MX2008008777A - Procedimiento para la preparacion de metionina y sus precursores homoserina o succinilhomoserina utilizando un microorganismo con expresion aumentada del sulfato permeasa - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un procedimiento para la producción de metionina o sus derivados al cultivar un microorganismo en un medio decultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre;el microorganismo reclamado se modifica de manera tal que se incrementa la producción de cisteína y/o de unidades C1 y/o se incrementa u optimiza el potencial de transferencia de las unidades C1 en homocisteína 10;también se reclama el aislamiento de metionina o sus derivados a partir del medio de fermentación.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE METIONINA Y SUS PRECURSORES HOMOSERINA O SUCCINILHOMOSERINA UTILIZANDO UN MICROORGANISMO CON EXPRESIÓN AUMENTADA DEL SULFATO PERMEASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un procedimiento para la producción de metionina o sus derivados al cultivar un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre. El microorganismo que se reclama se modificó de manera que se incrementa la producción de cisteína y/o unidades C1 y/o el potencial de transferencia de las unidades C1 sobre homocisteína se incrementa u optimiza. También se reclama el aislamiento de metionina o sus derivados a partir del medio de fermentación.

TÉCNICA ANTERIOR Los compuestos que contienen azufre tales como cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosilmetionina son críticos para metabolismo celular y se producen industrialmente para ser utilizados como aditivos de alimento o pienso, y como sustancias farmacéuticas. En particular, la metionina, un aminoácido esencial el cual no puede ser sintetizado por los animales, juega un papel importante en muchas funciones corporales. Además de su papel en la biosíntesis de proteínas, la metionina está involucrada en la transmetilación y en la biodisponibilidad de selenio y zinc. La metionina también se utiliza directamente como un tratamiento para trastornos como alergia y fiebre reumática. No obstante, la mayor parte de la metionina la cual se produce se agrega al pienso de los animales. Con el uso disminuido de proteínas derivadas de animales como resultado de BSE y la gripe aviar, se ha incrementado en la demanda de metionina pura. Químicamente, la D,L-metionina se produce comúnmente a partir de acroleína, metil mercaptano y cianuro de hidrógeno. No obstante, la mezcla racémica no funciona también como la L-metionina pura, tal como por ejemplo en aditivos para pienso de pollos (Saunderson, C. L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633). La L-metionina pura se puede producir a partir de metionina racémica, por ejemplo a través del tratamiento con acilasa de N-acetil-D, L-metionina lo cual incrementa notablemente los costos de producción. Esta demanda cada vez mayor por L-metionina pura junto con las preocupaciones ambientales vuelve atractiva la producción microbiana de metionina. Se han desarrollado microorganismos con mecanismos reguladores altamente complejos que ajustan con precisión la biosíntesis de componentes celulares y por lo tanto permiten velocidades de crecimiento máximas. En consecuencia, únicamente las cantidades requeridas de metabolitos, tales como aminoácidos, son los que se sintetizan y habitualmente no necesitan detectarse en el sobrenadante de cultivo de las cepas de tipo silvestre. Las bacterias controlan la síntesis de aminoácidos principalmente por inhibición por retroalimentación de enzimas y represión o activación de transcripción de genes. Los efectores para estas vías reguladoras son, la mayor parte de los casos, los productos finales de las vías pertinentes. En consecuencia, las estrategias para producir en exceso aminoácidos en los microorganismos requieren la eliminación de la regulación de estos mecanismos de control. Es bien conocido en muchos microorganismos la vía de síntesis de L-metionina. La metionina se deriva del aminoácido aspartato, pero su síntesis requiere la convergencia de dos vías adicionales, la biosíntesis de cisteína y el metabolismo de C1 (N-metiltetrahidrofolato). El aspartato se convierte en homoserina por una secuencia de tres reacciones. La homoserina subsecuentemente puede introducir la vía biosintética treonina/isoleucina o metionina. En E. coli, de entrada en la vía metionina requiere la acilación de homoserina a succinil-homoserina. Esta etapa de activación permite la condensación subsecuente con cisteína, lo que genera la cistationina que contiene tioéter, la cual se hidroliza para proporcionar homocisteína. La transferencia metilo final que lleva a metionina se lleva a cabo ya sea por metiltransferasa dependiente de B12 o independiente de B-?2. La biosíntesis de metionina en E. coli es regulada por expresión y activación de los genes biosintéticos de metionina vía las proteínas MetJ y MetR, respectivamente (revisado en Neidhardt, F. C. (ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley. M. Schaechter, and H. E. Umbarger (eds), 1996, Escherichia coli y Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology; Weissbach et al., 1991 Mol. Microbiol., 5, 1593-1597). MetJ junto con su correpresor S-adenosilmetionina se sabe que regula los genes metA, metB, metC, metE y metF. Otros genes codifican para enzima implicadas en la producción de metionina tales como glyA, metE, metH y metF se activan por MetR mientras que metA es reprimido por MetR. Las enzimas correspondientes están involucradas, todas, en la producción y transferencia de unidades C1 de serina a metionina. GIyA codifica la serina hidroxilmetiltransferasa que cataliza la conversión de serina a glicina y la transferencia concomitante de una unidad C1 en la coenzima tetrahidrofolato (THF). La unidad C1 en forma de metileno-THF necesita ser reducida a metil-THF antes de que se pueda transferir en homocisteína para producir metionina. Esta reacción es catalizada por la proteína MetF. La transferencia del grupo metilo es catalizada por MetH via vitamina B12 o directamente por MetE. Se sabe que la enzima MetH tiene una velocidad catalítica que es cien veces mayor que la de la enzima MetE. En ausencia de vitamina B12 y por lo tanto MetH activa, MetE puede constituir hasta 5% de la proteína celular total. La presencia de MetH activa reduce la actividad de MetE probablemente al reducir la cantidad de homocisteína que normalmente activa la transcripción de metE vía MetR. Por lo tanto, la producción de metionina vía MetH ahorra recursos importantes para la célula al no expresar grandes cantidades de MetE. Una acumulación de homocisteína es tóxica para E. coli (Tuite et al., 2005 J. Bacteriol, 187, 13, 4362-4371 ) y al mismo tiempo tiene un efecto regulador negativo sobre la expresión de metA vía MetR. Por lo tanto, se requiere claramente para una producción eficaz de metionina una expresión fuerte de las enzimas MetH y/o MetE. En E. coli el azufre reducido se integra en la cisteína y después se transfiere al precursor metionina, O-succinil-homoserina, un proceso denominado transulfuración (revisado en Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli y Salmonella: Cellular y Molecular Biology. American Society for Microbiology). La cisteína es producida a partir de O-acetilserina y H2S por sulfidrilación. El procedimiento es regulado negativamente por retroalimentación por el producto, cisteína, que actúa sobre la serina transacetilasa, codificada por CysE. La N-acetil-serina, la cual se produce de manera espontánea a partir de O-acetil-serina, junto con el factor de transcripción CysB activa genes que codifican para enzimas involucradas en el transporte de compuestos de azufre, su reducción a H2S y su integración en el compuesto de órgano-azufre cisteína, el cual, como la metionina es un aminoácido esencial. En ausencia de cisteína, MetB cataliza la conversión del precursor de metionina, O-succinilo homoserina en amoniaco, a-cetobutirato y succinato, una reacción denominada ?-eliminación (Aitken & Kirsch, 2005, Arch Biochem Biophys 433, 166-75). El a-cetobutirato posteriormente se puede convertir en isoleucina. Esta reacción secundaria no es deseable para la producción industrial de metionina dado que los dos aminoácidos son difíciles de separar. Por lo tanto, un aspecto importante para la producción industrial de metionina es una baja actividad de ?-eliminación. La solicitud de patente provisional de E.U.A. 60/650,124 presentada el 7 de febrero del 2005 describe como se puede reducir la ?-eliminación al optimizar la enzima MetB. La optimización del flujo de biosíntesis de cisteína también puede reducir la ?-eliminación y por lo tanto la producción del producto secundario isoleucina y constituye una modalidad de esta invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un procedimiento para la producción de metionina, sus precursores o productos derivados de los mismos en un procedimiento fermentativo utilizando microorganismos que tienen una producción aumentada de cisteína y que crecen en una fuente definida de carbono y azufre. Los precursores de metionina se definen como metabolitos que son parte de la vía metabólica específica de metionina o se pueden derivar de estos metabolitos. La vía específica de metionina comienza con la transformación de homoserina a succinilhomoserina por la enzima homoserina succiniltransferasa (MetA).

