JP2012196222A - 硫酸透過酵素の発現が増強された微生物を用いてメチオニンおよびその前駆体ホモセリンまたはスクシニルホモセリンを製造するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】システインおよび/もしくはC1単位の生成を増強する、ならびに/または、C1単位を10ホモシステイン上へ転移させる能力を増大および/もしくは最適化するように改変されている微生物。発酵培地からメチオニンまたはその誘導体を単離する。
【選択図】なし
Description
本発明は、炭素源および硫黄源を含む適切な培養培地内で微生物を培養することによってメチオニンまたはその誘導体を製造するための方法に関する。本発明の対象とする微生物は、システインおよび/もしくはC1単位の生成を増強するように、ならびに/またはホモシステイン上へC1単位を転移させる能力を増大もしくは最適化するように改変される。
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は、細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用されるべく工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような疾患のための治療薬として直接的に用いられる。しかしながら、製造されるメチオニンの大部分は動物用飼料に添加されている。
低減することによりMetE活性を低下させる。故に、MetHを介したメチオニンの生成は、大量のMetEを発現させないことにより、細胞のための重要な資源を節約する。ホモシステインの堆積は大腸菌にとって有毒であり(Tuite et al., 2005 J. Bacteriol, 187, 13, 4362-4371)、同時に、MetRを介したmetA発現に対する制御効果を有する。従って、酵素MetHおよび/またはMetEの強い発現が、効果的なメチオニン生成にとって明らかに必要である。
異種Ptrcプロモーターの制御下にmetF遺伝子をクローニングするために、Datsenko&Wanner(2000)により記載された相同組み換え法を用いた。この方法により、関与遺伝子近傍にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的のため、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
−遺伝子metFの配列(4130259−4160195)と相同な領域(大文字)(ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列);
−RBS(太字)、−35および−10ボックス(太字)を有するプロモーターPtrc配列と相同な配列(斜体);
−カナマイシン耐性カセットの増幅用領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645における参照配列)。
− 遺伝子metFの領域の配列(4130114−4130195)と相同な領域(小文字)(ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列);
−バクテリオファージT7末端の配列(Genbank V01146)と相同な領域(斜体、小文字);
−カナマイシン耐性カセットの増幅用領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645における参照配列)。
Ptrc−metFv R(配列番号4):CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG(4130524〜4130497の配列と相同である)。
pME101−thrA * 1
ホモセリンの生成を促進するために、トレオニンに対するフィードバック耐性が低下したアスパルトキナーゼ/ホモセリンをコードするthrA*を、プロモーターPtrcを用いてプラスミドpCL1920(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15, p. 4631)から発現させた。プラスミドpME101−thrA*1を構築するために、以下のオリゴヌクレオチドを用いてゲノムDNAからthrAをPCR増幅した:
BspH1 thrA(配列番号5):ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc;
Sma1 thrA(配列番号6):ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc。
PME101R(配列番号8):Agcttagtaaagccctcgctag;
ThrAF F318S(SmaI)(配列番号9):Ccaatctgaataacatggcaatg[tcc]agcgtttctggcccggg;
ThrAR F318S(SmaI)(配列番号10):Cccgggccagaaacgct[gga]cattgccatgttattcagattgg。
pME101−thrA*1−cysEを構築するために、オリゴヌクレオチドOmeB001およびOme B002を用いたPCRによりcysE遺伝子を増幅し、PCR産物を制限酵素PvuIIで切断し、ベクターpME101−thrA*1のSmaI部位にクローニングし、結果としてベクターpME101−thrA*1−cysEを得た。
GGAGGGACAGCTG[ATACGAAAGAAGTCCGCGAACTGGCGC];
Ome B002_cysEF−PvuII(配列番号12):
Atacgcagctg[ggacattagatcccatccccatactcaaatgtatgg]。
メチオニンの生成を促進するために、Ptrcプロモーターを用いてmetH遺伝子を過剰発現させた。構築のために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
−遺伝子metHの配列(4221461−4221408)と相同な領域(小文字)(ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列)
−RBS(太字)、−35および−10ボックス(太字)を有するプロモーターPtrc配列と相同な領域(斜体、大文字);
−カナマイシン耐性カセットの増幅用領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645における参照配列)。
−遺伝子metHの領域の配列(4221327−4221406)と相同な領域(斜体、大文字)(ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列);
−カナマイシン耐性カセットの増幅用領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645における参照配列)。
iclF(配列番号15):CCTTTGAGGTCGCATGGCCAGTCGGC(4221558〜4221533の配列と相同である);
iclR(配列番号16):GCTTTTTAATAGAGGCGTCGCCAGCTCCTTGCC(4219917〜4219949の配列と相同である)。
株MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm Ptrc−metF:Km Ptrc−metHを構築するために、クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットを、株MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm Ptrc−metH:Kmから取り除いた。
