensión del sedimento de células en 2.5 ml de MgSO4 a 10 mM, CaCl2 a 5 mM -Tubos de control: 100 µl de células -100 µl de fagos P1 de la cepa MG1655 (ΔmetK, Km) -Tubo de prueba: 100 µl de células + 100 µl de fagos P1 de la cepa MG1655 (ΔmetK, Km) -Incubación durante 30 minutos a 30°C sin agitació n -Adición de 100 µl de citrato de sodio a 1 M en cada tubo, y tratamiento por acción de remolino -Adición de 1 ml de medio de LB -Incubación por 1 hora a 37°C con agitación -Extensión sobre placas de medio de LB + Km 50 µg/ml después de centrifugación de los tubos por 3 minutos a 7000 rpm -Incubación a 37°C durante la noche.

Verificación de la cepa Se seleccionan entonces los transformantes resistentes a kanamicina, y se verifica la inserción de la región que contiene (metK, Km) por medio de un análisis por PCR con los oligonucleótidos MetKFscr y MetKRscr. La cepa retenida es designada como MG1655 ΔmetJ metA*11 pTRC metL metK*.

Puede eliminarse entonces el casete de resistencia a kanamicina. El plásmido pCP20 que posee FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT del cassette de resistencia a kanamicina, se introduce entonces en los sitios recombinantes por electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, se verifica la pérdida del casete de resistencia a kanamicina por medio de un análisis por PCR con los mismos oligonucleótidos que se usaron previamente (MetKFscr y MetKRscr).

Ejemplo 6 Fermentación de cepas de producción de E. coli y análisis de rendimiento

Se analizaron inicialmente cepas de producción en cultivos en matraces Erlenmeyer pequeños usando medio M9 modificado (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32: 120-128), que fue complementado con 5 g/l de MOPS y 5 g/l de glucosa. Se añadió carbenicilina cuando fuese necesario a una concentración de 100 mg/l. El cultivo de la noche anterior se usó para inocular un cultivo de 30 ml a una DO600 de 0.2. Después de que el cultivo había alcanzado una DO600 de 4.5 a 5, se añadieron 1.25 ml de una solución de glucosa a 50% y 0.75 ml de MOPS a 2 M (pH 6.9), y el cultivo se agitó por 1 hora. Después, se añadió IPTG, si era necesario.

Se analizaron metabolitos extracelulares durante la fase intermitente. Se cuantificaron aminoácidos por medio de CLAR después de derivatización con OPA/Fmoc, y se analizaron otros metabolitos relevantes usando GC-MS después de sililación.

Se obtuvieron los siguientes resultados para las cepas MG1655, MG1655 pTRCmetL MG1655 metA*11 pTRCmetL, MG1655 metA*13 pTRCmetL, MG1655 metA*11 ΔmetJ pTRCmetL, MG1655 metA*11 ΔmetJ pTRCmetL metK*H142Y.

Tabla 5

Concentraciones específicas de metabolitos extracelulares (mmoles/g de peso seco) después de fermentación intermitente (matraz Erlenmeyer)

Cepa producto (mmoles/g)

MG1655 MG1655 metA*11 MG1655 pTRCmetL MG1655 metA*11 pTRCmetL MG1655 metA*13 pTRCmetL MG1655 metA*11 pTRCmetL MG1655 metA*11 metJ pTRCmetL MG1655 metA*11 metJ pTRCmetL metK* H142Y

O-succinil homoserina

>0,01 0,02 0,05 0,31 0,27 0,03 0,03 0,39

homoserina

0,01 ND 0,17 0,07 0,09 0,01 ND 0,01

treonina

>0,01 ND 0,37 0,6 0,59 0,01 0,02 0,13

metionina

>0,01 >0,01 >0,01 0,06 0,03 0,2 0,26 0,31

isoleucina

ND ND 0,01 0,01 0,02 0,14 0,22 0,49

10 ND = no detectado.

Para incrementar más la producción de homoserina, la aspartoquinasa/homoserina, un alelo thrA* con resistencia reducida a la retroalimentación a treonina, es expresada del plásmido pCL1920 (Lerner e Inouye, 1990, NAR 18, 15 15 p 4631) usando el promotor Ptrc. Para la construcción del plásmido pME107, thrA fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico usando los siguientes oligonucleótidos:

BspH1thrA (SEC ID nº 29): ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc Sma1 thrA (SEC ID nº 30): ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc

20 El fragmento amplificado por PCR es cortado con las enzimas de restricción BspHI y SmaI y clonado en los sitios NcoI/SmaI del vector pTRC99A (Stratagene). Para la expresión a partir de un vector de bajo número de copias, se construye el plásmido pME101 de la manera siguiente. El plásmido pCL1920 es amplificado por PCR usando los oligonucleótidos pME101F y PME101R y el fragmento BstZ171-Xmm1 del vector pTRC99A que alberga al gen lac1,

25 y el promotor Ptrc es insertado en el vector amplificado. El vector resultante y el vector que alberga al gen thrA son restringidos por ApaIy SmaI, y el fragmento que contiene a thrA es clonado en el vector pME101. Para reemplazar ThrA de la inhibición por retroalimentación, se introduce la mutación F318S por medio de mutagénesis dirigida a sitio (Stratagene) usando los oligonucleótidos ThrAF F318S for y ThrAR F318S, resultando en el vector pME107. El vector pME107 se introdujo en las cepas ΔmetJ metA*11 con diferentes alelos metK*.

30 PME101F (SEC ID nº 31) Ccgacagtaagacgggtaagcctg PME101R (SEC ID nº 32): Agcttagtaaagccctcgctag ThrAF F318S (SmaI) (SEC ID nº 33): Ccaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggcccggg ThrAR F318S (SmaI) (SEC ID nº 34): Cccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattgg

35 Las cepas que produjeron cantidades sustanciales de metabolitos de interés, se pusieron a prueba a continuación bajo condiciones de producción en fermentadores de 300 ml (DASGIP) usando un protocolo de lotes de alimentación.

40 Para este propósito, el fermentador se llenó con 145 ml de medio mínimo modificado, y se inoculó con 5 ml de precultivo a una densidad óptica (DO600 nm) entre 0.5 y 1.2.

La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 37°C, y el pH se ajustó permanentemente a valores en tre 6.5 y 8 usando una solución de NH4OH. La velocidad de agitación se mantuvo entre 200 y 300 rpm durante la fase 45 intermitente, y se incrementó hasta 1000 rpm al final de la fase de lotes de alimentación. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo a valores entre 30 y 40% de saturación usando un controlador de gas. Cuando la densidad óptica alcanzó un valor entre 3 y 5, el lote de alimentación se inició con una magnitud de flujo inicial entre

0.3 y 0.5 ml/h, y un incremento progresivo hasta valores de magnitud de flujo entre 2.5 y 3.5 ml/h. En este punto, la

magnitud de flujo se mantuvo constante por 24 a 48 horas. El medio de la alimentación se basó en medio mínimo 50 que contenía glucosa a concentraciones entre 300 y 500 g/l.

La tabla 6 muestra concentraciones de metionina para las cepas ΔmetJ metA*11 pME107 metK*H142Y y ΔmetJ metA*11 pME107 metK*T227I, en comparación con la cepa de referencia ΔmetJ metA*11 pME107 después de aproximadamente 75 horas de operación. Ambas cepas que albergan los alelos metK* alcanzan una concentración 55 incrementada de metionina cuando se comparan con las cepas de referencia. De esta manera, las mutaciones metK

confieren una ventaja industrial sobre la producción de metionina, aumentando la productividad de las cepas. Tabla 6 Producción de metionina de la cepa de referencia ΔmetJ metA*11 pME107 y dos cepas que albergan las mutaciones

metK* después del tiempo de operación indicado que incluye el lote y lote de alimentación

Cepa

Tiempo de operación Metionina producida

ΔmetJ metA*11 pME107

77 h 75,5 mM

ΔmetJ metA*11 pME107 metK*H142Y

74.8 h 87,3 mM

ΔmetJ metA*11 pME107 metK*T227I

75 h 95,0 mM

Listado de secuencias

<110> Metabolic Explorer

<120> Enzima recombinante con sensibilidad alterada a la retroalimentación 15 <130> 347 921

<150> PCT/IB2004/001901

<151> 2004-05-12 20 <160> 34

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1 25 <211> 930

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220> 30 <221> CDS

<222> (1)..(930)