Los productos derivados de metionina se originan de vías de transformación y/o de degradación de metionina. Para incrementar la producción de cisteína los inventores han aumentado la expresión de genes involucrados en la producción de cisteína. En este contexto, el término aumentado describe un incremento en la actividad intracelular de una actividad enzimática la cual es codificada por el ADN correspondiente, por ejemplo, al incrementar el número de copias del gen utilizando un promotor fuerte o utilizando un alelo con actividad aumentada y posiblemente combinación de estas medidas. Los términos "expresión incrementada" o "expresión aumentada" se utilizan ambos en el texto y tienen significado similar. Para incrementar la expresión de un gen se puede codificar cromosómicamente o extracromosómicamente. Cromosómicamente pueden existir una o varias copias del genoma que se pueden introducir por métodos de recombinación conocidos por los expertos en el campo. Los genes extracromosómicos se pueden transportar por diferentes tipos de plásmidos que inciden con respecto a su origen de replicación y por lo tanto su número de copias en la célula. Pueden estar presentes como copias 1-5, aproximadamente 20 o hasta 500 copias, que corresponden a un número de copias bajo de plásmidos con replicación estrecha (pSC101 , RK2), plásmidos con un número de copia bajo (pACYC, pRSF1010) o plásmidos con un número de copia alto (pSK bluescript II). En una modalidad preferida de la invención, el gen se puede expresar utilizando promotores con fuerza diferente que necesitan o no necesitan ser introducidos por moléculas inductoras. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. Los ejemplos son los promotores Ptrc, Ptac, Plac y el promotor ? de cl u otros promotores conocidos por los expertos en el campo. La expresión de los genes objetivo puede ser reforzada o reducida por elementos que estabilicen o desestabilicen el ARN mensajero correspondiente (Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) o la proteína (por ejemplo etiquetas GST, Amersham Biosciences). La presente invención también se relaciona con microorganismos que contienen uno o varios alelos del gen que van a ser incrementados de acuerdo con la invención. En una modalidad particular de la invención, se incrementa la expresión de genes involucrados en la producción de cisteína. Los genes involucrados en la producción de cisteína comprenden genes que codifican para proteínas que se requieren para la importación de una fuente de azufre, la transformación de dicha fuente de azufre en sulfuro de hidrógeno y la asimilación de sulfuro de hidrógeno en la fuente de azufre en cisteína o sus derivados. En E. coli, estas proteínas son codificadas por los siguientes genes (seguido por los números de acceso y función del polipéptido correspondiente): gen número de acceso función cysA 1788761 sulfato permeasa cysU, cysT 1788764 componente de transportador sulfato ABC cysW 1788762 proteína de transporte de sulfato unida a membrana cysZ 1788753 ORF hacia el extremo 5' de cysK cysN 1789108 ATP sulfurilasa cysD 1789109 sulfato adenililtransferasa ccyyssCC 11778899110077 adenililsulfato cinasa cysH 1789121 adenililsulfato reductasa cysl 1789122 sulfito reductasa, subunidad a cysJ 1789123 sulfito reductasa, subunidad ß cysE 1790035 serina acetiltransferasa ccyyssKK 11778888775544 cisteína sintasa cysM 2367138 O-acetil serina sulfidrilasa cysZ 178853 transporte de sulfato sbp 1790351 proteína periplasmíca que une a sulfato En la descripción de la presente invención, los genes y proteínas se identifican utilizando las denominaciones de los genes correspondientes en E. coli. No obstante, y a menos de que especifique de otra manera, el uso de estas denominaciones tiene un significado más general de acuerdo con la invención y abarca la totalidad de los genes y proteínas correspondientes en otros organismos, más particularmente en microorganismos. PFAM (base de datos de familias de proteínas de alineaciones y modelos de Markov ocultos; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa una colección grande de alineaciones de secuencias de proteínas. Cada PFAM vuelve posible visualizar alineaciones múltiples, ver dominios de proteína, evaluar distribución entre organismos, tener acceso a otras bases de datos y visualizar estructuras de proteínas conocidas. Los COG (conjuntos de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) se obtienen al comparar secuencias de proteína de 66 genomas secuenciados por completo que representan 30 líneas filogénicas principales. Cada COG se define de por lo menos tres líneas, las cuales permiten la identificación de los dominios conservados anteriores. El medio de identificación de secuencias homologas y su porcentaje de homologías son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen, en particular, los programas BLAST, los cuales se pueden utilizar desde el sitio de red http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros implícitos indicados en ese sitio de la red. Las secuencias obtenidas después se pueden aprovechar (por ejemplo alinear) utilizando, por ejemplo, en programas como CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) o MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cqi-bin/multalin.pl), con los parámetros implícitos indicados en otros sitios de red.