−10mlのLB+Km 50μg/ml+グルコース 0.2%+CaCl2 5mMに、株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metF:Kmの一夜培養物100μlを植菌する。
−37℃で30分間振とうしながらインキュベートする。
−株MG1655上で調製された100μlのファージ溶解物P1(約1.109ファージ/ml)を添加する。
−全ての細胞が溶解するまで、37℃で3時間振とうする。
−200μlのクロロホルムを添加し、渦流動させる。
−4500gで10分間遠心分離にかけ、細胞片を取り除く。
−上澄みを殺菌チューブへ移し、200μlのクロロホルムを添加する。
−4℃で溶解物を保存する。
−LB培地における株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metHの一夜培養物5mlを1500gで10分間遠心分離にかける。
−2.5mlの10mM MgSO4および5mM CaCl2に細胞ペレットを懸濁させる。
−対照チューブ:細胞100μl、株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metF:KmのファージP1 100μl。
−試験チューブ:細胞100μl、株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metF:KmのファージP1 100μl。
−30℃で30分間、振とうせずにインキュベートする。
−各チューブに1M 酢酸ナトリウム100μlを添加し、渦流動させる。
−1mlのLBを添加する。
−37℃で1時間、振とうしながらインキュベートする。
−7000rpmで3分間チューブを遠心分離にかけた後、LB+Km50μg/mlを皿の上に広げる。
−37℃で一晩インキュベートする。
カナマイシン耐性形質転換体を選択し、プロモーター構築物Ptrc−metF:Kmの存在を、上述のオリゴヌクレオチドPtrc−metFv FおよびPtrc−metFv Rを用いたPCR分析により検証した。保持された株は、MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm Ptrc−metH Ptrc−metF:Kmと命名した。
異種Ptrcプロモーターの制御下にcysM遺伝子をクローニングするために、Datsenko&Wanner(2000)によって記載された相同組み換え法を用いた。本方法により、関連遺伝子の近傍にクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することができる。この目的のため、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
−遺伝子cysMの配列(2537627−2537681)と相同な領域(小文字)(ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列)
−RBS(太字)、−35および−10ボックス(太字)を有するプロモーターPtrc配列と相同な領域(斜体、小文字);
−カナマイシン耐性カセットの増幅用領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645における参照配列)。
− 遺伝子cysMの領域の配列(2537734−2537684)と相同な領域(小文字)(ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列);
−バクテリオファージT7末端の配列(Genbank V01146)と相同な領域(斜体、大文字);
−カナマイシン耐性カセットの増幅用領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645における参照配列)。
Ptrc−cycMv R:GCGTTTATTCGTTGGTCTGC(2537833〜2537814の配列と相同である)(配列番号20)。
株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metF Ptrc−metH Ptrc−cysM::Kmを構築するために、上述のように、プラスミドpCP20を用いて、株MG1655 metA*11 ΔmetJ:Cm Ptrc−metF:Km Ptrc−metHからクロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットを取り除いた。保持された株は、MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metF Ptrc−metHと命名した。
株MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm(pME101−thrA*1)、MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm Ptrc−metH:Km(pME101−thrA*1−cysE)、MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm Ptrc−metH Ptrc−metF:Km(pME101−thrA*1−cysE)およびMG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metF Ptrc−metH Ptrc−cysM:Km(pME101−thrA*1−cysE)を構築するために、プラスミド(pME101−thrA*1)または(pME101−thrA*1−cysE)を、形質転換により、株MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm、MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm Ptrc−metH:Km、MG1655 metA*11 ΔmetJ::Cm Ptrc−metH Ptrc−metF:KmおよびMG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metF Ptrc−metH Ptrc−cysM:Kmに導入した。
小エルレンマイヤーフラスコ内で、初めに生産株を評価した。2.5g/lグルコースを含むLB培地内で前培養物を増殖させ、これを使用して、最小培地PC1に一夜培養物を植菌した。この培養物を供給し、0.01g.L−1のビタミンB12を補充した培地PC1に50mlの培養物を植菌しOD600を0.2とした。特に示した場合には、硫酸アンモニウムの代わりに5.6g/lのチオ硫酸アンモニウムを使用した。必要に応じて、スペクチノマイシンを100mg/lの濃度で添加した。OD600が4.5〜5に達したら、OPA/Fmoc誘導体化後にHPLCによって細胞外アミノ酸を定量し、他の関連代謝産物をシリル化後にGC−MSを用いて分析した。
cysEおよびmetH発現における変化を検証するために、対応する酵素の活性を粗抽出物において測定した。
次いで、供給バッチプロトコールを用いて、300mlの発酵槽(DASGIP)において、製造条件下で目的の代謝産物の実質量を生成する株を試験した。
P1は、0.025〜0.35、好ましくは0.100であり、
P2は、0.400〜5.600、好ましくは1.600であり、
P3は、0.068〜0.95、好ましくは0.270であり、
P4は、1.250〜17.5、好ましくは5.000である。
Claims (27)