<223> Homoserina transuccinilasa

<210> 2

<211> 1155 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1155)

<223> S-adenosilmetionina sintetasa

<400> 2

5

<210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 3

10

tcaccttcaa catgcaggct cgacattggc 30

15

<210> 4 <211> 30 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 4

20 25

ataaaaaagg cacccgaagg tgcctgaggt <210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 5 30

cccggctgga agtggcaaca cg

22

30

<210> 6 <211> 26 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

35

<400> 6

gccggatgcg gcgtgaacgc ctatcc

26

40

<210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

45

<400> 7 tattcatgag tgtgattgcg caggcagggg cg 32

50

<210> 8 <211> 38 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 8

5 10

tataagcttc cataaacccg aaaacatgag taccgggc <210> 9 <211> 100 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 9 38

15 20

caggcaccag agtaaacatt gtgttaatgg acgtcaatac atctggacat ctaaacttct ttgcgtatag attgagcaaa catatgaata tcctccttag <210> 10 <211> 100 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 10 60 100

25 30

tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatca ggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttg ctttagtatt cccacgtctc tgtaggctgg agctgcttcg <210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 11 60 100

ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc

30

35

<210> 12 <211> 30 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

40

<400> 12

ttcgtcgtca tttaacccgc tacgcactgc

30

45

<210> 13 <211> 49 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

50

<400> 13 tattaaatta ccatggcacc gattcgtgtg ccggacgagc tacccgccg 49

55

<210> 14 <211> 47 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 14

60

tattaaatta gaattccgac tatcacagaa gattaatcca gcgttgg 47

65

<210> 15 <211> 47 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 15

cacacaggaa acagaccatg ccgatacgtg tgccggacga gctaccc

47

5

<210> 16 <211> 47 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

10

<400> 16

gggtagctcg tccggcacac gtatcggcat ggtctgtttc ctgtgtg

47

15

<210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

20

<400> 17 gtgatgacaa cttctagagt gtctggtcag gaaattcgtc c 41

25

<210> 18 <211> 41 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 18

30

ggacgaattt cctgaccaga cactctagaa gttgtcatca c 41

35

<210> 19 <211> 41 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 19

40 45

gctttcaaac tcacctttgg atgtcgatat ccagctgttg c <210> 20 <211> 41 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 20 41

gcaacagctg gatatcgaca tccaaaggtg agtttgaaag c

41

50

<210> 21 <211> 100 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

55

<400> 21

ttcgtgtgcc ggacgagcta cccgccgtca atttcttgcg tgaagaaaac gtctttgtga tgacaacttc tcgtgcgtct tgtaggctgg agctgcttcg

60 100

60

<210> 22 <211> 100 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

65

<400> 22

atccagcgtt ggattcatgt gccgtagatc gtatggcgtg atctggtaga cgtaatagtt gagccagttg gtaaacagta catatgaata tcctccttag

60 100

5

<210> 23 <211> 97 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

10

<400> 23 gcaaattttc tggttatctt cagctatctg gatgtctaaa cgtataagcg tatgtagtga ggtaatcagg ttatgccgat tcgtgtgccg gacgagc 60 97

15

<210> 24 <211> 99 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

20

<400> 24 cggaaataaa aaaggcaccc gaaggtgcct gaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg actatcacag aagattaatc cagcgttgga ttcatgtgc 60 99

25

<210> 25 <211> 100 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

30

<400> 25 ccgcccgcac aataacatca ttcttcctga tcacgtttca ccgcagatta tcatcacaac tgaaaccgat tacaccaacc tgtaggctgg agctgcttcg 60 100

35

<210> 26 <211> 100 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

40

<400> 26 gagttatatc atcatagatt aaacgctgtt atctgcaatt aagactttac tgaaaagaaa tgtaacaact gtgaaaaccg catatgaata tcctccttag 60 100