Utilizando las referencias proporcionadas en GenBank para genes conocidos, los expertos en la técnica serán capaces de determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este trabajo es esquemático y ventajosamente se realiza utilizando secuencias de consenso que se pueden determinar al llevar a cabo alineaciones de secuencia con genes derivados de otros microorganismos y al diseñar sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo. Estos métodos habituales de biología molecular son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo en Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York). Como una modalidad preferida, el microorganismo utilizado en el método de la presente invención se modifica para incrementar la expresión de cysE que codifica para serina transacetilasa. La presente invención también se relaciona con microorganismos que contienen uno o varios alelos que codifican para serina transacetilasa de acuerdo con la invención. Dichas cepas están caracterizadas por el hecho de que poseen un metabolismo cisteína el cual permite un flujo aumentado hacia metionina al proporcionar una concentración aumentada de sustrato para la síntesis de ?-cistationina, una reacción catalizada por MetB. A concentraciones bajas de cisteína la enzima MetB produce amoniaco, succinato y a-cetobutirato a partir de succinil-homoserina, una reacción denominada ?-eliminación. Una concentración aumentada de cisteína reduce la cantidad de a-cetobutirato producido y por lo tanto incrementa el flujo hacia metionina. La expresión aumentada de actividades de serina transacetilasa se puede invalidar en pruebas enzimáticas con serina y acetil-CoA. La reacción se inicia al agregar el extracto de proteína que contiene actividad de serina transacetilasa y la formación de O-acetil-serina se monitorea por CG-EM después de la precipitación de proteína y formación de derivados con un reactivo sililante. La presente invención también se relaciona con expresión aumentada de gen cysM que codifica para O-acetilserina sulfidrilasa lo cual permite integración aumentada de tiosulfato en sulfocisteína reforzando la producción de cisteína. La presente invención por lo tanto reivindica un procedimiento en el cual se reduce la ?-eliminación y por lo tanto la producción de isoleucina al optimizar la producción de cisteina. Un promotor heterólogo de acuerdo con la invención se entiende como el promotor de tipo silvestre modificado o cualquier promotor de otro organismo o un promotor completamente sintético. De manera preferencial, el promotor heterólogo es un promotor fuerte tal como Ptrc, Ptac, ? cl u otros promotores conocidos por los expertos en el campo. En otra modalidad preferida de la invención se reclama un procedimiento en el cual se utiliza un microorganismo para la producción de metionina o sus derivados en el cual se incrementa u optimiza la expresión de genes involucrados en la producción de unidades C1 y/o su potencial de transferencia en homocisteína. De acuerdo con la invención, la optimización se lleva a cabo en adaptar el nivel de expresión del gen involucrado de una manera que se obtiene la producción más alta de metionina. En la mayor parte de los casos esto se realiza al crear bibliotecas de expresión del gen involucrado utilizando, por ejemplo, promotores heterólogos y cribando en búsqueda de los mejores productores. De acuerdo con la invención, el término unidad C1 describe átomos de carbono solos que se unen a una molécula portadora tetrahidrofolato como grupos metilo, metileno, metenilo y formilo. El término "potencial de transferencia" describe la capacidad de los microorganismos para transferir unidades C1 a homocisteína. Este potencial está determinado por las actividades de MetF y/o MetH que se han incrementado y/u optimizado por los inventores. Los genes involucrados en la producción de unidades C1 se incluyen en lo siguiente: serA 1789279 fosfoglicerato deshidrogenasa seri3 1790849 fosfoserina fosfatasa serC 1787136 fosfoserina aminotransferasa glyA 1788902 serina hidroximetiltransferasa gcvT 1789272 aminometil transferasa dependiente de tetrahidrofolato gcvH 1789271 separación de glicina, portador de grupo aminometilo gcvP 1789269 glicina deshidrogenasa (descarboxilante) Ipd 1786307 lipoamida deshidrogenasa Los genes involucrados en la transferencia de unidades C1 en homocisteína se incluyen en lo siguiente: metF 1790377 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa mefH 1790450 homocisteína-N5- metiltetrahidrofolato transmetilasa dependiente de B12 metE 2367304 tetrahidropteroiltriglutamato metiltransferasa En una modalidad especialmente preferida de la invención el microorganismo utilizado para la producción de metionina se modifica para incrementar la expresión de metF o metH o ambos para expresar mefF a partir de un promotor heterólogo. Se puede validar la actividad de metionina sintasa (MetH) dependiente de vitamina B12 aumentada en pruebas enzimáticas con metil-THF y homocisteína en presencia de vitamina B12 y SAM. La reacción se inicia al agregar el extracto de proteína que contiene la actividad de metileno tetrahidrofolato reductasa, y la formación de metionina es monitoreada por CG-EM después de precipitación de proteína y formación de derivados con un reactivo sililante. La producción de metionina se puede incrementar adicionalmente al aumentar la expresión de genes adicionales involucrados en la biosíntesis de metionina, lo cual también es un objetivo de la invención. Los genes se incluyen en lo siguiente: metA 1790443 homoserina succiniltransferasa merB 1790375 cistationina-?-sintasa merC 1789383 cistationina-ß-liasa metF 1790377 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa metR 1790262 gen regulador positivo para metE, metH y metF Además, la expresión de genes en las vías que degradan metionina o que se desvían de la vía de producción de metionina se pueden reducir o se pueden suprimir los genes. speD 1786311 S-adenosilmetionina descarboxilasa speC 1789337 omitina descarboxilasa asfA 1788043 arginina succiniltransferasa dapA 1788823 dihidrodipicolinato sintasa Las reacciones anapleróticas se pueden reforzar al expresar ppc 1790393 fosfoenolpiruvato carboxilasa pps 1787994 fosfoenolpiruvato sintasa Las reacciones que consumen acetato se pueden reforzar mediante la expresión excesiva de acs 1790505 acetil-CoA sintetasa Se puede obtener un incremento adicional en la producción de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos al sobreexpresar uno o varios de los siguientes genes: piruvato carboxilasas, por ejemplo Rhizobium etli (pyc, U51439), o uno de sus homólogos, las enzimas sintetizantes de homoserina codificadas por los genes thrA (homoserina deshidrogenasa/aspartocinasa, 1786183), preferiblemente con sensibilidad de retroalimentación reducida, mefL (homoserina deshidrogenasa/aspartocinasa, g1790376) o lysC (aspartocinasa, 1790455) y asd (aspartato semialdehído deshidrogenasa). Un incremento adicional en la producción de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos se obtiene por medio de supresión del gen para la proteína represora MetJ, responsable de la regulación por disminución del reguión metionina, como se sugiere en JP 2000157267-A/3 (véase también GenBank 1790373). La producción de metionina se incrementa adicionalmente mediante el uso de los alelos homoserina succiniltransferasa con sensibilidad de retroalimentación reducida a sus inhibidores SAM y metionina, como se describe en la solicitud de patente WO 2005/111202 que se incorpora en este documento. Se puede obtener un incremento en la producción de L- metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos al atenuar la actividad o suprimir uno de los siguientes genes.

La atenuación en este contexto describe la reducción de la actividad ¡ntracelular de una enzima por medidas tales como reducción de su expresión, reducción de la estabilidad de la enzima, incremento de su degradación y/u otras soluciones conocidas por los expertos en el campo.

Gen entrada de GenBank actividad ackA 1788633 acetato cinasa pta 1788635 fosfotransacetilasa aceE 1786304 piruvato deshidrogenasa E1 aceF 1786305 piruvato deshidrogenasa E2 Ipd 1786307 piruvato deshidrogenasa E3 sucC 1786948 subunidad ß de succinil-CoA sintetasa sucD 1786949 subunidad a de succinil-CoA sintetasa pck 1789807 fosfoenolpiruvato carboxicinasa pykA 1788160 piruvato cinasa II pykF 1787965 piruvato cinasa I poxB 1787096 piruvato oxidasa HvB 1790104 acetohidroxi ácido sintasa subunidad grande HvN 1790103 acetohidroxi ácido sintasa subunidad pequeña HvG 1790202 acetohidroxi ácido sintasa subunidad grande 1790203 ilvM 1790204 acetohidroxi ácido sintasa I subunidad pequeña ilv\ 1786265 acetohidroxi ácido sintasa II subunidad grande HvH 1786266 acetohidroxi ácido sintasa II subunidad pequeña aroF 1788953 DAHP sintetasa aroG 1786969 DAHP sintetasa aroH 1787996 DAHP sintetasa thrB 1786184 homoserina cinasa thrC 1786185 treonina sintasa sdaA 1788116 serina desaminasa sdaB 1786161 serina desaminasa La producción de metionina se puede incrementar adicionalmente mediante el uso de un alelo metB alterado que utiliza de manera preferencial o exclusiva H2S y por lo tanto produce homocisteína a partir de O-succinil-homoserina como se ha descrito en la solicitud de patente WO 2004/076659, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia.