- 炭素源と硫黄源とを含む適切な培養培地内で微生物を培養し、該培養培地からメチオニンを回収することにより、メチオニン、その誘導体または前駆体を製造するための方法であって、該微生物が、システイン生成が増強されるように改変されている、方法。
- システイン生成に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現が増大している、請求項1に記載の方法。
- 少なくともcysEの発現が増大している、請求項2に記載の方法。
- 少なくともcysMの発現が増大している、請求項2に記載の方法。
- C1単位の生成および該C1単位をホモシステイン上へ転移させる能力に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現が増大しており、および/または異種プロモーターによって駆動される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- C1単位の生成および該C1単位をホモシステイン上へ転移させる能力に関与する少なくとも1つの遺伝子が、以下の遺伝子:
・メチオニンシンターゼをコードするmetE、metH;
・5,10−メチレンテトラヒドロフォレート還元酵素をコードするmetF;
・セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするglyA;および
・グリシン開裂複合体をコードするgcvTHP、lpd
からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。 - metE、metHおよび/またはmetFの発現が増大しており、および/または該遺伝子の少なくとも1つが異種プロモーターから発現する、請求項7に記載の方法。
- システイン生合成のフローを最適化することによってγ脱離活性が低く保たれ、それにより副産物イソロイシンの生成が低下している、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- メチオニン生成に関与する更なる遺伝子の発現が増大している、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- メチオニン生成を低減する遺伝子の発現が減衰している、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- metJ遺伝子によりコードされるメチオニンリプレッサーが欠失または変異しており、ならびに/またはS−アデノシルメチオニンおよび/もしくはメチオニンに対するフィードバック感度が低下した酵素をコードするホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ(MetA)対立遺伝子が株に組み込まれている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 培養培地中の硫黄源が、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、または異なる供給源の組み合わせである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 培養培地中の硫黄源が、硫酸塩もしくはチオ硫酸塩、またはこれらの混合物である、請求項13に記載の方法。
- 所望のアミノ酸/最終生成物の一部または全量(0〜100%)において任意に残存する発酵ブロスおよび/またはバイオマスの構成成分を単離する工程を含んでなる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- メチオニンまたはその誘導体の発酵による製造に使用される微生物であって、該メチオニンまたは誘導体の製造において、システイン生成を増強するように最適化されている、微生物。
- システイン生成に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現が増大している、請求項16に記載の微生物。
- 少なくともcysEの発現が増大している、請求項17に記載の微生物。
- 少なくともcysMの発現が増大している、請求項17に記載の微生物。
- C1単位の生成および該C1単位をホモシステイン上へ転移させる能力に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現が増大しており、および/または異種プロモーターによって駆動される、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
- C1単位の生成および該C1単位をホモシステイン上へ転移させる能力に関与する少なくとも1つの遺伝子が、以下の遺伝子:
・メチオニンシンターゼをコードするmetE、metH;
・5,10−メチレンテトラヒドロフォレート還元酵素をコードするmetF;
・セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするglyA;および
・グリシン開裂複合体をコードするgcvTHP、lpd
からなる群から選択される、請求項21に記載の微生物。 - metE、metHおよび/またはmetFの発現が増大しており、および/または該遺伝子の少なくとも1つが異種プロモーターから発現する、請求項21に記載の微生物。
- システイン生合成のフローを最適化することによってγ脱離活性が低く保たれ、それにより副産物イソロイシンの生成が低下している、請求項16〜23のいずれか一項に記載の微生物。
- メチオニン生成に関与する更なる遺伝子の発現が増大している、請求項16〜24のいずれか一項に記載の微生物。
- メチオニン生成を低減する遺伝子の発現が減衰している、請求項16〜25のいずれか一項に記載の微生物。
- metJ遺伝子によりコードされるメチオニンリプレッサーが欠失または変異しており、ならびに/またはS−アデノシルメチオニンおよび/もしくはメチオニンに対するフィードバック感度が低下した酵素をコードするホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ(MetA)対立遺伝子が組み込まれている、請求項16〜26のいずれか一項に記載の微生物。
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Citations (2)
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WO2007012078A1 (en) * | 2005-07-18 | 2007-01-25 | Basf Ag | Methionine producing recombinant microorganisms |
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---|
JPN6014000131; J Bacteriol., 1990年, 第172巻, 6142-6144ページ * |
JPN6014000134; Microbiology, 1995年, 第141巻, 133-140ページ * |
Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN112779200A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-05-11 | 浙江工业大学 | 高产l-甲硫氨酸的基因工程菌及其构建与应用 |
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