45

<210> 27 <211> 29 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

50

<400> 27 gcgcccatac ggtctgattc agatgctgg 29

55

<210> 28 <211> 29 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 28

60

gcgccagcaa ttacaccgat atccaggcc 29

65

<210> 29 <211> 40 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 29

ttatcatgag agtgttgaag ttcggcggta catcagtggc

40

5

<210> 30 <211> 39 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

10

<400> 30

ttacccgggc cgccgccccg agcacatcaa acccgacgc

39

15

<210> 31 <211> 24 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

20

<400> 31 ccgacagtaa gacgggtaag cctg 24

25

<210> 32 <211> 22 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 32

30

agcttagtaa agccctcgct ag 22

35

<210> 33 <211> 43 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético

<400> 33

40 45

ccaatctgaa taacatggca atgtccagcg tttctggccc ggg <210> 34 <211> 43 <212> ADN <213> Oligonucleótido sintético <400> 34 43

cccgggccag aaacgctgga cattgccatg ttattcagat tgg

43

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método para la preparación de metionina, sus precursores o productos derivados de la misma, en un proceso fermentativo con un microorganismo en el que la L-homoserina es convertida en O-succinilhomoserina con una homoserina transuccinilasa, que comprende la etapa de cultivar dicho microorganismo en un medio adecuado y recuperar la metionina, sus precursores o productos derivados de la misma una vez producidos, en el que la homoserina transuccinilasa es una homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina, caracterizado por que la homoserina transuccinilasa mutada es una homoserina transuccinilasa que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o la secuencia homóloga que presenta una actividad de homoserina transuccinilasa y que comparte una homología de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que comprende una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 que corresponde a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la homoserina succiniltransferasa es seleccionada de entre una homoserina transuccinilasa de Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholera y Yersinia pestis, con una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 correspondiente a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la homoserina transuccinilasa mutada con una sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina presenta la secuencia como se representa en la SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido Q en la posición 63 con el aminoácido E.

4. 4.

   Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la homoserina transuccinilasa con una sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina presenta la secuencia tal como se representa en la SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido L en la posición 62 con el aminoácido F.

5. 5.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que los microorganismos comprenden una enzima S-adenosilmetionina sintetasa con actividad enzimática de S-adenosilmetionina sintetasa reducida.

6. 6.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el microorganismo modificado es seleccionado de entre procariontes y eucariontes, preferentemente bajo procariontes y más específicamente Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum.

7. 7.

   Homoserina transuccinilasa mutada con una sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación Sadenosilmetionina y metionina, caracterizada por que la homoserina transuccinilasa mutada es una homoserina transuccinilasa que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o la secuencia homóloga que presenta una actividad de homoserina transuccinilasa y que comparte una homología de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 y que comprende una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 correspondiente a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

8. 8.

   Homoserina transuccinilasa mutada según la reivindicación 7, caracterizada por que es seleccionada de entre una homoserina transuccinilasa de Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholera y Yersinia pestis, con una secuencia seleccionada de entre S-N-S-P-L-E-V-D y S-N-S-P-F-Q-V-D en la región conservada 2 correspondiente a los aminoácidos 59 a 66 en la secuencia de aminoácidos de MetA de E. coli representada en la SEC ID nº 1.

9. 9.

   Homoserina transuccinilasa mutada según la reivindicación 7, caracterizada por que presenta la secuencia tal como se representa en la SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido Q en la posición 63 con el aminoácido E.

10. 10.

    Homoserina transuccinilasa mutada según la reivindicación 7, caracterizada por que presenta la secuencia tal como se representa en la SEC ID nº 1 en la que se sustituye el aminoácido L en la posición 62 con el aminoácido F.

11. 11.

    Secuencia de nucleótidos que codifica una homoserina transuccinilasa mutada con sensibilidad reducida a los inhibidores de retroalimentación S-adenosilmetionina y metionina como se define en una de las reivindicaciones 7 a

12. 10.

13. 12.

    Microorganismo que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 10.

14. 13.

    Microorganismo según la reivindicación 12, caracterizado por que se selecciona de entre procariontes y eucariontes, preferentemente bajo procariontes, y más específicamente Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum.

15. 14.

    Microorganismo según una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que el gen que codifica la

    aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa está sobreexpresado, y/o el gen que codifica el represor de metionina metJ está suprimido.

16. 15.

    Microorganismo según una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que la aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa está codificada por un alelo thrA desregulado por retroalimentación.

17. 16.

    Microorganismo según la reivindicación 13, caracterizado por que la enzima ThrA está desregulada por retroalimentación por la mutación Phe318Ser.