La fuente de azufre utilizada para la producción fermentativa de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos pueden ser cualquiera de las siguientes o una combinación de las mismas: sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, diotionito o sulfito. En una modalidad preferida de la invención, la fuente de azufre es sulfato y/o tiosulfato.

La invención también se relaciona con el procedimiento para la producción de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos, que comprende la fermentación del microorganismo productor de metionina descrito en lo anterior, la concentración de metionina, sus precursores o derivados y el aislamiento del producto deseado del caldo de fermentación. De acuerdo con la invención, los términos "cultivo" y "fermentación" se utilizan de manera indiferente para indicar el crecimiento del microorganismo en un medio de cultivo apropiado que contiene una fuente de carbono sencilla. De acuerdo con la invención, una fuente de carbono sencilla es una fuente de carbono que puede ser utilizada por aquellos expertos en la técnica para obtener crecimiento normal de un microorganismo, en particular de una bacteria. En particular puede ser un azúcar asimilable tal como glucosa, galactosa, sacarosa, lactosa o melasas, o productos secundarios de estos azúcares. Una fuente de carbono sencilla preferida especialmente es glucosa. Otra fuente de carbono sencilla preferida es sacarosa. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de definir las condiciones de cultivo para los microorganismos de acuerdo con la invención. En particular, las bacterias son fermentadas a una temperatura entre 20°C y 55°C, de manera preferencial entre 25°C y 40°C y de manera más específica a aproximadamente 30°C para C. glutamicum y aproximadamente 37°C para E.coli. La fermentación generalmente se lleva a cabo en fermentadores con un medio de cultivo inorgánico de composición definida conocida adaptado para la bacteria utilizada, que contiene por lo menos una fuente de carbono sencilla, y si es necesario, un co-sustrato necesario para la producción del metabolito.

En particular, el medio de cultivo inorgánico para E. coli puede ser de una composición idéntica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 32: 120-128), un medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) o un medio tal como el definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270; 88-96). De manera análoga, el medio de cultivo inorgánico para C. glutamicum puede ser de una composición idéntica o similar al medio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) o al medio tal como el descrito por Riedel et al. (2001 , J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583). El medio puede estar suplementado para compensar las auxotrófias introducidas por mutaciones. Después de la fermentación, la L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos se recuperan y purifican si es necesario.

Los métodos para la recuperación y purificación del compuesto producido tal como metionina en el medio de cultivo son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Opcionalmente, de 0 a 100% de la biomasa puede ser retenida durante la purificación del producto de fermentación. La invención también se relaciona con un microorganismo que está optimizado para la producción fermentativa de metionina. El término "microorganismo optimizado" describe al microorganismo en el cual se integran las modificaciones descritas en lo anterior lo que lleva a un mejor desempeño industrial para la producción de uno o varios de los metabolitos deseados y posiblemente la menor producción de productos secundarios. En una aplicación preferida, el organismo es E. coli o C. glutamicum o Saccharomyces cerevisiae. En la aplicación más preferida, los organismos son E. coli.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una cepa de E. coli en la cual se ha sustituido el represor metionina codificado por el gen para metJ por el cásete de cloramfenicol (?meíJ::Cm) y que alberga el alelo metA con sensibilidad reducida de retroalimentación a metionina y SAM (me¡7\*11 ) se ha descrito en PCT No. PCT/IB04/001901 presentada el 12 de mayo del 2004. Dentro de estas cepas se introducen las siguientes modificaciones genéticas.

Construcción de MG1655 merA*11 ?mefJ::Cm Ptrc-metF::Km El clon del gen metF bajo el control del promotor P rc heterólogo, la estrategia de recombinación homologa descrita pro Datsenko y Wanner (2000) es la que se utiliza. Esta estrategia permite la inserción de un cásete de resistencia a cloramfenicol o canamicina cerca de los genes involucrados.

Para este propósito se utilizan los siguientes oligonucleótidos: PtrcmetF R (SEQ ID NO: 1 ) GCCAGGCTCTGATTCAGGGCATCCCGCTGGCTGGCGTGAAAAAAGCTC rXTaatatacctccttattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaacagctcTGl AGGCTG GAGCTGCTTCG con: una región (mayúsculas) homologa a la secuencia (4130259-4160195) del gen metF (la secuencia de referencia en el sitio de la red http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) una región (cursivas) homologa al promotor de la secuencia Ptrc con las cajas RBS (negrillas), el -35 y el -10 (negrillas) una región (mayúsculas) para la amplificación del cásete de resistencia a canamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, N. L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645) Ptrc-metF F (SEQ ID NO: 2) ccttcatctttacatctggacgtctaaacggatagatgtgcacaacacaacatataactacaagcgattgatga ggtaaggtrcacac ggc caccrrcgggrgggcc rrcrgcCATATGAATATCCTCCTTAG con: una región (minúsculas) homologa a la secuencia (4130114-4130195) de la región del gen merF (secuencia de referencia en el sitio de la red http://qenolist.pasteur.fr/Colibri/) una región (cursivas, minúsculas) homologa a la secuencia de la parte terminal del bacteriófago T7 (GenBank V01146) una región (mayúsculas) para la amplificación del cásete de resistencia a canamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B. L, 2000, PNAS, 97: 6640-6645). Los oligonucleótidos Ptrc-metF y Ptrc-metF R se utilizan para amplificar el cásete de resistencia a canamicina a partir del plásmido pKD4. El producto de PCR obtenido después se introduce por electroporación en la cepa MG1655 metA* J\ ?mefJ (pKD46), en la cual la enzima recombinasa Red expresada permite la recombinación homologa. Los transformantes resistentes a canamicina se seleccionan y la inserción del cásete de resistencia se verifica por un análisis por PCR con los oligonucleótidos Ptrc-metFv F y Ptrc-metFv R definidos en los siguiente. Ptrc-metFv F (SEQ ID NO: 3): GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG (homologa a la secuencia de 4129866 a 4129894). Ptrc-metFv R (SEQ ID NO: 4): CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG (homologa a la secuencia de 4130524 a 4130497). La cepa resultante se denomina MG1655 metA*'\ '\ Amett Ptrc-metFKm.

Construcción del plásmido pME101-thrA*1-cvsE pME101-thrA*1 El refuerzo de la producción de homoserina thrA* que codifica para aspartocinasa/homoserina con resistencia reducida de retroalimentación a treonina se expresa a partir del plásmido pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 ) utilizando el promotor Ptrc. Para la construcción del plásmido pME101-thrA*1 fnrA se amplifica por PCR a partir de ADN genómico utilizando los siguientes oligonucleótidos: 8spH1 thrA (SEQ ID NO: 5): ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc SmalthrA (SEQ ID NO: 6): ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc El fragmento amplificado por PCR se corta en las enzimas de restricción SspH1 y Smal y se clona en los sitios Nco\/Sma\ del vector pTRC99A (Stratagene). Para la expresión a partir de un vector de copia bajo se construye como sigue el plásmido pME101. Se amplifica el plásmido pCL1920 por PCR utilizando los oligonucleótidos PME101 F y PME101 R y el fragmento SsrZ17l-Xmr)l del vector pTRC99A que alberga el gen lac\ y el, promotor Pire se inserta dentro del vector amplificado. El vector resultante y el vector que alberga al gen thrA se limitan por Apa\ y Smal y el fragmento que contiene thrA se clona en el vector pME101. Para liberar ThrA de la inhibición por retroalimentación se introduce la mutación F318S mediante mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene) utilizando los oligonucleótidos ThrAF F318S y ThrAR F318S, lo que resulta en el vector pME101-thrA*1. PME101 F (SEQ ID NO: 7): Ccgacagtaagacgggtaagcctg PME101 R (SEQ ID NO: 8): Agcttagtaaagccctcgctag ThrAF F318S (Smal) (SEQ ID NO: 9): Ccaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggcccggg ThrAR F318S (Smal) (SEQ ID NO: 10): Cccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattgg pME101-thrA*1-cvsE Para la construcción del pME101 -thrA*1-cysE se amplifica el gen cysE por PCR utilizando los oligonucleótidos Ome B001 y Ome B002, el producto de PCR se corta con la enzima de restricción Pwvll y se clona en el sitio Smal del vector pME101-thrA*1 lo que resulta en el vector pME101-thrA*1-cysE. Ome B001_cysER-Pvull (SEQ ID NO: 11 ) GGAGGGAC GCTGATACGAAAGAAGTCCGCGAACTGGCGC Ome B002_cysEF-Pvull (SEQ ID NO: 12) Atacgcaqcfqggacattagatcccatccccatactcaaatgtatgg El sitio Pvtvll está subrayado. La secuencia en negrillas corresponde a cysE (Colibrí) (3780423-3780397) Construcción de MG1655 meiA*11 ?merJ:: Cm Pfr-mefH:: Km Para reforzar la producción de metionina, el gen mepH se sobreexpresa utilizando el promotor Pire. Para la construcción se utilizan los siguientes oligonucleótidos: DicIR-metHF (SEQ ID NO: 13) gcaccagaayacgttcatttaactgcgcacgcagttgttccactttgctgctcatG TCTGTCCTCCAG TACA TGCAACCCCACACA TTA TACGAGCCGGA TGA TTAA TTGTCAACAGC TCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con: una región (minúsculas) homologa a la secuencia (4221461-4221408) del gen merH (secuencia de referencia en el sitio de la red http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) una región (cursivas, mayúsculas) homologa al promotor de la secuencia Ptrc con la RBS (negrillas) de los cuadros -35 y -10 (negrillas) una región (mayúsculas) para la amplificación del cásete de resistencia a canamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B. L, 2000, PNAS, 97: 6640-6645). icIR-metHF (SEQ ID NO: 14) GCTTTTA CCA CA GA TGCG TTTA TGCCA G TA TGGTTTG TTGAA TTTTTA TTAA ATCTGGGTTGAGCGTGTCGGGAGCAAGTCAJATGAATAJCCJCCTTAG con: una región (cursivas, mayúsculas) homologa a la secuencia (4221327-4221406) de la región del gen mefH (secuencia de referencia en el sitio de la red http://qenolist.pasteur.fr./Colibr¡/), una región (mayúsculas) para la amplificación del cásete de resistencia a canamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B. L, 2000, PNAS, 97: 6640-6645). Los oligonucleótidos DicIR-metHF e icIR-metHF se utilizan para amplificar el cásete de resistencia a canamicina a partir del plásmido pKD4. El producto de PCR obtenido después se introduce por electroporación dentro de la cepa MG1655 meíA*11 ?merJ (pKD46), en la cual se expresa la enzima de Red recombinasa que permite la recombinación homologa. Los transformantes resistentes a canamicina se seleccionan y la inserción del cásete de resistencia se verifica por un análisis por PCR con los oligonucleótidos icIF e icIR definidos en lo siguiente. icIF (SEQ ID NO: 15): CCTTTGAGGTCGCATGGCCAGTCGGC (homologa a la secuencia de 4221558 a 4221533). icIR (SEQ ID NO: 16): GCTTTTTAATAGAGGCGTCGCCAGCTCCTTGCC (homologa a la secuencia de 4219917 a 4219949). La cepa resultante se denomina MG1655 mefA*11 ?merJ Pirc-merH:Km. Construcción de MG1655 merA*11 ?merJ:: Cm Pirc-merF:Km Pfrc-mefH Para la construcción de la cepa MG1655 merA*11 ?merJ:: Cm Pfrc-mefF^m Pírc-merH se eliminan el cásete de resistencia a cloramfenicol y canamicina de la cepa MG1655 mefA*11 ?merJ:: Cm Ptrc-metH:Km. Se introduce en la cepa recombinante por electroporación el plásmido pCP20 que presenta FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT del cásete de resistencia a cloramfenicol. Después de una serie de cultivos a 42°C, se verifica la pérdida de los dos casetes por análisis por PCR. La cepa que los retiene se denomina MG1655 meíA*1 1 ?me/J Pirc-merH. Para transferir la construcción promotora Ptrcv.metF: Km en la cepa MG1655 merA*11 ?merJ Pfrc-mefH, se utiliza el método de transducción de fago P1. El protocolo que se sigue se implementa en 2 etapas con la preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 MG1655 merA*11 ?meíJ Pírc-merF:Km y la transducción subsecuente en la cepa MG1655 me/A*11 ?merJ Pfrc-merH Preparación del lisado de fago P1 : Inoculación con 100 µl de un cultivo durante la noche de la cepa MG1655 mefA*11 ?merJ Pfrc-mefF:Km de 10 mi de LB + Km 50 µg/ml + glucosa 0.2% + CaCI2 5mM. Incubación durante 30 min a 37°C con agitación. Adición de 100 µl de lisado de fago P1 preparado en la cepa MG1655 (aproximadamente 1 x 109 fagos/ml). Agitación a 37°C durante 3 horas hasta que todas las células han sido usadas. Adición de 200 µl de cloroformo y someter a remolino. Centrifugación durante 10 min a 4500 g para eliminar los residuos celulares. Transferencia del sobrenadante a un tubo estéril y adición de 200 µl de cloroformo. Almacenado del lisado a 4°C.

Transducción Configuración durante 10 min a 1500 g de 5 mi de un cultivo durante la noche de la cepa de MG1655 mefA*11 ?merJ Prrc-mefH en medio LB. Suspensión del sedimento celular en 2.5 mi de MgS04 10 mM, CaCI2 5 mM. tubos control: 100 µl de células 100 µl de fagos P1 de la cepa MG1655 merA*11 ?merJ Prrc-merF:Km Tubo de ensayo: 100 µl de células + 100 µl de fagos P1 de la cepa MG1655 me.A*11 ?merJ P/rc-mefF:Km Incubación durante 30 min a 30°C sin agitación. Adición de 100 µl de citrato de sodio 1 M en cada tubo y someter a remolino Adición de 1 mi de LB. Incubación durante 1 hora a 37°C con agitación. Dispersión en recipientes LB + Km, 50 µg/ml después de centrifugación de tubos durante 3 minutos a 7000 rpm. Incubación a 37°C durante la noche.

Verificación de la cepa Se seleccionan los transformantes resistentes a canamicina y se verifica la presencia de la construcción promotora Prrc-mefF:Km por análisis de PCR con los oligonucleótidos Ptrc-metFv F y Ptrc-metFv R, descritos antes. La cepa que retiene se designa MG1655 mefA*11 ?merJ::Cm Prrc-merH Pfrc-mefF:Km Construcción de MG1655 mefA*11 ?merJ::Cm Pfrc-cysM::Km Para clonar el gen cysM bajo el control del promotor Ptrc heterólogo se utiliza la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko y Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un cásete de resistencia a cloramfenicol o a canamicina cerca de los genes involucrados. Para este propósito se utilizan los siguientes oligonucleótidos: Ptrc-cysM F gcctgatgcgacgcttgcgcgtcttatcaggtctacaggttacaaaccttgccataarafaccfccríaccaca caffaíacgagccggargafraaírgfcaaca cfcCATATGAATATCCTCCTTAG (SEQ ID NO: 17) con: una región (minúsculas) homologa a la secuencia (2537627-2537681 ) del gen cysM (secuencia de referencia en el sitio de la red http://qenolist.pasteur.fr/Colibri/) una región (cursivas, minúsculas) homologa a la secuencia Ptrc promotora con la RBS (negrillas) de las cajas -35 y -10 (negrillas) una región (mayúsculas) para la amplificación del cásete de resistencia a canamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B. L, 2000, PNAS, 97: 6640-6645), Ptrc-cysM R ggttgagtgaatgttaaacgcccggaggcgcttcccgcgatccgggctttt TATCACACTGGCTCA CCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCJGTAGGCJGGAGCJGCTJCG (SEQ ID NO: 18) con: una región (minúsculas) homologa a la secuencia (2537734-2537684) del gen cysM (secuencia de referencia en el sitio de la red http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) una región (cursivas, mayúsculas) homologa a la secuencia de la parte terminal del bacteriófago T7 (GenBank V01146) una región (mayúsculas) para la amplificación del cásete de resistencia a canamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B. L, 2000, PNAS, 97: 6640-6645). Se utilizan los oligonucleótidos Ptrc-cysM F y Ptrc-cysM R para amplificar el cásete de resistencia a canamicina a partir del plásmido PKD4. El, producto de PCR obtenido después se introduce por electroporación dentro de la cepa MG1655 meíA*11 ?meíJ (pKD46), en la cual se expresa la enzima Red recombinasa que permite la recombinación homologa. Los transformantes resistentes a canamicina después se seleccionan y la inserción del cásete de resistencia se verifica por un análisis por PCR con los oligonucleótidos Ptrc-cysMv F y Ptrc-cysMv R definidos en los siguiente. Ptrc-cysMv F: ggtgacaagaatcagttccgc (homologa a la secuencia de 2537262 a 2537282) (SEQ ID NO: 19) Ptrc-cysMv R: GCGTTTATTCGTTGGTCTGC (homologa a la secuencia de 2537833 a 2537814) (SEQ ID NO: 20) La cepa resultante se denomina MG1655 meíA*11 ?meíJ Pírc-cysM::Km.

Construcción de MG1655 meíA*11 ?meíJ Ptrc-metF Ptrc-metH Ptrc-cysM Km Para la construcción de la cepa MG1655 meíA*11 ?meíJ Pírc- eíF Pírc-meíH Pírc-cysM:Km se eliminan los casetes de resistencia a cloramfenicol y canamicina de la cepa MG1655 meíA*11 ?meíJ:Cm Pírc-meíF:Km Pfrc-meíH utilizando el plásmido pCP20, como se describe en lo anterior. La cepa retenida se denomina MG1655 meíA*11 ?meíJ Ptrc-metF Ptrc-metH. Para transferir la construcción promotora Pírc-cysM: Km dentro de la cepa MG1655 meíA*11 ?meíJ Pírc-meíF Pírc-meíH, se utiliza el método de transducción de fago P1. El protocolo que se sigue se implementa en 2 etapas con la preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 MG1655 meíA*11 ?me/J Pírc-cysM.Km y la transducción subsecuente en la cepa MG1655 meíA*11 ?meíJ Ptrc-metF Ptrc-metH, como se describe en lo anterior. La cepa retenida se denomina MG1655 meíA*11 ?meíJ Ptrc-metF Ptrc-metH Pfrc-cysM_Km.

Expresión aumentada combinada de cysE y meíH y expresión optimizada de meíF y cysM con alelos metA*11 y ?metJ Para la construcción de las cepas MG1655 meíA*11 ?meíJ::Cm (pME101-ír)rA*1 ), MG1655 meíA*1 1 ?meíJ::Cm Pírc-meíH:Km (pME101-ír>rA*1-cysE), MG1655 meíA*11 ?meíJ::Cm Pírc-meíH Pírc-meíF:Km (pME101-ír»rA*1-cysE) y MG1655 meíA*11 ?meíJ Pírc- eíF Pírc-meíH Pírc-cysM:Km (pME101-fr)rA*1-cysE), se introducen los plásmidos (pME101-ír>rA*1 ) o (pME101-í/?rA*1-cysE) dentro de las cepas MG1655 meíA*11 ?meíJ::Cm, MG1655 meíA*1 1 ?meíJ::Cm Pírc-meíH:Km, MG1655 meíA*11 ?meíJ::Cm Pírc-meíH Pírc-meíF:Km y MG1655 meíA*11 ?meíJ Ptrc-metF Ptrc-metH Pírc-cysM:Km por transformación.

Evaluación de cepas productoras de metionina con expresión aumentada de cysE, meíH y/o cysM y/o meíF bajo el control de un promotor heterólogo Las cepas de producción inicialmente se evalúan en matraces Erlenmeyer pequeños. Se hace crecer un precultivo en medio LB con 2.5 g/l de glucosa y se utiliza para inocular un cultivo durante la noche en medio mínimo PC1. Este cultivo sirve para inocular un cultivo de 50 mi de una DO600 de 0.2 en medio PC1 suplementado con 0.01 g.l"1 de vitamina B12. Sí se indica, se sustituye el sulfato de amonio por 5.6 g/l de tiosulfato de amonio. Se agrega espectinomicina si es necesario a una concentración de 100 mg/ml. A una DO600 de 4.5 a 5 se cuantifican los aminoácidos extracelulares por CLAP después de generación de derivados OPA/Fmoc y se analizan otros metabolitos pertinentes utilizando CG-EM después de sililación.

CUADRO 1 Composición del medio mínimo PC1 Como se puede ver en el cuadro 2, la cantidad de metionina se incrementa ante la sobreexpresión de cysE, cysE y meíH o cysE, meíH y expresión alterada de meíF en total. La expresión aumentada de cysM puede implementar adicionalmente la producción de metionina. Ciertas producen cantidades mayores de metionina en presencia de tiosulfato. La producción de metionina más alta se obtiene cuando cysE, cysM y meíH se sobreexpresan y la expresión de meíF está bajo el control del promotor Pire en presencia de tiosulfato. La producción de isoleucina se reduce notablemente ante la expresión de cysE y meíH, indicando una actividad reducida de ?-eliminación. La sobreexpresión de cysM reduce la ?-eliminación en una cepa que sobreexpresa cysE y metH y que expresa metF a partir de un promotor heterólogo.

CUADRO 2 Metionina e isoleucina en mmol/q DW producido en cultivo en lote con sulfato (S) y tiosulfato (T) como fuente de azufre por cepas descritas en lo anterior; n-d-, no determinado 3. Determinación de cambios en las actividades de enzima de CysE y MetH Para validar los cambios en la expresión de la expresión de cysE y meíH se determinaron las actividades de las enzimas correspondientes en extractos crudos. Para la determinación de las actividades de enzima se cultivaron cepas de e. coli in vitro en medio mínimo como se describe en lo anterior y se cosecharon en la fase semilogarítmica. Se resuspendieron en amortiguador de fosfato de potasio frío y se sometieron a sonicado en hielo (sonicador Branson, 70W). Después de centrifugación se cuantificaron las proteínas contenidas en los sobrenadantes (Bradford, 1976). Para la determinación de la actividad de serina acetiltransferasa (CysE), se analizaron 10 µl de extracto en fosfato de potasio 100 mM, pH 7.5, acetil-CoA 4 mM, L-serina 30 mM durante 10 minutos a 25°C. La proteína se precipita con acetona y se detecta O-acetilserina por CG-EM después de generación de derivados con un reactivo sililante. Para la determinación de la actividad de metionina sintasa dependiente de vitamina B12 (MetH), se analizaron extractos de 100 µl en fosfato de potasio 100 mM, Ph 7.2, homocisteína 1 mM, metiltetrahidrofolato 0.25 mM, vitamina B12 50 µM, S-adenosil-metionina 20 µM y DTT 25 mM durante 10 minutos a 37°C. La proteína se precipita con acetona y la metionina producida se detecta por CG-EM después de formación de derivados con un reactivo sililante.

Como se puede ver en el cuadro 3, la sobreexpresión de los genes cysE y meíH incrementan la actividad de la enzima correspondiente. De esta manera la actividad aumentada de estos genes tiene como resultado una producción aumentada de metionina.

CUADRO 3 Actividades en mUI/g DW de serina acetiltransferasa (CysR) y metionina sintasa (MetH) en cepas productoras de metionina cultivadas en presencia de tiosulfato Validación de producción de metionina bajo condiciones de fermentación Las cepas que producen cantidades sustanciales de metabolitos de interés posteriormente se prueban bajo condiciones de producción en fermentadores de 300 mi (DASGIP) utilizando un protocolo de lote de alimentación. Para este propósito se utiliza un cultivo de 8 horas que crece en medio LB con 2.5 g/l de glucosa para inocular un precultivo durante la noche en medio mínimo PC1 (véase antes). Los fermentadores se llenan con 150 mi de medio mínimo (B1 ) y se inoculan a una concentración de biomasa de casi 0.09 g/l con 1.5 mi de precultivo concentrado (entre 9 y 12 g/l).

CUADRO 4 Composición del medio mínimo B1 CUADRO 5 Medio mínimo FB tipo T1 CUADRO 6 Medio mínimo FB tipo S La temperatura del cultivo se mantiene constante a 37°C y el pH se ajusta permanentemente a valores entre 6.5 y 8, de manera preferible 6.7 utilizando una solución de NH4OH. La velocidad de agitación se mantiene en 600 rpm durante la fase de lote y se incrementa hasta 1000 rpm al final de la fase de alimentación de lote. La concentración de oxígeno disuelto se mantiene en valores entre 20 y 40%, de manera preferible 30% de saturación mediante la utilización de un controlador de gas. Cuando la masa de células alcanza una concentración de 0.9 a 1.2 g/l, la alimentación de lote se inicia con un caudal inicial entre 0.1 y 1.5 ml/h, de manera preferible 0.43 ml/h y un incremento sigmoideo (24 h) hasta valores de caudal entre 0.5 y 5.8 ml/h, de manera preferible de 1.7 ml/h. Las condiciones precisas de alimentación se calculan por la fórmula siguiente: en donde Q(t) es el caudal de alimentación en ml/h para un volumen de lote de 150 mi P1 está entre 0.025 y 0.35, de manera preferible 0.100. P2 está entre 0.400 y 5.600, de manera preferible 1.600. P3 está entre 0.068 y 0.95, de manera preferible 0.270. P4 está entre 1.250 y 17.5, de manera preferible 5.000. En este caso se utiliza el medio FB que contiene glucosa en concentraciones entre 300 y 800 g/l (de manera preferible 500 g/l). Cuando la concentración de la biomasa ha alcanzado valores entre 20 y 50 g/l (preferiblemente 35 g/l, entre 40 y 80 h) la fermentación se detiene y se determinan las concentraciones extracelulares de metionina e isoleucina utilizando CLAP.

CUADRO 7 Títulos de metionina que se obtienen en fermentaciones de alimentación por lote de cepas que sobreexpresan cysE y mefH o mefF bajo un promotor heterólogo o una combinación de los tres. Ref corresponde a MG1655 mefA*11 ?mefJ. Las cepas se hacen crecer en presencia de tiosulfato (T) o sulfato (S) Como se puede ver en el cuadro 7, la expresión aumentada de cysE, cysE y efH, cysE, efH y mefF bajo el control de un promotor heterólogo o crecimiento de las cepas en presencia de tiosulfato puede incrementar de manera significativa la producción de metionina. La producción de isoleucina se reduce de manera significativa por sobreexpresión de cysE y/ mefH. La cepa que produce la cantidad más grande de metionina en el termentador de 300 mi posteriormente se prueba bajo condiciones de producción en un termentador de 2.5 I (PIERRE GUERIN) utilizando un protocolo de lote de alimentación. Para este propósito se utiliza un cultivo de 8 h que crece en medio LB con 2.5 g/l de glucosa para inocular un precultivo durante la noche en medio mínimo PC1. Los fermentadores se llenan con 600 mi de medio mínimo (B2) y se inoculan a una biomasa de 0.9 g/l con 6 mi de precultivo concentrado (entre 9 y 12 g/l). La temperatura del cultivo se mantiene constante a 37°C y se ajusta permanentemente el pH a valores entre 6.3 y 8, de manera preferible 6.8 utilizando una solución de NH4OH 28%. La velocidad de agitación inicial se establece en 200 rpm durante la fase en lotes y se incrementa hasta 1200 rpm durante la fase de alimentación por lote. El caudal de aire inicial se establece en 40 Nl/h durante la fase en lote y se incrementa hasta 250 Nl/h durante la fase de alimentación por lote. La concentración del oxígeno disuelto se mantiene en valores entre 20 y 40% de saturación, de manera preferible 30% al incrementar la velocidad de agitación y el caudal de aire. Cuando la concentración de biomasa alcanza 1.2 a 1.5 g/l, la alimentación por lotes se inicial con un caudal inicial entre 0.5 y 4 ml/h, de manera preferible 1.0 ml/h y un incremento exponencial (15 h) hasta valores de caudal entre 3 y 35 ml/h, de manera preferible 20.1 ml/h. En este punto, el caudal se mantiene constante durante 10 a 45 horas, de manera preferible 30 horas. Para la alimentación de FB se utiliza tipo T2 (véase cuadro 8) que contiene glucosa en concentraciones entre 300 y 800 g/l, de manera preferible 750 g/l. Cuando la concentración de la biomasa ha alcanzado valores entre 40 y 110 g/l, de manera preferible 90 g/l, se detiene la fermentación y se determina la concentración extracelular de metionina utilizando CLAP. La cepa MG1655 meíA*11 ?meíJ Pírc-meíH Ptrc-metF (pME101 -thrA*1-cysE) produce 169 mM de metionina bajo estas condiciones.

CUADRO 8 Medio mínimo FB tipo T2 CUADRO 9 Composición del medio mínimo B2

Claims (27)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para la producción de metionina, sus derivados o precursores al cultivar un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre y recuperación de metionina del medio de cultivo, en donde el microorganismo se modifica para mejorar la producción de cisteína.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se incrementa la expresión de por lo menos un gen involucrado en la producción de cisteína.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque por lo menos un gen involucrado en la producción de cisteína se selecciona de entre el grupo que consiste de: cysA sulfato permeasa; cysU, cysT componente del transportador ABC sulfato; cysW proteína de transporte de sulfato unida a membrana; cysZ ORF hacia el extremo 5' de cysK; cysN ATP sulfurilasa; cysD sulfato adenililtransferasa; cysC adenililsulfato cinasa; cysH adenililsulfato reductasa; cysl sulfito reductasa, subunidad a; cysJ sulfito reductasa, subunidad ß; cysE serina acetiltransferasa; cysK cisteína sintasa; cysM O-acetil sulfidrilasa; cysZ transporte de sulfato; sbp proteína periplasmíca que une a sulfato.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 2,

caracterizado además porque se incrementa por lo menos la expresión de cysE.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se incrementa la expresión de cysM.

6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque se incrementa y/o se impulsa por un promotor heterólogo la expresión de por lo menos un gen el cual está involucrado en la producción de unidades C1 y el potencial de transferencia sobre homocisteína.

7 '.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque por lo menos un gen , el cual se involucra en la producción de unidades C1 y/o el potencial de transferencia sobre homocisteína, se selecciona de entre el grupo que consiste de: mefE, metH que codifica para metionina sintasa; meíF que codifica para 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa; glyA que codifica para serina hidroximetiltransferasa; gcvTHP, Ipd que codifica para el complejo de separación de glicina.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la expresión de meíE, meíH y/o mefF se incrementa y/o por lo menos uno de los genes se expresa a partir de un promotor heterólogo.

9.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones

1 a 8, caracterizado además porque la actividad de ?-eliminación se mantiene

baja al optimizar el flujo de biosíntesis de cisteína y por lo tanto se reduce la producción del producto secundario isoleucina.

10.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque se incrementa la expresión de genes adicionales involucrados en la producción de metionina.

11.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque se atenúa la expresión de genes que disminuyen la producción de metionina.

12.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado además porque el receptor de metionina codificado por el gen meíJ se suprime o muta y/o se integran en la cadena alelos para homoserina succiniltransferasa (MetA) que codifican para enzimas con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina.

13.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones

1 a 12, caracterizado además porque la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato, tiosulfato, hidrógeno, sulfuro, ditionato, ditionito, sulfito o una combinación de las diferentes fuentes.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato o tiosulfato, o una mezcla de las dos.

15.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque comprende la etapa de aislamiento de

los aminoácidos/constituyentes deseados del caldo de fermentación y/o la biomasa que opcionalmente permanece en porciones en la cantidad total (0-100%) en el producto final.

16.- Un microorganismo utilizado para la producción fermentativa de metionina o sus derivados en el cual la producción de metionina o derivados, en donde el microorganismo se optimiza para incrementar la producción de cisteína.

17.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación

16, caracterizado además porque se incrementa la expresión de por lo menos un gen involucrado en la producción de cisteina.

18.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación

17, caracterizado además porque por lo menos un gen involucrado en la producción de cisteína se selecciona de entre el grupo que consiste de: cysA sulfato permeasa; cysU, cysT componente del transportador ABC sulfato; cysW proteína de transporte de sulfato unida a membrana; cysZ ORF corriente arriba de cysK; cysN ATP sulfurilasa; cysD sulfato adenililtransferasa; cysC adenililsulfato cinasa; cysH adenililsulfato reductasa; cysl sulfito reductasa, subunidad a; cysJ sulfito reductasa, subunidad ß; cysE serina acetiltransferasa; cysK cisteína sintasa; cysM O-acetil-sulfidrolasa; cysZ transporte sulfato; sbp proteína de unión de sulfato periplasmíca.

19.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque se incrementa por lo menos la expresión de cysE.

20.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque se incrementa por lo menos la expresión de cysM. 21.- El microorganismos de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado además porque se incrementa y/o se impulsa por un promotor heterólogo la expresión de por lo menos un gen, el cual está involucrado en la producción de unidades C1 y el potencial de transferencia a homocisteína. 22.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque por lo menos un gen , el cual se involucra en la producción de unidades C1 y el potencial de transferencia sobre homocisteína, se selecciona de entre el grupo que consiste de: meíE, meíH que codifica para metionina sintasa; meíF que codifica para 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa; glyA que codifica para serina hidroximetiltransferasa; gcvTHP, Ipd que codifica para el complejo de separación de glicina. 23.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la expresión de meíE, meíH y/o mefF se incrementa y/o por lo menos uno de los genes se expresa a partir de un promotor heterólogo. 24.- El microorganismo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 23, caracterizado además porque la actividad de ?-eliminación se mantiene baja al optimizar el flujo de biosíntesis de cisteína y

por lo tanto se reduce la producción del producto secundario isoleucina. 25.- El microorganismo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado además porque se incrementa la expresión de genes adicionales involucrados en la producción de metionina. 26.- El microorganismo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 25, caracterizado además porque se atenúa la expresión de genes que disminuyen la producción de metionina. 27.- El microorganismo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 26, caracterizado además porque el represor de metionina codificado por el gen meíJ se suprime o muta y/o se integran alelos de homoserina succiniltransferasa (MetA) que codifican para enzimas con sensibilidad de retroalimentación reducida a S-adenosilmetionina y/o metionina.